一種應用于核酸序列分析中的樣品純化方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種應用于核酸序列分析中的樣品純化方法，可以用較少的時間，簡便地從樣品中獲得高純度的目標成分，減少檢測結果中的干擾峰；同時又能在不影響檢測效果的前提下，減少檢測所需的樣品量以及其它試劑的用量，從而降低核酸序列分析中的成本，有較高的應用價值。
【專利說明】—種應用于核酸序列分析中的樣品純化方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種應用于核酸序列分析中的樣品純化方法。

【背景技術】
[0002]在核酸序列分析中，聚合酶鏈式反應被廣泛應用于各種核酸測序儀平臺。經聚合酶鏈式反應之后獲得的樣品成分復雜，在用0嫩測序儀檢測前必須進行純化，并且純化的效果對于最終的檢測效果極為重要。目前廣泛采用的乙醇沉淀法，通過向樣品溶液中加入乙醇，經沉淀，離心后實現樣品中目標成分與雜質成分分離。該方法比較難獲得純度很高的樣品中的目標成分，檢測結果中容易出現干擾峰；操作繁瑣，耗時；需要大量人工操作，難以實現自動化。


【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種應用于核酸序列分析中的樣品純化方法，可以用較少的時間，簡便地從樣品中獲得高純度的目標成分，減少檢測結果中的干擾峰；同時又能在不影響檢測效果的前提下，減少檢測所需的樣品量以及其它試劑的用量，從而降低核酸測序的成本。
[0004]本發(fā)明提供了一種應用于核酸序列分析中的樣品前處理方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:
(1)將用功能基團改性的納米磁珠溶液分散于待純化的樣品溶液中并混合均勻，在室溫下培育5分鐘；
(2)將混合溶液放置于磁力裝置上2-3分鐘；
(3)用移液器將混合溶液中的液體吸干后，再加入乙醇的水溶液，在室溫下培育30秒，再將混合溶液中的液體吸干；
(4)再重復第3步1次；
(5)撤去磁力裝置，向吸干液體的混合溶液剩余物中加入緩沖液，再混合均勻；
(6)將混合溶液放置于磁力裝置上1分鐘后，將混合溶液中的上清液吸取出來，可以直接在核酸序列分析儀上進行檢測。
[0005]所述的方法中，用功能基團改性的納米磁珠溶液與待純化的樣品溶液中的體積比為1:1-3:1,用功能基團改性的納米磁珠溶液的濃度為101118/1^-1001118/1^。磁珠的直徑為50-800納米，磁珠的組分和重量含量百分比為:氧化釓20-50%，四氧化三鐵20-40%，二氧化硅:10-60%。乙醇水溶液的體積濃度為50%-95%。
[0006]所述的磁力裝置的磁場強度為0.1-1特斯拉。
[0007]所述的緩沖液的主要成分為水，三羥甲基氨基甲烷和氯化氫；三羥甲基氨基甲烷和氯化氫的摩爾比為1 ；1，邱值在7-9，濃度為0.005-0.0511101/1。操作過程中，加入緩沖液與待純化的樣品溶液的體積比1:2-1:4。
[0008]所述的待純化樣品為經過聚合酶鏈式反應或者測序反應之后獲得的樣品。測序前的聚合酶鏈式$(?)反應體系參見各種用于核酸序列分析的聚合酶鏈式$(?)反應體系，以八81公司的81^76 ^3.1體系為例，聚合酶鏈式反應體系(10 1x1反應體系)的成分為:0.5 —4此0？ 81^76反應混合物，0-3 1x1的2丨5乂緩沖溶液，10卿01弓丨物，50-500叩的0嫩模板，加入去離子蒸懼水至10此。
[0009]本發(fā)明操作簡便，可以用較少的時間，簡便地從樣品中獲得高純度的目標成分，減少檢測結果中的干擾峰；同時又能在不影響檢測效果的前提下，減少檢測所需的樣品量以及其它試劑的用量，從而降低核酸測序的成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1.反應體系的體積為5沿，使用0.5耵81^76 ^3.1進行反應，反應產物用乙醇沉淀法進行純化的核酸片斷檢測圖，采用八卯116(1 0108781:61118公司的3730X1核酸序列分析儀進行分析。
[0011]圖2.反應體系的體積為5沿，使用0.125沿81^76 ^3.1進行反應，反應產物用本發(fā)明中的方法進行純化的核酸片斷檢測圖，采用八卯116(1 0108781:61118公司的3730X1核酸序列分析儀進行分析。

【具體實施方式】
[0012]通過下述實施例有助于進一步理解本發(fā)明，但并不限制發(fā)明的內容。
[0013]具體實施中采用八卯116(1 8108781:61118公司的81^76 ^3.1試劑盒，進行聚合酶鏈式反應，結果用八卯116(1 0108781:61118公司的3730核酸序列分析儀進行分析。
[0014]實施例1對照實驗
按照八卯116(1 0108781:61118公司的81^76末端染色系統(tǒng)的操作要求，5)^1反應體系中應加入0.5 1^1 81^1)76 (八卯116(1 8108781:61118公司的試劑)，2卿01引物〈5’ -161^^06^06600^61)，50叩的0嫩模板(普洛麥格公司，113^18重組噬菌體然后直接用去離子蒸餾水稀釋至5叱，進行反應，用乙醇沉淀法純化后，再用0嫩測序儀進行檢測，作為對照實驗。
[0015]反應的條件為:在75 0條件下預熱3分鐘；45個循環(huán)，每個循環(huán)包括:95 0變性10秒，50 0退火20秒，60 0延伸4分鐘。
[0016]乙醇沉淀法的具體步驟如下:
(1)向待純化的聚合酶鏈式反應產物中加入150沿混合溶液(1-丁醇:無水乙醇，35%:65^,/^)；
(2)用移液槍吸入壓出混合，確保反應產物完全分散在混合溶液中；
(3)室溫下離心30分鐘，離心力為3500噸；
(4)將卩⑶板倒扣在凈化無塵濾紙上除去上清液；
(5)將？⑶板翻轉后放回離心機，室溫下離心1分鐘，離心力為500(父邑)；
(6)加入150耵洗液，洗液成分為:65%無水乙醇:35%0.1禮(乙二胺基四乙酸)，室溫下離心10分鐘，離心力為3，500 ( X 0 ；再將板倒扣在凈化無塵紙上除去上清液；
(7)將步驟6和步驟？重復操作一次； (8)將？⑶板放回離心機，室溫下離心1分鐘，離心力為500(父邑)；
(9)干燥后，用上樣緩沖液0嫩II(八卯11也6！11公司)重新溶解，即可進行分析。
[0017]結果見附圖1。
[0018]實施例2，將實施例1中的反應體系各組分的量降低到1/4，即5叱反應體系中應加入0.125 1^1 81^1)76 (八卯116(1 8108781:61118公司的試劑)，0.4卿01引物〈5’ -161^^06^06600^61)，12.5叩的0嫩模板(普洛麥格公司，肌3卹18重組噬菌體然后直接用去離子蒸餾水稀釋至5叱，進行聚合酶鏈式反應后采用本發(fā)明的方法進行純化，再用0嫩測序儀進行檢測。
[0019]？?:?。糠磻臈l件與實施例1中的反應條件相同。
[0020]本實施例中的納米磁珠溶液制備方法如下:
^0.0511101/1^56(:12^^501111, 0.111101/1 的？6?:13 溶液 50?[和 0.111101/1 的(^(勵3〉3
溶液50此混合均勻，加熱至801，再向溶液中緩慢加入50此0.7^1/1的氫氧化鈉溶液。攪拌30分鐘后，將上述混合溶液加入到5001 0.5001/1正硅酸鈉溶液與5.84^1 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，再向混合溶液中加入0.018磺酸鈉，用此1溶液將邱值調節(jié)至6.0，待液體成為凝膠后，在2001的烘箱中干燥6小時，所得樣品粉碎后用去離子蒸餾水洗滌3次。再將所得的樣品粉末加入到5此水和300此甲醇的混合溶液中，與150此甘油混合后，用超聲波處理30分鐘。然后將混合溶液加熱至851攪拌3小時。冷卻后，用磁力裝置將反應體系中的顆粒物質吸附到反應容器壁，將液體吸干后，移走磁力裝置，加入10001去離子蒸餾水攪拌后，再用磁力裝置將反應體系中的顆粒物質吸附到反應容器壁，將其余液體吸干。最后加入50“ 3%丙二醛磷酸緩沖鹽溶液，磷酸緩沖鹽的濃度為0.1001/1,邱值為7.4),室溫下放置2小時即可使用。
[0021]本發(fā)明中的純化方法的操作程序如下:
(1)將納米磁珠溶液9叱分散于待純化的樣品溶液中并混合均勻，在室溫下培育5分鐘；
(2)將混合溶液放置于磁力裝置上2-3分鐘；
(3)用移液器將混合溶液中的液體吸干后，再加入150虬乙醇的水溶液(7090,在室溫下培育30秒，再將混合溶液中的液體吸干；
(4)再重復第3步1次；
(5)撤去磁力裝置，向吸干液體的混合溶液剩余物中加入
0.05001/1,邱8.0),再混合均勻；
(6)將混合溶液放置于磁力裝置上1分鐘后，將混合溶液中的上清液吸取出來，轉移到新板中即可直接在核酸序列分析儀上進行檢測。
[0022]結果見附圖2。
[0023]對比檢測結果可發(fā)現，采用本發(fā)明所述方法，將核酸序列分析中各組分的用量降低50%以上，獲得的檢測結果也能達到甚至超過采用乙醇沉淀法進行樣品處理所獲得的檢測結果。
【權利要求】
1.一種應用于核酸序列分析中的樣品前處理方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)將用功能基團改性的納米磁珠溶液分散于待純化的樣品溶液中并混合均勻，在室溫下培育5分鐘； (2)將混合溶液放置于磁力裝置上2-3分鐘； (3)用移液器將混合溶液中的液體吸干后，再加入乙醇的水溶液，在室溫下培育30秒，再將混合溶液中的液體吸干； (4)再重復第3步I次； (5)撤去磁力裝置，向吸干液體的混合溶液剩余物中加入緩沖液，再混合均勻； (6)將混合溶液放置于磁力裝置上I分鐘后，將混合溶液中的上清液吸取出來，可以直接在核酸序列分析儀上進行檢測。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中用功能基團改性的納米磁珠溶液與待純化的樣品溶液中的體積比為1:1-3:1，用功能基團改性的納米磁珠溶液的濃度為 lOmg/mL-lOOmg/mLo
3.磁珠的直徑為50-500納米，磁珠的組分和重量含量百分比為:氧化釓20-50%，四氧化三鐵20-40%，二氧化硅:10-60%。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，磁力裝置的磁場強度為0.1-1特斯拉。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，乙醇水溶液的體積濃度為50%-95%。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，加入緩沖液與待純化的樣品溶液的體積比1:2-1:4，緩沖液的主要成分為水，三羥甲基氨基甲烷和氯化氫；三羥甲基氨基甲烷和氯化氫的摩爾比為I ;1，ρΗ值在7-9，濃度為0.005-0.05mol/L。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(6)中，核酸序列分析儀是指ABI.310，3100，3730 或 3730XL DNA 測序儀，Illumina HiSeq 1000，HiSeq 2000，HiSeq.2500, HiSeq 3000,或 MySeq DNA 測序儀，Megbase 1000 DNA 測序儀。
【文檔編號】C12Q1/68GK104419760SQ201310405339
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月7日 優(yōu)先權日:2013年9月7日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:上海畢歐橋生物科技有限公司