小型豬細(xì)胞色素p450重組酶的構(gòu)建表達(dá)及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種小型豬CYP3A22和CYP3A46重組酶的構(gòu)建表達(dá)方法及應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)克隆表達(dá)小型豬CYP3A22和CYP3A46基因，獲得功能良好的pCYP3A22和pCYP3A46重組酶，并應(yīng)用于小型豬與人CYP3A的單酶的相似性評(píng)價(jià)，為藥物臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究提供指導(dǎo)。本發(fā)明提供的重組酶可在臨床前藥代動(dòng)力學(xué)體外篩選合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中的應(yīng)用，通過(guò)體外孵育實(shí)驗(yàn)考察某經(jīng)CYP3A代謝藥物被小型豬CYP3A和人CYP3A重組酶的代謝情況是否相似，判斷該藥物的臨床前試驗(yàn)是否適合選用小型豬作為其藥代動(dòng)力學(xué)研究的動(dòng)物模型。該體外結(jié)果同時(shí)可為體內(nèi)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及參考依據(jù)。
【專利說(shuō)明】小型豬細(xì)胞色素P450重組酶的構(gòu)建表達(dá)及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及小型豬細(xì)胞色素P450基因的蛋白重組表達(dá)及應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450，CYP)是一類含有非共價(jià)結(jié)合血紅素的蛋白，主要位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，在人和動(dòng)物體內(nèi)普遍存在。P450酶是人體內(nèi)重要的藥物代謝酶，負(fù)責(zé)催化內(nèi)源性物質(zhì)或外源性物質(zhì)的I相代謝，參與了接近90%左右的臨床藥物的代謝[1]。該酶主要存在于肝臟中，在一些肝外組織(如:肺，小腸，腎臟等)中也廣泛存在。編碼該酶的P450基因是一個(gè)基因超家族，含有多個(gè)家族和亞家族，其中CYP3A亞家族含量最多，代謝底物譜最廣，是人類最主要的藥物代謝酶。另外，CYP3A與許多癌癥的發(fā)生、治療及預(yù)后都密切相關(guān)，大大提聞了人們對(duì)它的關(guān)注程度。
[0003]新藥上市前必須經(jīng)過(guò)臨床前動(dòng)物研究考察藥物的安全性和有效性，動(dòng)物研究能夠初步判斷藥物在體內(nèi)的藥效及藥代動(dòng)力學(xué)行為，為藥物進(jìn)行臨床試驗(yàn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及重要的參考依據(jù)。因此，臨床前研究中使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需能較好的模擬人體中的情況，才能對(duì)后續(xù)的人體臨床試驗(yàn)產(chǎn)生更好的指導(dǎo)意義。細(xì)胞色素P450的差異是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人藥物代謝特性差異的重要原因[2]，其介導(dǎo)的藥物代謝對(duì)藥物的ADME具有重要影響，其介導(dǎo)藥物生成代謝產(chǎn)物的種類和轉(zhuǎn)化快慢在很大程度上決定了藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效及清除率，決定了藥物的有效性和安全性。因此，在藥物臨床前研究時(shí)我們應(yīng)根據(jù)藥物性質(zhì)的不同，盡量選擇與人體內(nèi)ADME代謝特性相似的動(dòng)物模型?？紤]到CYP3A酶在藥物代謝中的主導(dǎo)地位，不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的CYP3A代謝特性就成為動(dòng)物模型選擇的重要依據(jù)。
[0004]隨著動(dòng)物保護(hù)運(yùn)動(dòng)的興起，國(guó)際動(dòng)物保護(hù)組織對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的限制更加嚴(yán)格，“3R”原則(Reduce, Replace, Refine)逐漸推廣，使得靈長(zhǎng)類動(dòng)物及犬等高等動(dòng)物使用受到限制，以小型豬進(jìn)行藥物的藥理、毒理、藥代、藥效的研究日漸增多。肝微粒體水平的研究表明小型豬與人CYP酶代謝特性相似，其中豬的CYP3A在催化活性及抑制特性上與人最為接近[3]。然而肝微粒體為混合酶系，并不能反應(yīng)小型豬單酶的代謝特性，本研究通過(guò)桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，能夠獲得活性良好的小型豬CYP3A家族最主要的單酶CYP3A22和CYP3A46[4]，為體外研究小型豬與人CYP3A的單酶的相似性，以及體外評(píng)價(jià)小型豬是否適合用作某藥物臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供理想的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供代謝活性良好的小型豬CYP3A22和CYP3A46重組酶的構(gòu)建表達(dá)方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn):
[0006](1)以巴馬小型豬的肝cDNA為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)CYP3A22和CYP3A46基因的特定引物，獲得巴馬香豬CYP3A22和CYP3A46基因的編碼序列，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1、SEQ ID No: 2所示，將該基因片段添A后與pMD18_T連接得pMD18_T/CYP3A22和pMD18_T/CYP3A46質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增。
[0007]所設(shè)計(jì)的引物序列如下:
[0008]SEQ ID No:3CYP3A22 上游引物:ATGGACCTGATCCCAAGCTT
[0009]SEQ ID No:4CYP3A22 下游引物:TCAGGCTCCACTTACGGTC
[0010]SEQ ID No:5CYP3A46 上游引物:ATGGACCTGATCCCAGGCTT
[0011]SEQ ID No:6CYP3A46 下游引物:TCAGGCTCCACTTGTGGTC。
[0012](2)以獲得的pMD18-T/CYP3A22和pMD18_T/CYP3A46質(zhì)粒為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)含有BamHI, SAlI兩個(gè)酶切位點(diǎn)的特定引物，獲得兩端含特定酶切位點(diǎn)的巴馬香豬CYP3A22和CYP3A46基因，用BamHI，Sail兩個(gè)酶進(jìn)行雙酶切得到CYP3A22、CYP3A46兩個(gè)基因片段。
[0013]引物序列如下:
[0014]SEQ ID No:7CYP3A22 h游引物:GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAAGCT,
[0015]SEQ ID No:8CYP3A22 下游引物:
[0016]ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTCC,
[0017]SEQ ID No: 9CYP3A46 h.游引物:GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAGGCTTTTC,
[0018]SEQ ID No:10CYP 3A46 上游引物:
[0019]ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTGTGGTCC。
[0020](3)將載體質(zhì)粒pFastBacl也用同樣的兩個(gè)酶雙酶切，得到含有與上述兩個(gè)基因片段相同酶切位點(diǎn)的載體片段，通過(guò)T4連接酶分別將CYP3A22、CYP3A46基因片段與載體片段連接，構(gòu)建 pFastBac-CYP3A22，pFastBac_CYP3A46 兩種質(zhì)粒。
[0021](4)再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)座，獲得Bacmid_CYP3A22和Bacmid-CYP3A46重組粘粒。將重組粘粒別轉(zhuǎn)染草地夜蛾卵巢細(xì)胞(Sf9)，獲得重組病毒V-CYP3A22和V-CYP3A46，再分別將以上兩種重組病毒與v-CYPOR和v_CYPb5共感染Sf9細(xì)胞，即可在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)CYP3A22和CYP3A46重組蛋白；通過(guò)Western Bolt驗(yàn)證重組蛋白的表達(dá)，通過(guò)CYP3A經(jīng)典底物睪酮和咪達(dá)唑侖驗(yàn)證CYP3A22和CYP3A46活性。
[0022]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該小型豬CYP3A22和CYP3A46重組酶在臨床前藥代動(dòng)力學(xué)體外篩選合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中的應(yīng)用。本發(fā)明的用途通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn):(1)以研究藥物作為底物，分別與PCYP3A22/46孵育，檢測(cè)該藥物經(jīng)pCYP3A22/46代謝生成的代謝產(chǎn)物種類及相對(duì)含量，將該結(jié)果與hCYP3A4/5的結(jié)果進(jìn)行比較，若生成的主要代謝產(chǎn)物和相對(duì)含量較為一致，則小型豬與人CYP3A代謝該藥物的代謝物譜相似；(2)將系列濃度的研究藥物分別與PCYP3A22/46孵育，繪制酶動(dòng)力學(xué)曲線，通過(guò)GraphPad Prism5軟件計(jì)算米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速率Vmax、和內(nèi)在代謝清除率Clint (Vmax/Km)等酶動(dòng)力學(xué)參數(shù),將所得結(jié)果與hCYP3A4/5的結(jié)果進(jìn)行比較，若軟件擬合所得的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)相近，則可以說(shuō)明小型豬與人CYP3A對(duì)該藥物的親和力和轉(zhuǎn)化速率相近。綜合以上結(jié)果，小型豬與人CYP3A對(duì)該藥物的代謝特性相近，則可以推斷該藥物的臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究適合選用小型豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
[0023]本發(fā)明的積極效果是:隨著小型豬在藥物的藥理、毒理、藥代、藥效的研究日漸增多，考察小型豬CYP酶的功能特性并與人體進(jìn)行相似性比較，從而判斷小型豬是否適合用作該藥物臨床前研究的動(dòng)物模型變得更加關(guān)鍵。本發(fā)明首次克隆表達(dá)小型豬CYP3A22和CYP3A46基因，獲得功能良好的pCYP3A22和pCYP3A46重組酶可應(yīng)用于小型豬與人CYP3A的單酶的相似性評(píng)價(jià)并為藥物臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究提供指導(dǎo)，通過(guò)體外孵育實(shí)驗(yàn)考察某經(jīng)CYP3A代謝藥物被小型豬CYP3A和人CYP3A重組酶的代謝情況是否相似，可以初步判斷該藥物的臨床前試驗(yàn)是否適合選用小型豬作為其藥代動(dòng)力學(xué)研究的動(dòng)物模型，該體外結(jié)果同時(shí)可為體內(nèi)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及參考依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1A是cDNA文庫(kù)PCR產(chǎn)物電泳鑒定，條帶1、2分別為用CYP3A22和CYP3A46特異引物PCR的產(chǎn)物電泳圖。
[0025]圖1B是PCR產(chǎn)物連T載體后轉(zhuǎn)化入DH5 α后菌液抽提質(zhì)粒的電泳鑒定，條帶1、2分別是 PMD18-T/CYP3A22 和 pMD18_T/CYP3A46 質(zhì)粒。
[0026]圖1C 是 pMD18-T/CYP3A22 和 pMD18_T/CYP3A46 兩種質(zhì)粒 PCR 產(chǎn)物電泳鑒定。
[0027]圖1D是pFastBac_CYP3A22，pFastBac_CYP3A46兩種質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物電泳鑒定。
[0028]圖1E是重組Bacmid粘粒PCR產(chǎn)物電泳鑒定，條帶1、2分別是Bacmid_CYP3A22，Bacmid-CYP3A46的PCR產(chǎn)物電泳圖。
[0029]圖2是鑒定重組蛋白的表達(dá)的Western Blot圖，條 帶1、2、3、4分別是空白Sf9、P0R+CYPb5、pCYP3A22、pCYP3A46 樣品。
[0030]圖3A-E 是 pCYP3A22、pCYP3A46、對(duì)照 hCYP3A4、pCYP3A5、及陰性對(duì)照蛋白液代謝睪酮生成產(chǎn)物的液相色譜圖，圖3A、3B、3C、3D、3E分別是pCYP3A22、pCYP3A46、hCYP3A4、hCYP3A5和陰性對(duì)照CYP0R+CYPb5蛋白液的孵育結(jié)果。
[0031]圖4A-E 是 pCYP3A22、pCYP3A46、對(duì)照 hCYP3A4、pCYP3A5、及陰性對(duì)照蛋白液代謝咪達(dá)唑侖生成產(chǎn)物的液相色譜圖，圖A、B、C、D、E分別是pCYP3A22、pCYP3A46、hCYP3A4、hCYP3A5和陰性對(duì)照CYP0R+CYPb5蛋白液的孵育結(jié)果。
[0032]圖5是pCYP3A22、pCYP3A46及對(duì)照hCYP3A4、hCYP3A5代謝睪酮生成6 β -羥基睪酮的酶動(dòng)力學(xué)曲線，其中圖A、B、C、D分別是pCYP3A22、pCYP3A46、hCYP3A4、hCYP3A5的擬合結(jié)果。
[0033]圖6是pCYP3A22、pCYP3A46及對(duì)照hCYP3A4、hCYP3A5代謝咪達(dá)唑侖生成1_羥基咪達(dá)唑侖的酶動(dòng)力學(xué)曲線，其中圖A、B、C、D分別是pCYP3A22、pCYP3A46、hCYP3A4、hCYP3A5的擬合結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0034]本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0035]實(shí)施例1:目的基因的制備
[0036]1.lpCYP3A22 和 pCYP3A46cDNA 的克隆
[0037](I)用PCR方法從巴馬小型豬肝臟cDNA文庫(kù)中獲得小型豬CYP3A22和CYP3A46的基因片段。所用引物如下:
[0038]SEQ ID No: 3CYP3A22 上游引物:ATGGACCTGATCCCAAGCTT
[0039]SEQ ID No: 4CYP3A22 下游引物:TCAGGCTCCACTTACGGTC
[0040]SEQ ID No:5CYP3A46 上游引物:ATGGACCTGATCCCAGGCTT
[0041]SEQ ID No:6CYP3A46 下游引物:TCAGGCTCCACTTGTGGTC[0042]反應(yīng)體系為:10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5 μ 1、濃度為10mmol/L的dNTPs2.5 μ 1、濃度為10 μ mol/L的上、下游引物各2 μ 1、模板2 μ 1、濃度為5U/μ I的DNA聚合酶0.5 μ 1、濃度為50mmol/L的MgC12溶液2 μ 1、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為25 μ I ；
[0043]反應(yīng)條件為:溫度96°C預(yù)變性5分鐘，然后95°C變性30秒、58 °C退火30秒、72°C延伸I分鐘，共12個(gè)循環(huán)，每循環(huán)I次退火溫度降低0.50C ;再95°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，共33個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘；經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR結(jié)果，得到長(zhǎng)度約1.5kb的條帶(見圖1A)，位置正確，認(rèn)為獲得目的基因。
[0044](2)將位置正確的PCR產(chǎn)物膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行添A反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定并且膠回收，回收產(chǎn)物與PMD18-T Vector (T載體)相連。
[0045](3)轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，于含氨芐LB固體培養(yǎng)基上，37°C孵箱培養(yǎng)過(guò)夜。待次日培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌斑后，挑取培養(yǎng)基上的單菌落至液體含氨芐的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)10-12h。將菌液用試劑盒抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果符合一般質(zhì)粒的特征(見圖1B)，最亮一條為環(huán)形質(zhì)粒，認(rèn)為得到了 pMD18-T/CYP3A22和PMD18-T/CYP3A46 質(zhì)粒。
[0046]取所得陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，從pMDlS-Τ載體的多克隆位點(diǎn)兩端分別測(cè)序，測(cè)定插入片段的序列，均獲得1512bp的ORF序列。測(cè)序結(jié)果表明得到CYP3A22和CYP3A46基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示。
[0047]1.2pFastBac-CYP3A22, pFastBac-CYP3A46 的構(gòu)建
[0048]以1.1中得到的pMD18-T/CYP3A22和pMD18_T/CYP3A46質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得CYP3A22和CYP3A46基因片段，并引入SalI和BamHI兩個(gè)酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)示)，如此可通過(guò)酶切、連接與pFastBac載體連接。PCR引物如下:
[0049]SEQ ID No: 7CYP3A22 h.游引物 GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAAGCT
[0050]SEQ ID No:8CYP3A22 下游引物
[0051 ] ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTCC;
[0052]SEQ ID No: 9CYP3A46 h.游引物 GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAGGCTTTTC
[0053]SEQ ID No: 10CYP3A46 上游引物
[0054]ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTGTGGTCC
[0055]PCR的反應(yīng)體系(50 μ I)和過(guò)程:
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種小型豬CYP3A22和CYP3A46重組酶的構(gòu)建表達(dá)方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn): (I)以巴馬小型豬的肝cDNA為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)CYP3A22和CYP3A46基因的特定引物，獲得巴馬香豬CYP3A22和CYP3A46基因的編碼序列，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1、SEQ IDNo: 2所示，將該基因片段添A后與pMD18-T連接得pMD18_T/CYP3A22和pMD18_T/CYP3A46質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌疋cWi DH5a感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增； 所述引物序列如下: SEQ ID No:3 CYP3A22 上游引物:ATGGACCTGATCCCAAGCTT， SEQ ID No:4 CYP3A22 下游引物:TCAGGCTCCACTTACGGTC， SEQ ID No:5 CYP3A46 上游引物:ATGGACCTGATCCCAGGCTT， SEQ ID No:6 CYP3A46 下游引物:TCAGGCTCCACTTGTGGTC ; (2 )以獲得的pMD18-T/CYP3A22和pMD18_T/CYP3A46質(zhì)粒為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)含有BamHI，SAlI兩個(gè)酶切位點(diǎn)的特定引物，獲得兩端含特定酶切位點(diǎn)的巴馬香豬CYP3A22和CYP3A46基因，用BamHI，Sail兩個(gè)酶進(jìn)行雙酶切得到CYP3A22、CYP3A46兩個(gè)基因片段； 引物序列如下:
SEQ ID No:7 CYP3A22 h.游引物:GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAAGCT, SEQ ID No:8 CYP3A22下游引物:ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTCC, SEQ ID No:9 CYP3A46 h游引物:GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAGGCTTTTC,
SEQ ID No: 10 CYP3A46 h游引物:ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTGTGGTCC ； (3)將載體質(zhì)粒pFastBacl也用同樣的兩個(gè)酶雙酶切，得到含有與上述兩個(gè)基因片段相同酶切位點(diǎn)的載體片段，通過(guò)T4連接酶分別將CYP3A22、CYP3A46基因片段與載體片段連接，構(gòu)建 pFastBac-CT/^^^，pFastBac-CT/^4必兩種質(zhì)粒； (4)再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入疋co7iDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)座，獲得Bacmi和^>acmid-CYP3A46 重組粘粒； (5)將重組粘粒別轉(zhuǎn)染草地夜蛾卵巢細(xì)胞(Sf9)，獲得重組病毒V-CYP3A22和V-CYP3A46,再分別將以上兩種重組病毒與v-CYPOR和v_CYPb5共感染Sf9細(xì)胞，即在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)CYP3A22和CYP3A46重組蛋白；通過(guò)Western Bolt驗(yàn)證重組蛋白的表達(dá)，通過(guò)CYP3A經(jīng)典底物睪酮和咪達(dá)唑侖驗(yàn)證CYP3A22和CYP3A46活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1構(gòu)建的所述的一種小型豬CYP3A22和CYP3A46重組酶在藥代動(dòng)力學(xué)體外篩選合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn):(1)以研究藥物作為底物，分別與PCYP3A22/46孵育，檢測(cè)該藥物經(jīng)pCYP3A22/46代謝生成的代謝產(chǎn)物種類及相對(duì)含量，將該結(jié)果與hCYP3A4/5的結(jié)果進(jìn)行比較，若生成的主要代謝產(chǎn)物和相對(duì)含量較為一致，則小型豬與人CYP3A代謝該藥物的代謝物譜相似；(2)將系列濃度的研究藥物分別與PCYP3A22/46孵育，繪制酶動(dòng)力學(xué)曲線，通過(guò)GraphPad Prism5軟件計(jì)算米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速率Vmax、和內(nèi)在代謝清除率Clint的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，將所得結(jié)果與hCYP3A4/5的結(jié)果進(jìn)行比較，若軟件擬合所得的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)相近，則說(shuō)明小型豬與人CYP3A對(duì)該藥物的親和力和轉(zhuǎn)化速率相近；綜合以上結(jié)果，小型豬與人CYP3A對(duì)該藥物的代謝特性相近，則推斷該藥物的藥代動(dòng)力學(xué)研究適合選用小型豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK103468722SQ201310405336
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月8日
【發(fā)明者】邊詣聰, 魏泓, 余露山, 商海濤, 曾蘇, 郭科男, 馬利萍, 劉宇, 鄭小麗, 姚青青 申請(qǐng)人:浙江大學(xué), 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)