一種抑制麥蚜細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因表達的dsRNA及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制麥蚜細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因表達的dsRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種雙鏈RNA分子，如序列表的序列2所示。本發(fā)明還保護編碼所述RNA分子的DNA分子。本發(fā)明還保護所述RNA分子或所述DNA分子的應(yīng)用，為如下（1）至（4）中的至少一種：（1）防治蚜蟲；（2）促進蚜蟲死亡；（3）抑制蚜蟲生長；（4）抑制蚜蟲體內(nèi)細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的表達。本發(fā)明對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上蚜蟲的防治具有重要應(yīng)用價值。
【專利說明】—種抑制麥蚜細胞色素C氧化酶Vl Ic亞基基因表達的dsRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抑制麥蚜細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因表達的dsRNA及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]麥蚜(尤其是麥長管蚜)是危害中國小麥生產(chǎn)的主要害蟲之一，據(jù)統(tǒng)計，中國每年小麥蚜蟲危害面積可高達0.17億公頃，占小麥總種植面積的62%，造成減產(chǎn)15%-30%，嚴(yán)重時可高達50%。近年來，由于全球氣候變暖、耕作制度變化等因素，使蚜蟲的繁殖能力和適應(yīng)性顯著增強，其危害日趨嚴(yán)重。目前，蚜蟲防治以噴灑農(nóng)藥為主，大量使用農(nóng)藥不僅對人畜有害，而且造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。培育抗蚜蟲小麥品種是防止蚜蟲危害的最有效途徑，但由于現(xiàn)有種質(zhì)資源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性機制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通過基因工程培育小麥抗蚜新種質(zhì)具有重要意義。
[0003]植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)已成為農(nóng)作物抗蟲基因工程的熱點之一，通過寄主植物表達相應(yīng)昆蟲特異基因的dsRNA，昆蟲取食植物后沉默其相應(yīng)的基因從而達到控制害蟲危害的目的。RNAi的過程是雙鏈RNA (dsRNA)進入生物體內(nèi)，被Dicer酶切割成21_23nt的siRNA, siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合，與互補序列的靶mRNA結(jié)合，被Dicer識別，造成靶基因表達量的下降。近年來，利用dsRNA體外飼喂或注射來篩選RNA靶標(biāo)基因，導(dǎo)致靶標(biāo)基因表達和沉默，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于昆蟲生長發(fā)育關(guān)鍵基因的鑒定和功能分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種抑制麥蚜細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因表達的dsRNA及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供了一種雙鏈RNA分子，如序列表的序列2所示。
[0006]本發(fā)明還保護編碼所述RNA分子的DNA分子。所述DNA分子為序列表的序列I所示的DNA分子。
[0007]含有所述RNA分子的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0008]含有所述DNA分子的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0009]本發(fā)明還保護所述RNA分子或所述DNA分子在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的用途為如下(I)至(4)中的至少一種:(I)防治蚜蟲；(2)促進蚜蟲死亡；(3)抑制蚜蟲生長；
(4)抑制蚜蟲體內(nèi)細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的表達。所述蚜蟲具體可為麥蚜，更具體可為麥長管蚜。所述蚜蟲可為具有細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的蚜蟲。所述細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因具體·可為具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有與序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。[0010]本發(fā)明還保護一種產(chǎn)品，其活性成分為所述RNA分子或所述DNA分子；所述產(chǎn)品的用途為如下(I)至(4)中的至少一種:(1)防治蚜蟲；(2)促進蚜蟲死亡；(3)抑制蚜蟲生長；(4)抑制蚜蟲體內(nèi)細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的表達。所述蚜蟲具體可為麥蚜，更具體可為麥長管蚜。所述蚜蟲可為具有細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的蚜蟲。所述細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因具體可為具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有與序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。
[0011]本發(fā)明還保護所述RNA分子或所述DNA分子的應(yīng)用，為如下(I)至(4)中的至少一種:(1)防治蚜蟲；(2)促進蚜蟲死亡；(3)抑制蚜蟲生長；(4)抑制蚜蟲體內(nèi)細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的表達。所述蚜蟲具體可為麥蚜，更具體可為麥長管蚜。所述蚜蟲可為具有細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的蚜蟲。所述細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因具體可為具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有與序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。
[0012]本發(fā)明還保護用于抑制蚜蟲體內(nèi)細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的表達的物質(zhì)在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的用途為如下(a)和/或(b)和/或(C): Ca)防治蚜蟲；
(b)促進蚜蟲死亡；(C)抑制蚜蟲生長。所述蚜蟲具體可為麥蚜，更具體可為麥長管蚜。所述蚜蟲可為具有細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的蚜蟲。所述細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因具體可為具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有與序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。
[0013]本發(fā)明還保護一種產(chǎn)品，其活性成分為抑制蚜蟲體內(nèi)細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的表達的物質(zhì)；所述產(chǎn)品的用途為如下(a)和/或(b)和/或(C): Ca)防治蚜蟲；(b)促進蚜蟲死亡；(C)抑制蚜蟲生 長。所述蚜蟲具體可為麥蚜，更具體可為麥長管蚜。所述蚜蟲可為具有細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的蚜蟲。所述細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因具體可為具有序列表的序列5所示DNA片段的DNA分子或具有與序列表的序列5所示的DNA片段具有80%以上同源性的DNA片段的DNA分子。
[0014]本發(fā)明基于麥長管蚜的細胞色素C氧化酶VIIc亞基的cDNA的保守序列，提供了一種dsRNA。體外飼喂本發(fā)明提供的dsRNA，可以通過RNAi沉默麥長管蚜體內(nèi)細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因，進而對麥長管蚜產(chǎn)生致死效應(yīng)，且隨著dsRNA濃度增大和飼喂時間延長，麥長管蚜的死亡率均逐漸增大。本發(fā)明對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上蚜蟲的防治具有重要應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為制備dsRNA-1和dsRNA-2的過程中的PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0016]圖2為dsRNA-1和dsRNA-2的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0017]圖3為用P3-F和P3-R組成的引物對鑒定內(nèi)參基因的擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0018]圖4為用P2-F和P2-R組成的引物對鑒定細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的擴增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。
【具體實施方式】
[0019]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。17體外轉(zhuǎn)錄試劑盒:NEB公司。
[0020]麥長管蚜:參考文獻:錢幼亭，周廣和，張淑香，張向才.麥長管蚜有性世代的研究.植物保護，1982，01，14-15.;公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得；將麥長管蚜接種到小麥品種科農(nóng)199的幼苗上，放入人工氣候箱中(20±2°C、60%-80%濕度、16小時光照/8小時黑暗)進行繁殖。
[0021]實施例1、用于沉默細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的dsRNA的制備
[0022]1、提取麥長管蚜的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0023]2、以步驟I得到的cDNA為模板，用P1-F和Pl-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1A。
[0024]Pl-F (上游引物):TAATACGACTCACTATAGGG AG TGGTTCAAAAGCCGTACAAGCGT ；
[0025]Pl-R (下游引物):TAATACGACTCACTATAGGG AG GGAAGACCAAAACCGGTGCTAAAGA。
[0026]下劃線標(biāo)注的區(qū)域為17啟動子序列。
[0027]PCR 反應(yīng)體系:10 X PCR Buffer 5 U L, dNTP (2.5mmol ? L-1) 4 ii L、rTaq 0.5 U L,上游引物(20 u mo I ? L—1) I u L、下游引物(20 u mo I ? L—1) I u L、模板I U L,用ddH20補足至50 u L0
[0028]PCR 反應(yīng)條件:94 °C 4min ；94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 30s，39 個循環(huán)；72 °CIOmin ;4°C保存。
[0029]3、dsRNA-1 的制備
[0030]回收步驟2得到的PCR擴增產(chǎn)物并作為模板，采用17體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄(42°C孵育16小時)，用DNaseI和RNaseA消化殘留的模板DNA和單鏈RNA，得到dsRNA-1。
[0031]dsRNA-1的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2A。將dsRNA_l進行測序，測序結(jié)果表明，dsRNA-1為序列表的序列2所示的雙鏈RNA。用無RNase水溶解dsRNA-1，用分光光度計(波長260nm)進行定量，然后置于_20°C冰箱中保存。
[0032]實施例2、用于沉默GFP基因的dsRNA的制備
[0033]1、合成序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子。
[0034]2、以步驟I得到的雙鏈DNA分子為模板，用P4-F和P4-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1B。
[0035]P4-F (上游引物):TAATACGACTCACTATAGGG ACGGGAACTACAAGACACG ；
[0036]P4-R (下游引物):TAATACGACTCACTATAGGG C TTTGGAAAGGGCAGATT。
[0037]PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件同實施例1的步驟2中的PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件。
[0038]3、dsRNA-2 的制備
[0039]回收步驟2得到的PCR擴增產(chǎn)物并作為模板，采用17體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄(42°C孵育16小時)，用DNaseI和RNaseA消化殘留的模板DNA和單鏈RNA，得到dsRNA-2。
[0040]dsRNA-2的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2B。將dsRNA_2進行測序，測序結(jié)果表明，dsRNA-2為序列表的序列4所示的雙鏈RNA。用無RNase水溶解dsRNA-2，用分光光度計(波長260nm)進行定量 ，然后置于_20°C冰箱中保存。[0041]實施例3、dsRNA在抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用
[0042]一、蚜蟲人工飼料的配制和飼育器的準(zhǔn)備
[0043]人工飼料配制方法和飼育器的結(jié)構(gòu)見參考文獻(李彩霞，高麗鋒，高玲玲，李潤植.全純?nèi)斯I養(yǎng)液飼養(yǎng)蚜蟲的研究.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997，17(3):225-228.LiC X，Gao L F，Gao L Lj Li R Z.Study on the rearing of aphids on a artificiallyholidic diets.Journal of Shanxi Agricultural University, 1997, 17(3):225-228.(inChinese))。用0.2 u m孔徑的細菌過濾器過濾人工飼料，分裝到2.0mL滅菌的離心管中，保存于-20°C的冰箱中，避免反復(fù)凍融。
[0044]二、dsRNA在抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用
[0045]麥長管蚜的飼喂方法見參考文獻:糾敏，劉樹生.利用人工飼料飼養(yǎng)蚜蟲技術(shù).華東昆蟲學(xué)報，2004，13(2): 102-109.Jiu M, Liu S S.Aphid rearing with artificialdiets.Entomological Journal of East China, 2004，13 (2):102-109。
[0046]1、分組處理
[0047]DSR8組:每個飼育器中放入15頭3齡的麥長管蚜，采用混合飼料甲(混合飼料甲的制備方法:每100 u L人工飼料中加入750ng dsRNA-1)飼喂蚜蟲，每兩天更換新的混合飼料甲、每兩天統(tǒng)計死亡率并取存活的麥長管蚜檢測細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的相對
表達量。
[0048]GFP組:每個飼育器中放入15頭3齡的麥長管蚜，采用混合飼料乙(混合飼料乙的制備方法:每100 V- L人工飼料中加入750ng dsRNA-2)飼喂姆蟲,每兩天更換新的混合飼料乙、每兩天統(tǒng)計死亡率并取存活 的麥長管蚜檢測細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的相對表達量。
[0049]對照組:每個蚜蟲飼育器中放入15頭3齡的麥長管蚜，采用人工飼料飼喂蚜蟲，每兩天更換新的人工飼料、每兩天統(tǒng)計死亡率并取存活的麥長管蚜檢測細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的相對表達量。
[0050]每組設(shè)置5個重復(fù)處理(即5個飼育器)。
[0051]養(yǎng)殖條件:20±2°C、濕度60%_80%，16小時光照/8小時黑暗。
[0052]2、死亡率統(tǒng)計結(jié)果
[0053]使用EXcel2003軟件對死亡率進行統(tǒng)計學(xué)分析，計算平均值與方差，并進行顯著性差異的分析(t-test，P〈0.01或0.05)。結(jié)果見表1。
[0054]表1各組的死亡率統(tǒng)計分析結(jié)果，平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(％)
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種雙鏈RNA分子,如序列表的序列2所不。
2.編碼權(quán)利要求1所述RNA分子的DNA分子。
3.含有權(quán)利要求1所述RNA分子或權(quán)利要求2所述DNA分子的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒。
4.權(quán)利要求1所述RNA分子或權(quán)利要求2所述DNA分子在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的用途為如下(I)至(4)中的至少一種:(1)防治蚜蟲；(2)促進蚜蟲死亡；(3)抑制蚜蟲生長；(4)抑制蚜蟲體內(nèi)細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的表達。
5.一種產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述RNA分子或權(quán)利要求2所述DNA分子；所述產(chǎn)品的用途為如下(I)至(4)中的至少一種:(1)防治蚜蟲；(2)促進蚜蟲死亡；(3)抑制蚜蟲生長；(4)抑制蚜蟲體內(nèi)細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的表達。
6.權(quán)利要求1所述RNA分子或權(quán)利要求2所述DNA分子的應(yīng)用，為如下(I)至(4)中的至少一種:(I)防治蚜蟲；(2)促進蚜蟲死亡；(3)抑制蚜蟲生長；(4)抑制蚜蟲體內(nèi)細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的表達。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，如權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，或，如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述蚜蟲為麥蚜。
8.用于抑制姆蟲體內(nèi)細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的表達的物質(zhì)在制備廣品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的用途為如下(a)和/或(b)和/或(c):(a)防治蚜蟲；(b)促進蚜蟲死亡；(C)抑制蚜蟲生長。
9.一種產(chǎn)品，其活性成分為抑制蚜蟲體內(nèi)細胞色素C氧化酶VIIc亞基基因的表達的物質(zhì)；所述產(chǎn)品的用途為如下(a)和/或(b)和/或(C): Ca)防治蚜蟲；(b)促進蚜蟲死亡；(C)抑制蚜蟲生長。
10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，或，如權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述蚜蟲為麥蟲牙。
【文檔編號】A01N57/16GK103667288SQ201310556607
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】夏蘭琴, 王大海, 孫永偉, 杜文明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所