一種過氧化物酶在制備防治腦血管疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種過氧化物酶Prdx1（peroxiredoxin-1）在制備防治缺血性腦卒中、血管性癡呆等腦血管病變?yōu)榛A(chǔ)的腦損傷疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建攜帶Prdx1基因過表達(dá)質(zhì)粒和重組慢病毒載體，從細(xì)胞和整體動(dòng)物水平試驗(yàn)證明了Prdx1能夠有效逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血性損傷，保護(hù)血腦屏障BBB，緩解腦微循環(huán)障礙引起的神經(jīng)功能損傷，從而達(dá)到防治腦血管疾病的作用。本發(fā)明提供的Prdx1基因慢病毒載體有望成為治療腦血管疾病藥物的重要途徑，為Prdx1在基因治療腦血管疾病的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
【專利說明】一種過氧化物酶在制備防治腦血管疾病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及過氧化物酶Prdxl (peroxiredoxin-Ι)的藥物用途，尤其涉及Prdxl在缺血性腦卒中、血管性癡呆等腦血管病變?yōu)榛A(chǔ)的腦損傷疾病治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腦血管病是危害人類生命健康的常見病、多發(fā)病，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。隨著人口老齡化趨勢的加速，我國的腦血管病發(fā)病率更是持續(xù)增高，給患者及其家庭和社會(huì)帶來沉重的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)資料顯示，腦血管病以缺血性為多見。缺血性腦血管病是多因素、多層次的復(fù)雜病理過程，其發(fā)病進(jìn)程中的腦微血管功能狀態(tài)已逐步引起關(guān)注。腦微血管作為缺血性腦損傷病理事件中受侵害的早期首要靶標(biāo)，觸發(fā)和加重了缺血區(qū)域神經(jīng) 細(xì)胞損傷，為此以腦微血管為切入點(diǎn)開展腦微血管結(jié)構(gòu)與功能完整性保護(hù)顯得尤為重要，也是進(jìn)一步研究腦血管疾病治療方法的突破口所在。
[0003]缺血等刺激導(dǎo)致血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷，是眾多腦血管損傷疾病的重要病理反應(yīng)過程。機(jī)體內(nèi)積蓄過多的 ROS (reactive oxygen species)、RNS (reactive nitrogenspecies)等自由基破壞了細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡，導(dǎo)致重要蛋白、DNA等活性和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。應(yīng)用藥物清除過度積蓄的ROS等自由基，保護(hù)重要蛋白免受氧化應(yīng)激破壞是改善血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血損傷的重要環(huán)節(jié)，對(duì)防治以血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷為病理基礎(chǔ)的腦血管疾病有重大實(shí)際意義。
[0004]抗氧化蛋白超家族過氧化物酶Peroxiredoxin-Ι (Prdxl)是新近被發(fā)現(xiàn)的非硒類小分子過氧化物酶Prdxs家族中一員，其N端和C端各含I個(gè)保守的還原性Cys殘基(Cys52和Cysl73)，經(jīng)氧化可形成二聚體扮演過氧化物酶的功能，也可進(jìn)一步聚合成四聚體發(fā)揮分子伴侶功能，同時(shí)也可結(jié)合其他靶蛋白發(fā)揮抗凋亡等多種生物功能。有研究報(bào)道，Prdxl基因敲除小鼠存活率低，和機(jī)體內(nèi)過度激活的氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)；心血管病病理機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)Prdxl上調(diào)可抑制炎癥因子的粘附，抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑形成。但目前尚未見如何將Prdxl用于逆轉(zhuǎn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，防治缺血性腦卒中、血管性癡呆等腦血管病變?yōu)榛A(chǔ)的腦損傷疾病的應(yīng)用報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種過氧化物酶Prdxl (Peroxiredoxin-l)在制備腦損傷疾病藥物中的應(yīng)用，主要是在制備治療缺血性腦卒中、血管性癡呆等腦血管病變?yōu)榛A(chǔ)的腦損傷疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建Prdxl過表達(dá)重組質(zhì)粒和慢病毒，從細(xì)胞和整體動(dòng)物水平試驗(yàn)證明Prdxl有效逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血性損傷，保護(hù)血腦屏障BBB，緩解腦微循環(huán)障礙引起的神經(jīng)功能損傷，從而達(dá)到防治腦血管疾病的作用。
[0006]具體通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
(I)將人源Prdxl基因插入到pEGFP -Cl質(zhì)粒上，構(gòu)建Prdxl過表達(dá)質(zhì)粒:提取Hela細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,設(shè)計(jì)Prdxl引物:
primer F:AAACTCGAGATGTCTTCAGGAAATGCTAAAATTGGGCAC，
primer R:AAAGCGGCCGCCTTCTGCTTGGAGAAATATTCTTTGCTC,
PCR克隆人源性目的基因Prdxl，并進(jìn)行電泳、割膠純化，用Xho I/Not I對(duì)克隆的目的基因Prdxl進(jìn)行雙酶切得到目的基因片段，質(zhì)粒載體pEGFP-Cl雙酶切后回收線性化的載體片段，目的基因片段與線性化的載體片段連接后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，陽性克隆送測序，測序無誤的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，命名為pEGFP-Prdxl，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);
(2)將Prdxl基因整合到慢病毒載體上，構(gòu)建Prdxl過表達(dá)慢病毒Prdxl過表達(dá)載體構(gòu)建:用EcoR I和BamH I對(duì)化學(xué)合成的Prdxl基因酶切得到目的基因片段，表達(dá)載體ρ⑶H-CMV-MCS-EFl-copGFP酶切后回收線性化的載體片段，目的基因片段與線性化的載體片段連接后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，陽性克隆送測序，測序無誤的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，命名為ρ⑶H-CMV-Prdx1-EFl-copGFP ；
慢病毒包裝:將攜帶Prdxl的載體質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒ρ⑶/NL-BH*DDD以及膜蛋白質(zhì)粒pLTR-G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以質(zhì)量比3:2:1混合，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，形成攜帶Prdxl基因的重組慢病毒，命名為LV-Prdxl-GFP。經(jīng)擴(kuò)增、純化、滴度測定等獲得2.28X IO8IU/ml高滴度的Prdxl過表達(dá)慢病毒，用于后續(xù)動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)。
[0007](3)采用永生化人臍靜脈來源的EA.hy926細(xì)胞系制作血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧缺糖氧化應(yīng)激損傷模型(Oxygen-Glucose Deprivation, OGD),模擬體外血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血損傷狀態(tài)。采用該模型觀察Prdxl過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)OGD誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，證明Prdxl的血管內(nèi)皮保護(hù)作用；
(4)建立小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再`灌注模型和合適Prdxl基因過表達(dá)方式，觀察Prdxl慢病毒的腦內(nèi)分布，考察Prdxl調(diào)控腦血管缺血損傷引起的神經(jīng)功能障礙、血腦屏障破壞以及神經(jīng)元損傷情況，證明Prdxl的神經(jīng)血管單元保護(hù)作用和治療缺血性腦血管疾病的應(yīng)用潛力。
[0008]本發(fā)明提供的方法，用攜帶過氧化物酶Prdxl的重組質(zhì)?；蛘呗《据d體，對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷關(guān)聯(lián)疾病進(jìn)行基因治療，可有效改善血管缺血損傷，保護(hù)血腦屏障BBB，緩解腦微循環(huán)障礙引起的神經(jīng)功能損傷，從而達(dá)到防治腦血管疾病的作用。因此采用本發(fā)明提供的Prdxl基因慢病毒載體有望成為治療腦血管疾病的重要新策略。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，PCR擴(kuò)增人源性目的基因Prdxl的產(chǎn)物鑒定電泳圖；其中M:DL1, 000 DNA Marker, P1、P2:PCR擴(kuò)增Prdxl的產(chǎn)物，平行兩組，大小為600bp左右，與目的基因大小相符。
[0010]圖2是過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，雙酶切位點(diǎn)Xho I/Not I。
[0011]圖3是過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，質(zhì)粒載體pEGFP-Cl示意圖。
[0012]圖4:過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，確認(rèn)Prdxl目的基因與線性質(zhì)粒連接的電泳圖；其中M:DLl1OOO DNA Marker，L1、L2: Prdxl與線性質(zhì)粒連接為重組質(zhì)粒，平行兩組，大小為
4.3kbp左右，與理論值相符。[0013]圖5是過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子的電泳圖；其中M:DL1，000 DNAMarker, 1-8:挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化子,大小為4.3kbp左右，與理論值相符。
[0014]圖6是過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，陽性克隆測序比對(duì)結(jié)果。
[0015]圖7是過表達(dá)慢病毒構(gòu)建，載體質(zhì)粒pCDH-CMV-Prdxl-EFl-copGFP示意圖。
[0016]圖8是過表達(dá)慢病毒構(gòu)建，菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子的電泳圖，其中陰性對(duì)照(空載體)，DL2，000 DNA Marker: 2 kb, I Kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp，3-10 為挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化子。
[0017]圖9是過表達(dá)慢病毒構(gòu)建，慢病毒包裝質(zhì)粒P⑶/NL_BH*DDD示意圖。
[0018]圖10是過表達(dá)慢病毒構(gòu)建，膜蛋白質(zhì)粒pLTR-G示意圖。
[0019]圖11是過表達(dá)慢病毒構(gòu)建，慢病毒LV-Prdxl-GFP的目的基因表達(dá)檢測Western結(jié)果，樣品說明:1為HL-60空細(xì)胞樣品；2為陰性對(duì)照病毒感染HL-60細(xì)胞樣品；3為目的病毒(LV-Prdxl-GFP)感染HL-60后樣品。
[0020]圖12是Prdxl逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡信號(hào)激活。
[0021]圖13是Prdxl抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞DNA斷裂損傷。
[0022]圖14是Prdxl改善缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙。
[0023]圖15是Prdxl緩解缺血再灌注導(dǎo)致的血腦屏障損傷。
[0024]圖16是Prdxl對(duì)缺血再灌注誘發(fā)的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。
【具體實(shí)施方式】
[0025]本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之內(nèi)。
[0026]實(shí)施例一構(gòu)建Prdxl過表達(dá)重組質(zhì)粒
1.1以Hela細(xì)胞總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，并定量。
[0027]Hela細(xì)胞來源:美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC)的 CCL-2 Hela 細(xì)胞。
[0028]Hela細(xì)胞總RNA提取實(shí)驗(yàn)步驟:
O先棄掉六孔板DMEM培養(yǎng)基，加入Iml TRIzol制成細(xì)胞懸液。
[0029]2)室溫靜置，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到EP管中，加入0.2ml氯仿/酚，手搖15秒，靜置2-3分鐘，12000g離心15分鐘(2°C-8°C)。
[0030]3)分三層RNA溶解在上層的水相中，吸取水相，加入0.5ml異丙醇，12000g離心10分鐘(2°C-8°C)。
[0031]4)離心后棄上清加Iml 75%乙醇洗滌，渦旋混勻，然后7500g離心5分鐘(2°C-
8。。)。
[0032]5)干燥 5-10 分鐘，加入 20ml RNA-free water 溶解。
[0033]A.逆轉(zhuǎn)錄體系
【權(quán)利要求】
1.一種過氧化物酶Prdxl在制備腦損傷疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，在制備治療缺血性腦卒中、血管性癡呆的腦損傷疾病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)將人源Prdxl基因插入到pEGFP-Cl質(zhì)粒上，構(gòu)建Prdxl過表達(dá)質(zhì)粒:提取Hela細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,設(shè)計(jì)Prdxl引物:
primer F:AAACTCGAGATGTCTTCAGGAAATGCTAAAATTGGGCAC，
primer R:AAAGCGGCCGCCTTCTGCTTGGAGAAATATTCTTTGCTC, PCR克隆人源性目的基因Prdxl，并進(jìn)行電泳、割膠純化，用Xho I/Not I對(duì)克隆的目的基因Prdxl進(jìn)行雙酶切得到目的基因片段，質(zhì)粒載體pEGFP-Cl雙酶切后回收線性化的載體片段，目的基因片段與線性化的載體片段連接后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，陽性克隆送測序，測序無誤的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，命名為pEGFP-Prdxl，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn); (2)將Prdxl基因整合到慢病毒載體上，構(gòu)建Prdxl過表達(dá)慢病毒 Prdxl過表達(dá)載體構(gòu)建:用EcoR I和BamH I對(duì)化學(xué)合成的Prdxl基因酶切得到目的基因片段，表達(dá)載體ρ⑶H-CMV-MCS-EFl-copGFP酶切后回收線性化的載體片段，目的基因片段與線性化的載體片段連接后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，陽性克隆送測序，測序無誤的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，命名為ρ⑶H-CMV-Prdx1-EFl-copGFP ； 慢病毒包裝:將攜帶Prdxl的載體質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒ρ⑶/NL-BH*DDD以及膜蛋白質(zhì)粒PLTR-G共轉(zhuǎn)染293T細(xì).胞，以質(zhì)量比3:2:1混合，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，形成攜帶Prdxl基因的重組慢病毒，命名為LV-Prdxl-GFP ;經(jīng)擴(kuò)增、純化、滴度測定等獲得2.28*108IU/ml高滴度的Prdxl過表達(dá)慢病毒，用于后續(xù)動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)； (3)采用永生化人臍靜脈來源的EA.hy926細(xì)胞系制作血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧缺糖氧化應(yīng)激損傷模型(Oxygen-Glucose Deprivation, OGD),模擬體外血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血損傷狀態(tài)； (4)建立小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型和合適Prdxl基因過表達(dá)方式，觀察Prdxl慢病毒的腦內(nèi)分布，考察Prdxl調(diào)控腦血管缺血損傷引起的神經(jīng)功能障礙、血腦屏障破壞以及神經(jīng)元損傷情況，證明Prdxl的神經(jīng)血管單元保護(hù)作用和治療缺血性腦血管疾病的應(yīng)用潛力。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，過氧化物酶Prdxl基因全長或所包含部分序列作為生物藥物導(dǎo)入體內(nèi)使用，可通過其他藥劑載藥途徑使用，但不限于此。
4.根據(jù)權(quán)利要求廣3任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述Prdxl防治腦血管疾病特征是改善缺血誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血腦屏障破壞以及腦神經(jīng)功能障礙。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK103432574SQ201310372610
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月25日
【發(fā)明者】韓峰, 陶蓉蓉, 陸楠楠, 王歡, 廖美華, 黃繼云, 田允 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)