逃避預(yù)存免疫的重組腺病毒及其構(gòu)建方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于基因治療和疫苗載體的重組腺病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。具體涉及一種易于包裝、免疫水平較高且能很好的避免人體針對5型腺病毒預(yù)存免疫的重組腺病毒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【專利說明】逃避預(yù)存免疫的重組腺病毒及其構(gòu)建方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于基因治療和疫苗載體重組腺病毒及其構(gòu) 建方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 重組腺病毒（recombinant adenovirus, rAd)以攜帶外源基因片段大、滴度高、易 于操作、不會整合到宿主基因組等優(yōu)點成為一種良好的基因治療和疫苗載體。目前，已知的 人腺病毒（Ad)有57種血清型，分為7個亞屬（A-G)，已經(jīng)在基因治療和疫苗載體方面得到 了很多的應(yīng)用，特別是C亞屬的血清2和5型（Ad2和Ad5)已被極其廣泛地應(yīng)用于體外基 因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)接種疫苗和基因治療等各個領(lǐng)域。目前，應(yīng)用最廣的腺病毒載體（adenovirus vector，Adv)是人血清5型腺病毒，它也是當(dāng)前腫瘤基因治療和人類免疫缺陷病毒（HIV)疫 苗的研究的主要病毒載體。另外，諸如乙肝病毒、瘧疾、結(jié)核等病原體的疫苗研制也都十分 重視5型腺病毒載體的應(yīng)用。
[0003] 例如，在基因治療的應(yīng)用方面：2003年10月我國國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA) 正式批準(zhǔn)了世界第一個抗腫瘤基因治療藥物--重組人P53腺病毒注射液(深圳賽百諾基 因公司）上市，隨后在2005年11月，SFDA又批準(zhǔn)了全球首個溶瘤病毒類新藥--重組人5 型腺病毒注射液(上海三維生物技術(shù)有限公司）上市。而在疫苗載體的研究方面：重組5型 腺病毒（rAd5)的強(qiáng)免疫原性也已被大量的臨床前研究所證實。Shiver和Emini (默克公 司)等人在以重組腺病毒類，痘病毒類，甲病毒類，分支桿菌以及質(zhì)粒DNA疫苗均表達(dá)猴免疫 缺陷病毒（SIV)Gag抗原的一些免疫原性比較實驗中，重組5型腺病毒載體引發(fā)了最強(qiáng)抗原 特異的CTL反應(yīng)（Shiver and Emini, 2004;Shiver et al·，2002)。因此艾滋病疫苗的大規(guī) 模臨床研究就使用了 rAd5載體（W001/02607, W002/22080)。
[0004] 然而，重組5型腺病毒（rAd5)應(yīng)用中的一個主要問題是人體針對載體本身存在十 分普遍的預(yù)存免疫，人體內(nèi)較高的針對Ad5的抗體水平會顯著地降低病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 和轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。例如，艾滋病疫苗的臨床研究顯示：預(yù)存免疫的存在使得rAd5疫苗在 小鼠、恒河猴以及人體內(nèi)的免疫原性都顯著地下降。而且，Ad5特異中和抗體在人體內(nèi)的廣 泛存在還有可能導(dǎo)致不相容的和難以預(yù)知的免疫反應(yīng)和毒性（Barouch and Nabel, 2005)， 這就嚴(yán)重限制了重組腺病毒載體的應(yīng)用。然而，相關(guān)的調(diào)查卻顯示：目前西方國家Ad5的血 清陽性率已經(jīng)接近70%，而在非洲的撒哈拉和東南亞的部分地區(qū)有報道顯示Ad5的血清陽 性率甚至高于90%。除了預(yù)存免疫問題，rAd5可以說是一種幾乎完美的基因治療和疫苗載 體。
[0005] 目前嘗試解決Ad5預(yù)存免疫問題的策略主要有以下幾種：①利用新方法來運載 rAd5載體；②從其它人體腺病毒血清型甚至其它動物種屬中開發(fā)新的重組腺病毒載體；③ 對rAd5載體進(jìn)行基因工程改造，這一方法與其他方法相比更安全也更具有應(yīng)用性。該法 方具體是以源于人體安全性較好的人體稀有血清型腺病毒如Ad35、Adll、Ad26、Ad48以及 Ad49等的抗原決定簇基因來替換rAd5載體的相應(yīng)基因以希望獲得既保留rAd5載體的免疫 原性，又帶有稀有腺病毒亞型血清學(xué)性質(zhì)的嵌合型載體（W02006/040330)。Dan H. Barouch 等以替換了人腺病毒血清48型全部7個HVR的rAd5載體表達(dá)SIV的結(jié)構(gòu)蛋白Gag基因。 小鼠和猴子體內(nèi)試驗顯示，在較高水平針對rAd5的預(yù)存免疫條件下，Gag的表達(dá)不被明顯 抑制，其相關(guān)試驗也說明腺病毒中和抗體主要針對六鄰體HVR。然而該載體的包裝效率以及 免疫小鼠產(chǎn)生針對Gag抗體滴度僅約為rAd5的1/3 (Roberts et al.，2006)。
[0006] 如前所述，rAd5載體的應(yīng)用受限于被野生型Ad5感染后人體內(nèi)已經(jīng)存在的較高滴 度的中和抗體水平。盡管病毒外殼上不同的衣殼蛋白均能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體，但實驗顯示 Ad5特異的中和抗體主要針對的是病毒六鄰體蛋白（Sumida et al.，2005)。另外，腺病毒 的免疫是血清型特異的，這就提示我們可以使用在人體內(nèi)感染極低的腺病毒六鄰體來替換 Ad5,從而可以逃避Ad5的預(yù)存免疫。但是六鄰體的替換并不容易，自1998年以來，研究人 員用人其他血清型的腺病毒六鄰體來替換5型腺病毒的相應(yīng)基因，然而由于受株型限制除 與Ad5同亞屬的且人感染率也較高的個別血清型外大多難以成功包裝（Gall，Crystal，and Falck-Pedersen, 1998;Youil et al.，2002)。對六鄰體蛋白更為深入的結(jié)構(gòu)和功能研究發(fā) 現(xiàn)，每個六鄰體是六鄰體蛋白的同源三聚體，有一個五面體的基底和三角形的塔尖，基底包 含Pl和P2兩個區(qū)，塔區(qū)由3個環(huán)構(gòu)成Loopl、Loop2和Loop4。單克隆抗體檢測不同亞型純 化后的六鄰體蛋白表明，在六鄰體表面有許多的抗原決定簇存在于Loopl、L 〇〇p2和L〇〇p4 這幾個環(huán)上。而對15個不同型的腺病毒的六鄰體蛋白的核酸序列研究顯示，基底的PU P2區(qū)是保守的，變化區(qū)主要集中在Loopl、Loop2區(qū)。Loopl、Loop2對應(yīng)1419-1428個氨基 酸，有7個獨特的超變區(qū)（hypervariable region，HVR)，在這7個HVR中，HVR1-HVR6出現(xiàn) 在 Loopl 中，HVR7 在 Loop2 上（Rux and Burnett，2000)。其中，狀!?1、爪^2、爪^4、爪^5和 HVR7中含有中和抗原決定簇的一部分，包括大于99%的六鄰體型特異性殘基。由于這5個 HVR位于Loopl、Loop2,所以Loopl、Loop2會是較好的中和抗原決定簇。Dan H.Barouch等 以人腺病毒血清48型全部7個HVR替換rAd5表達(dá)SIV Gag基因的相關(guān)實驗結(jié)果，就證實 了這一點。然而這種從局部地區(qū)稀有血清型隨意選擇并替換其全部7個HVR的方法仍然面 臨病毒包裝率以及誘發(fā)體液免疫水平不足的問題。
[0007] 因此，目前在該領(lǐng)域仍然需要通過基因工程技術(shù)進(jìn)一步改造腺病毒載體以獲得一 種易于包裝、免疫水平較高且能很好的避免預(yù)存免疫的重組腺病毒載體。本發(fā)明就是為了 滿足此種需求并提供相關(guān)優(yōu)點，這必將有利于腫瘤的基因治療和人類免疫缺陷病毒（HIV)、 結(jié)核、以及瘧疾等引發(fā)的傳播性疾病疫苗的發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種重組腺病毒載體，其特點是能很好的避免針對Ad5載體本身的 預(yù)存免疫，即該載體的免疫原性幾乎不受人體內(nèi)廣泛存在的Ad5中和抗體干擾。同時該載 體包裝水平接近rAd5,并且在具有較高水平針對rAd5的預(yù)存免疫條件下仍然能針對其表 達(dá)的外源基因引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，幾乎與改造前rAd5載體在無預(yù)存免疫條件下的免疫 水平相當(dāng)。本發(fā)明的實現(xiàn)是基于以人體稀有血清型腺病毒如Ad43、Ad37的抗原決定簇基因 替換rAd5的相應(yīng)部分。而用于替換的稀有血清型腺病毒以及替換基因的選擇是基于有利 于改造后病毒載體的包裝和不影響原病毒載體免疫水平考慮的。
[0009] 本發(fā)明提供了一種rAd5載體，為HVR5、7被其他人腺病毒血清型的HVR5、7替換的 rAd5載體，其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。在一個優(yōu)選的實施方案中，提供 了一種rAd5載體，為HVR1-7被其他人腺病毒血清型的HVR1-7替換的rAd5載體，其中所述 其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述載體的Loop4被所述 其他人腺病毒血清型的Loop4的替換。在一個更優(yōu)選的實施方案中，其中所述rAd5載體的 HVR1-7和Loop4的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1-8,所述人腺病毒血清型Ad43的HVR1-7和 Loop4的氨基酸序列為SEQ ID No: 17-24,所述人腺病毒血清型Ad37的HVR1-7和Loop4的 氨基酸序列為SEQ ID No:9-16。
[0010] 本發(fā)明還提供了制備上述rAd5載體的方法。所述方法包括以其他人腺病毒血清 型的HVR5、7替換rAd5載體的HVR5、7,其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。在 一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括以其他人腺病毒血清型的HVR1-7替換rAd5載體的 HVR1-7,其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述 方法還包括還以所述其他人腺病毒血清型的L 〇〇p4替換所述rAd5載體的L〇〇p4。在一個最 優(yōu)選的實施方案中，所述rAd5載體的HVR1-7和L 〇〇p4的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1-8,所 述人腺病毒血清型Ad43的HVRl-7和Loop4的氨基酸序列為SEQIDN0:17-24，所述人腺病 毒血清型Ad37的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列為SEQ ID N0:9-16。
[0011] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明的rAd5載體用于制備疫苗或基因治療藥物的用途。
[0012] 本發(fā)明的載體既保留rAd5載體的強(qiáng)免疫原性，又帶有稀有血清型腺病毒血清學(xué) 性質(zhì)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1.顯示了 Ad37、Ad43和Ad5在中國人群中的中和抗體血清陽性率差異。以496 個中國健康人群的血樣進(jìn)行了抗Ad5、Ad37和Ad43病毒中和活性的檢測。y軸表示的是不 同血清型病毒中和抗體為陽性人群的百分比。
[0014] 圖2.腺病毒載體示意圖和構(gòu)建流程圖。
[0015] 圖3.腺病毒載體克隆及限制性內(nèi)切酶鑒定電泳圖。
[0016] 圖4.包含Ad37和Ad43的HVR1-7和Loop4的腺病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017] 圖5.表達(dá)人類免疫缺陷病毒（HIV) 1型Gag基因的穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及體外表達(dá)示 意圖。
[0018] 圖6.病毒載體包裝示意圖。
[0019] 圖 7. rAd5、Ad5-37HVR(5, 7)、Ad5-37HVRa_7)、Ad5-37HVRU_7) L4、 Ad5-43HVR(5, 7)、Ad5-43HVR(l-7)、Ad5-43HVR(l-7)L4 病毒重組效率對比圖。
[0020] 圖8. IFN-ELISP0T試驗檢測Ad5陰性和陽性小鼠 HIV-IGag特異的CD8 + T淋巴細(xì) 胞反應(yīng)結(jié)果圖。
[0021] 圖 9. rAd5、Ad5-37HVR(l-7)、Ad5-HVR(l-7)L4、Ad5-43HVR(l-7)、Ad5-43HVR(l-7) L4在小鼠體內(nèi)的體液免疫反應(yīng)與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果對比。
[0022] 圖 10. rAd5、Ad5-HVR(l-7)、Ad5-HVR(l-7)L4、Ad5-43HVR(l-7)、Ad5-43HVR(l-7)L4 中和抗體在中國人群血清中的陽性率。

【具體實施方式】
[0023] 本發(fā)明的腺病毒載體高表達(dá)了改造后的中國流行株的人類免疫缺陷病毒（HIV)I 型Gag (gag基因編碼HIV的核心蛋白)基因，以考察載體逃避預(yù)存免疫的能力和免疫水平。 該基因已經(jīng)用于艾滋病疫苗的臨床研究。因此，本發(fā)明的載體特別適合用作疫苗載體，同時 也可以很好地應(yīng)用于基因治療，所以本發(fā)明還提供了本發(fā)明的腺病毒載體用于制備疫苗或 基因治療藥物的用途。
[0024] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理 解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社）或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用 試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0025] 實施例lrAd5載體和表達(dá)人類免疫缺陷病毒（HIV) 1型Gag基因的穿梭質(zhì)粒的構(gòu) 建
[0026] 1)嵌合Ad5骨架質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0027] 第一步是基因合成：Ad5、Ad37和Ad43的DNA和氨基酸序列從GenBank獲得， 它們的HVR1-7和L 〇〇p4的氨基酸序列分別見表1、表2和表3。確定各型別的基因序列 后，根據(jù)克隆需要首先合成了其中相應(yīng)序列被Ad37、Ad43的HVR5和7、HVR1-7和L 〇〇p4 的DNA序列替換的部分Ad5六鄰體序列，即SEQ ID N0:25-30表示的序列（見下文）： Ad5-37HVR(l-7)，為其HVR1-7被Ad37的HVR1-7替換的rAd5載體六鄰體部分序列（SEQ ID NO: 25) ;Ad5_37Loop4,為其Loop4被Ad37的Loop4替換的rAd5載體六鄰體部分序列（SEQ ID NO: 26) ;Ad5-43HVR(l-7)，為其 HVR1-7 被 Ad43 的 HVR1-7 替換的 rAd5 載體六鄰體部分 序列（SEQ ID N0:27) ;Ad5_43Loop4,為其 Loop4 被 Ad43 的 Loop4 替換的 rAd5 載體六鄰體 部分序列（SEQ ID N0:28);Ad5-37HVR(5, 7)，為其 HVR5, 7 被 Ad37 的 HVR5, 7 替換的 rAd5 載 體六鄰體部分序列（SEQ ID NO: 29) ;Ad5-43HVR (5, 7)，為其 HVR5, 7 被 Ad43 的 HVR5, 7 替換 的rAd5載體六鄰體部分序列（SEQ ID NO: 30)。由于任何DNA序列的改變均可能對于病毒 載體的包裝能力產(chǎn)生影響，因此合成了帶有原始載體酶切位點的替換核苷酸序列。上述6 條用于替換的基因序列均由生工生物工程(上海）股份有限公司合成。
[0028] 第二步是中間載體改造，利用pGEM?-TEasy (普洛麥格公司），通過聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)（PCR)刪除其多克隆酶切位點ApaI和AatII，同時引入AscI，獲得中間載體GTeasy。利 用PCRTopo2. 1載體(美國Invitrogen)，PCR刪除HpaI并引入AatII，獲得另一中間載體 GTopoH?？寺∈褂玫南拗菩詢?nèi)切酶均購自于NEB公司。PCR的具體步驟如下
[0029] A)載體改造引物設(shè)計：
[0030] GTeasy ：
[0031] 上游：5, -AGTACTCAACCAAGTCATTCTG-3，（SEQ ID N0:31)
[0032] 下游：5, -CCATGGGGCGCGCCAATTCGCCCTATAGTGAGTC-3'（SEQ ID N0:32)
[0033] GTopoH ：
[0034] 上游：5, -TCTAGAGACGTCAATTCGCCCTATAGTGAGTC-3'（SEQ ID N0:33)
[0035] 下游：5, -AGATCTTGATCCCCTGCG-3'（SEQ ID N0:34)
[0036] B) PCR 反應(yīng)：
[0037] PCR 的反應(yīng)體系（50 μ I):
[0038] 滅菌水：34· 5μ I
[0039] IOXbuffer (美國 Invitrogen 公司）：5 μ I
[0040] MgSO4 (25mM) :2 μ I
[0041] dNTP(各 2mM) :5μ I
[0042] 引物混合物：1. 5 μ I (混合物為：100mM的上游引物I μ l+100mM的下游引物 1 μ 1+8 μ 1滅菌水）
[0043] 模板（pGEM?-TEasy，濃度為 lOng/μ 1 ;或PCRTopo2. 1，濃度為 lOng/ulM μ 1 高 保真Taq酶（美國Invitrogen公司，1單位/ μ 1) :1 μ 1
[0044] PCR反應(yīng)程序：
[0045] 預(yù)變性：94°C, 3min ;
[0046] 3〇個循環(huán)：
[0047] 變性：94°C，30s,
[0048] 退火：54 °C，30s，
[0049] 延伸：72 °C，Imin ;
[0050] 再延伸：72°C，IOmin。
[0051] 第三步是病毒載體構(gòu)建，通過多步克隆構(gòu)建在rAd5載體包含六鄰體區(qū)域的限制 性內(nèi)切酶AscI (載體內(nèi)僅2個該位點）之間替換合成的替換基因，即替換HVR5和7 ;替換 HVR1-7 ;或者替換 HVR1-7 和 Loop4。
[0052] 所述通過多步克隆構(gòu)建的具體步驟如下(參見圖2所示意的質(zhì)粒構(gòu)建流程圖中的 步驟A-F):
[0053] A)原始Ad5骨架質(zhì)粒即AdMax系統(tǒng)的pBHGloxAEl，3Cre質(zhì)粒（購自上海白澤生 物科技有限公司），用AscI單酶切回收9620bp的目的基因片段，同時AscI單酶切GTeasy 載體，回收3157bp目的基因片段，將回收的兩部分片段連接，構(gòu)建質(zhì)粒9620-GTeasy。
[0054] B)將質(zhì)粒 9620-GTeasy 和 GTopoH進(jìn)行 Hindlll/Aatll 雙酶切后，將 9620-GTeasy 質(zhì)粒切出目的片段5620bp和GTopoH片段的3840bp分別進(jìn)行膠DNA瓊脂糖凝膠回收、連接、 轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒得到5620-GTopoH。該質(zhì)粒是構(gòu)建過程中非常重要的一個中間過渡質(zhì)粒，在 此基礎(chǔ)上分別替換上述步驟一中合成的其中相應(yīng)序列被Ad37和43型的HVR5和7 ;HVRl-7 ; L〇〇p4的DNA序列替換的部分Ad5六鄰體序列。
[0055] C)利用ApaI和HpaI將合成的其中相應(yīng)序列被Ad37和43型的HVR5和7 ;HVRl-7 的DNA序列替換的部分Ad5六鄰體序列（即SEQIDN0:25、SEQIDN0:27、SEQIDN0:29或 SEQ ID NO: 30)替換5620-GTopoH中的相應(yīng)序列。對于得到的產(chǎn)物，分別以AatII和HindIII 進(jìn)行單酶切鑒定，切成線性條帶，電泳出現(xiàn)在約9620bp處；同時HpaI和HindIII雙酶切鑒 定，得到出現(xiàn)在約2243bp和7377bp處電泳條帶，證明此單克隆為陽性克隆。
[0056] D)用NheI和BamHI雙酶切將其中相應(yīng)序列被Ad37或43型的Loop4的DNA序列替 換的部分Ad5六鄰體序列（即SEQ ID N0:26或SEQ ID N0:28)替換至上述步驟C)中得到的 含相應(yīng)HVR (1-7)的DNA序列的N5620-GTopoH，構(gòu)建出替換了 Loop4基因的NL5620-GTopoH。
[0057] E)在構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒上，用Hindlll/Aatll雙酶切NL5620-GTopoH回收 5620bp的目的片段，再與質(zhì)粒9620-GTeasy回收的約8000bp的目的條帶進(jìn)一步連接，構(gòu)建 完成基因替換的質(zhì)粒N9620-GTeasy。
[0058] F)在質(zhì)粒 N9620_GTeasy 的基礎(chǔ)上，AscI 單酶切質(zhì)粒 N9620_GTeasy 回收 9620bp 的片段，同時AscI單酶切原始質(zhì)粒pBHGlox Λ El，3Cre，將這兩部分進(jìn)行連接以獲得目的質(zhì) 粒。
[0059] 通過以上步驟可實現(xiàn)在Ad5骨架載體中替換了 Ad37和Ad43的HVR5和7 ; HVR1-7 ;或者 HVR1-7 和 Loop4 的，分別命名為 pAd5-37HVR(5, 7)、pAd5-37HVR(l-7)、 pAd5-37HVR(l-7)L4、pAd5-43HVR(5, 7)、pAd5-43HVR(l-7)、pAd5-43HVR(l-7) L4。其中，pAd5-37HVR(5, 7)是指其HVR5和7被Ad37的HVR5和7替換的Ad5骨 架載體；pAd5-37HVR(l-7)是指其HVR1-7被Ad37的HVR1-7替換的Ad5骨架載體； pAd5-37HVR(l-7) L4 是指其 HVR1-7 和 Loop4 被 Ad37 的 HVR1-7 和 Loop4 替換的 Ad5 骨 架載體；pAd5-43HVR(5, 7)是指其HVR5和7被Ad43的HVR5和7替換的Ad5骨架載體； pAd5-43HVR(l-7)是指其 HVR1-7 被Ad43 的 HVR1-7 替換的 Ad5 骨架載體；pAd5-43HVR(l-7) L4是指其HVR1-7和Loop4被Ad43的HVR1-7和Loop4替換的Ad5骨架載體。
[0060] 第四步是上述重組腺病毒載體的驗證。由于骨架質(zhì)粒沒有進(jìn)行回收純化，又是單 酶切，可能導(dǎo)致骨架質(zhì)粒自連，或者目的片段連接出現(xiàn)反向結(jié)果，這就需要大量提取質(zhì)粒 DNA，全方位系統(tǒng)鑒定。以替換了 Ad37HVR(l-7)的質(zhì)粒為例，結(jié)果如圖3所示，具體步驟如 下：
[0061] A)電泳實驗：以原始Ad5骨架載體為對照進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在1%的凝膠、125V 電壓電泳30分鐘后，正確大小的質(zhì)粒條帶位于在Ikb DNA Marker (NEB公司）最高條帶之 上。
[0062] B)酶切鑒定：在電泳鑒定質(zhì)粒大小后，先用HindIII單酶切鑒定質(zhì)粒完整性， 根據(jù)質(zhì)粒序列圖譜，HindIII酶切后電泳會產(chǎn)生大小約1200bp、2500bp、3100bp、4000bp、 5000bp、8000bp的六條帶；再以BglII單酶切鑒定質(zhì)粒的方向性，若是正向質(zhì)粒有4000bp、 5000bp、6000bp三條帶，若是反向替換，則只有5000bp -條帶；還要用KpnI等酶切鑒定合 成基因是否成功替換到該質(zhì)粒。通過上述幾種酶切鑒定，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確。
[0063] OPCR鑒定：酶切鑒定正確后，對目的質(zhì)粒再進(jìn)行PCR鑒定，分別用Ad5和Ad37的 HVR引物及L〇〇p4引物，PCR改造的質(zhì)粒和原始骨架Ad5質(zhì)粒，分別獲得相應(yīng)的特異目的條 帶說明質(zhì)粒替換成功。
[0064] D)測序鑒定：獲得的質(zhì)粒經(jīng)過PCR和酶切鑒定正確后，我們又設(shè)計引物對改造的 區(qū)域以及對于病毒包裝和復(fù)制的關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行測序鑒定?？寺『Y選的質(zhì)粒測序結(jié)果經(jīng)計算 機(jī)軟件Vector NTI分析正確無誤后，即可用于后面病毒包裝實驗。
[0065] 引物設(shè)計以及目的如下：
[0066] Asc-PVII鑒定以AscI連接的方向是否正確
[0067] 5' -GCCTTCAACTCATCCGCCA-3' （SEQ ID N0:35)
[0068] JD-HVR鑒定是否序列是否替換成功
[0069] 5, -AAGGGTGCCCCAAATCCT-3' （SEQ ID N0:36)
[0070] ITR-34054鑒定包裝信號區(qū)域是否完整
[0071] 5, -CATCGGTCAGTGCTAAAAAG-3' （SEQ ID N0:37)
[0072] 100K-25443鑒定病毒裝配關(guān)鍵蛋白是否缺失或突變
[0073] 5, -GATCATGGAGTCAGTCGAGA-3' （SEQ ID N0:38)
[0074] 33K-27577鑒定病毒復(fù)制調(diào)控蛋白是否缺失或突變
[0075] 5' -AGGATGGCACCCAAAAAG-3， （SEQ ID N0:39)
[0076] Knob-5鑒定病毒結(jié)構(gòu)蛋白是否缺失或突變
[0077] 5' -TCGGTCAGTGCTAGTCGA-3' （SEQ ID N0:40)
[0078] 表I. Ad5的HVR1-7和Loop4氨基酸序列。
[0079]

【權(quán)利要求】
1. 一種構(gòu)建重組腺病毒的方法，所述方法包括以其他人腺病毒血清型的HVR5、7替換 rAd5載體的HVR5、7,其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。
2. -種構(gòu)建重組腺病毒的方法，所述方法包括以其他人腺病毒血清型的HVR1-7替換 rAd5載體的HVR1-7,其中所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，還包括還以所述其他人腺病毒血清型的L〇〇p4替換所述 rAd5 載體的 Loop4。
4. 權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述rAd5載體的HVR1-7和L〇〇p4的氨基酸序列 為560 10勵：1-8，所述人腺病毒血清型4(143的爪^1-7和1〇〇?4的氨基酸序列為3￡0 10 NO: 17-24,所述人腺病毒血清型Ad37的HVR1-7和Loop4的氨基酸序列為SEQ ID N0:9-16。
5. -種rAd5載體，為HVR5、7被其他人腺病毒血清型的HVR5、7替換的rAd5載體，其中 所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。
6. -種rAd5載體，為HVR1-7被其他人腺病毒血清型的HVR1-7替換的rAd5載體，其中 所述其他人腺病毒血清型是Ad43或Ad37。
7. 權(quán)利要求5或6的rAd5載體，所述載體的L〇〇p4被所述其他人腺病毒血清型的 Loop4的替換。
8. 權(quán)利要求5-7任一項的rAd5載體，其中所述rAd5載體的HVR1-7和Loop4的氨基 酸序列為SEQ ID NO: 1-8,所述人腺病毒血清型Ad43的HVR1-7和L〇〇p4的氨基酸序列為 5￡0 10勵：17-24，所述人腺病毒血清型八(137的爪^1-7和1〇〇?4的氨基酸序列為3￡0 10 N0:9-16。
9. 權(quán)利要求5-8任一項的rAd5載體用于制備疫苗或基因治療藥物的用途。
【文檔編號】C12N15/74GK104419717SQ201310372658
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月23日
【發(fā)明者】于彬, 孔維, 于湘暉, 王真, 吳昊, 王儲 申請人:長春百克生物科技股份公司, 吉林大學(xué)