新型等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)(imsa)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及到一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，即等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)(IMSA)。該技術(shù)無(wú)需熱循環(huán)儀器，在等溫條件和單一功能性酶作用下即可實(shí)現(xiàn)對(duì)病原基因的擴(kuò)增。等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)(IMSA)的結(jié)果判定可通過觀察副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀、于擴(kuò)增前或后加入顯色劑觀察顏色變化等簡(jiǎn)單措施實(shí)現(xiàn)。其最大特點(diǎn)是，在擴(kuò)增過程中會(huì)產(chǎn)生多倍數(shù)的能自我配對(duì)繼而引發(fā)循環(huán)擴(kuò)增的寡核苷酸結(jié)構(gòu)，使得隨后循環(huán)擴(kuò)增引發(fā)幾率明顯增加，繼而使得擴(kuò)增效率和檢測(cè)靈敏度提升。于此，基于等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)(IMSA)我們建立了對(duì)手足口病病原柯薩奇病毒A16型(CVA16)和人腸道病毒EV71型(EV71)的VP1基因的檢測(cè)，以及對(duì)人甲型H7N9流感病毒的HA基因的快速檢測(cè)方法。該發(fā)明可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速、高靈敏性高特異性檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】新型等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)（IMSA)

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及到一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其主要特點(diǎn)是在等溫條件下擴(kuò)增過 程中會(huì)產(chǎn)生多倍數(shù)的能自我配對(duì)繼而引發(fā)循環(huán)擴(kuò)增的特殊核苷酸結(jié)構(gòu)。本發(fā)明能夠被應(yīng)用 于病原基因的快速、高靈敏性和高特異性檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病病原現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

【背景技術(shù)】：
[0002] 近幾十年來(lái)，核酸擴(kuò)增技術(shù)為分子生物研究和病原微生物檢測(cè)做出了革命性的貢 獻(xiàn)。到目前為主，核酸擴(kuò)增技術(shù)主要基于兩種策略：一種是通過具備熱循環(huán)儀器實(shí)現(xiàn)升溫降 溫來(lái)完成模板核酸解鏈、引物退火結(jié)合模板以及隨后引物延伸的三個(gè)過程；另一種是在等 溫條件和特殊功能性酶作用下完成前述三個(gè)過程。
[0003] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)就是典型的基于熱循環(huán)的核酸分子擴(kuò)增技術(shù)。隨著PCR的 不斷發(fā)展，其許多相關(guān)性的改進(jìn)技術(shù)也不斷被開發(fā)出來(lái)，如多重PCR、巢式PCR、實(shí)時(shí)PCR及 逆轉(zhuǎn)錄PCR等。PCR技術(shù)雖然被廣泛采用并作為分子診斷的標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)，但是在現(xiàn)場(chǎng)和床 旁檢測(cè)（POCT)中卻受到限制，這與它本身無(wú)法逾越的缺陷有關(guān)。一方面，PCR必須依賴不易 攜帶的熱循環(huán)儀器；另一方面，對(duì)于PCR結(jié)果處理操作過于繁冗。此外，在擴(kuò)增時(shí)間上PCR 難以滿足快速的需求。而等溫技術(shù)卻能在POCT上發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。等溫技術(shù)可以在簡(jiǎn)單的 恒溫裝置如水浴鍋中實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，且同PCR比，其能在短時(shí)間達(dá)到同等擴(kuò)增效果或具備更高 的檢測(cè)線水平。但是，考慮到成本和穩(wěn)健性因素，并不是所有的等溫技術(shù)都具備POCT應(yīng)用 價(jià)值，如鏈置換擴(kuò)增（SDA)和等溫嵌合引物引發(fā)核酸擴(kuò)增（ICAN)等。這兩種等溫技術(shù)需要 至少兩種以上的特殊功能性酶，而且擴(kuò)增不穩(wěn)健，需要繁瑣的體系優(yōu)化。因此，快速、靈敏、 有成本效益的穩(wěn)健性等溫技術(shù)才是POCT真正的需求。
[0004] 基于此，我們發(fā)明了一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，即等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增 (isothermal multiple self-matching-initiated amplification, IMSA)。該發(fā)明是從一 種高特異性、一管式密閉巢式PCR即聚合酶鏈置換反應(yīng)（PCDR)技術(shù)中得到啟發(fā)。雖然PCDR 具備快速檢測(cè)性，但其同普通PCR-樣在POCT應(yīng)用上受到阻礙。于此，在MSA技術(shù)中，我 們將PCDR技術(shù)中的四條引物（內(nèi)外各一對(duì)）進(jìn)行了特殊的改變，引入四條混合式具備自我 配對(duì)功能的引物，使得其不需要熱循環(huán)儀器，在等溫條件和單一功能性酶下，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)病 原基因的快速、高靈敏、高特異擴(kuò)增。在結(jié)果判定上，MSA能夠通過觀察副產(chǎn)物焦磷酸鎂 白色沉淀、于擴(kuò)增前或后加入顯色劑觀察顏色變化等簡(jiǎn)單措施進(jìn)行判定。頂SA技術(shù)最大特 點(diǎn)就是，在等溫核酸擴(kuò)增過程中會(huì)產(chǎn)生多倍數(shù)的能自我配對(duì)繼而引發(fā)循環(huán)擴(kuò)增的特殊核苷 酸結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)的大量產(chǎn)生富集，使得隨后循環(huán)擴(kuò)增引發(fā)幾率明顯增加，繼而使得擴(kuò)增效 率增加，最終使得檢測(cè)靈敏度提升。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 1.本發(fā)明主要是介紹一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，是對(duì)目前核酸分子檢測(cè)技術(shù) 手段的改進(jìn)和補(bǔ)充，具有簡(jiǎn)單、快速、高靈敏性高特異性的優(yōu)勢(shì)。圖1所示，為MSA技術(shù)中 相關(guān)引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)和組合。在頂SA中一共有六條引物，四條混合式引物（DsF、DsR、FIT 和RIT)和兩條非混合式引物（SteR和SteF)。六條引物由目的基因片段上的七個(gè)位點(diǎn)組 成，如圖1所示沖3、？2、？1、1\1?1、1?2和1?3。引物〇8?由？1(3的的互補(bǔ)序列，下同）和卩3 組成，DsR由Rlc和R3組成，F(xiàn)IT由Tc和F2組成，RIT由T和R2組成，SteR即位點(diǎn)Flc， SteF即位點(diǎn)Rlc。在Bst DNA聚合酶作用和等溫條件下（60?65°C )，上述的四條混合式 引物可產(chǎn)生四種原始自我配對(duì)結(jié)構(gòu)，如圖2所示。在隨后的引發(fā)循環(huán)擴(kuò)增過程中，四條混合 式引物可基于該四種結(jié)構(gòu)產(chǎn)生多倍數(shù)的能自我配對(duì)并不斷引發(fā)循環(huán)擴(kuò)增的自我配對(duì)結(jié)構(gòu)， 從而決定了擴(kuò)增反應(yīng)的高靈敏性和高特異性；同時(shí)，擴(kuò)增中引入兩條非混合式引物，可反應(yīng) 明顯加速。針對(duì)RNA病毒的檢測(cè)，可以通過添加逆轉(zhuǎn)錄酶，建立逆轉(zhuǎn)錄等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增 (RT-IMSA)來(lái)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。
[0006] MSA檢測(cè)技術(shù)特點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。首先，檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高。整 個(gè)檢測(cè)時(shí)間可縮短至1小時(shí)內(nèi)，檢測(cè)靈敏度可與實(shí)時(shí)熒光定量PCR媲美。其次，檢測(cè)特異性 高。所設(shè)計(jì)的六條特異性引物，只在其與識(shí)別靶序列中七個(gè)結(jié)合區(qū)完全匹配的情況下擴(kuò)增 才能順利進(jìn)行。再則，所有的擴(kuò)增過程都可在60?65°C等溫下完成，無(wú)需PCR儀，降低了對(duì) 實(shí)驗(yàn)硬件的要求。最后，污染機(jī)會(huì)低和結(jié)果可視化。
[0007] 2.基于頂SA技術(shù)建立了對(duì)手足口病病原柯薩奇病毒A16型（CVA16)和人腸 道病毒EV71型（EV71)的VPl基因的快速檢測(cè)方法。選擇CVA16(GenBank accession no. GQ279371. 1)和 EV71 (GenBank accession no. GQ279370.1))VP1 基因區(qū)域分別進(jìn)行 CVA16-MSA和EV71-MSA的引物設(shè)計(jì)，包括四條混合式引物（DsF、DsR、FIT和RIT)和兩條 非混合式引物（SteR和SteF)。所有引物的具體序列見表1和表2。
[0008] 表I = RT-MSA檢測(cè)柯薩奇病毒A16型VPl基因的引物序列
[0009]

【權(quán)利要求】
1. 一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，即等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增（isothermal multiple self-matching-initiated amplification, IMSA)，可應(yīng)用于病原基因的快速、高靈敏性和 高特異性檢測(cè)。其中包括：（1)MSA檢測(cè)技術(shù)的引物設(shè)計(jì)，及其對(duì)應(yīng)靶序列位點(diǎn)的組合。四 條混合式引物（DsF、DsR、FIT和RIT)和兩條非混合式引物（SteR和SteF)。六條引物由 目的基因片段上的七個(gè)位點(diǎn)組成$3、？241、1\1?1、1?2和1?3)。引物0逆由？1(^1的互補(bǔ) 序列，下同）和F3組成，DsR由Rlc和R3組成，F(xiàn)IT由Tc和F2組成，RIT由T和R2組成， SteR即位點(diǎn)Flc，SteF即位點(diǎn)Rlc。（2)MSA檢測(cè)技術(shù)的引物比例組合為DsF / DsR:FIT / RIT:SteR/ SteF=l:4:8。（3)基于頂SA技術(shù)建立了對(duì)手足口病病原柯薩奇病毒A16型 (CVA16)和人腸道病毒EV71型（EV71)的VP1基因的檢測(cè)，以及對(duì)人甲型H7N9流感病毒的 HA基因的快速檢測(cè)方法。含每種病原IMSA檢測(cè)方法所用的6條寡核苷酸引物。（4)HNB(羥 基萘酚藍(lán)）染料及其改良染料（GeneFinder?與HNB的混合染料）。
2. 權(quán)利要求1所述的IMSA檢測(cè)技術(shù)的引物設(shè)計(jì)和其對(duì)應(yīng)靶序列位點(diǎn)的組合，包括應(yīng)用 IMSA技術(shù)所開發(fā)的其他病原的檢測(cè)試劑盒。
3. 權(quán)利要求1所述的MSA檢測(cè)技術(shù)的引物比例組合為DsF / DsR:FIT / RIT:SteR / SteF=l:4 :8 或DsF / DsR :FIT / RIT=1 :4。
4. 權(quán)利要求1所述的手足口病病原柯薩奇病毒A16型（CVA16)和人腸道病毒EV71型 (EV71)，及人甲型H7N9流感病毒檢測(cè)的逆轉(zhuǎn)錄等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)（RT-MSA)的引 物，包括表1、表2和表3所列的基因序列及其每種序列的互補(bǔ)序列或變體。
5. 權(quán)利要求1所述的CVA16、EV71和人甲型H7N9流感病毒檢測(cè)的逆轉(zhuǎn)錄等溫多自配 引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)（RT-MSA)，包括CVA16、EV71和人甲型H7N9流感病毒及其變異株。
6. 權(quán)利要求5所述的本發(fā)明的應(yīng)用范圍包括各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，流感檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí) 驗(yàn)室，哨點(diǎn)醫(yī)院用于CVA16、EV71和人甲型H7N9流感病毒檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。
7. 權(quán)利要求1所述的CVA16、EV71和人甲型H7N9流感病毒的基于HNB(羥基萘酚藍(lán)） 染料及其改良染料（GeneFinder?與HNB的混合染料）肉眼可視化顏色的逆轉(zhuǎn)錄等溫多自 配引發(fā)擴(kuò)增技（RT-IMSA)的反應(yīng)程序和檢測(cè)程序。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104388581SQ201310370202
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2013年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月23日
【發(fā)明者】馬學(xué)軍, 丁雄, 聶凱, 許文波, 石磊 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所