一組人類心肌細(xì)胞的新型分子標(biāo)記物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一組人類心肌細(xì)胞的新型分子標(biāo)記物及其應(yīng)用。該組標(biāo)記物由如下29種基因組成：POPDC2、ALPK2、TRIM55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX、NRK、ABLIM1、SYNPO2L、ANKRD1、TNNI1、MYH6、ABRA、TPM1、C15orf52、MYOM1、MASP1、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2。本發(fā)明的標(biāo)記物在心肌細(xì)胞的篩選和鑒定上具有重要作用，并且在人類心臟早期發(fā)育研究、心臟疾病模型構(gòu)建、心臟疾病的治療以及心臟疾病藥物靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)或藥物研發(fā)中都具有潛在的作用與極大的意義。
【專利說(shuō)明】—組人類心肌細(xì)胞的新型分子標(biāo)記物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一組人類心肌細(xì)胞的新型分子標(biāo)記物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]心臟病是威脅人類健康的殺手，毎年都有上千萬(wàn)人因罹患各類心臟疾病失去生命，給家庭和公共衛(wèi)生事業(yè)帶來(lái)了極大的壓カ和負(fù)擔(dān)。無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，心臟病的發(fā)病率和病死率都居高不下，然而面對(duì)如此嚴(yán)峻的考驗(yàn)，目前心臟疾病的治療卻不容樂(lè)觀，藥物治療停留在緩解癥狀的階段，手術(shù)治療如搭橋手術(shù)等開(kāi)支較大且存在一定的風(fēng)險(xiǎn)和可能的副作用，介入治療也仍處于探索階段，鮮有標(biāo)本兼治的治療方法問(wèn)世。究其原因，很大一方面是人類對(duì)心臟以及心臟疾病認(rèn)識(shí)的不足。心臟疾病的病因追根溯源是心肌細(xì)胞的缺失或功能的紊亂。因而未來(lái)根治心臟疾病的ー個(gè)思路便是研究心臟病的分子致病機(jī)理，尋找影響心臟纖維化或者心肌細(xì)胞增殖的決定性因子，實(shí)現(xiàn)對(duì)紊亂的心肌細(xì)胞進(jìn)行人為調(diào)控使其恢復(fù)正常功能的目的(I)。
[0003]近年來(lái)，隨著誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(inducedPluripotency Stem Cells, iPSCs)技術(shù)的產(chǎn)生，人們能夠在體外獲得iPSCs并分化為病人特異的心肌細(xì)胞，通過(guò)基因矯正或其他手段得到“健康”的病人來(lái)源的心肌細(xì)胞(I);利用轉(zhuǎn)分化(transdifferentiation)技術(shù)可以不經(jīng)過(guò)iPSCs過(guò)程由其他便于獲得的細(xì)胞類型直接獲得心肌細(xì)胞(2)，這些技術(shù)的發(fā)展為將來(lái)實(shí)現(xiàn)在病人體內(nèi)的細(xì)胞移植治療提供了可能。
[0004]1.Mordwinkin NMj Burridge PWj Wu JC.2013.A review of humanpluripotent stem celI`—derived cardiomyocytes for high-throughput drugdiscovery, cardiotoxicity screening,and publication standards.Journal ofcardiovascular translational research6:22-30.[0005]2.Wada R, Muraoka N, Inagawa K, Yamakawa H, Miyamoto K, Sadahiro T, UmeiT，Kaneda R, Suzuki T, Kamiya K, Tohyama S，Yuasa S，Kokaji K，Aeba R，Yozu R，YamagishiH，Kitamura T，F(xiàn)ukuda K，Ieda M.2013.1nduction of human cardiomyocyte-like cellsfrom fibroblasts by defined factors.Proceedings of the National Academy ofSciencesllO:12667-12672.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一組人類心肌細(xì)胞的新型分子標(biāo)記物及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供的一組用于鑒定或輔助鑒定人類心肌細(xì)胞的標(biāo)記物，由如下29種基因組成:P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIPl、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB, LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX, NRK、ABLIMU SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MY0M1、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC, F2RL2。
[0008]所述29種基因滿足如下條件:與人類胚胎多能干細(xì)胞和/或人類神經(jīng)干細(xì)胞相比，在人類心肌細(xì)胞中該29種基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平均顯著降低、且在人類心肌細(xì)胞中該29種基因的mRNA表達(dá)量均顯著提高。
[0009]上述標(biāo)記物中，所述該29種基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平均顯著降低是指在人類心肌細(xì)胞中每種基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化的量均比人類胚胎多能干細(xì)胞和/或人類神經(jīng)干細(xì)胞中相同基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化的量降低5%以上。
[0010]所述該29種基因的mRNA表達(dá)量均顯著提高是指在人類心肌細(xì)胞中每種基因的mRNA表達(dá)量均是人類胚胎多能干細(xì)胞和/或人類神經(jīng)干細(xì)胞中相同基因mRNA表達(dá)量的2倍以上。
[0011]上述任一所述標(biāo)記物在鑒定人心肌細(xì)胞中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]上述應(yīng)用中，所述應(yīng)用為非疾病治療或診斷方法。
[0013]上述任一所述標(biāo)記物在制備、開(kāi)發(fā)或設(shè)計(jì)鑒定人心肌細(xì)胞的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014]上述任一所述標(biāo)記物在從人心肌細(xì)胞、人胚胎多能干細(xì)胞和人神經(jīng)干細(xì)胞中鑒定出人心肌細(xì)胞中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015]上述任一所述標(biāo)記物在從人心肌細(xì)胞和人胚胎多能干細(xì)胞中鑒定出人心肌細(xì)胞中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016]上述任一所述標(biāo)記物在制備、開(kāi)發(fā)或設(shè)計(jì)具有如下功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬 于本發(fā)明的保護(hù)范圍:從人心肌細(xì)胞、人胚胎多能干細(xì)胞和人神經(jīng)干細(xì)胞中鑒定出人心肌細(xì)胞。
[0017]上述任一所述標(biāo)記物在制備、開(kāi)發(fā)或設(shè)計(jì)具有如下功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:從人心肌細(xì)胞和人胚胎多能干細(xì)胞中鑒定出人心肌細(xì)胞。
[0018]上述任一所述的應(yīng)用中，所述人心肌細(xì)胞是由所述人胚胎多能干細(xì)胞分化而來(lái)的；所述人神經(jīng)干細(xì)胞是由所述人胚胎多能干細(xì)胞分化而來(lái)的。
[0019]檢測(cè)29種基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平的物質(zhì)和檢測(cè)29種基因的mRNA表達(dá)量的物質(zhì)在制備鑒定人類心肌細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]所述29 種基因?yàn)?P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIPU HSPB7、NPPA, KBTBD10,MYL4、CRYAB、LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX,NRK,ABLIMl、SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC, F2RL2。
[0021]檢測(cè)29種基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平的物質(zhì)和檢測(cè)29種基因的mRNA表達(dá)量的物質(zhì)在制備具有如下功能的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:從人心肌細(xì)胞、人胚胎多能干細(xì)胞和人神經(jīng)干細(xì)胞中鑒定出人心肌細(xì)胞。
[0022]所述29 種基因?yàn)?P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIPU HSPB7、NPPA, KBTBD10,MYL4、CRYAB、LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX,NRK,ABLIMl、SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC, F2RL2。
[0023]檢測(cè)29種基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平的物質(zhì)和檢測(cè)29種基因的mRNA表達(dá)量的物質(zhì)在制備具有如下功能的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:從人心肌細(xì)胞和人胚胎多能干細(xì)胞中鑒定出人心肌細(xì)胞。
[0024]所述29 種基因?yàn)?P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIPU HSPB7、NPPA, KBTBD10,MYL4、CRYAB、LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX,NRK,ABLIMl、SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC, F2RL2。
[0025]上述任一所述應(yīng)用中，所述人心肌細(xì)胞是由所述人胚胎多能干細(xì)胞分化而來(lái)的；所述人神經(jīng)干細(xì)胞是由所述人胚胎多能干細(xì)胞分化而來(lái)的。
[0026]上述任一所述應(yīng)用中，所述由人胚胎多能干細(xì)胞分化而來(lái)的人心肌細(xì)胞中和所述由人胚胎多能干細(xì)胞分化而來(lái)的人神經(jīng)干細(xì)胞中，所述人胚胎多能干細(xì)胞為同一株系的人胚胎多能干細(xì)胞。
[0027]由于H9-ESC，H9-NSC及H9-CM具有完全相同的基因型與遺傳背景，將H9-ESC或H9-NSC作為對(duì)照，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組及全基因組DNA甲基化分析具有嚴(yán)格的無(wú)偏見(jiàn)性。通過(guò)大規(guī)模比較H9-ESC，H9-NSC及H9-CM的基因表達(dá)譜和全基因組DNA甲基化譜，篩選出29種新型分子標(biāo)記物。本發(fā)明涉及的新型分子標(biāo)記物在心肌細(xì)胞的篩選和鑒定上具有重要作用，并且在心臟疾病模型構(gòu)建、心臟疾病的治療以及心臟疾病藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)或藥物研發(fā)中都具有潛在的作用與極大的意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為人類心肌細(xì)胞的鑒定。
[0029]圖2為人類胚胎多能干細(xì)胞、人類神經(jīng)干細(xì)胞和人類心肌細(xì)胞基因表達(dá)熱圖以及qPCR驗(yàn)證。
[0030]圖3為人類胚胎多能干細(xì)胞、人類神經(jīng)干細(xì)胞和人類心肌細(xì)胞中全基因組啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平熱圖。
[0031]圖4為編碼心肌結(jié)構(gòu)蛋白與心臟轉(zhuǎn)錄因子的基因的DNA去甲基化與基因表達(dá)水平正相關(guān)性分析。
[0032]圖5為雙核心穩(wěn)定調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
[0033]圖6為功能相關(guān)性 網(wǎng)絡(luò)分析。
[0034]圖7為基因-疾病網(wǎng)絡(luò)分析。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0036]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0037]人類胚胎多能干細(xì)胞系H9購(gòu)自美國(guó)WiCell Research Institute,貨號(hào)為WA09(H9)-DL-7 ；
[0038]絲裂霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為M0503 ；
[0039]小鼠胚胎成纖維細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，貨號(hào)為PMEF-CFL ；
[0040]細(xì)胞外基質(zhì)(qualified-Matrigel)購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences,貨號(hào)為 354277 ；
[0041]DMEM/F12 培養(yǎng)基購(gòu)自 Invitrogen 公司，貨號(hào)為 11320-033 ；
[0042]⑶F12培養(yǎng)基配方如下:
[0043]DMEM/F12(購(gòu)自 Invitrogen，貨號(hào)為 11320-033)、0.1mM 非必需氨基酸(購(gòu)自 Invitrogen,貨號(hào)為 11140-050) >ImM GlutaMAXTM ニ妝(購(gòu)自 Invitrogen,貨號(hào)為35050-061)、20%Knockout 血清替代物(購(gòu)自 Invitrogen，貨號(hào)為 N10828-028)、1% 青霉素/鏈霉素(購(gòu)自Invitrogen,貨號(hào)為15070-063)、55 y M 0 -巰基こ酉享(購(gòu)自Invitrogen,貨號(hào)為 21985-023)和 10ng/ml Human FGF2 (購(gòu)自 Joint Protein Central)；
[0044]RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自 Invitrogen 公司，貨號(hào)為 11875119 ；[0045]B27添加劑購(gòu)自Invitrogen公司，貨號(hào)為0080085SA ；
[0046]B27 (不含 Insulin)添加劑購(gòu)自 Invitrogen 公司，貨號(hào)為 0050129SA ；
[0047]mTeSR 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) StemCell Technologies ；
[0048]ROCK 抑制劑 Y-27632 購(gòu)自 Sigma-Aldrich，貨號(hào)為 Y0503 ；
[0049]CHIR99021 購(gòu)自 Selleck ；
[0050]Wnt 抑制劑 IWP4 購(gòu)自 Stemgent ；
[0051]Triton X-100 購(gòu)自 Sigma，貨號(hào) T-8787 ；
[0052]鼠抗cTnT 購(gòu)自 Lab Vision ；
[0053]鼠抗 MF2O 購(gòu)自 Developmental Studies Hybridoma Bank ；
[0054]兔抗MLC2v 購(gòu)自 ProteinTech Group ；
[0055]鼠抗 a-Actinin 購(gòu)自 Sigma-Aldrich ;
[0056]ニ抗 Alex Fluor488goat ant1-mouse IgG 購(gòu)自 Life Technologies ；
[0057]ニ抗 Alex Fluor568goat ant1-rabbit IgG 購(gòu)自 Life Technologies ；
[0058]人類胚胎多能干細(xì)胞系H9來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞(hNSCs)及分化方案在文獻(xiàn)“LiuGH, Qu J, Suzuki K，Nivet E, Li M, Montserrat N，Yi F，Xu X，Ruiz S，Zhang W, WagnerU, Kim A, Ren B, Li Y,Goebl` A, Kim J, Soligalla RD, Dubova I, Thompson J,YatesJ, 3rd, Esteban CR, Sancho-Martinez I, Izpisua Belmonte JC.2012.Progressivedegeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2.Nature491:603-607.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所獲得人類胚胎多能干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞(hNSCs)；
[0059]RNeasy Mini Kit 購(gòu)自 QIAGEN ；
[0060]AffymetrixGeneCnipPrimeView Human Gene Expression Arrays 購(gòu)自Affymetrix,貨號(hào)為 901837。
[0061]實(shí)施例1、人類胚胎多能干細(xì)胞的培養(yǎng)
[0062]將人類胚胎多能干細(xì)胞系H9利用如下方法進(jìn)行培養(yǎng):
[0063]一、將H9細(xì)胞接種至預(yù)先培養(yǎng)了經(jīng)過(guò)絲裂霉素滅活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)板中，使用人類多能干細(xì)胞培養(yǎng)基(CDF12培養(yǎng)基)與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)。
[0064]ニ、用DMEM/F12培養(yǎng)基將細(xì)胞外基質(zhì)稀釋至體積分?jǐn)?shù)為1%的濃度，并用稀釋后的細(xì)胞外基質(zhì)包被培養(yǎng)板。
[0065]三、將步驟一培養(yǎng)的H9細(xì)胞接種至預(yù)先用體積分?jǐn)?shù)為1%的細(xì)胞外基質(zhì)包被的培養(yǎng)板中，使用mTeSR培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0066]實(shí)施例2、人類胚胎多能干細(xì)胞向人類心肌細(xì)胞分化
[0067]人類胚胎多能干細(xì)胞系H9向人類心肌細(xì)胞分化方案基于Palecek方案(Lian X,Hsiao C, WiIson G,Zhu K，Hazeltine LB, Azarin SM, Raval KK, ZhangJ，Kamp TJ,PaleceK SP.2012.Robust cardiomyocyte differentiation from humanpluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerical09:E1848-1857.)進(jìn)行改進(jìn)，改進(jìn)后的方案進(jìn)ー步提高了人類心肌細(xì)胞的純度，該方案的具體步驟如下:[0068]一、用DMEM/F12培養(yǎng)基將細(xì)胞外基質(zhì)稀釋至體積分?jǐn)?shù)為1%的濃度，用稀釋后的細(xì)胞外基質(zhì)包被培養(yǎng)板。
[0069]ニ、將人類胚胎多能干細(xì)胞系H9消化為單細(xì)胞懸液，以IO5個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種到經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為1%的細(xì)胞外基質(zhì)包被的培養(yǎng)板中，添加含有10 ii M ROCK抑制劑Y-27632的mTeSR培養(yǎng)基。37°C、5% ニ氧化碳條件下培養(yǎng)24小時(shí)，然后改用mTeSR培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
[0070]三、起始心肌細(xì)胞的分化。
[0071](一)在第I天換用含有12ii M CHIR99021的RPMI/B27_insulin培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，24小時(shí)后更換為RPMI/B27-1nsulin培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0072](ニ)第3天換用含有5 ii M Wnt抑制劑IWP4的RPMI/B27_insulin培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，期間不換液。
[0073](三)從第5天起每隔2-3天更換RPMI/B27培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0074](四)第15天，將肉眼可見(jiàn)的可自主收縮的人類心肌細(xì)胞薄片或團(tuán)塊通過(guò)機(jī)器分選或人工挑取進(jìn)行收集。
[0075](五)將收集的細(xì)胞重新接種到經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為1%的細(xì)胞外基質(zhì)包被的培養(yǎng)板中，用RPMI/B27培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0076]實(shí)施例3、人類心肌細(xì)胞的鑒定
[0077]人類胚胎多能干細(xì)胞來(lái)源的人類心肌細(xì)胞不僅在形態(tài)上表現(xiàn)出心肌細(xì)胞特有的收縮功能，并且可以進(jìn)ー步通過(guò)免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)對(duì)心肌細(xì)胞特異性的生物學(xué)標(biāo)記進(jìn)行鑒定。
[0078]一、免疫熒光鑒定
[0079](一)將實(shí)施例2得到的人類心肌細(xì)胞分為四組，各組分別經(jīng)4%多聚甲醛固定，
0.3%Triton X-100/PBS通透。然后四組分別與四種ー抗(鼠抗cTnT,鼠抗MF20，兔抗MLC2v,鼠抗a-Actinin) 4°C孵育過(guò)夜。將ー抗清洗后于室溫進(jìn)行ニ抗孵育I小時(shí)，其中第一組使用的ニ抗為Alex Fluor488goat ant1-mouse IgG,第二組使用的ニ抗為AlexFluor488goat ant1-mouse IgG,第三組同時(shí)使用ニ抗Alex Fluor488goat ant1-mouse IgG和ニ抗 Alex Fluor568goat ant1-rabbit IgG 進(jìn)行孵育。
[0080](ニ)細(xì)胞核用DAPI進(jìn)行負(fù)染。激光共聚焦顯微鏡采集圖像進(jìn)行分析。
[0081]cTnT 為心肌肌I丐蛋白 T (cardiac troponin T)；
[0082]MF20為肌球蛋白重鏈；
[0083]MLC2V 為肌球蛋白輕鏈 2V(myosin light chain2V)；
[0084]a-Actinin 為肌動(dòng)蛋白。
[0085]結(jié)果如圖1A所示。
[0086]圖1A中，I (a-c)表示cTnT在不同放大倍率下的染色結(jié)果，2 (a_c)表示MF20在不同放大倍率下的染色結(jié)果，3a表示a -Actinin的染色結(jié)果，3b表示MCL2v的染色結(jié)果，3c為3a和3b重疊的結(jié)果。
[0087]結(jié)果表明，人類胚胎多能干細(xì)胞來(lái)源的人類心肌細(xì)胞能夠表達(dá)心肌特異的標(biāo)記物心肌肌I丐蛋白T (cardiac troponin T)和肌球蛋白，通過(guò)對(duì)肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的免疫突光染色可觀察到心肌纖維結(jié)構(gòu)。[0088]ニ、流式細(xì)胞術(shù)鑒定
[0089]結(jié)果如圖1B所示。
[0090]圖1B表明，分化得到的人類心肌細(xì)胞群中大約96%是cTnT陽(yáng)性細(xì)胞，大約91%是MF20陽(yáng)性的細(xì)胞。
[0091]實(shí)施例4、轉(zhuǎn)錄組分析
[0092]一、設(shè)置三組樣品:人類胚胎多能干細(xì)胞(hESCs)H9 (以下簡(jiǎn)稱為H9-ESC)，人類胚胎多能干細(xì)胞系H9來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞(hNSCs)(以下簡(jiǎn)稱為H9-NSC)以及實(shí)施例3鑒定出的人類胚胎多能干細(xì)胞系H9來(lái)源的人類心肌細(xì)胞(hCMs)(以下簡(jiǎn)稱為H9-CM)，每組細(xì)胞樣品共設(shè)三個(gè)平行。
[0093]ニ、使用Trizol法提取各組細(xì)胞各樣品的總RNA,并使用RNeasy Mini Kit進(jìn)ー步純化。
[0094]三、將三組細(xì)胞的樣品用“AffymetrixGeneChipPrimeViewHuman GeneExpression Arrays”基因芯片處理。
[0095]四、表達(dá)差異比較
[0096]分析比較各組細(xì)胞中不同基因在H9-ESC、H9-NSC及H9-CM中的表達(dá)情況。由AffymetrixGeneChip Scanner30007G 米集基因芯片的表達(dá)信號(hào)。利用 R/Bioconductor 處理表達(dá)信號(hào)，根據(jù)RMA算法歸ー化后轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)值，并繪制H9-ESC、H9-NSC和H9-CM三種細(xì)胞各3份樣品的表達(dá)熱圖(heatmap)，結(jié)果如圖2A所示。
[0097]圖2A 中，`
[0098]hESC # UhESC # 2和hESC # 3分別為H9-ESC的三個(gè)平行樣品；
[0099]hNSC # UhNSC # 2和hNSC # 3分別為H9-NSC的三個(gè)平行樣品；
[0100]hCM # 1、hCM # 2和hCM # 3分別為H9-CM的三個(gè)平行樣品；
[0101]l/4x表示基因的表達(dá)水平下調(diào)到4倍；
[0102]l/2x表示基因的表達(dá)水平下調(diào)到2倍；
[0103]Ix表示基因的表達(dá)水平無(wú)顯著變化；
[0104]2x表示基因的表達(dá)水平上調(diào)到2倍；
[0105]4x表示基因的表達(dá)水平上調(diào)到4倍。
[0106]圖中是以人胚胎干細(xì)胞H9-ESC作為基因上調(diào)和下調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0107]經(jīng)過(guò)分析，與基因在H9-ESC和H9-NSC中的表達(dá)量相比，共有695個(gè)基因在H9-CM中的表達(dá)量同時(shí)是H9-ESC和H9-NSC中的表達(dá)量的2倍以上，共有401個(gè)基因在H9-CM中的表達(dá)量均不足H9-ESC和H9-NSC中的表達(dá)量的一半。
[0108]五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證關(guān)鍵基因的表達(dá)結(jié)果，表I為各關(guān)鍵基因的引物。其中部分結(jié)果如圖2B所示，驗(yàn)證結(jié)果與芯片分析得到的結(jié)果一致。
[0109]表I驗(yàn)證引物
[0110]
【權(quán)利要求】
1.一組用于鑒定或輔助鑒定人類心肌細(xì)胞的標(biāo)記物，由如下29種基因組成:P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIPl、HSPB7、NPPA, KBTBD10, MYL4、CRYAB, LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX, NRK、ABLIMU SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA, TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2 ； 所述29種基因滿足如下條件:與人類胚胎多能干細(xì)胞和/或人類神經(jīng)干細(xì)胞相比，在人類心肌細(xì)胞中該29種基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平均顯著降低、且在人類心肌細(xì)胞中該29種基因的mRNA表達(dá)量均顯著提高。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)記物，其特征在于:所述該29種基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平均顯著降低是指在人類心肌細(xì)胞中每種基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化的量均比人類胚胎多能干細(xì)胞和/或人類神經(jīng)干細(xì)胞中相同基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化的量降低5%以上； 所述該29種基因的mRNA表達(dá)量均顯著提高是指在人類心肌細(xì)胞中每種基因的mRNA表達(dá)量均是人類胚胎多能干細(xì)胞和/或人類神經(jīng)干細(xì)胞中相同基因mRNA表達(dá)量的2倍以上。
3.權(quán)利要求1或2所述標(biāo)記物在鑒定人心肌細(xì)胞中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為非疾病治療或診斷方法； 或，權(quán)利要求1或2所述標(biāo)記物在制備、開(kāi)發(fā)或設(shè)計(jì)鑒定人心肌細(xì)胞的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1或2所述標(biāo)記物在從人心肌細(xì)胞、人胚胎多能干細(xì)胞和人神經(jīng)干細(xì)胞中鑒定出人心肌細(xì)胞中的應(yīng)用； 或，權(quán)利要求1或2所述標(biāo)記物在從人心肌細(xì)胞和人胚胎多能干細(xì)胞中鑒定出人心肌細(xì)胞中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1或2所述標(biāo)記物在制備、開(kāi)發(fā)或設(shè)計(jì)具有如下功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用:從人心肌細(xì)胞、人胚胎多能干細(xì)胞和人神經(jīng)干細(xì)胞中鑒定出人心肌細(xì)胞； 或，權(quán)利要求1或2所述標(biāo)記物在制備、開(kāi)發(fā)或設(shè)計(jì)具有如下功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用:從人心肌細(xì)胞和人胚胎多能干細(xì)胞中鑒定出人心肌細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述人心肌細(xì)胞是由所述人胚胎多能干細(xì)胞分化而來(lái)的；所述人神經(jīng)干細(xì)胞是由所述人胚胎多能干細(xì)胞分化而來(lái)的。
7.檢測(cè)29種基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平的物質(zhì)和檢測(cè)29種基因的mRNA表達(dá)量的物質(zhì)在制備鑒定人類心肌細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用； 所述 29 種基因?yàn)?P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA, KBTBD10、MYL4、CRYAB,LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX,NRK,ABLIMl、SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC、F2RL2。
8.檢測(cè)29種基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平的物質(zhì)和檢測(cè)29種基因的mRNA表達(dá)量的物質(zhì)在制備具有如下功能的試劑盒中的應(yīng)用:從人心肌細(xì)胞、人胚胎多能干細(xì)胞和人神經(jīng)干細(xì)胞中鑒定出人心肌細(xì)胞； 所述 29 種基因?yàn)?P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA, KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX,NRK、ABLIMl、SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC、F2RL2。
9.檢測(cè)29種基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平的物質(zhì)和檢測(cè)29種基因的mRNA表達(dá)量的物質(zhì)在制備具有如下功能的試劑盒中的應(yīng)用:從人心肌細(xì)胞和人胚胎多能干細(xì)胞中鑒定出人心肌細(xì)胞； 所述 29 種基因?yàn)?P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA, KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX,NRK,ABLIMl、SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC、F2RL2。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一所述的應(yīng)用，其特征 在于:所述人心肌細(xì)胞是由所述人胚胎多能干細(xì)胞分化而來(lái)的；所述人神經(jīng)干細(xì)胞是由所述人胚胎多能干細(xì)胞分化而來(lái)的。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103451284SQ201310370253
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】劉光慧, 顧穎, 胡安·卡洛斯·伊斯畢華·貝爾蒙特, 曲靜, 楊濟(jì)平, 張維琦, 任若通 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所