利用基因型檢測強直性脊柱炎易感性的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用基因型檢測強直性脊柱炎易感性的方法和試劑盒，其中，檢測強直性脊柱炎易感性的方法包括：檢測該個體的PSMB1基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的PSMB1基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患強直性脊柱炎的可能性高于正常人群；該試劑盒包括：特異性擴增PSMB1基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴增出長度為100-2000bp且含有SEQ ID NO.1中第618位的擴增產(chǎn)物。本發(fā)明可用于早期輔助性診斷強直性脊柱炎，而且可使一些攜帶者在未發(fā)病前就采取合理的預防措施，從而提高攜帶者的生存期和生存質(zhì)量，具有極其重大的應用價值和社會效益。
【專利說明】利用基因型檢測強直性脊柱炎易感性的方法和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測強直性脊柱炎易感性的方法和試劑盒，特別是涉及一種利用 基因型檢測強直性脊柱炎易感性的方法和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 強直性脊柱炎又名別赫捷列夫氏（VonBechterev)病或馬-施二氏 (Maritstrumpell)病，是一種慢性、進行性，中軸關(guān)節(jié)受累的慢性炎癥性疾病。主要影響 骨盆的骶髂關(guān)節(jié)、脊柱關(guān)節(jié)和椎旁組織。主要癥狀為下腰痛、脊椎僵硬及運動范圍受限、 X線顯示兩側(cè)骶髂關(guān)節(jié)炎（sacroilitis)為其特征。由于該病一般先侵犯骶髂關(guān)節(jié)，并重 點累及脊柱，最終導致脊柱骨性強直，故目前國內(nèi)外多稱之為強直性脊柱炎（Ankglosing Spondytitis, AS)〇
[0003] 強直性脊柱炎有明顯的種族性，在不同民族中發(fā)病率的差異很大。印第安人發(fā)病 率最高，北美印第安人發(fā)病率為2. 7%?6. 3%。其次為白種人，白種人中發(fā)病率為0. 1%? 1.4%。黃種人低于白種人，我國約為0.3%。而黑人發(fā)病率最低，約為白人的1/4,在非洲 僅為0. 2 %。
[0004] 強直性脊柱炎好發(fā)于20至40歲的成年人，尤其是20?30歲的青年男性。
[0005] 強直性脊柱炎呈常染色體顯性遺傳，有明顯的家族遺傳傾向，遺傳因素 >90%。據(jù) 調(diào)查，強直性脊柱炎病人親屬發(fā)病率比一般人高一倍左右，同胞復發(fā)風險比為82. 90%以上 的AS病人具有HLA-B27陽性，在正常人群中陽性率為8%;子女HLA-B27陽性占 50%，發(fā)生 強直性脊柱炎的占 25%。目前基本上已有定論，HLA-B27作為獨立的致病基因在AS的發(fā)病 中起作用。因為在HLA-B27陽性個體中只有1 %?5%發(fā)展成為AS，提示還有其他基因參與 AS的發(fā)病。
[0006] PSMBl基因位于6q27,大小約為22Kbp，其編碼的產(chǎn)物屬于蛋白酶體B型家族，是 一種泛素-蛋白酶復合物中的20S核心β-亞單位。蛋白酶體是一種存在于胞質(zhì)和胞核內(nèi) 的蛋白水解酶復合物，負責降解細胞內(nèi)大部分蛋白質(zhì)，在MHC I類分子包括HLA-B27分子的 表達及相關(guān)抗原呈遞過程中起關(guān)鍵作用。MHC I類分子呈遞的抗原均來源于蛋白酶體的降 解產(chǎn)物。蛋白酶體的功能受其結(jié)構(gòu)組成的調(diào)控，其核心部分是由α和β亞單位組成的四 環(huán)狀圓柱形結(jié)構(gòu)，與ΡΑ28結(jié)合后成為免疫蛋白酶體。PSMBl是β環(huán)中重要的結(jié)構(gòu)亞單位。 β環(huán)的改變會影響到降解蛋白質(zhì)的速度及切割位點，以及內(nèi)源性蛋白質(zhì)的降解和抗原的呈 遞。PSMBl基因的多態(tài)性影響著免疫蛋白酶體與待降解目標蛋白的結(jié)合情況，引起降解內(nèi)源 性蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗原肽的數(shù)量和性質(zhì)發(fā)生改變，其中可能包括能誘導AS發(fā)生的特異性抗 原肽。有研究發(fā)現(xiàn)PSMBl基因與另一種自身免疫性疾病I型糖尿病的發(fā)生有關(guān)（J Autoim mun. 2005May;24(3):243-50)〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用基因型檢測強直性脊柱炎易感性的方 法和試劑盒，為輔助診斷(尤其是早期診斷）強直性脊柱炎和治療強直性脊柱炎提供基礎。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對個體的利用基因型檢測強直性脊柱炎易感性 的方法的方法，包括步驟：
[0009] 檢測該個體的PSMBl基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的PSMBl基因、轉(zhuǎn)錄本和 /或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患強直性脊柱炎的可能性高于正常人群。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法中檢測的是PSMBl的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常PSMBl 核苷酸序列比較差異。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性（SNP):
[0012] 第618位的基因型CC ;其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO. 1。
[0013] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測樣品是否存在PSMBl基因的單核苷酸多態(tài) 性的方法，包括步驟：
[0014] 1)用PSMBl基因特異性引物擴增樣品的PSMBl基因，得到擴增產(chǎn)物；
[0015] 2)檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下的單核苷酸多態(tài)性：
[0016] 第618位的G/C多態(tài)(尤其是基因型CC);其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO. 1。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述PSMBl基因特異性引物具有SEQ ID NO. 2和3的序列。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的擴增產(chǎn)物的長度為100_2000bp，且含有SEQ ID NO. 1中第 618 位。
[0019] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種利用基因型檢測強直性脊柱炎(強直性脊柱炎 易感性）的試劑盒，其包括：特異性擴增PSMBl基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，更佳地，所述的引物擴 增出長度為100_2000bp且含有SEQ ID NO. 1中第618位的擴增產(chǎn)物。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑：
[0021] 1)與SEQ ID NO. 1中第618位的G/C多態(tài)相結(jié)合的探針；
[0022] 2)識別SEQ ID NO. 1中第618位的G/C多態(tài)的限制性內(nèi)切酶。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述第618位的G/C多態(tài)是G/C多態(tài)中的基因型CC。
[0024] 所述引物的序列，可如SEQ ID NO. 2和3所示。
[0025] 所述擴增產(chǎn)物的長度為100_2000bp且含有SEQ ID NO. 1中第618位。
[0026] 本發(fā)明經(jīng)過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析。發(fā)現(xiàn) 和證明了 PSMBl的基因組序列與強直性脊柱炎密切相關(guān)，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在PSMBl 基因的SEQ ID NO. 1中第618位的SNP (第618位的基因型CC)在對照組和病例組中的分 布存在顯著性差異（P < 0. 05)，因此，可作為輔助性檢測強直性脊柱炎(或其易感性）的特 異性SNP。在此基礎上完成了本發(fā)明。
[0027] 本發(fā)明對PSMBl基因中的幾乎整個區(qū)域進行了測序，關(guān)聯(lián)研究表明SEQ ID NO. 1 中第618位的基因型CC是與強直性脊柱炎易感性關(guān)聯(lián)性非常高的SNP。
[0028] 具體而言，本發(fā)明揭示了 PSMBl基因一種單核苷酸多態(tài)性（SNP)以及該多態(tài)性與 強直性脊柱炎的相關(guān)性。本發(fā)明的SNP是SEQ ID NO. 1所示序列的第618位的G/C多態(tài)， 基因型CC在強直性脊柱炎病人群中的頻率，要高于在正常對照人群中的頻率。
[0029] 基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，PSMBl蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括：用于 輔助性診斷強直性脊柱炎。
[0030] 另一方面，本發(fā)明還包括對人PSMBl基因 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異 性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結(jié)合于人 PSMBl基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人PSMBl基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合 于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人PSMBl蛋白的分 子，也包括那些并不影響人PSMBl蛋白功能的抗體。
[0031] 本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片 段，如Fab'或（Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗 體。
[0032] 本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化 的人PSMBl基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn) 生。與之相似的，表達人PSMBl蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn) 抗體。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括弗氏佐劑等。
[0033] 本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制 備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人PSMBl蛋白功能的抗體以及不影響人PSMBl蛋白功能的抗 體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人PSMBl基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲 得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人PSMBl基因產(chǎn) 物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞（例如E. Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物 而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體（如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽），可以用真核細 胞（例如酵母或昆蟲細胞）中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
[0034] 抗人PSMBl蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術(shù)中，檢測活檢標本中的人PSMBl 蛋白的多少和/或突變與否。一種優(yōu)選的抗PSMBl抗體是不識別正常PSMBl但識別突變 PSMBl的抗體，或者識別正常PSMBl但不識別突變PSMBl的抗體。利用這些抗體，可以方便 地進行蛋白質(zhì)水平的強直性脊柱炎易感性檢測。
[0035] 利用本發(fā)明PSMBl蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與PSMBl蛋白發(fā)生相互 作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
[0036] 本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人PSMBl蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本 領(lǐng)域所熟知的，且包括ELISA等。
[0037] -種檢測檢測樣品中是否存在PSMBl蛋白的方法是利用PSMBl蛋白的特異性抗體 進行檢測，它包括：將樣品與PSMBl蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成 了抗體復合物就表示樣品中存在PSMBl蛋白。
[0038] PSMBl蛋白的多聚核苷酸可用于PSMBl蛋白相關(guān)疾病的輔助診斷。在診斷方面， PSMBl蛋白的多聚核苷酸可用于檢測PSMBl蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下PSMBl蛋白的 異常表達。如PSMBl基因 DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷PSMBl蛋白的表達異 常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法,Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公 開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可 作為探針固定在微陣列（microarray)或DNA芯片（又稱為"基因芯片"）上，用于分析組 織中基因的差異表達分析和基因診斷。用PSMBl蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應 (RT-PCR)體外擴增也可檢測PSMBl蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0039] 檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。PSMBl蛋白突變的形式包括與正常野生 型PSMBl基因 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募?術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋 白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
[0040] 最方便的檢測本發(fā)明SNP的方法，是通過用PSMBl基因特異性引物擴增樣品的 PSMBl基因，得到擴增產(chǎn)物；然后檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性：第618位 的基因型CC，其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO. 1。
[0041] 應理解，在本發(fā)明揭示了 PSMBl基因的SNP與強直性脊柱炎的相關(guān)性之后，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以方便地設計出可特異性擴增出含該SNP位置的擴增產(chǎn)物，然后通過測序等方 法確定是否存在第618位的基因型CC。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。 雖然引物與模板序列完全互補是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一 定的不互補（尤其是引物的5'端）的情況下，也能夠特異性地擴增（即僅擴增出所需的片 段）。
[0042] 含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物 擴增出的擴增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對應位置。一種優(yōu)選的引物對具有SEQ ID NO. 2和3 的序列。
[0043] 雖然擴增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴增產(chǎn)物的長度為100_2000bp，較 佳地為150-1500bp，更佳地為200-1000bp。這些擴增產(chǎn)物都應含有SEQ ID NO. 1中第618 位。
[0044] 由于本發(fā)明的SNP與強直性脊柱炎具有非常高的關(guān)聯(lián)性，因而可用于早期輔助性 診斷強直性脊柱炎，而且可以未雨綢繆地使一些攜帶者在未發(fā)病前就采取合理的預防措 施，從而提高攜帶者的生存期和生存質(zhì)量，因此，具有極其重大的應用價值和社會效益。

【具體實施方式】
[0045] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件如 Sambrook 等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York :ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0046] 實施例1
[0047] 一、研究對象
[0048] 病例樣本全部采集自門診病人，患者的診斷由富有臨床經(jīng)驗的風濕病科醫(yī)師根據(jù) 1984年提出修訂的紐約標準作出，并通過多次隨訪確診。對照樣本選自南方中心樣本庫中 病例組年齡、性別匹配、無關(guān)節(jié)炎病史的個體。
[0049] 在知情同意的基礎上，隨機收集了 581例AS病人和612例健康的正常對照個體的 外周血樣本。
[0050] 二、實驗方法和結(jié)果
[0051] UDNA 提取
[0052] 用常規(guī)酚氯仿法從人的外周血樣本中提取DNA (也可采用商業(yè)化的試劑盒，提前 DNA)，濃度校正至20ng/μ 1后，用于常規(guī)PCR擴增。
[0053] 2、用于PCR和測序中的引物設計
[0054] 根據(jù)GenBank中PSMBl的基因組序列，設計和合成以下引物：
[0055] 有義引物 Pl :5' -gctctttccgcagttgtttc-3' (SEQ ID NO. 2 所不）
[0056] 反義引物 P2 :5' -accaaggctgtatcgcaatc-3' (SEQ ID NO. 3 所不）。
[0057] 3、PSMBl 基因的 PCR 擴增
[0058] 以提取的DNA為模板，用含Taq酶的常規(guī)PCR反應所需試劑，在GeneAmp9700PCR儀 上以Touchdown程序進行PCR擴增。反應條件為：94°C預變性2分鐘，94°C變性30秒，63Γ 退火40秒，72°C延伸40秒，共10個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度遞減0. 5°C ;以后94°C變性30 秒，58°C退火40秒，72°C延伸40秒，共30個循環(huán)；最后72°C延伸7分鐘。
[0059] PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證。結(jié)果，獲得PSMBl基因的擴增產(chǎn)物。
[0060] 4、SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測
[0061] PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹脂純化后，用ABI-3730DNA測序儀(美國應用生物系統(tǒng)公司 appliedbiosystems (ABI))進行測序，用 Polyphred 軟件（美國華盛頓大學11^口://(11'〇〇8· mbt. Washington. edu/Polyphred. html)進行序列的判讀、基因分型和SNP確認。
[0062] 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在以下SNP :
[0063] SEQ ID NO. 1 中第 618 位的 G/C 多態(tài)（rsl2717)〇
[0064] 其中，rsl2717 :
[0065] tgcatttatattcagttctgccactcccagttcatgcactgttgtcacatggctctttccgcagttgtt tcttagtgggacttcagcacgccttga ttttcccttctgtagttcattgtggcgtaatcatatgttatactgcttg ttttctttgtactttttattatcagtgaggttgtgagctctttaaggataggaaat gttatatacattttttatta gccaggacaattaacgttcccaccgttattcgagttgccgttgcgccatagttctgacaatttttttgtatggtcag acttaa atttttgtccattggggtgaattccaatgttttcttcgagggggaaaaaaacaaaaaacaaacaaaaaaa accctttacatccctgtcagcgctttttg gaatgggcgggattcaactaccaaagggacaagccgccgtgcagccc tccaggagcaacgactagcgtgagatagagaggccgggagcg aacttcagGAGAAGCCGGAAGTGGCGTAACGTCC GGTCAAGGCAGCCATCTCGCCGTGAGA CAGCAAGTGTCGGATCCGCAGGCGCAGCCGTGCGATGTTGTCCTCTACA GCCATGTATT CGGCT (G/C)CTGGCAGAGACTTGGGGATGGAACCGCACAGAGCCGCGGGCCCTTTGCAGCTGCGA TT TTCGCCCTACGTTTTCAACGGAGGgtaaaaaccccagagagctgcggctttcactttcgcccttcccccatctg ctgaagc ctatttaggagtcaccgccgtgatggcgctgccccgggctcctgcaggcctcagaaccctgagctgagg gggtccgcacaaggccggtctcc ctgccgtcctctcatgccctgtgtttccctcttcaggctcgctttgctcaagt ttacttggtgattgcgatacagccttggtttttagggttt (SEQ ID N0.1 所示）。其中，序列中的"（G/ C)"即為SNP位點。
[0066] 5、SNP基因分型和關(guān)聯(lián)分析
[0067] 用直接單向測序法進行SNP基因分型。即在強直性脊柱炎病人和正常對照組中進 行分型和關(guān)聯(lián)分析。
[0068] 對基因分型結(jié)果進行描述性統(tǒng)計分析，列聯(lián)表進行卡方檢驗。觀察基因型在病人 和對照之間是否具有差異，其分析結(jié)果如下：
[0069] 根據(jù)病例-對照關(guān)聯(lián)分析的研究方法對基因分型的結(jié)果進行了卡方計算，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)位于第一外顯子的多態(tài)性位點rsl2717的基因型CC具有顯著的統(tǒng)計學差異。其中，在病 例樣本中，rsl2717的分布為（基因型GG362例、基因型GC189例、基因型CC30例）；而在對 照樣本中為(基因型GG405例、基因型GC190例、基因型CC17例)，兩者具有顯著性差異。 [0070] 基因型CC在病例中比在對照中要多，卡方檢驗P=O. 039?；蛐虲C的個體罹患強 直性脊柱炎的風險要比其它兩種基因型（GG+GC)的個體高I. 83倍（95%CI: I. 02-3. 28)。
[0071] 以上結(jié)果表明：基因型CC增加了強直性脊柱炎的易感性，PSMBl基因多態(tài)性位點 rsl2717的基因型CC與強直性脊柱炎的發(fā)病顯著相關(guān)。即：SEQ ID NO. 1中第618位的SNP 位點與強直性脊柱炎的發(fā)生存在著相關(guān)性。
[0072] 實施例2強直性脊柱炎易感性檢測試劑盒
[0073] 如實施例1所述，SEQ ID NO. 1中第618位的G/C多態(tài)（SNP位點）與強直性脊柱 炎疾病密切相關(guān)。因此，可基于這個SNP位點，設計PSMBl基因特異性引物，再以病人的DNA 為模板進行擴增進行檢測。
[0074] 制備一試劑盒（100人次)，其含有：
[0075] 1)有義引物 Pl (SEQ ID NO. 2 所示），濃度 IOOpmol ;
[0076] 2)反義引物P2 (SEQ ID NO. 3所示)，濃度IOOpmol ;以及
[0077] 3)含Taq酶、dNTP、鎂離子、PCR反應緩沖液的PCR反應液。
[0078] 隨機挑選100個人構(gòu)成的測試組，其中，包括：未知是否患強直性脊柱炎的對象、 已知患強直性脊柱炎病人和經(jīng)檢測無強直性脊柱炎的正常人。
[0079] 抽取測試組中待檢測對象的外周血3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的商業(yè)化試劑 盒）從血液中提取DNA。將強直性脊柱炎檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到10 μ mol/1，以所 提取的DNA為模板與所提供的引物進行PCR反應。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI3730DNA測序儀 進行測序，用Polyphred軟件進行序列的判讀和SNP確認。
[0080] 或者，將擴增產(chǎn)物與正常對照用變性高效液相色譜儀（DHPLC)進行色譜分析，也可 檢測出SEQ ID NO. 1中第618位的基因型CC。
[0081] 檢測結(jié)果：對于PSMBl基因存在第618位的基因型CC的對象，進一步通過常規(guī)方 法檢測以確認是否患有強直性脊柱炎情況。檢測結(jié)果表明，含第618位的基因型CC的檢測 對象的強直性脊柱炎易感性比例明顯高于該位點為GG的檢測對象。
[0082] 因此，這表明通過檢測PSMBl基因的SEQ ID NO. 1中第618位的基因型CC，可進行 強直性脊柱炎的輔助性檢測。
[0083] 實施例3強直性脊柱炎易感性輔助性檢測
[0084] 重復實施例2的檢測，不同點在于隨機選取了 70個人(檢測前不知道是否有強直 性脊柱炎癥狀）進行檢測。
[0085] 制備一試劑盒（100人次)，其含有：
[0086] 1)有義引物 Pl (SEQ ID NO. 2 所示），濃度 IOOpmol ;
[0087] 2)反義引物P2 (SEQ ID NO. 3所示)，濃度IOOpmol ;以及
[0088] 3)含Taq酶、dNTP、鎂離子、PCR反應緩沖液的PCR反應液。
[0089] 抽取待檢測對象的外周血3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的商業(yè)化試劑盒）從血 液中提取DNA。將強直性脊柱炎檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到Ιθμπιο?/l，以所提取的 DNA為模板與所提供的引物進行PCR反應。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI3730DNA測序儀進行測 序，用Polyphred軟件進行序列的判讀和SNP確認。
[0090] 結(jié)果同樣證實了，含SEQ ID NO. 1中第618位的基因型CC的檢測對象的強直性脊 柱炎比例明顯高于該位點為GG的檢測對象。
【權(quán)利要求】
1. 一種利用基因型檢測強直性脊柱炎的試劑盒，其特征在于，包括：特異性擴增PSMB1 基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴增出長度為100_2000bp且含有SEQ ID NO. 1中第618 位的擴增產(chǎn)物。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還含有選自下組的試劑： 1) 與SEQ ID NO. 1中第618位的G/C多態(tài)相結(jié)合的探針； 2) 識別SEQ ID NO. 1中第618位的G/C多態(tài)的限制性內(nèi)切酶。
3. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述第618位的G/C多態(tài)是G/C多態(tài)中 的基因型CC。
4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述引物的序列如SEQ ID NO. 2和3所 /_J、i 〇
5. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述擴增產(chǎn)物的長度為100_2000bp且含 有 SEQ ID NO. 1 中第 618 位。
【文檔編號】C12Q1/68GK104419748SQ201310370141
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】黃薇, 牛振民 申請人:上海人類基因組研究中心