順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因、其編碼的多肽及其相關(guān)應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因、其編碼的多肽及其相關(guān)應(yīng)用，所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因具有如SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列，由該基因編碼的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶具有如SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列。用所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因構(gòu)建的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建基因工程菌，該基因工程菌經(jīng)過誘導(dǎo)后能將順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽高效率地轉(zhuǎn)化為L(+)-酒石酸或其鹽，從該大腸桿菌中獲得的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶具有將順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽高效率地轉(zhuǎn)化為L(+)-酒石酸或其鹽的能力。
【專利說明】順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因、其編碼的多肽及其相關(guān)應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，提供了一種新的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因及其編碼的多肽，進(jìn)一步提供了用于編碼這種多肽的多核苷酸，用于表達(dá)該種多肽的重組表達(dá)載體和重組微生物菌株及制備L (+)-酒石酸或其鹽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]L(+)_酒石酸[(2R，3R)-2，3-二羥丁烷_1，4 二羥酸]是一種天然結(jié)構(gòu)的有機(jī)酸，在某些植物果實(shí)如葡萄、羅望子果實(shí)中有較高的含量，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、建筑、化工、紡織、電鍍等行 業(yè)，其需求量正在逐年遞增。過去，生產(chǎn)L(+)_酒石酸的主要方法是從葡萄酒的副產(chǎn)物酒石中提取得到。目前主要利用微生物所分泌表達(dá)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶來生產(chǎn)L (+)-酒石酸或其鹽:先以順丁烯二酸酐為原料加水得到順丁烯二酸，再以鎢酸或鎢酸鹽為催化劑使順丁烯二酸與過氧化氫反應(yīng)制得順式環(huán)氧琥珀酸，最后利用順式環(huán)氧琥珀酸水解酶或具有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的微生物將順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽水解為L(+)_酒石酸或其鹽。
[0003]1974年，佐藤英次等采用酶法合成L(+)_酒石酸，即用化學(xué)合成的順式環(huán)氧琥珀酸作為底物，在含有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的微生物作用下，使底物水解為L(+)_酒石酸，而且?guī)缀醪划a(chǎn)生副產(chǎn)物。
[0004]1976 年，Kamatani 等在 M.S.M.S.Pat.N0.4028185A、M.S.Pat.N0.4013509A 和M.S.Pat.N0.4011135A中闡述了利用微生物轉(zhuǎn)化順式環(huán)氧琥珀酸生產(chǎn)L(+)-酒石酸的方法，使L (+)-酒石酸的大量生產(chǎn)真正成為可能。
[0005]目前報道的可以用于生產(chǎn)L(+)_酒石酸或其鹽的微生物主要有:無色桿菌屬(Achromobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和棒狀桿菌屬(Coryncbacterium)。
[0006]一般認(rèn)為，微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L(+)_酒石酸具有酶立體專一性好、酶促反應(yīng)快、產(chǎn)品光學(xué)純度和產(chǎn)品得率高、產(chǎn)品分離純化簡單易行等特點(diǎn)。但是由于微生物體內(nèi)固有的酶系統(tǒng)非常復(fù)雜，順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的表達(dá)量不高，其活性也受到胞內(nèi)胞外多種因素的制約，導(dǎo)致L(+)_酒石酸生產(chǎn)效率低下。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建具有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的基因工程菌，可以實(shí)現(xiàn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的高效表達(dá)，這也成為工業(yè)生產(chǎn)L(+)_酒石酸的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的主要目的在于，克服現(xiàn)有的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶表達(dá)量不高，導(dǎo)致L (+)_酒石酸生產(chǎn)效率低下的缺陷，而提供一種新的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶編碼基因，所要解決的技術(shù)問題是實(shí)現(xiàn)由其編碼的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的高效表達(dá)，進(jìn)而提高L(+)_酒石酸的生產(chǎn)效率。
[0008]本發(fā)明提供了一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因，其核苷酸序列來源于分離純化的克雷伯氏菌BK-58菌株(Klebsiella sp.BK-58),優(yōu)選為具有中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號CGMCC N0.4949的克雷伯氏菌BK-58菌株，其拉丁文學(xué)名為Klebsiella sp.BK-58，于2011年6月12日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院
3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。
[0009]上述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的核苷酸序列(基因組DNA、cDNA或RNA)，與SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有70%以上，優(yōu)選為80%以上，更優(yōu)選為90%以上的同源性。具體來說，本發(fā)明提供的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的核苷酸序列可以是SEQID NO:1所示核苷酸序列的等位基因變異體，或者是從其他物種分離得到的核苷酸序列，也可以是SEQ ID NO:1所示核苷酸序列截短、刪除、替代或增加一個或整個核苷酸的結(jié)果。序列之間的同源性可以用標(biāo)準(zhǔn)的比對方法確定，比如ClustalX。
[0010]本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的核苷酸序列是含有全部SEQ IDNO:1所示序列的核苷酸序列或含有部分SEQ ID NO:1所示序列的核苷酸序列。
[0011]前述的“含有部分SEQ ID NO:1所示序列的核苷酸序列”是指該序列含有超過100個與SEQ ID NO:1所示序列中的核苷酸相同的核苷酸，亦指其編碼的氨基酸多肽具有與由全部SEQ ID NO:1所示序列編碼的氨基酸多肽(即SEQ ID NO: 2的完整氨基酸序列)相似的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力。
[0012]上述“含有部分SEQ ID NO:1所示序列的核苷酸序列”編碼的氨基酸多肽具有與由全部SEQ ID NO:1所示序列編碼的氨基酸多肽(即SEQ ID NO: 2)相似的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力，優(yōu)選具有SEQ ID NO:280%以上的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力，更優(yōu)選具有SEQ ID NO:2100%的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力。
[0013]本發(fā)明還提供了一種重組核苷酸序列，其含有前述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的核苷酸序列，且鄰接有一個或多個、來源于同源或異源微生物的調(diào)控序列。
[0014]所述的調(diào)控序列，其包括選自啟動子序列、分泌信號序列、終止信號序列等調(diào)控序列中的一種或多種。
[0015]本發(fā)明另外提供了一種含有前述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的核苷酸序列的載體，其任選地還包含一個或多個來源于同源或異源微生物的調(diào)控序列。
[0016]所述“載體”系指所有可用于將核苷酸序列轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞的生物化學(xué)構(gòu)架。本發(fā)明涉及的載體可為質(zhì)粒、病毒、噬菌粒、脂質(zhì)體、陽離子囊泡中的一種或幾種。上述載體中可以包含一個或多個前述的調(diào)控序列。本發(fā)明的載體優(yōu)選為質(zhì)粒。
[0017]本發(fā)明涉及的宿主細(xì)胞，優(yōu)選為一種重組宿主細(xì)胞，其由本發(fā)明所述核苷酸序列或載體經(jīng)轉(zhuǎn)化而來。
[0018]前述的“本發(fā)明所述核苷酸序列或載體經(jīng)轉(zhuǎn)化而來的宿主細(xì)胞”，系指該宿主本身沒有前述的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的核苷酸序列或載體，而是經(jīng)過轉(zhuǎn)化后，使得宿主帶有該核苷酸序列或載體。
[0019]上述宿主細(xì)胞 能表達(dá)前述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的核苷酸序列或載體，并且產(chǎn)生前述核苷酸序列或載體編碼的氨基酸序列。本發(fā)明涉及的前述核苷酸序列能整合到所選宿主的基因組中，或以游離型載體的形式存在于前述宿主細(xì)胞中。
[0020]為了便利起見，本發(fā)明涉及的重組宿主細(xì)胞包括微生物，優(yōu)選為細(xì)菌和真菌，包括酵母。上述重組宿主細(xì)胞經(jīng)改造優(yōu)選后，能高水平地表達(dá)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶。
[0021 ] 上述“高水平地表達(dá)”是在前述重組宿主細(xì)胞中，通過相鄰調(diào)控序列控制前述核苷酸序列來實(shí)現(xiàn)過量表達(dá)。
[0022]本發(fā)明另外又提供了一種分離純化后得到的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列，其由前述分離純化后的核苷酸編碼，并(或)由前述重組宿主細(xì)胞表達(dá)。
[0023]本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，其分子量在25_35kDa，優(yōu)選為約30kDa(理論值為 30.124kDa)。
[0024]本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列或其多肽由前述重組宿主細(xì)胞胞外或胞內(nèi)表達(dá)和(或)分泌表達(dá)。
[0025]本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有50%以上，優(yōu)選為70%以上，更優(yōu)選為90%以上的同源性。
[0026]本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的全部或部分(50個以上，優(yōu)選100個以上的氨基酸)，其順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力至少為完整氨基酸序列SEQ ID NO:2的80%以上，優(yōu)選為95%以上。即，可將本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個，幾個，例如2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個氨基酸，或多個，例如10個或10個以上氨基酸，但仍可維持其活力。本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶或其部分序列的分子量約30kDa或更低或更高。
[0027]本發(fā)明涉及的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶可通過無爭議的酶實(shí)驗鑒定，比如將順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽水解成L (+)_酒石酸或其鹽。在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物并產(chǎn)酶。用該培養(yǎng)物或分離該培養(yǎng)物中的微生物細(xì)`胞，并檢測其酶活力。
[0028]在合適的培養(yǎng)中誘導(dǎo)野生型微生物或本發(fā)明所述的重組細(xì)胞產(chǎn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，通過熟知的方法如柱層析，分離出目的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，檢測酶氨基酸序列的“活性部位”，并從上述野生型微生物或重組細(xì)胞中獲得順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的DNA序列。
[0029]順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的DNA序列，通過從微生物中純化出的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的N-末端序列和C-末端序列獲得。
[0030]本發(fā)明中，通過純化出的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的N-末端序列和C-末端序列設(shè)計兼并引物，經(jīng)過PCR技術(shù)，將約0.Skb含順式環(huán)氧琥珀酸水解酶編碼序列的PCR產(chǎn)物插入PUCm-T載體。整個插入片段的DNA序列通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的測序技術(shù)檢測。
[0031]設(shè)計含Nde I和BamH I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物，通過PCR技術(shù)，得到含順式環(huán)氧琥珀酸水解酶編碼序列的PCR產(chǎn)物，將此PCR產(chǎn)物插入pUCm-T載體，并用Nde I和BamHI限制性內(nèi)切酶消化該含有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶編碼序列的PUCm-T載體，并將該酶切后的片段插入pET22b(+)載體相應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)處。整個插入片段的DNA序列通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的測序技術(shù)檢測。
[0032]上述構(gòu)建好的插入了順式環(huán)氧琥珀酸水解酶編碼序列的pET22b(+)表達(dá)載體在大腸桿菌宿主中表達(dá)。含插入了順式環(huán)氧琥珀酸水解酶編碼序列的pET22b(+)質(zhì)粒的上述大腸桿菌宿主，培養(yǎng)在含相應(yīng)抗生素的合適培養(yǎng)基(比如LB培養(yǎng)基)中，使插入了順式環(huán)氧琥珀酸水解酶編碼序列的pET22b(+)質(zhì)粒能持續(xù)的存在于宿主細(xì)胞中，然后收集上述細(xì)胞并測定順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力。
[0033]本發(fā)明中順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因并不僅限于在大腸桿菌中表達(dá)。本發(fā)明中順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的DNA片段能很便利地在細(xì)菌或真菌，包括酵母中表達(dá)。為了使上述基因能在細(xì)菌、真菌以及酵母中表達(dá)，順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的DNA序列可以通過控制與其相鄰的DNA序列(如啟動子、終止子、上游激活序列等)使得該基因在所選宿主中最終得以(過量)表達(dá)。
[0034]順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的DNA序列通過恰當(dāng)?shù)男揎棧梢允鬼樖江h(huán)氧琥珀酸水解酶分泌(胞外表達(dá))在宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中。這種修飾通常可通過插入編碼引導(dǎo)序列的DNA序列來實(shí)現(xiàn)。該引導(dǎo)序列在所選宿主中通過分泌機(jī)制使得順式環(huán)氧琥珀酸水解酶得以分泌表達(dá)并在宿主培養(yǎng)基中得以復(fù)性。
[0035]本發(fā)明提供了表達(dá)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的宿主的培養(yǎng)條件(比如培養(yǎng)基、溫度
坐')
寸/ o
[0036]本發(fā)明提供一種利用本發(fā)明涉及的重組宿主細(xì)胞或本發(fā)明涉及的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶氨基酸序列來水解一種順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽。本發(fā)明所涉及的順式環(huán)氧琥珀酸鹽為順式環(huán)氧琥珀酸與各種陽離子形成的鹽，陽離子包括且不僅限于銨離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子和鈣離子等。
[0037]本發(fā)明涉及的酶可以以下列形式應(yīng)用:可直接利用培養(yǎng)后經(jīng)過透析處理或未經(jīng)透析處理的細(xì)胞；該酶可作為純化的蛋白或細(xì)胞抽提`物(即經(jīng)過一次或多次離心提取步驟后得到的宿主細(xì)胞的部分物質(zhì))。本發(fā)明涉及的酶能以上述任何形式與其它酶以上述任何形式聯(lián)合應(yīng)用。除此之外，順式環(huán)氧琥珀酸水解酶在宿主細(xì)胞表達(dá)后分泌到其胞外的培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)基中復(fù)性。亦即，該酶制劑可與(或不與)一種或多種其它酶聯(lián)合并以粗酶制劑或部分(或完全)純酶制劑的形式應(yīng)用。
[0038]本發(fā)明提供了一種利用本發(fā)明所述的基因工程菌生產(chǎn)L(+)_酒石酸或其鹽的方法。在順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液中加入本發(fā)明所述的基因工程菌細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行酶促反應(yīng)，獲得L(+)_酒石酸或其鹽。其中，順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽的摩爾濃度為0.1~2mol/L，優(yōu)選為0.5~1.5mol/L,更優(yōu)選為0.8~1.2mol/L ;反應(yīng)溫度為10~55°C，優(yōu)選為20~45°C，更優(yōu)選為32~40°C ;順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽溶液的pH值為4.5~11.0，優(yōu)選為6.0~9.5，更優(yōu)選為8.0~9.0。
[0039]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和有益效果。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明可達(dá)到相當(dāng)?shù)募夹g(shù)進(jìn)步性及實(shí)用性，并具有產(chǎn)業(yè)上的廣泛利用價值，其至少具有下列優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明從克雷伯氏菌BK-58菌株中克隆了順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因，其核苷酸序列和目前文獻(xiàn)報道的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的核苷酸序列均不相同，是一種新的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因；由本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因編碼的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，其氨基酸序列和目前文獻(xiàn)報道的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶氨基酸序列均不相同，是一種新穎的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶；含有本發(fā)明所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因的基因工程菌酶活力是目前文獻(xiàn)報道的最高的。
[0040]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更明顯易懂，以下特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，詳細(xì)說明如下。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(1%)電泳的結(jié)果。
[0042]圖2為本發(fā)明實(shí)施例4中的基因工程菌經(jīng)過0.lmmol/L IPTG誘導(dǎo)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】[0043]為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例，對依據(jù)本發(fā)明提出的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因、其編碼的多肽及其相關(guān)應(yīng)用其【具體實(shí)施方式】、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。
[0044]本發(fā)明的整體思路包括以下幾點(diǎn):從克雷伯氏菌中分離純化順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，對順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的N-末端和C-末端進(jìn)行測序，根據(jù)此N-末端和C-末端的氨基酸序列設(shè)計兼并引物，從克雷伯氏菌中克隆順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對轉(zhuǎn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，驗證順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的功能。以上各點(diǎn)皆為單獨(dú)實(shí)施例，以下將結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0045]實(shí)施例1:順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的分離純化
[0046]克雷伯氏菌BK-58 (Klebsiella sp.BK-58)保存于LB斜面培養(yǎng)基，該斜面培養(yǎng)基的組成為:1%蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母提取物，1.5%瓊脂，pH7.0。
[0047]1:順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力的測定
[0048]取1.0g濕細(xì)胞，生理鹽水洗兩次，用IOmL lmol/L的順式環(huán)氧琥珀酸鈉(pH8.0)懸浮濕細(xì)胞,37 °C反應(yīng)Ih,測定反應(yīng)液中酒石酸的含量。
[0049]反應(yīng)液中酒石酸含量的檢測方法如下:取2.5mLl%的偏釩酸銨溶液，置于一個25mL的容量瓶中，加適量的上述反應(yīng)液后，再加ImL lmol/L的硫酸，用蒸餾水定容至25ml，混勻后取一部分用分光光度計測定480nm處的吸光值，并根據(jù)制定的L(+)_酒石酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算反應(yīng)液中酒石酸的含量。
[0050]酶活單位定義為:在上述反應(yīng)條件下，1.0g濕細(xì)胞Ih產(chǎn)生I mo I酒石酸所需的酶量。
[0051]為了快速定量檢測在可溶性酶液中順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的活力，其檢測方法如下:在3.9mL0.lmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)中加入1.0mL lmol/L的順式環(huán)氧琥珀酸鈉底物，37°C保溫5min后，加入0.1mL酶液，并在37°C反應(yīng)20min，取適量上述反應(yīng)液，用上述方法測定其中酒石酸的含量。
[0052]2:順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的分離純化
[0053](I)從斜面培養(yǎng)基上接種克雷伯氏菌BK-58至LB培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24h，形成種子液。LB培養(yǎng)基的組成為:1%蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母提取物，pH7.0。
[0054](2)將種子液轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C振蕩24h，使其產(chǎn)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:1%蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母提取物，1%順式環(huán)氧琥珀酸鈉，pH7.0。[0055](3)離心收集細(xì)胞，用0.lmol/L磷酸鉀緩沖液懸浮。
[0056](4)懸浮液用超聲破碎儀超聲20min,8000rpm離心30min,收集上清液I。
[0057](5)上清液I中加硫酸銨至40%飽和度，1000Orpm離心20min，收集上清液2。
[0058](6)上清液2中加硫酸銨至75%飽和度，1000Orpm離心20nin，收集沉淀并用預(yù)冷的0.lmol/L磷酸鉀緩沖液溶解。
[0059](7) 4°C于0.lmol/L磷酸鉀緩沖液中透析48h，期間更換3_4次透析液。
[0060](8)透析后的酶液過 DEAE-Sepharose 柱(4.0cm 1.d.X 50cm),流速為 lmL/min,過柱流出液具有酶活。
[0061](9)過柱流出液用PEG20000濃縮，將濃縮液過Pheny-Sepharose柱(2.6cm
1.d.X 50cm)，用0.lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)洗脫，流速為lmL/min，收集具有酶活性的流出液，并用PEG20000濃縮。
[0062](10)濃縮液過MonoQ HR5/5柱，并用0.lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)洗脫，流速為0.2mL/min,收集具有酶活性的流出液，并用PEG20000濃縮。
[0063](11)步驟(8)到步驟(11)重復(fù)3次，取部分重復(fù)3次后的收集液，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用考馬斯亮藍(lán)R250染色，結(jié)果顯示，純化后的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠中條帶單一，并且分子量約為30kDa。
[0064]實(shí)施例2:對順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的N-末端和C-末端進(jìn)行測序
[0065]順式環(huán)氧琥珀酸水解酶N-末端氨基酸序列和C-末端氨基酸序列通過常用的方法檢測，其方法如下:將上述分離純化后`得到的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，通過Western雜交轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。該膜用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，切割順式環(huán)氧琥珀酸水解酶對應(yīng)的條帶并回收，然后用蛋白測序儀ABI PR0CISETM494cLC測其N-末端的10個氨基酸序列，用蛋白測序儀ABI PR0CISETM491cLC測其C-末端的10個氨基酸序列。測序結(jié)果顯示，該順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的N-末端10個氨基酸序列為MKFSGASLFA (SEQID勵:3)，0末端10個氨基酸序列為”￡1^^^11^(5￡0 ID NO:4) ?
[0066]實(shí)施例3:設(shè)計兼并引物，克隆順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因
[0067]根據(jù)上述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的N-末端序列(SEQ ID N0:3)、C_末端序列(SEQID NO:4)和不編碼氨基酸的終止密碼子序列(TAA/TGA/TAG)設(shè)計兩條兼并引物如下:
[0068]引物1:5，-ATGAARTTYWSNGGNGCNWSNYTNTTYGCN-3，(SEQ ID NO:5)；
[0069]引物2:5，-YYANGCNCCNARCATNCCNGCNARYTCNACNAC-3，(SEQ ID NO:6)；
[0070]其中，R:A/G,Y:C/T, ff:A/T, S:G/C, V:A/G/C, N:A/G/C/T。
[0071]用兼并引物克隆順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的步驟如下:
[0072](I)采用液體LB培養(yǎng)基，在30°C搖床以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)克雷伯氏菌BK-58，12h后收集細(xì)胞，按照 AxyPrep Bacterial Genomic DNA MiniPrep Kit (AXYGEN)中所述的方法抽提克雷伯氏菌BK-58的基因組。
[0073](2)以上述基因組為模板，以引物I和引物2為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為:步驟I所得的模板3 ii L，Taq DNA聚合酶(5M/ u L) I u L, 10XPCRbuffer5 u LjMgCl2 (25mmol/L) 3 y L，弓 I物 I (10 y mol/ii L) I y L，弓 I物 2 (10 y mol/u L) I u L,dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2035 u L,總體積 50 u L。
[0074](3)上述50 ii L PCR反應(yīng)體系進(jìn)行如下PCR反應(yīng)程序:[0075]94°C 預(yù)熱 5min ;然后 94°C 50s, 50°C 30s,72°C lmin,30 個循環(huán)；最后 72°C 延伸IOmin0
[0076](4)取上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(1%)電泳。電泳結(jié)果如圖1所示，其中，泳道I在750bp到1000bp之間有一條清晰的條帶，而作為對照的泳道2無對應(yīng)條帶?；厥沼镜繧的750bp到1000bp之間清晰條帶的PCR產(chǎn)物并與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5 a，挑取菌落進(jìn)行測序驗證。測序結(jié)果如SEQ ID NO:1所示，其長度為825個核苷酸，其中ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子。利用BioXM軟件將SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列得到如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列(即本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列)。將本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因和氨基酸序列分別與在線數(shù)據(jù)庫中已報道的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)在線數(shù)據(jù)庫中已報道的序列與本發(fā)明的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因和氨基酸序列相似性都不超過50%，由此說明，本發(fā)明所獲得的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因是一個新的基因。
[0077]實(shí)施例4:克雷伯氏菌順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)
[0078]根據(jù)SEQ ID NO:1所示的序列設(shè)計含有限制性內(nèi)切酶Nde I識別位點(diǎn)的正向引物3和含有限制性內(nèi)切酶BamH I識別位點(diǎn)的反向引物4，引物3和引物4的序列分別為:
[0079]引物3:5，-CATATGAAATTTTCTGGCGCCTCT(SEQ ID NO:7)；
[0080]引物4:5，-GGATCCTTAGGCGCCCAGCAT(SEQ ID NO:8) ?
[0081] 以克雷伯氏菌BK-58的基因組為模板，引物3和引物4為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為:實(shí)施例3步驟I所得的模板3 u L，Taq DNA聚合酶(5M/ u L) I u L, 10XPCRbuffer5 u LjMgCl2 (25mmol/L) 3 y L，弓 I物 3 (10 y mol/ii L) I y L，弓 I物 4 (10 y mol/u L) I u L,dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2035 u L,總體積 50 u L。
[0082]上述50 ii L PCR反應(yīng)體系進(jìn)行如下PCR反應(yīng)程序:
[0083]94°C 預(yù)熱 5min ;然后 94°C 50s, 44°C 30s,72°C lmin,30 個循環(huán)；最后 72°C 延伸IOmin0
[0084]回收PCR產(chǎn)物并與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5 a，挑取菌落進(jìn)行測序驗證。將測序結(jié)果與順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因(如SEQ ID NO:1所示)進(jìn)行比對，結(jié)果顯示:含有限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I識別位點(diǎn)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因成功插入PUCm-T載體。然后用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I分別對含有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的PUCm-T載體和pET-22b (+)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，用T4DNA連接酶將酶切下來的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因與酶切后的pET-22b(+)載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取菌落進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因進(jìn)行比對，序列完全匹配，說明成功構(gòu)建了含有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的pET-22b(+)重組載體和含有pET-22b(+)重組載體的基因工程菌。
[0085]此基因工程菌經(jīng)過0.lmmol/L IPTG誘導(dǎo)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖2所示。在圖2的第3泳道(基因工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)胞裂解液樣品)的25-35kDa之間有一條很濃的條帶，該條帶顯示的蛋白大小與根據(jù)該順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列計算所得的蛋白大小相符；以只含pET22b(+)載體而無任何外源核苷酸插入片段的大腸桿菌BL21為對照的第2泳道無對應(yīng)蛋白條帶，說明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因所編碼的重組蛋白能高效表達(dá)。按照實(shí)施例1中順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性的測定方法，對照菌沒有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力，而含有本發(fā)明所述順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的工程菌酶活力為35600U/g。
[0086]實(shí)施例5:利用本發(fā)明所述的基因工程菌制備L(+)酒石酸
[0087]本實(shí)施例中，樣品的紅外光譜用Nicolet_Nexus670傅立葉轉(zhuǎn)換式紅外光譜儀檢測；樣品的核磁共振氫譜和碳譜用Bruker Avance DMX500核磁共振儀檢測；樣品的質(zhì)譜用Bruker Esquire3000pl U s質(zhì)譜儀檢測；樣品的旋光度用WZZ-2B旋光儀檢測。
[0088]實(shí)施例4中所述的基因工程菌在IOOmL LB培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)12h后，接A IL LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)10h，然后向培養(yǎng)液中加入IOg順式環(huán)氧琥珀酸二鈉，繼續(xù)37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)12h后，加入過量的CaCl2水溶液，對產(chǎn)物進(jìn)行過濾，將過濾得到的沉淀進(jìn)行水洗得到14g酒石酸鈣，再對酒石酸鈣依次進(jìn)行硫酸酸解、陰和陽離子交換柱精制、濃縮、結(jié)晶、分離和烘干得到6.7g固體產(chǎn)物。經(jīng)紅外光譜、紫外光譜、核磁共振譜、質(zhì)譜檢測，確定該固體產(chǎn)物為酒石酸。經(jīng)旋光度檢測，該固體產(chǎn)物的比旋光度為
[a] 1=+12.1。，證明該固體產(chǎn)物為右旋型酒石酸，即L (+)-酒石酸，且純度為99.9%。
[0089]本實(shí)施例中的順式環(huán)氧琥珀酸二鈉可以替換為順式環(huán)氧琥珀酸或其與各種陽離子形成的鹽，陽離子包括且不僅限于銨離子、鉀離子、鎂離子和鈣離子等。
[0090]實(shí)施例6:編碼由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸且具有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性的多肽基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)
[0091]1.在本發(fā)明所述的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的5’端隨意添加一段核苷酸序列
[0092]根據(jù)SEQ ID NO:1所示的序列設(shè)`計含有限制性內(nèi)切酶Nde I識別位點(diǎn)和一段隨意添加的核苷酸序列的正向引物5，引物5的序列為:
[0093]引物5:5，-CATATGGACCGTCGTCAGTTCATGAAATTTTCTGGCGCCTCT(SEQ ID NO:9)；
[0094]以克雷伯氏菌BK-58的基因組為模板，引物5和實(shí)施例4中的引物4為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為:實(shí)施例3步驟I所得的模板3 ii L，Taq DNA聚合酶(5M/U L) I U L, 10XPCR buffer5 u L, MgCl2 (25mmol/L) 3 u L,引物 5 (10 u mol/u L) I u L,引物
4(10 u mol/u L) I u L, dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2035 u L,總體積 50 u L。
[0095]上述50 ii L PCR反應(yīng)體系進(jìn)行如下PCR反應(yīng)程序:
[0096]94°C 預(yù)熱 5min ;然后 94°C 50s, 44°C 30s,72°C lmin,30 個循環(huán)；最后 72°C 延伸IOmin0
[0097]回收PCR產(chǎn)物并與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5 a，挑取菌落進(jìn)行測序驗證。其測序結(jié)果如SEQ ID NO: 10所示。將測序結(jié)果與順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因(如SEQ ID NO:1所示)進(jìn)行比對,結(jié)果顯示:如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列相當(dāng)于在如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的5’端添加了 ATGGACCGTCGTCAGTTC(SEQ ID NO: 11)這一段核苷酸序列。SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示，SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列相當(dāng)于在SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的N-端添加了 6個氨基酸序列(SEQ ID NO: 13)。用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I分別對含有如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列的pUCm-T載體和pET-22b(+)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，用T4DNA連接酶將酶切下來的如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列與酶切后的pET_22b (+)載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建含有如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列的pET-22b(+)重組載體和含有此pET-22b (+)重組載體的基因工程菌。
[0098]此基因工程菌在含100 U g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過夜。以只含pET-22b(+)載體而無任何外源核苷酸插入片段的大腸桿菌BL21為對照。按照實(shí)施例1中順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性的測定方法，對照菌沒有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力，而上述基因工程菌酶活力為38800U/g。
[0099]利用本實(shí)施例所述的基因工程菌，用實(shí)施例5的方法制備L(+)酒石酸，同樣得到純度為99.9%的L(+)酒石酸。
[0100]2.在本發(fā)明所述的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的3’端隨意添加一段核苷酸序列
[0101]根據(jù)SEQ ID NO:1所示的序列設(shè)計含有限制性內(nèi)切酶BamH I識別位點(diǎn)和一段隨意添加的核苷酸序列的反向引物6，引物6的序列為:
[0102]引物 6:5，-GGATCCTTACTTGTTCGGCGTCTGTTTGGCGCCCAGCAT(SEQ ID NO: 14)；
[0103]以克雷伯氏菌BK-58的基因組為模板，引物6和實(shí)施例4中的引物3為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為:實(shí)施例3步驟I所得的模板3 ii L，Taq DNA聚合酶(5M/U L) I U L, 10XPCR buffer5 u L, MgCl2 (25mmol/L) 3 y L，引物 6 (10 y mol/y L) I y L，引物
3(10 u mol/u L) I u L, dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2035 u L,總體積 50 u L。
[0104]上述50 ii L PCR反應(yīng)體系進(jìn)行如下PCR反應(yīng)程序:
[0105]94°C 預(yù)熱 5min ;然后 94°C 50s, 44°C 30s, 72 °C lmin,30 個循環(huán)；最后 72°C 延伸IOmin0
[0106]回收PCR產(chǎn)物并與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5 a，挑取菌落進(jìn)行測序驗證。其測序結(jié)果如SEQ ID NO: 15所示。將測序結(jié)果與順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因(如SEQ ID NO:1所示)進(jìn)行比對,結(jié)果顯示:如SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列相當(dāng)于把順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的終止密碼子TAA突變?yōu)锳AA并在其3’端添加了含有終止密碼子 TAA 的 CAGACGCCGAACAAGTAA(SEQ ID NO: 16)這一段核苷酸序列。SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:17所示，SEQ ID N0:17所示的氨基酸序列相當(dāng)于在SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的C-端添加了 6個氨基酸序列(SEQ IDNO: 18)。用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I分別對含有如SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的pUCm-T載體和pET-22b(+)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，用T4DNA連接酶將酶切下來的如SEQID NO: 15所示的核苷酸序列與酶切后的pET-22b (+)載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，構(gòu)建含有如SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的pET_22b (+)重組載體和含有此pET-22b (+)重組載體的基因工程菌。
[0107]此基因工程菌在含100 U g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過夜。以只含pET-22b(+)載體而無任何外源核苷酸插入片段的大腸桿菌BL21為對照。按照實(shí)施例1中順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性的測定方法，對照菌沒有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力，而上述基因工程菌酶活力為35800U/g。
[0108]利用本實(shí)施例所述的基因工程菌，用實(shí)施例5的方法制備L(+)酒石酸，同樣得到純度為99.9%的L(+)酒石酸。
[0109]3.在本發(fā)明所述的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的5’端和3’端同時隨意添加一段核苷酸序列
[0110]以克雷伯氏菌BK-58的基因組為模板，引物5和引物6為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為:實(shí)施例3步驟I所得的模板3 u L，Taq DNA聚合酶(5M/ u L) I u L, 10XPCRbuffer5 u LjMgCl2 (25mmol/L) 3 u L，弓 I物 5 (10 u mol/ U L) I u L，弓 I物 6 (10 u mol/ u L) I u L,dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2035 u L,總體積 50 u L。
[0111]上述50 ii L PCR反應(yīng)體系進(jìn)行如下PCR反應(yīng)程序:
[0112]94°C 預(yù)熱 5min ;然后 94°C 50s, 54°C 30s, 72 °C lmin,30 個循環(huán)；最后 72°C 延伸IOmin0
[0113]回收PCR產(chǎn)物并與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5 a，挑取菌落進(jìn)行測序驗證。其測序結(jié)果如SEQ ID NO: 19所示。將測序結(jié)果與順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因(如SEQ ID NO:1所示)進(jìn)行比對,結(jié)果顯示:如SEQ ID NO: 19所示的核苷酸序列相當(dāng)于在如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的5’端添加了 ATGGACCGTCGTCAGTTC(SEQ ID NO: 11)這一段核苷酸序列，同時將順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的終止密碼子TAA突變?yōu)锳AA并在其3’端添加了含有終止密碼子TAA的CAGACGCCGAACAAGTAA (SEQ ID NO: 16)這一段核苷酸序列。SEQ ID NO: 19所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:20所示，SEQ IDNO: 19所示的氨基酸序列相當(dāng)于在SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的N-端添加了 6個氨基酸序列(SEQ ID NO: 13)同時在其C-端添加了 6個氨基酸序列(SEQ ID NO: 18)。用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I分別對含有如SEQ ID NO: 19所示的核苷酸序列的pUCm_T載體和pET-22b(+)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，用T4DNA連接酶將酶切下來的如SEQ ID N0:19所示的核苷酸序列與酶切后的pET-22b (+)載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，構(gòu)建含有如SEQ ID勵:19所示的核苷酸序列的？￡1'-2213(+)重組載體和含有此pET_22b (+)重組載體的基因工程菌。
[0114]此基因工程菌在含100 u g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過夜。以只含pET-22b(+)載體而無任何外源核苷酸插入片段的大腸桿菌BL21為對照。按照實(shí)施例1中順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性的測定方法，對照菌沒有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力，而上述基因工程菌酶活力為36200U/g。
[0115]利用本實(shí)施例所述的基因工程菌，用實(shí)施例5的方法制備L(+)酒石酸，同樣得到純度為99.9%的L(+)酒石酸。
[0116]4.在本發(fā)明所述的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的內(nèi)部取代一段核苷酸序列
[0117]根據(jù)SEQ ID NO:1所示的序列設(shè)計突變引物:引物7和引物8，引物7和引物8的序列分別為:
[0118]引物7: 5，-AGTGATCAAGGGGGAAAAACCGTGGACCACGACAG (SEQ ID NO: 21)；
[0119]引物8:5’ -CTGTCGTGGTCCACGGTTTTTCCCCCTTGATCACT (SEQ ID NO: 22)。
[0120]以實(shí)施例4中含有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的pET_22b(+)重組載體為模板，引物7和引物8為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為:模板3iiL，SuperLA Taq DNA聚合酶(5M/ u L) I u L, 10XPCR buffer5 y L,引物 7 (10 y mol/y L) 2 y L，引物 8(10 y mol/U L)2u L, dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2036 u L,總體積 50 u L。
[0121 ] 上述50 ii L PCR反應(yīng)體系進(jìn)行如下PCR反應(yīng)程序:
[0122]94°C 預(yù)熱 5min ;然后 94°C 50s, 56°C 30s, 72°C 7min，25 個循環(huán)；最后 72°C 延伸IOmin0
[0123]PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)構(gòu)建基因工程菌，挑取菌落進(jìn)行測序。將測序結(jié)果(SEQ ID NO:23)與順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因(SEQ ID NO:1)進(jìn)行比對，比對結(jié)果顯示，SEQ ID NO: 23所示的序列是SEQ ID NO:1所示的序列第299、300位的核苷酸GG被核苷酸AA取代的結(jié)果。SEQ ID NO: 23所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示，SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列相當(dāng)于SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的第100位氨基酸精氨酸被賴氨酸取代的結(jié)果。
[0124]此基因工程菌在含100 U g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過夜。以只含pET-22b(+)載體而無任何外源核苷酸插入片段的大腸桿菌BL21為對照。按照實(shí)施例1中順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性的測定方法，對照菌沒有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力，而上述基因工程菌酶活力為32400U/g。
[0125]利用本實(shí)施例所述的基因工程菌，用實(shí)施例5的方法制備L(+)酒石酸，同樣得到純度為99.9%的L(+)酒石酸。
[0126]5.在本發(fā)明所述的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的5’端缺失一段核苷酸序列
[0127]根據(jù)SEQ ID NO:1所示的序列設(shè)計含有限制性內(nèi)切酶Nde I識別位點(diǎn)的正向引物9，引物9的序列為:
[0128]引物9:5’-CATATG AACCAGATGGCCTTA(SEQ ID NO:25)；
[0129]以克雷伯氏菌BK-58的基因組為模板，引物9和實(shí)施例4中的引物4為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為:實(shí)施例3步驟I所得的模板3 ii L，Taq DNA聚合酶(5M/U L) I U L, 10XPCR buffer5 u L, MgCl2 (25mmol/L) 3 u L,引物 5 (10 u mol/u L) I u L,引物
4(10 u mol/u L) I u L, dNTP (IOOmmoI/L) I u L, H2035 u L,總體積 50 u L。
[0130]上述50 ii L PCR反應(yīng)`體系進(jìn)行如下PCR反應(yīng)程序:
[0131]94°C 預(yù)熱 5min ;然后 94°C 50s, 44°C 30s, 72 °C lmin,30 個循環(huán)；最后 72°C 延伸IOmin0
[0132]回收PCR產(chǎn)物并與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5 a，挑取菌落進(jìn)行測序驗證。其測序結(jié)果如SEQ ID N0:26所示。將測序結(jié)果與順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因(如SEQ ID NO:1所示)進(jìn)行比對,結(jié)果顯示:如SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列相當(dāng)于在如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的5’端缺失了
[0133]AACCAGATGGCCTTAAAGCCCTGTTCTTTGACGTCCAGGGAACACTTGTCGATTTTTATTCGACAATCACCCGAG AGGGCGAAGCCTTCTCAGCTGTTC這一段核苷酸序列。SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:27所示，SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列相當(dāng)于在SEQID N0:2所示的氨基酸序列的N-端缺失了 33個氨基酸序列。用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I分別對含有如SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列的pUCm_T載體和pET_22b (+)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，用T4DNA連接酶將酶切下來的如SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列與酶切后的pET-22b(+)載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建含有如SEQ IDNO: 26所示的核苷酸序列的pET-22b (+)重組載體和含有此pET_22b (+)重組載體的基因工程菌。
[0134]此基因工程菌在含100 U g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過夜。以只含pET-22b(+)載體而無任何外源核苷酸插入片段的大腸桿菌BL21為對照。按照實(shí)施例I中順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性的測定方法，對照菌沒有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力，而上述基因工程菌酶活力為33600U/g。
[0135]利用本實(shí)施例所述的基因工程菌，用實(shí)施例5的方法制備L(+)酒石酸，同樣得到純度為99.9%的L(+)酒石酸。
[0136]以上各實(shí)施例中，某些步驟并非必須，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行順序更替、具體操作參數(shù)的改變或類似步驟的替換等。
[0137]盡管已參照本發(fā)明的確定優(yōu)選實(shí)例表示和描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員將理解的是，可在不背離由 所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明宗旨和范圍的前提下對本發(fā)明進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)上的修改。
[0138]
【權(quán)利要求】
1.一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因具有如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一種順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因，其特征在于其與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有70%以上的同源性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因，其特征在于其與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有80%以上的同源性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因，其特征在于其與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:15 或 SEQID NO:19 所示。
7.一種多肽，其特征在于其具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
8.一種由權(quán)利要求2所述的編碼基因編碼的多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
9.一種多肽，其特征在于其氨基酸序列是由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列經(jīng)過氨基酸的取代、缺失或添加而得，并且具有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽，其特征在于其具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的50個以上的氨基酸，其順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力至少為完整氨基酸序列SEQ ID NO:2的80%以上。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多肽，其特征在于其具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的100個以上的氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多肽，其特征在于其順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力至少為完整氨基酸序列SEQ ID NO:2的95%以上。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO:24, SEQ IDNO:27, SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 17 或 SEQ ID NO:20 所示。
14.一種多核苷酸，其特征在于其具有用于編碼權(quán)利要求9所述多肽的核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的多核苷酸，其特征在于其與SEQID NO:1所示的核苷酸序列具有70%以上的同源性。
16.—種重組表達(dá)載體或重組微生物菌株,其特征在于:用于表達(dá)權(quán)利要求7-13任一權(quán)利要求所述的多肽。
17.一種使用權(quán)利要求7-13任一權(quán)利要求所述的多肽制備L ( + )_酒石酸或其鹽的方法，其特征在于:將該多肽與順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽反應(yīng)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的制備L( + )-酒石酸或其鹽的方法，其特征在于:順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽的摩爾濃度為0.1~2mol/L，pH值為4.5~11.0，反應(yīng)溫度為10~55°C。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的制備L( + )-酒石酸或其鹽的方法，其特征在于:順式環(huán)氧琥珀酸或其鹽的摩爾濃度為0.5~1.5mol/L, pH值為6.0~9.5，反應(yīng)溫度為20~45°C。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的制備L( + )-酒石酸或其鹽的方法，其特征在于:順式環(huán)氧琥 珀酸或其鹽的摩爾濃度為0.8~1.2mol/L, pH值為8.0~9.0，反應(yīng)溫度為32~40°C。
【文檔編號】C12N1/15GK103614398SQ201310369774
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】張建國, 謝志鵬, 程永青, 潘海峰, 鮑文娜 申請人:杭州寶晶生物化工有限公司