利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于食品處理領域,公開了一種利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法。該方法包含如下具體步驟:(1)制備得到重組畢赤酵母菌GS115/pPIC9K-A4-Prx;將重組菌接種于BMGY培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至OD600為2~6,離心收集菌體;(2)用無菌BMMY液體培養(yǎng)基將菌體重懸,控制菌懸液OD600值為0.9~1.1;28~30℃,200~250r/min下每24h添加甲醇,連續(xù)誘導培養(yǎng)3d后,室溫離心收取上清液,即得到重組過氧化物A4-Prx粗酶液;(3)將步驟(2)的粗酶液與食品樣品液混合,反應后,即得到降解玉米赤霉烯酮后的食品樣品液,其玉米赤霉烯酮降解率高達70%以上。
【專利說明】利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于食品處理領域,具體涉及一種利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA,ZEN)是一種具有二羥基苯甲酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的雌激素類真菌毒素,由玉米赤霉菌、禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌等菌產(chǎn)生,主要污染小麥、大麥、燕麥、玉米等農(nóng)作物。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FA0)2002年資料,每年全世界約有25%的農(nóng)作物糧食被霉菌毒素污染,而我國每年由于霉變所引起的飼料損失占總產(chǎn)量的10%以上。
[0003]ZEN性質(zhì)穩(wěn)定難降解,玉米及其副產(chǎn)品極易受ZEN污染,從而導致大量食品中高水平的殘留量。ZEN會引起種豬或家禽早熟,生殖周期紊亂,給種豬等養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失,進一步對攝入被ZEN污染的農(nóng)、畜產(chǎn)品的人引發(fā)多種中毒癥、中樞神經(jīng)受損,甚至死亡。從全國倉庫和飼料廠中抽樣檢測,發(fā)現(xiàn)玉米等農(nóng)作物和飼料中ZEN的檢出率高達100%,檢出濃度超標嚴重。謝良民等對上海市大型超市中多類食品調(diào)查結(jié)果表明,ZEN的檢出率極高,其中調(diào)味品均超出國家標準(食品中ZEN含量≤60μ g/kg),且最高達150μ g/kg(謝良民,葛懿云,李俊旋.上海零售食品中玉米赤霉烯酮含量初步研究[J].中國科協(xié)第五屆青年學術(shù)年會文集,2004,756.)。王金榮等對酒糟蛋白飼料(DDGS)多個樣品調(diào)查結(jié)果顯示,ZEN的陽性檢出率均為100%,ZEN含量達1219.90 μ g/kg以上,超出國家標準(我國2006年飼料衛(wèi)生標準規(guī)定玉米類飼料中ZEN含量≤500 μ g/kg)2倍以上,其對以DDGS為飼料的禽畜危害深遠(王金榮,馬鵬,黃亞寬,等.2010年上半年DDGS常規(guī)養(yǎng)分含量差異及霉菌毒素污染狀況調(diào)查[J].飼料工業(yè),2011,32(17):61-64.)。此外,有研究表明十余種市售谷物相關(guān)食品中ZEN檢出率也高達76.90%。
[0004]生物轉(zhuǎn)化脫毒ZEN技術(shù)能避免物理和化學方法的去毒效果有限、營養(yǎng)物質(zhì)損失大、成本高和有害物質(zhì)殘留等缺點,已成為研究熱點和主要趨勢。日本Takahash1-Ando等人對粉紅粘帚霉(Clonostachys rosea)的研究較為全面,分離出的內(nèi)酯水解酶zhdlOl可破壞ZEN結(jié)構(gòu),使其轉(zhuǎn)化為雌激素毒性較弱的化合物,且ZEN的降解率在80~90%之間(Kimara M, Naoko T,Nishiu-chi T.Molecular Biology and Biotechnology forReduction of Fusarium Mycotoxin Contamination.Pesticide Biochemistry andPhysiology, 2006,86 (3):117-123.)。大腸桿菌和釀酒酵母表達的重組zhdlOl表現(xiàn)出了內(nèi)酯水解酶的能力,對ZEN的降解率可達75%,具有zhdlOl的轉(zhuǎn)基因玉米也具備降解ZEN的會泛力(Tomoko I,Naoko Tj Noriyuki 0,et al.Reduced contamination by the fusariummycotoxin zearalenone in maize kernels through genetic modification with adetoxification gene.Applied and Environmental Microbiology,2007,73(5):1622-1629.).
[0005]此外,奧地利Molnar從白蟻后腸中分離出了一種新酵母菌一毛孢子菌屬Trichosporon mycotoxinivorans,它的培養(yǎng)物能將ZEN降解為二氧化碳和其它弱紫外吸收的代謝物,從而降低其毒性(Molnar O, Schatzmayr G, Fuchs E, etal.Trichosporon mycotoxinivorans sp.nov., a new yeast species useful inbiological detoxification of various mycotoxins.Systematic and AppliedMicrobiology, 2004, 27:661-671.)。
[0006]Abdullah從玉米地里分離的假單胞菌ZEA-1可利用ZEN為唯一碳源,并且在12h內(nèi)可將ZEN減少一半,編碼此ZEN降解酶的基因在大腸桿菌中也獲得了活性表達(AbdullaD.Altalhi, Bahig El-Deeb.Localization of zearalenone detoxification gene(s)inpZEA—lplasmid of Pseudomonas putida ZEA-1and expressed in Escherichia col1.JHazard Mater,2009, 161:1166-1172.)。
[0007]唐語謙等從玉米耕種的土壤中分離獲得了一株可高效降解ZEN的不動桿菌 Acinetobacter sp.SM04 (Yuanshan Yu,Liping Qiu,Hui ffu,Yuqian Tang, etal.Degradation of zearalenone by the extracellular extracts of Acinetobactersp.SM041iquid cultures.Biodegradation, 2011, 22:613 - 622.),并從中分離到一個過氧化物酶 Prx (Yuanshan Yu, Liping Qiu, Hui ffu, Yuqian Tang, et al.0xidation ofzearalenone by extracellular enzymes from Acinetobacter sp.SM04into smallerestrogenic products.World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011, 27:2675-2681.)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]為了克服現(xiàn)有 技術(shù)的缺點與不足,本發(fā)明的目的在于提供一種利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA, ZEN)的方法,該方法對食品中ZEN毒素的去除率可達70%以上。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
[0010]一種利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法,包含如下具體步驟:
[0011](I)通過PCR,在SEQ ID N0.1的序列的5’端添加Avr II酶切位點,在3’端添加Not I酶切位點,得到帶有Avr II和Not I酶切位點的序列;接著通過Avr II和Not I酶分別雙酶切PPIC9K載體和前述帶有Avr II和Not I酶切位點的序列;然后將酶切后的載體和序列連接,得到A4-Prx基因插入pPIC9K載體上的重組質(zhì)粒pPIC9K_A4_Prx,將其轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,得到重組畢赤酵母菌GS115/pPIC9K_A4_Prx。
[0012](2)將重組畢赤酵母菌GS115/pPIC9K-A4-Prx接種于BMGY培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至OD600為2-6,離心收集菌體;洗滌,用無菌BMMY液體培養(yǎng)基將菌體重懸,控制菌懸液0D_值為0.9-1.1 ;28-30°C,200-250r/min下每24h添加甲醇,連續(xù)誘導培養(yǎng)3d后,室溫離心收取上清液,即得到重組過氧化物A4-Prx粗酶液。
[0013](3)將步驟(2)的重組過氧化物A4_Prx粗酶液與食品樣品液混合,反應后,即得到降解玉米赤霉烯酮后的食品樣品液。
[0014]步驟(2)所述的BMGY培養(yǎng)基的pH值為6-8 ;所述的BMMY液體培養(yǎng)基的pH值為6-8 ;所述的BMMY液體培養(yǎng)基中含有0.5%體積濃度的甲醇用于誘導。
[0015]步驟(2)所述的添加甲醇指添加至甲醇的終體積濃度為0.5%。
[0016]步驟(2)所述的振蕩培養(yǎng)指在28-30°C,振蕩頻率為200-250r/min下培養(yǎng)18h。[0017]步驟(2)所述的離心收集菌體指在速率為4000-5000r/min下離心5-lOmin。
[0018]步驟(2)所述的離心收取上清液指在速率為8000-12000r/min下離心5-IOmin0
[0019]步驟(3)所述的食品樣品液由以下方法得到:取Ig粉碎的食品,加入4mL體積分數(shù)為84%的乙腈水溶液,常溫200r/min速率下振蕩lh,靜止放置,得到食品樣品液。
[0020]步驟(3 )所用重組過氧化物A4-Prx粗酶液的量為每4mL食品樣品液使用160mL粗酶液,并添加40mL0.25mol/L Tris-HCl (pH8.5)緩沖液和8mL0.5mol/LH202水溶液混合均勻。
[0021]步驟(3)所述的反應是在40°C下反應12h。
[0022]步驟(3)所述的食品指谷物類食品,尤其是玉米相關(guān)的所有食品,包括玉米粉、食用醋、燕麥和黃豆醬油等。
[0023]測定食品樣品中的玉米赤霉烯酮含量時,取定性濾紙過濾該食品樣品液,濾液再用玉米赤霉烯酮凈化柱PriboFiisl? M260純化處理,得到樣品提取液上HPLC進行檢測。
[0024]上述重組畢赤酵母菌GS115/pPIC9K-A4_Prx用甲醇誘導培養(yǎng),表達產(chǎn)物直接分泌到胞外,離心所得到的上清液中即含有表達的蛋白產(chǎn)物一ZEN降解酶A4-Prx。
[0025]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù),具有如下的優(yōu)點及有益效果:
[0026]采用本發(fā)明的方法,對食品中ZEN毒素的降解率可達70%以上,提升各類食品的質(zhì)量以達到國家安全標準,實現(xiàn)食品的安全使用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1是畢赤酵母表達系統(tǒng)中重組質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定圖。其中:M為150bpmarker ;2 為 pPIC9K 質(zhì)粒;3 為 pPIC9K_A4_Prx 雙酶切產(chǎn)物。
[0028]圖2是重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-A4-Prx的菌落PCR鑒定圖。其中M為150bpmarker ;1 -6 為 GS115/pPIC9K_A4_Prx ;7 為 GSl 15。
[0029]圖3是表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖。其中:M為蛋白marker ;1為GSl 15 ;2為GSl 15/PPIC9K ;3 -4 為 GS115/pPIC9K-A4-Prx0
[0030]圖4是利用重組過氧化物酶A4_Prx處理玉米粉中ZEN的液相檢測圖。其中,A為玉米粉中ZEN的液相檢測圖;B為過氧化物酶A4-Prx酶液處理玉米粉樣品12h后ZEN的液相檢測圖。
[0031]圖5是利用重組過氧化物酶A4_Prx處理食用醋中ZEN的液相檢測圖。其中,A為食用醋中ZEN的液相檢測圖;B為過氧化物酶A4-Prx酶液處理食用醋樣品12h后ZEN的液相檢測圖。
[0032]圖6是利用重組過氧化物酶A4_Prx處理燕麥中ZEN的液相檢測圖。其中,A為燕麥中ZEN的液相檢測圖;B為過氧化物酶A4-Prx酶液處理燕麥樣品12h后ZEN的液相檢測圖。
[0033]圖7是利用重組過氧化物酶A4_Prx處理黃豆醬油中ZEN的液相檢測圖。其中,A為黃豆醬油中ZEN的液相檢測圖;B為過氧化物酶A4-Prx酶液處理黃豆醬油樣品12h后ZEN的液相檢測圖?!揪唧w實施方式】
[0034]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述,但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0035]實施例1
[0036]一、重組畢赤酵母菌GS115/pPIC9K-A4_Prx的構(gòu)建:
[0037](一)目的基因A4_Prx的擴增;
[0038](I)質(zhì)粒pPIC9K-A4_Prx的獲得及其驗證
[0039]①目的序列設計與合成:按Genbank上不動桿菌Acinetobacter sp.SMO4的JF964958.1序列,依照表達載體pPIC9K的多克隆位點,選擇Avr II和Not I酶切位點,設計引物(PI,P2)用于從Acinetobacter sp.SM04的總DNA中擴增目的序列。具體序列如下:
[0040]JF964958.1 序列:
[0041 ] ATGAGCTTGATTAATACTGAAGTTAAACCATTCCAAGCAACTGCTTACC
[0042]ACAACGGCCAATTTGTTGAAGTTAACGAAACTAACCTTAAAGGTAAATGGT
[0043]CTGTTGTATTCTTCTATCCAGCTGACTTCACTTTCGTTTGCCCAACTGAACT
[0044]TGGTGACTTAGCTGACAACTACGCTGAATTCCAAAAACTTGGTGTTGAAAT
[0045]TTATGCTGTATCTACTGATACACACTTCACTCACAAAGCTTGGCACGACACT
[0046]TCTGAAGAAATCAAAAAAATCCAATATCCATTAGTTGGTGACCCAACTTGG
[0047]ACTCTTTCTAAAAACTTCGACGTTCTTATCGAATCTGAAGGTTTAGCTGAC
[0048]CGTGGTACTTTCGTTATCGATCCAGAAGGTAAAATCCAAATCGTTGAACTC
[0049]AACGCTGGTGGTATCGGCCGTGACGCATCTGAACTTCTTCGTAAAGTAAAA
[0050]GCTGCTCAATACGTACACGCTCACCCAGGTGAAGTTTGTCCAGCTAAATGG[0051 ] AAAGAAGGCGAAGCTACTCTTGCTCCATCTATCGACTTAGTTGGTAAAATC
[0052]TAA
[0053]上游引物P1: 5 ’ -TTACCTAGGATGAGCTTGATTAATACTG-3 ’
[0054]下游引物P2:5 ’ -TATATTGCGGCCGCTTAGATTTTACCA-3 ’
[0055]引物的終濃度為20 μ mol/L, _20°C儲存?zhèn)溆谩?br>
[0056]PCR反應體系原料配比如下:
[0057]
【權(quán)利要求】
1.一種利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法,其特征在于包括如下具體步驟: (1)通過PCR,在SEQID N0.1的序列的5’端添加Avr II酶切位點,在3’端添加Not I酶切位點,得到帶有Avr II和Not I酶切位點的序列;接著通過Avr II和Not I酶分別雙酶切PPIC9K載體和前述帶有Avr II和Not I酶切位點的序列;然后將酶切后的載體和序列連接,得到A4-Prx基因插入pPIC9K載體上的重組質(zhì)粒pPIC9K_A4_Prx,將其轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,得到重組畢赤酵母菌GS115/pPIC9K_A4_Prx ; (2)將重組畢赤酵母菌GS115/pPIC9K-A4-Prx接種于BMGY培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至0D_為2-6,離心收集菌體;洗滌,用無菌BMMY液體培養(yǎng)基將菌體重懸,控制菌懸液OD6tltl值為0.9-1.1 ;28-30°C,200-250r/min下每24h添加甲醇,連續(xù)誘導培養(yǎng)3d后,室溫離心收取上清液,即得到重組過氧化物A4-Prx粗酶液; (3)將步驟(2)的重組過氧化物A4-Prx粗酶液與食品樣品液混合,反應后,即得到降解玉米赤霉烯酮后的食品樣品液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法,其特征在于:步驟(2)所述的BMGY培養(yǎng)基的pH值為6-8 ;所述的BMMY液體培養(yǎng)基的pH值為6-8 ;所述的BMMY液體培養(yǎng)基中含有0.5%體積濃度的甲醇用于誘導。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法,其特征在于:步驟(2)所述的添加甲醇指添加至甲醇的終體積濃度為0.5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法,其特征在于:步驟(2)所述的振蕩培養(yǎng)指在28-30°C,振蕩頻率為200-250r/min下培養(yǎng)18h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法,其特征在于:步驟(2)所述的離心收集菌體指在速率為4000-5000r/min下離心5-lOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法,其特征在于:步驟(2)所述的離心收取上清液指在速率為8000-12000r/min下離心5-lOmin。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法,其特征在于:步驟(3)所述的食品樣品液由以下方法得到:取Ig粉碎的食品,加入4mL體積分數(shù)為84%的乙腈水溶液,常溫200r/min速率下振蕩lh,靜止放置,得到食品樣品液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法,其特征在于:步驟(3)所用重組過氧化物A4-Prx粗酶液的量為每4mL食品樣品液使用160mL粗酶液,并添加40mL0.25mol/L Tris-HCl (ρΗ8.5)緩沖液和8mL0.5mol/L H2O2水溶液混合均勻。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法,其特征在于:步驟(3)所述的反應是在40°C下反應12h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用重組畢赤酵母菌降解食品中玉米赤霉烯酮的方法,其特征在于:步驟(3)所述的食品指谷物類食品。
【文檔編號】A23L1/015GK103451115SQ201310356776
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月15日
【發(fā)明者】唐語謙, 陳藝, 鐘鳳, 吳暉, 肖俊梅, 賴富饒, 余以剛, 肖性龍, 李曉鳳, 劉冬梅 申請人:華南理工大學