一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種解決上述技術(shù)問(wèn)題的利用基因敲除技術(shù)把赤霉素真菌的ent-貝殼杉烯酸氧化酶基因敲除,導(dǎo)致這種酶無(wú)法在赤霉素真菌內(nèi)表達(dá),從而避免ent-貝殼杉烯酸轉(zhuǎn)換成赤霉素A12（GA12），進(jìn)而把積累的ent-貝殼杉烯酸轉(zhuǎn)換成甜菊醇的方法。本發(fā)明的應(yīng)用和實(shí)施使其其顯著的技術(shù)效果主要體現(xiàn)在：真菌發(fā)酵生產(chǎn)赤霉素已是成熟穩(wěn)定的工藝,其菌株是赤霉素高產(chǎn)量的生產(chǎn)菌株，本發(fā)明思路新穎，巧妙地利用了已經(jīng)成熟的赤霉素生產(chǎn)通路，以獲得自然界產(chǎn)量極少的兩種萜類化合物：甜菊醇及ent-貝殼杉烯酸，產(chǎn)量遠(yuǎn)高于國(guó)外同行報(bào)道，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種赤霉素前體四環(huán)性雙萜ent-貝殼杉烯酸的制備方法、及由 ent-貝殼杉烯酸制備得到甜菊醇的方法，具體是涉及一種由基因工程改造的貝殼杉烯酸氧 化酶參與的雙萜ent-貝殼杉烯酸的制備方法、及由ent-貝殼杉烯酸制備得到甜菊醇的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 甜菊糖甙、俗稱甜菊糖、甜菊糖苷，是菊科草本植物甜葉菊提取物，其作為一種高 甜度、低熱值的非發(fā)酵性的天然甜味劑已在亞洲、北美、南美洲和歐盟各國(guó)廣泛應(yīng)用于食 品、飲料、調(diào)味料的生產(chǎn)中。甜菊糖甙的甜度為蔗糖的200?300倍，而熱量只有蔗糖的 1/300,可作為植物無(wú)熱量的代糖品。
[0003] 甜菊糖甙以二萜類化合物甜菊醇（Steviol)為糖苷非糖配基，根據(jù)13位上的羥基 和19位上的羧基上以0-糖苷鍵相連的糖基種類及數(shù)最不同，已有至少8種糖苷被發(fā)現(xiàn)，其 中以萊寶迪甙（RebaudiosideA)為主。早期甜菊糖甙的生產(chǎn)方法主要是直接從甜葉菊植 物中提取得到甜菊糖甙，而由該方法得到的甜菊糖甙產(chǎn)物經(jīng)常會(huì)由于提取步驟工藝過(guò)程 中的雜質(zhì)引入而帶有不良味道，其作為食物添加劑的安全性受到影響，且單純由植物得到 的方法嚴(yán)重限制于耕作條件影響的甜葉菊產(chǎn)量，因此，解決上述問(wèn)題的甜菊糖甙及其前提 甜菊醇的合成成為研究熱點(diǎn)。
[0004] 而赤霉素，一類化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于二萜類酸的植物激素，已有研究表明甜菊糖甙生物 合成過(guò)程與赤霉素生物合成密切相關(guān)。赤霉素主要是依靠赤霉菌（Gibberellafujikuroi) 發(fā)酵工藝制得，該工藝成熟、完善的工藝，已有30年到40年的使用歷史，其過(guò)程中的重 要中間體貝殼杉烯酸同時(shí)也是甜菊糖甙的前體物質(zhì)，如下述路線所示：

【權(quán)利要求】
1. 一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特征在于，該方法包括：載體 構(gòu)建中包含ent-貝殼杉烯酸氧化酶基因的敲除或/和優(yōu)化后的ent-貝殼杉烯酸羥化酶基 因的插入，所述的萜類化合物是ent-貝殼杉烯酸、甜菊醇、萊鮑迪甙A，萊鮑迪甙B，萊鮑迪 甙C，萊鮑迪甙D，萊鮑迪甙E，萊鮑迪甙F或萊鮑迪甙M。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特征在 于，優(yōu)化后的ent-貝殼杉烯酸羥化酶基因，其堿基序列如序列表中SEQ ID NO :4所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特 征在于，所述的利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其工程菌為大腸桿菌、酵母細(xì) 胞、海藻細(xì)胞、植物細(xì)胞、革蘭氏陽(yáng)性菌或真菌中的任意一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特征在 于，所述的酵母細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞或亞羅酵母。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特征在 于，所述的革蘭氏陽(yáng)性菌為芽孢桿菌細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特征在 于，所述的真菌為鐮刀菌，甘蔗鐮孢菌，藤倉(cāng)赤霉菌，木薯痂圓孢菌，暗球腔菌。
7. -種基于基因工程改造酶制備ent-貝殼杉烯酸的方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) ent-貝殼杉烯酸氧化酶基因敲除載體的構(gòu)建 以藤倉(cāng)赤霉菌（Gibberella fujikuroi)基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增左右同源臂， 以pCambial302為模板擴(kuò)增潮霉素基因表達(dá)框，然后以同源重組的方法將3個(gè)片段連接至 PAN7-1骨架中，測(cè)序驗(yàn)證后，獲得正確的敲除載體； (2) 基因工程菌的獲得 將藤倉(cāng)赤霉菌（Gibberella fujikuroi )接種到PDA固體培養(yǎng)上，27°C培養(yǎng)8天后，從 新鮮斜面上取大小約0. 5cm2的菌苔，磨碎后接入100ml MYG液體培養(yǎng)基中，24°C，130r/min 培養(yǎng)24小時(shí)后按1%的接種量（v/v)轉(zhuǎn)種到上述新鮮液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)15小時(shí).菌 絲用無(wú)菌水、1M的MgS04各洗滌一遍；取大約lg濕菌絲于10ml溶壁酶液中，37°C溫育4小 時(shí)，所述溶壁酶液配置方法為：l〇ml的1M MgS04中加入200mg溶壁酶，過(guò)濾除菌；懸浮液 用3000rpm離心lOmin，棄去含菌絲體碎片的沉淀，上清用無(wú)菌水緩緩稀釋至MgS04濃度為 0. 5M，3000rpm離心15min，沉淀原生質(zhì)體用0. 5M MgS04、lM山梨醇溶液各洗漆一遍，最后原 生質(zhì)體懸浮于1M山梨醇溶液中，適當(dāng)稀釋后涂布于MYG固體再生培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)2-3 天，觀察再生情況； 將原生質(zhì)體的濃度調(diào)為6xl07個(gè)/ml，取0. 4ml原生質(zhì)體，加入10ug或20ug線性化的 質(zhì)粒DNA，混合后冰浴20min，加入100ul PEG8000溶液，混勻后冰浴20min.再加入2mlPEG 8000溶液，混勻后室溫5min以上；用4ml山梨醇溶液稀釋，3000rpm離心10min，沉淀用2ml 山梨醇溶液懸浮；取〇. 2ml原生質(zhì)體涂布于15ml的再生培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)12小時(shí)后，覆 蓋l〇ml含潮霉素的軟瓊脂MYG，26°C繼續(xù)培養(yǎng)6 - 7天后觀察結(jié)果； (3) 轉(zhuǎn)化子的檢出 在對(duì)照沒(méi)有生長(zhǎng)的前提下，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化平板上的抗性菌落數(shù)；計(jì)算轉(zhuǎn)化率；將轉(zhuǎn)化子接 種到含抗生素的平板上測(cè)定其抗性水平；分別用PCR擴(kuò)增測(cè)序法及Soutern Blot的方法 進(jìn)行驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性菌落轉(zhuǎn)接到含抗生素的PDA培養(yǎng)基上，重復(fù)繼代篩選6次，保存菌 株； (4)發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定 所得赤霉工程菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，接入種子培養(yǎng)基50ml中，在30°C、300rpm 搖床培養(yǎng)48小時(shí)，然后以10%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，250ml三角瓶裝30ml發(fā)酵培養(yǎng) 基，在30°C、300rpm發(fā)酵8天；發(fā)酵液經(jīng)單層濾紙過(guò)濾后將濾液pH調(diào)至2. 0,濾液經(jīng)0. 45um 濾膜過(guò)濾，所得樣品進(jìn)行HPLC色譜分析。
8. -種由上述ent-貝殼杉烯酸制得甜菊醇的方法，包括如下步驟： (1) ent-貝殼杉烯酸羥化酶基因插入載體的構(gòu)建 將來(lái)自甜葉菊（Stevia Rebaudiana Bertoni)編碼的ent-貝殼杉烯酸輕化酶（KAH， kaurenoic acid_13hydroxylase)的多核苷酸(Genbank Accession Number: EU722415, SEQ ID NO :3)進(jìn)行密碼子優(yōu)化后通過(guò)全基因合成的方式獲得，以用于在藤倉(cāng)赤霉菌 (Gibberella fujikuroi)中表達(dá)；將優(yōu)化后的編碼ent-貝殼杉烯酸輕化酶的多核苷酸 (SEQ ID N0:4)克隆到改進(jìn)后的這pAN7-l表達(dá)載體中g(shù)pdA啟動(dòng)子的控制下，得到可以表達(dá) ent-貝殼杉烯酸羥化酶的質(zhì)粒；所用克隆方法為同源重組的方式，所用到的擴(kuò)增引物為： F4: 5' CTTTTCTCTTTCTTTTCCCAATGGAGGCTTCTTACCTCTACATCT 3' R4: 5' TCAGTAACGTTAAGTGGATCCTTATTAGAGCTCAGAGAGGAGGTTG 3' 以Gibberella fujikuroi基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增左右同源臂；以pCambial302 為模板擴(kuò)增潮霉素基因表達(dá)框，然后以同源重組的方法將4個(gè)片段連接至pAN7-l骨架中， 測(cè)序驗(yàn)證后，獲得正確的插入載體； (2) 基因工程菌的獲得 將藤倉(cāng)赤霉菌（Gibberella fujikuroi)接種到PDA固體培養(yǎng)上，27°C培養(yǎng)8天后，從 新鮮斜面上取大小約0. 5cm2的菌苔，磨碎后接入100ml MYG液體培養(yǎng)基中，24°C，130rpm 培養(yǎng)24小時(shí)后按1%的接種量（v/v)轉(zhuǎn)種到上述新鮮液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)15小時(shí)；菌 絲用無(wú)菌水、1M的MgS04各洗滌一遍；取大約lg濕菌絲于10ml溶壁酶液中，37°C溫育4小 時(shí)，所述溶壁酶液配置方法為：l〇ml的1M MgS04中加入200mg溶壁酶，過(guò)濾除菌；懸浮液用 3000rpm離心10min，棄去含菌絲體碎片的沉淀，上清用無(wú)菌水緩緩稀釋至MgS04濃度為0. 5 M，3000rpm離心15min，沉淀(原生質(zhì)體）用0. 5M MgS04、1M山梨醇溶液各洗滌一遍，最后原 生質(zhì)體懸浮于1M山梨醇溶液中，適當(dāng)稀釋后涂布于MYG固體再生培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)2-3 天，觀察再生情況； 將原生質(zhì)體的濃度調(diào)為6xl07個(gè)/ml，取0. 4ml原生質(zhì)體，加入10ug或20ug線性化的 質(zhì)粒DNA，混合后冰浴20min.加入100ul PEG8000溶液，混勻后冰浴20min.再加入2ml PEG 8000溶液，混勻后室溫5min以上；用4ml山梨醇溶液稀釋，3000rpm離心10min，沉淀用2ml 山梨醇溶液懸??；取〇. 2ml原生質(zhì)體涂布于15ml的再生培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)12小時(shí)后，覆 蓋l〇ml含潮霉素的軟瓊脂MYG ;26°C繼續(xù)培養(yǎng)6 - 7天后觀察結(jié)果； (3) 轉(zhuǎn)化子的檢出 在對(duì)照沒(méi)有生長(zhǎng)的前提下，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化平板上的抗性菌落數(shù)；計(jì)算轉(zhuǎn)化率；將轉(zhuǎn)化子接 種到含抗生素的平板上測(cè)定其抗性水平；分別用PCR擴(kuò)增測(cè)序法及Soutern Blot的方法 進(jìn)行驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子；將陽(yáng)性菌落轉(zhuǎn)接到含抗生素的PDA培養(yǎng)基上，重復(fù)繼代篩選6次，保存菌 株； (4)發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定 所得赤霉工程菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，接入種子培養(yǎng)基50ml中，在30°C、300rpm 搖床培養(yǎng)48小時(shí)，然后以10 %的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，250ml三角瓶裝30ml發(fā)酵培養(yǎng) 基，在30°C、300rpm發(fā)酵8天；發(fā)酵液經(jīng)單層濾紙過(guò)濾后將濾液pH調(diào)至2. 0,濾液經(jīng)0. 45um 濾膜過(guò)濾，所得樣品進(jìn)行HPLC色譜分析。
【文檔編號(hào)】C12N15/09GK104342432SQ201310310257
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月23日
【發(fā)明者】朱惠霖 申請(qǐng)人:南京諾云生物科技有限公司