一種白金針菇菌包工廠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)配套新品種選育方法
【專利摘要】一種白金針菇菌包工廠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)配套新品種選育方法。發(fā)明屬于食用菌栽培學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及怎樣在人工條件下培育白金針菇新品種的方法，通過(guò)收集國(guó)內(nèi)栽培白金針菇菌株，通過(guò)菌株純化、拮抗試驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行親緣關(guān)系比較，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行菌包工廠化生產(chǎn)發(fā)菌試驗(yàn)，構(gòu)建小型核心種質(zhì)庫(kù)，對(duì)篩選出各方面優(yōu)良的菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合雜交等實(shí)驗(yàn)，篩選并最終選育出生產(chǎn)能力旺盛、生物轉(zhuǎn)化率高的新品種，并進(jìn)行各級(jí)菌種培養(yǎng)和出菇實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化新菌種的培養(yǎng)條件并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特征分析，為白金針菇的進(jìn)一步推廣開發(fā)研究提供新的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菌種。
【專利說(shuō)明】一種白金針菇菌包工廠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)配套新品種選育方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食用菌栽培學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及怎樣在人工條件下培育白金針菇新品種 的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 金針燕學(xué)名毛柄金錢菌，又稱毛柄小火燕、構(gòu)菌、樸燕、冬燕、樸菰、凍菌、金燕、智 力燕等，英文為：〃ENIKI MUSHROOM〃，學(xué)名為/?遞因其菌柄細(xì)長(zhǎng)，似金 針菜，故稱金針菇，屬傘菌目白蘑科金針菇屬。
[0003] 金針菇在自然界廣為分布，中國(guó)、日本、俄羅斯、歐洲、北美洲、澳大利亞等地均有 分布。在中國(guó)北起黑龍江，南至云南，東起江蘇，西至新疆均適合金針菇的生長(zhǎng)。金針菇不 含葉綠素，不具有光合作用，不能制造碳水化合物，完全可在黑暗環(huán)境中生長(zhǎng)，必須從培養(yǎng) 基中吸收現(xiàn)成的有機(jī)物質(zhì)，如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪的降解物，為腐生營(yíng)養(yǎng)型，是一種 異養(yǎng)生物，屬擔(dān)子菌類。金針菇是一種木材腐生菌，易生長(zhǎng)在柳、榆、白楊樹等闊葉樹的枯樹 干及樹樁上。金針菇是秋冬與早春栽培的食用菌，以其菌蓋滑嫩、柄脆、營(yíng)養(yǎng)豐富、味美適口 而著稱于世。據(jù)測(cè)定，金針菇氨基酸的含量非常豐富，高于一般菇類，尤其是賴氨酸的含量 特別高，賴氨酸具有促進(jìn)兒童智力發(fā)育的功能。金針菇干品中含蛋白質(zhì)8. 87%，碳水化合物 60. 2%，粗纖維達(dá)7. 4%，經(jīng)常食用可防治潰瘍病。最近研究又表明，金針菇內(nèi)所含的一種物質(zhì) 具有很好的抗癌作用。金針菇既是一種美味食品，又是較好的保健食品，金針菇的國(guó)內(nèi)外市 場(chǎng)日益廣闊。金針菇人工栽培技術(shù)并不復(fù)雜，只要能控制好環(huán)境條件，就容易獲得穩(wěn)定可靠 的產(chǎn)量。在作為食材時(shí)，金針菇特別是涼拌菜和火鍋的上好食材，其營(yíng)養(yǎng)豐富，清香撲鼻而 且味道鮮美，深受大眾的喜愛(ài)。
[0004] 雖然金針菇營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值高，但國(guó)內(nèi)對(duì)金針菇的研究起步較晚，尤其白金針菇菌 包工廠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)優(yōu)良品種選育和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)工藝的研究，更是近幾年才剛剛開始。有 關(guān)金針菇的研究上世紀(jì)末本世紀(jì)初才逐漸開始，且主要停留在對(duì)金針菇的野生馴化、生物 學(xué)特性及人工栽培技術(shù)等方面。近年來(lái)，我國(guó)和日本已對(duì)金針菇的人工馴化新品種進(jìn)行了 研究，但由于對(duì)金針菇的生物學(xué)特性了解不夠完善，人工栽培子實(shí)體，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量 低，因而未得到全面開發(fā)，目前金針菇在日本和我國(guó)非常暢銷，而且價(jià)格較高。隨著人們對(duì) 金針菇食（藥）用價(jià)值認(rèn)識(shí)的逐步深入，許多食品及藥品行業(yè)對(duì)其需求也越來(lái)越大，但受 現(xiàn)在金針菇新品種的影響，金針菇的種植利潤(rùn)價(jià)值一直很高，因此有著廣闊的發(fā)展前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] -、試驗(yàn)菌株資源收集與整理 菌種資源是新品種選育的基石，是資源創(chuàng)新利用的基礎(chǔ)。我們已經(jīng)收集了國(guó)內(nèi)外的人 工生產(chǎn)白金針菇菌株20種。已分別進(jìn)行了菌株的來(lái)源、種類、生物學(xué)特征、分類地位、分子 標(biāo)記（ITS序列信息）的材料檔案，并已建立了從白金針菇子實(shí)體分離和保存菌種的操作規(guī) 程和方法體系，保證了我們可以源源不斷地收集和提純復(fù)壯白金針菇。
[0006] 考慮國(guó)內(nèi)金針菇菌株品種混亂，同種異名，異種同名現(xiàn)象普遍，我們采用常規(guī)的拮 抗實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行排除。
[0007] 1.菌株菌絲形態(tài)觀察 選取菌株生長(zhǎng)旺盛的菌株進(jìn)行試驗(yàn)。
[0008] 2.菌株保守性ERIC分子鑒定技術(shù)（圖1) 2. 1 PDA液體培養(yǎng)基。
[0009] 2. 2基因組總DNA提取采用2 X CTAB。
[0010] 取〇. 2g液氮研磨的真菌粉末，放入1. 5mL以滅菌的EP管，加入600uL已65°C預(yù)熱 的2 X CTAB提取液，再加入1. 2uL的巰基乙醇，充分混勻。65°C水浴45min，期間定期晃動(dòng)混 勻。將EP管從水浴中拿出，室溫冷卻后，再在該EP管中加入600uL的氯仿：異戊醇（24:1)， 振蕩混勻5-10min。8000r/min離心lOmin，取上清。重復(fù)抽提兩次。加0. 8倍體積的冷的 異丙醇，混勻，-20°C放置15-30min。10000r/min離心8min去沉淀，70%乙醇清洗2次，風(fēng) 干。加 100uLTE(pH8. 0)溶解。加入 2uLRNaseA(10mg/ml)，37°C溫箱中 30min。加等體積氯 仿：異戊醇（24 :1)，振蕩混勻，10000r/min離心lOmin取上清。加入2倍的冷的無(wú)水乙醇 和 1/10 的 3MNaAC，-20°C放置 15-30min。10000r/min 離心 lOmin。取沉淀，70% 乙醇清洗 2 次，風(fēng)干，加20uLTE(pH8. 0)溶解，4°C保存。
[0011] 2.2 ERIC 分子鑒定 通過(guò)ERIC分子標(biāo)記技術(shù)，剔除掉相互間異名同種的白金針菇菌菌株，保留下相互間有 差異的白金菇菌株。最后，白金針菇菌種資源來(lái)源，如下表所示： 表1白金針菇菌株來(lái)源 Table 1 Sources of Flammulina velutipes

【權(quán)利要求】
1. 種細(xì)胞質(zhì)融合在白金針菇菌包工廠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)中的育種技術(shù)，其特征在于該新品種 通過(guò)兩個(gè)菌株細(xì)胞質(zhì)體融合成雜交合體。
2. 具體工藝步驟為： 供試菌株的菌絲體液體培養(yǎng) 原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的形成 原生質(zhì)體的融合 融合的原生質(zhì)體再生 融合子的篩選 優(yōu)良融合子的鑒定 白金針菇菌包工廠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1 一種細(xì)胞質(zhì)融合在白金針燕菌包工廠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)中的育種技術(shù)所 述，其步驟2特征在于包括：配制穩(wěn)滲劑，并用針孔過(guò)濾器過(guò)濾除菌；將-20 °C冰箱中保存 的溶壁酶稱取〇. 05 g的溶壁酶至無(wú)菌5 ml的EP管中，并用過(guò)濾除菌的穩(wěn)滲劑稀釋并加入 5 μ 1氯霉素溶液除菌，待用；去25 °C下培養(yǎng)5天的2個(gè)金針菇菌株菌絲體取出并用穩(wěn)滲 劑清洗兩次；將清洗后的白金針菇菌絲體轉(zhuǎn)至盛有溶壁酶液的EP管中，并用封口膜封口， 劇烈震蕩使菌絲體破裂便于消化； 將EP管置于30°C的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中消化，每半小時(shí)取0. 1 ml的酶液觀察并計(jì)數(shù)，直 至原生質(zhì)體數(shù)量開始下降，最后一次計(jì)數(shù)的時(shí)間減去半小時(shí)即為最佳消化時(shí)間；將最佳消 化時(shí)間內(nèi)消化的酶液用四層的擦鏡紙過(guò)濾兩次(注意過(guò)濾次數(shù)不宜過(guò)多，否則收集到的原 生質(zhì)體數(shù)量將受到明顯影響)，離心收集菌體，并用穩(wěn)滲劑調(diào)整菌體濃度至1X l〇7r/ml，計(jì) 算獲得的原生質(zhì)體比例，三次計(jì)數(shù)取平均值。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 一種細(xì)胞質(zhì)融合在白金針燕菌包工廠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)中的育種技術(shù)所 述，其步驟3特征在于用不同的溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑，以蒸餾水作為對(duì)照，在相同條件 下，用溶壁酶進(jìn)行作用，結(jié)果如表1所示。表1穩(wěn)滲劑對(duì)原生質(zhì)體得率的影響
經(jīng)上表我們可以看出0. 6M的KC1溶液和MgS04溶液做穩(wěn)滲劑效果較好，但在觀察中發(fā) 現(xiàn)利用MgS04溶液做穩(wěn)滲劑得到的原生質(zhì)體在4°C的冰箱中保存兩天后細(xì)胞破裂嚴(yán)重，所以 本實(shí)驗(yàn)中采用KC1做穩(wěn)滲劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 一種細(xì)胞質(zhì)融合在白金針燕菌包工廠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)中的育種技術(shù)所 述，其步驟5的特征在于與酵母菌等低等真菌不同，白金針菇屬于高等真菌，在進(jìn)行原生質(zhì) 體再生時(shí)的再生比例一般低于5%，因此取稀釋濃度為1000col/ml的原生質(zhì)體懸濁液0. lml 進(jìn)行復(fù)壁培養(yǎng)并進(jìn)行五次計(jì)數(shù)取平均值，以降低因菌體未混勻帶來(lái)的偶然性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 一種細(xì)胞質(zhì)融合在白金針燕菌包工廠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)中的育種技術(shù) 所述，其步驟8特征在于包括：拌料一打包一滅菌一接菌一:1?養(yǎng)（18 -20°C )-催雷（13- 15°C)-出菇(冷庫(kù)4-8°C)-采收一包裝一運(yùn)輸銷售。
【文檔編號(hào)】C12N15/04GK104250644SQ201310221260
【公開日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2013年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月3日
【發(fā)明者】蔡德華 申請(qǐng)人:魯東大學(xué)