專利名稱：一種金針菇、靈芝混菌發(fā)酵的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種混菌發(fā)酵的方法，具體涉及一種金針菇、靈芝混菌發(fā)酵的方法。
背景技術(shù)：
金M鬼QFIammuIina被稱為“增智燕”,含有18種氨基酸,包括8種人體必需的氣基酸，富含鋒、I丐、憐、鐵等多種礦物質(zhì)，有促進(jìn)人體智力、生長(zhǎng)發(fā)育、提聞機(jī)體免疫能力的作用，尤其在增強(qiáng)機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力、抗疲勞、消除疲勞等方面的作用強(qiáng)于蘑菇、香菇、木耳等食用菌。靈芝(fefloofe/ma含有多糖、三職類化合物、多肽等十多種有效成分。靈芝不同于一般藥物對(duì)某種疾病而起治療作用，亦不同于一般營(yíng)養(yǎng)保健食品只對(duì)某一方面營(yíng)養(yǎng)素的不足進(jìn)行補(bǔ)充和強(qiáng)化，而是在整體上雙向調(diào)節(jié)人體機(jī)能平衡，調(diào)節(jié)人體新陳代謝機(jī)能，提高自身免疫能力和耐缺氧能力，促使內(nèi)臟或器官機(jī)能正?；Ｈ斯ぴ耘嘟疳樄?、靈芝由于子實(shí)體生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，受季節(jié)和原材料的限制，產(chǎn)量低，不能滿足需要，目前研究主要集中在分別對(duì)金針菇、靈芝進(jìn)行深層發(fā)酵工藝及活性物質(zhì)功能上，但在發(fā)酵過(guò)程中普遍使用一些生化物質(zhì)作為其發(fā)酵的培養(yǎng)基組分，這不僅造成培養(yǎng)基價(jià)格較貴，同時(shí)發(fā)酵后產(chǎn)物利用方面還存在安全性問(wèn)題?；炀l(fā)酵是指采用兩種或多種微生物的協(xié)同作用共同完成某發(fā)酵過(guò)程的一種新型發(fā)酵技術(shù)，是純種發(fā)酵技術(shù)的新發(fā)展，也是一種不需要進(jìn)行復(fù)雜的DNA體外重組卻可取得類似效果的新型發(fā)酵技術(shù)，可提高發(fā)酵效率甚至可形成新產(chǎn)品。上海師范大學(xué)王淑珍曾用靈芝、松茸混菌發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵后，由于活性物質(zhì)間的協(xié)同、增效、互補(bǔ)，及新產(chǎn)生的活性物質(zhì)，其生理功能效果優(yōu)于原來(lái)的單菌發(fā)酵產(chǎn)物。目前真菌混菌發(fā)酵技術(shù)及其相關(guān)產(chǎn)品尚有待于進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種能促進(jìn)、提高和改變發(fā)酵液中活性產(chǎn)物質(zhì)量的金針燕、靈芝混菌發(fā)酵方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的該混菌發(fā)酵方法為混菌發(fā)酵培養(yǎng)基由雙糖、多糖、淀粉類糧食、蛋白質(zhì)類糧食組成，所述的混菌發(fā)酵培養(yǎng)基包括l(T20g/L淀粉、15 25g/L馬鈴薯、l(T20g/L蔗糖、l(T30g/L玉米、l 10g/L黃豆；采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，混菌培養(yǎng)金針菇和靈芝；以金針菇和靈芝為菌種，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基活化、液體發(fā)酵培養(yǎng)制備單菌發(fā)酵種子液，混合接種金針菇、靈芝于混菌發(fā)酵培養(yǎng)基，接種比例I:廣3:1，溫度22^26°C,pH 4. 5^5. 5，培養(yǎng)時(shí)間是12(T240h，混菌發(fā)酵后的菌絲和發(fā)酵液可用于發(fā)酵產(chǎn)物生物量、多糖及三萜類化合物的提取與測(cè)定。具體步驟如下
(I)配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基按照GB4789. 15-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》配制，用于菌種的復(fù)蘇及保存；(2)菌種活化取金針菇No.5. 65菌株和靈芝No. 5. 786菌株分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上活化廣2次；
(3)分別制備單菌發(fā)酵種子液取金針菇、靈芝活化后的菌塊分別接種于液體培養(yǎng)基中，22 26 °C發(fā)酵培養(yǎng)168 288h ；
(4)配制混菌發(fā)酵培養(yǎng)基馬鈴薯去皮后切成約Icm3小塊，玉米、黃豆粉碎至顆粒大小為100 μ m,培養(yǎng)基組成為l(T20g/L淀粉、15 25g/L馬鈴薯、l(T20g/L蔗糖、l(T30g/L玉米、riOg/L黃豆，加水配制；先將馬鈴薯、玉米、黃豆加水煮25min，再加入溶解好的淀粉和蔗糖，加水定容后滅菌；
(5)制備混菌發(fā)酵種子液取金針菇、靈芝單菌發(fā)酵種子液,接種于混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液酸堿度pH 4. 5 5. 5，接種量配比為I: Γ3: 1，共計(jì)5%，22 26°C發(fā)酵培養(yǎng)144 240h ；
(6)分離生物量發(fā)酵液過(guò)濾收集菌絲，60°C烘干至質(zhì)量恒定并稱質(zhì)量；
(7)胞外粗多糖提取與測(cè)定發(fā)酵液過(guò)濾后離心取上清液，8(T90°C水浴濃縮成原體積的O. 2^0. 25倍，加入4飛倍體積95%乙醇，4°C靜置，濃縮液離心，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀兩次，烘干至恒重，得胞外粗多糖；
(8)胞內(nèi)三萜類化合物的提取取Ig菌絲加50 mL甲醇靜置過(guò)夜后過(guò)濾，蒸干后加4mL 95%乙醇溶解；
(9)胞外三萜類化合物的提取取發(fā)酵液15mL，用3倍體積的水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，減壓蒸干，加4mL 95%乙醇溶解。有益效果，由于采用上述方案，使用的混菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為糧食作物，培養(yǎng)基包括馬鈴薯、玉米、黃豆粉、淀粉和蔗糖，現(xiàn)有技術(shù)中的混菌發(fā)酵培養(yǎng)基均使用化學(xué)試劑，糧食培養(yǎng)基較化學(xué)試劑培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分更全面，更有利于獲得綠色、天然、安全的活性產(chǎn)物及功能性產(chǎn)品；促進(jìn)、提高和改變了發(fā)酵液中活性產(chǎn)物質(zhì)量，達(dá)到了本發(fā)明的目的。優(yōu)點(diǎn)
(1)本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了金針菇、靈芝菌絲體的混菌發(fā)酵培養(yǎng)；
(2)培養(yǎng)基配方天然，使用方便在本發(fā)明的混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，使用的均為天然糧食作物，無(wú)化學(xué)試劑，配制方便、簡(jiǎn)單，而且通常在發(fā)酵過(guò)程中，不必對(duì)PH值進(jìn)行調(diào)節(jié)；
(3)通過(guò)金針菇、靈芝混菌發(fā)酵，與金針菇、靈芝單菌發(fā)酵相比，胞外多糖、三萜類化合物產(chǎn)量均得以8% 35%的提高。通過(guò)混菌發(fā)酵，與較單菌發(fā)酵相比，促進(jìn)、提高和改變了發(fā)酵液中活性產(chǎn)物質(zhì)量。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明
實(shí)施例I:
I、菌種
金針燕iFlanmiulina veIutipes):購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心,編號(hào)
為 5. 65 ;
艮HGanoderma購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心,編號(hào)為5. 786,經(jīng)
誘變選育后，產(chǎn)多糖能力得以一定程度的提高。2、培養(yǎng)基混菌發(fā)酵培養(yǎng)基所需原料包括蔗糖、淀粉、馬鈴薯、玉米、黃豆，購(gòu)自超市，馬鈴薯去皮后切成約Icm3小塊，玉米、黃豆粉碎至顆粒大小為100 μ m。組成為l(T20g/L蔗糖、l(T20g/L淀粉、15 25g/L馬鈴薯、l(T30g/L玉米、flOg/L黃豆，回水配制；先將馬鈴薯、玉米、黃豆加水煮25min，再加入溶解好的淀粉和蔗糖，用水定容后滅菌。金針菇、靈芝混菌發(fā)酵培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物的提取與測(cè)定
混菌發(fā)酵方法為混菌發(fā)酵培養(yǎng)基由雙糖、多糖、淀粉類糧食、蛋白質(zhì)類糧食組成，采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，混菌培養(yǎng)金針菇和靈芝；以金針菇和靈芝為菌種，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基活化、液體發(fā)酵培養(yǎng)制備單菌發(fā)酵種子液，混合接種金針菇、靈芝于混菌發(fā)酵培養(yǎng)基，接種比例1:1 3:1，溫度22 261，pH 4. 5 5. 5，培養(yǎng)時(shí)間是120 240h，混菌發(fā)酵后的菌絲和發(fā)酵液可用于發(fā)酵產(chǎn)物生物量、多糖及三萜類化合物的提取與測(cè)定。所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基為在實(shí)驗(yàn)室中被廣泛采用的培養(yǎng)基，所述的混菌發(fā)酵培養(yǎng)基即糧食培養(yǎng)基。 I、發(fā)酵工藝(培養(yǎng)瓶培養(yǎng))
將金針菇No. 5. 65菌株和靈芝No. 5. 786菌株在24 28°C下保溫培養(yǎng)活化菌種6 9天，取活化后的菌塊接種于液體培養(yǎng)基中，25°C搖床培養(yǎng)7天，制備得金針菇、靈芝單菌發(fā)酵種子液，所述的液體培養(yǎng)基是實(shí)驗(yàn)室中用于培養(yǎng)金針菇、靈芝的普通液體培養(yǎng)基；按照接種量I: f 3:1接種于320mL混菌發(fā)酵培養(yǎng)基500mL搖瓶中，25°C搖床培養(yǎng)192h，發(fā)酵液過(guò)濾后，菌絲烘干至恒重得生物量，結(jié)果如下。生物積累量(干g/100mL):金針燕4 6 ;靈芝3 5 ;混菌4 6。結(jié)果表明，采用上述含有不同濃度的玉米、黃豆混菌發(fā)酵培養(yǎng)基均能成功的進(jìn)行金針菇、靈芝混菌發(fā)酵。2、發(fā)酵工藝(IOL發(fā)酵罐培養(yǎng))
取金針菇、靈芝單菌發(fā)酵種子液，分別接種于含有混菌發(fā)酵培養(yǎng)基的IOL發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，混菌接種時(shí)接種量配比為1:廣3:1，共計(jì)5%，pH 4. 5 5.5 ;溫度24 °C ;時(shí)間14ri68h0發(fā)酵液過(guò)濾后，菌絲烘干至恒重得生物量，結(jié)果如下。生物積累量(干g/100mL):金針菇5· 5 6. 5 ;靈芝4 5 ;混菌5 6。結(jié)果表明，在上述混菌發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，均能進(jìn)行金針菇、靈芝單菌和混菌發(fā)酵罐培養(yǎng)，且培養(yǎng)時(shí)間較培養(yǎng)瓶培養(yǎng)有所縮短。3、胞外多糖的提取
發(fā)酵液過(guò)濾后4000r/min離心取上清液，80°C水浴濃縮成原體積的O. 2倍，加入5倍體積95%乙醇，4°C靜置12h，濃縮液4000r/min離心，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀兩次，70°C烘干至恒重，得胞外粗多糖。4、胞內(nèi)三萜類化合物的提取
取I g菌絲加50 mL甲醇靜置12h后過(guò)濾，蒸干后加4 mL 95%乙醇溶解。5、胞外三萜類化合物的提取
取發(fā)酵液15mL，用3倍體積的水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，減壓蒸干，力口4mL 95%乙醇溶解。6、活性成分積累
(I)胞外多糖的積累胞外多糖(g/L):金針菇37 39 ;靈芝:27 29 ;混菌:41 43。結(jié)果表明，混菌發(fā)酵胞外多糖含量比金針菇、靈芝單菌發(fā)酵均得以提高。(2)三萜類化合物的積累
胞內(nèi)三萜產(chǎn)量(X10-2 mg/g):金針菇64 68 ;靈芝:72 78 ;混菌:86 90。胞外三萜產(chǎn)量(X 10_2 g/L):金針菇66 70 ;靈芝71 74 ;混菌80 84。 結(jié)果表明，混菌發(fā)酵后胞內(nèi)、胞外三萜產(chǎn)量比金針菇、靈芝單菌發(fā)酵均得以提高。上述結(jié)果表明，采用混菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行金針菇、靈芝混菌發(fā)酵后，胞外多糖、三萜類化合物均得以8% 35%的提高。
權(quán)利要求
1.一種金針菇、靈芝混菌發(fā)酵的方法，其特征是該混菌發(fā)酵方法為混菌發(fā)酵培養(yǎng)基由雙糖、多糖、淀粉類糧食、蛋白質(zhì)類糧食組成，所述的混菌發(fā)酵培養(yǎng)基包括l(T20g/L淀粉、15 25g/L馬鈴薯、l(T20g/L蔗糖、l(T30g/L玉米、l 10g/L黃豆；采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，混菌培養(yǎng)金針菇和靈芝；以金針菇和靈芝為菌種，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基活化、液體發(fā)酵培養(yǎng)制備單菌發(fā)酵種子液，混合接種金針菇、靈芝于混菌發(fā)酵培養(yǎng)基，接種比例I: I 3:1，溫度22 26°C，pH 4. 5 5. 5，培養(yǎng)時(shí)間是120 240h，混菌發(fā)酵后的菌絲和發(fā)酵液可用于發(fā)酵產(chǎn)物生物量、多糖及三萜類化合物的提取與測(cè)定； 具體步驟如下 (1)配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基按照GB4789.15-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》配制，用于菌種的復(fù)蘇及保存； (2)菌種活化取金針菇No.5. 65菌株和靈芝No. 5. 786菌株分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上活化廣2次； (3)分別制備單菌發(fā)酵種子液取金針菇、靈芝活化后的菌塊分別接種于液體培養(yǎng)基中，22 26 °C發(fā)酵培養(yǎng)168 288h ； (4)配制混菌發(fā)酵培養(yǎng)基馬鈴薯去皮后切成約Icm3小塊，玉米、黃豆粉碎至顆粒大小為100 μ m,培養(yǎng)基組成為l(T20g/L淀粉、15 25g/L馬鈴薯、l(T20g/L蔗糖、l(T30g/L玉米、riOg/L黃豆，加水配制；先將馬鈴薯、玉米、黃豆加水煮25min，再加入溶解好的淀粉和蔗糖，加水定容后滅菌； (5)制備混菌發(fā)酵種子液取金針菇、靈芝單菌發(fā)酵種子液,接種于混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，共酵培養(yǎng)液酸堿度PH 4. 5 5. 5，接種量配比為I: f 3:1，共計(jì)5%，22 26 °C發(fā)酵培養(yǎng)144 240h ； (6)分離生物量發(fā)酵液過(guò)濾收集菌絲，60°C烘干至質(zhì)量恒定并稱質(zhì)量； (7)胞外粗多糖提取與測(cè)定發(fā)酵液過(guò)濾后離心取上清液，8(T90°C水浴濃縮成原體積的O. 2^0. 25倍，加入4飛倍體積95%乙醇，4°C靜置，濃縮液離心，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀兩次，烘干至恒重，得胞外粗多糖； (8)胞內(nèi)三萜類化合物的提取取Ig菌絲加50 mL甲醇靜置過(guò)夜后過(guò)濾，蒸干后加4mL 95%乙醇溶解； (9)胞外三萜類化合物的提取取發(fā)酵液15mL，用3倍體積的水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，減壓蒸干，加4mL 95%乙醇溶解。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種金針菇、靈芝混菌發(fā)酵的方法，方法步驟(1)分別制備金針菇、靈芝的發(fā)酵種子液；(2)制備混菌發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由蔗糖、淀粉、馬鈴薯、玉米、黃豆組成；(3)將步驟(1)中制得的金針菇、靈芝發(fā)酵種子液共同接種于混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行混菌深層培養(yǎng)，進(jìn)而獲得多糖、三萜類化合物等活性產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)(1)實(shí)現(xiàn)了金針菇、靈芝菌絲體的混菌發(fā)酵培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)基配方天然，使用方便在混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，使用的均為天然糧食作物，無(wú)化學(xué)試劑，配制方便、簡(jiǎn)單，而且通常在發(fā)酵過(guò)程中，不必對(duì)pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)；(3)通過(guò)金針菇、靈芝混菌發(fā)酵，與金針菇、靈芝單菌發(fā)酵相比，胞外多糖、三萜類化合物產(chǎn)量均得以8%~35%的提高。
文檔編號(hào)C12P39/00GK102925527SQ20121045581
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者董玉瑋, 劉全德, 苗敬芝, 李勇, 劉輝, 張靜 申請(qǐng)人:徐州工程學(xué)院