TmDGAT1b基因的啟動子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了TmDGAT1b基因的啟動子及其應用，屬于生物【技術領域】。所述啟動子為如下任一所示：1）核苷酸序列為序列表中SEQ?ID?No.1的DNA；2）核苷酸序列與SEQ?ID?No.1互補的DNA；3）在高嚴緊條件下能夠與上述1）或2）DNA雜交且具有啟動子功能的DNA；4）對上述1）或2）所示DNA進行一個或多個堿基的取代、缺失和/或添加且具有啟動子功能的DNA；5）與上述1）或2）所示DNA具有至少90％同源性且具有啟動子功能的DNA。本發(fā)明的啟動子能特異調(diào)控外源基因表達，能使外源基因在擬南芥莖組織中得到表達，具有重要應用價值。
【專利說明】TmDGATIb基因的啟動子及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】中的一種啟動子，特別是涉及一種來源于四合木的TmDGATlb基因的啟動子，及其用于調(diào)控植物目的基因表達的應用。

【背景技術】
[0002]三脂酰甘油(Triacylglycerol，TAG)是人類和動物賴以生存的重要化合物之一，也是石油的可能替代品之一。隨著人們對植物油需求的日益增長，提高植物油的產(chǎn)量與開發(fā)新型油料作物成為人們關心的重要問題。研究表明，在植物營養(yǎng)器官中積累油脂是提高植物油產(chǎn)量的最為有效的手段之一。四合木(Tetraena mongolica)是我國內(nèi)蒙古地區(qū)特有的一種強旱生落葉小灌木，屬蔡藜科(Zygophyllaceac)四合木屬的單型種植物。研究表明，四合木莖組織中含有大量的三脂酰甘油，含量高達46mg/g干重。因此，研究四合木莖組織中TAG合成和積累的分子機制，對能源植物的開發(fā)和利用具有重要的意義。
[0003]二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT，EC2.3.1.20)是催化TAG生物合成的關鍵酶和限速酶，在調(diào)控植物油脂積累水平過程中起決定作用。研究表明，四合木中存在兩個DGATl基因，分別為 TmDGATla 和 TmDGATIb(GenBank 登錄號分別為 JX163929 與 JX163930)，均對 TAG的合成具有重要的作用。通過對這兩個基因調(diào)控機理的研究，從而解析四合木在營養(yǎng)器官中積累三脂酰甘油的分子機理，為植物營養(yǎng)器官積累油脂的基因工程研究提供理論基礎和重要的基因資源。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明涉及一種啟動子，所述啟動子為如下任一所示:
[0005]I)核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0.1的DNA ；
[0006]2)核苷酸序列與SEQ ID N0.1互補的DNA ；
[0007]3)在高嚴緊條件下能夠與上述I)或2) DNA雜交且具有啟動子功能的DNA ；
[0008]4)對上述I)或2)所示DNA進行一個或多個堿基的取代、缺失和/或添加且具有啟動子功能的DNA ；
[0009]5)與上述I)或2)所示DNA具有至少90%同源性且具有啟動子功能的DNA。
[0010]典型地，“雜交條件”根據(jù)測量雜交時所用條件的“嚴緊性”程度來分類。嚴緊性程度可以以例如核酸結合復合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C );“高等嚴緊性”發(fā)生在Tm以下約5_10°C ;“中等嚴緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ;“低嚴緊性”發(fā)生在Tm以下約20_25°C。作為替代，或者進一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴緊性洗滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極低嚴緊性；3XSSC =低至中等嚴緊性；1XSSC =中等嚴緊性；
0.5XSSC =高等嚴緊性。從功能上說，可以采用最大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴緊同一或近嚴緊同一的核酸序列；而采用高等嚴緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。
[0011]在本發(fā)明中，所述對SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時在所述核苷酸序列的5'端和/或3'端，和/或序列內(nèi)部進行例如不超過2-45個,或者不超過2-30個,或者不超過3-20個,或者不超過4-15個,或者不超過5-10個,或者不超過6-8個的分別用逐個連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取代、缺失、添加修飾。
[0012]本發(fā)明還涉及一種核酸構建體，其包含本發(fā)明所述的啟動子，與所述的啟動子可操作連接的基因，其中所述啟動子與所述基因來源相同或者不同。
[0013]本發(fā)明還涉及一種載體，其特征在于，所述載體含有本發(fā)明所述的啟動子或核酸構建體，所述載體可以通過例如將上述啟動子或核酸構建體插入克隆載體或表達載體而得到，或者可以通過人工合成得到；具體地，所述載體為將上述啟動子或核酸構建體與PMD19-T質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體。
[0014]本發(fā)明還涉及一種含有本發(fā)明所述載體的重組細胞，所述重組細胞可以通過將含有本發(fā)明所述的載體轉(zhuǎn)化至宿主細胞而得到。
[0015]本發(fā)明還涉及一種植物愈傷組織或外植體，所述愈傷組織或外植體轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的啟動子和/或核酸構建體和/或載體和/或感染有本發(fā)明的重組細胞。
[0016]本發(fā)明還涉及一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的啟動子和/或核酸構建體和/或載體和/或感染本發(fā)明的重組細胞。
[0017]本發(fā)明還涉及用于擴增本發(fā)明所述啟動子的引物對，其特征在于，所述引物對的兩條引物分別含有序列表中SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列；優(yōu)選的，所述引物對的兩條引物在5'端還分別連接有限制性酶切位點和/或保護堿基；具體地，所述引物對的兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4和SEQID N0.5 所示。
[0018]本發(fā)明還涉及制備SEQ ID N0.1所示的啟動子的方法，包括以四合木基因組DNA為模板，使用一對擴增引物進行擴增；所述擴增引物根據(jù)SEQ ID N0.1在四合木DNA中的序列分別針對首尾進行設計，例如為本發(fā)明所述的引物對。
[0019]本發(fā)明還涉及一種調(diào)控植物中目的基因表達的方法，所述方法包括將本發(fā)明的核酸構建體和/或載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織或外植體中的步驟，或用本發(fā)明的重組細胞感染植物愈傷組織或外植體的步驟。
[0020]本發(fā)明還涉及一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組細胞或植物愈傷組織或植物外植體。
[0021]本發(fā)明還涉及本發(fā)明的啟動子和/或核酸構建體和/或載體和/或重組細胞用于調(diào)控植物目的基因表達的用途，特別是用在使目的基因在植物莖組織中表達的應用；其中，所述的植物為雙子葉植物，具體為擬南芥；以及用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途。
[0022]本發(fā)明還涉及本發(fā)明的愈傷組織或外植體用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途。
[0023]實驗證明，本發(fā)明SEQ ID N0.1所示DNA具有啟動子功能，能使外源基因在莖組織中表達。本發(fā)明SEQ ID N0.1所示DNA能夠特異調(diào)控外源基因的表達，具有重要的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是雙元表達載體構建流程。
[0025]圖2是轉(zhuǎn)基因擬南芥⑶S組織化學染色結果。

【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖和具體的實施例對本發(fā)明做進一步說明:
[0027]實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0028]實施例1、啟動子的制備及功能驗證
[0029]一、啟動子的制備
[0030]以四合木的基因組DNA為模板，用引物對ProTmDeATlbf和ProTmD(；ATlbr進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0031]PCR體系如下:
[0032]

【權利要求】
1.一種啟動子，為如下任一所示: 1)核苷酸序列為序列表中SEQID N0.1的DNA ； 2)核苷酸序列與SEQID N0.1互補的DNA ； 3)在高嚴緊條件下能夠與上述I)或2)DNA雜交且具有啟動子功能的DNA ； 4)對上述I)或2)所示DNA進行一個或多個堿基的取代、缺失和/或添加且具有啟動子功能的DNA ； 5)與上述I)或2)所示DNA具有至少90%同源性且具有啟動子功能的DNA。
2.—種核酸構建體，其包含權利要求1所述的啟動子、與所述啟動子可操作連接的基因，其中所述啟動子與所述基因來源相同或者不同。
3.一種載體，其特征在于，所述載體含有權利要求1所述的啟動子或權利要求2所述的核酸構建體；所述載體通過將權利要求1所述的啟動子或權利要求2所述的核酸構建體插入克隆載體或表達載體而得到，或者通過人工合成得到。
4.根據(jù)權利要求3所述的載體，其特征在于，所述載體為權利要求1所述的啟動子或權利要求2所述的核酸構建體與PMD19-T質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體。
5.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞含有權利要求1所述的啟動子或權利要求2所述的核酸構建體或權利要求3或4所述的載體；具體地，所述重組細胞為重組大腸桿菌細胞或重組農(nóng)桿菌細胞。
6.一組引物對，所述引物對用于擴增得到權利要求1所述的啟動子，其特征在于，所述引物對的兩條引物分別含有序列表中SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列；優(yōu)選的，所述引物對的兩條引物在5'端還分別連接有限制性酶切位點和/或保護堿基；具體地，所述引物對的兩條引物的核苷酸序列分別為SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3或SEQ IDN0.4 和 SEQ ID N0.5 所示。
7.—種調(diào)控植物中目的基因表達的方法，包括如下步驟:將權利要求2所述的核酸構建體或權利要求3或4所述的載體或權利要求5所述的重組細胞導入植物。
8.權利要求1所述的啟動子或權利要求2所述的核酸構建體或權利要求3或4所述的載體或權利要求5所述的重組細胞在調(diào)控植物目的基因表達中的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，權利要求1所述的啟動子或權利要求2所述的核酸構建體或權利要求3或4所述的載體或權利要求5所述的重組細胞在使目的基因在植物莖組織中表達的應用；其中，所述的植物為雙子葉植物。
10. 根據(jù)權利要求8或9所述的應用，其特征在于，所述的植物為擬南芥。
【文檔編號】C12N15/84GK104178484SQ201310188798
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月21日 優(yōu)先權日:2013年5月21日
【發(fā)明者】許亦農(nóng), 李敏春 申請人:中國科學院植物研究所