專利名稱：對dna片段進(jìn)行3’末端生物素標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對DNA片段進(jìn)行3’末端生物素標(biāo)記的方法。
背景技術(shù)：
DNA標(biāo)記是現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的常用操作。相應(yīng)的，人們發(fā)展出許多方法實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，比如PCR、末端置換、切刻平移等。但是，專門用于DNA片段末端標(biāo)記，無放射性且產(chǎn)生平末端的方法少之又少且效率較低。隨著基因組科學(xué)的發(fā)展以及高通量測序技術(shù)的應(yīng)用，特別是全基因組染色質(zhì)構(gòu)像俘獲方法的快速發(fā)展，對簡便高效的DNA片段末端標(biāo)記方法提出了迫切需求。H1-C是一種全基因組范圍染色質(zhì)構(gòu)像俘獲技術(shù),在該技術(shù)中，Job dekker etal.(Belton JM, 2012; Lieberman-Aiden E, 2009)米用限制性內(nèi)切酶 HindIII 切割染色質(zhì)，隨后又使用Klenow片段，按照經(jīng)典的Fill-1n反應(yīng)進(jìn)行末端標(biāo)記與補(bǔ)平；然而，酶切會(huì)帶來較高的背景以及顯著的DNA片段偏好，因此，背景干凈而且無偏好的超聲打碎染色質(zhì)方法對于全基因組染色質(zhì)構(gòu)象俘獲研究意義重大。遺憾的是，超聲打碎產(chǎn)生的DNA片段末端毫無規(guī)律，既可能是平末端，也可能是3’或5’凸出或者凹陷末端。因此，無法使用Fill-1n反應(yīng)進(jìn)行DNA末端標(biāo)記與補(bǔ)平。目前，對于超聲打碎的DNA片段，通常采用的做法是先進(jìn)行末端補(bǔ)平與磷酸化修飾，然后添加帶有標(biāo)記的接頭。ChIA-PET(Fullm)Od MJ, 2009a; LiG, 2012)、Roche以及ABI公司的mate pair試劑盒(Berglund EC, 2011)就是用這種方法進(jìn)行了標(biāo)記。顯而易見，與Fill-1n反應(yīng)相比，添加接頭的方法步驟較多，而且由于無法去除多余接頭，該方法不能應(yīng)用于H1-C。末端轉(zhuǎn)移酶可以通過不依賴模板的方式在DNA的3’末端添加標(biāo)記dNTP，但是，這種標(biāo)記方法產(chǎn)生了 3’凸出末端，因而無法適用于需要平末端以進(jìn)行DNA片段之間連接的染色質(zhì)構(gòu)象俘獲相關(guān)技術(shù)。T4DNA聚合酶和Klenow片段均是具有Y — 3' DNA聚合酶以及:VDNA外切酶活性的嗜溫DNA聚合酶。當(dāng)雙鏈DNA片段與此種酶共同孵育時(shí)，在該外切酶活性不斷的切下3’末端核苷酸，同時(shí)聚合酶活性又不斷填補(bǔ)該空位的過程中，可以將標(biāo)記核苷酸摻入，從而標(biāo)記該末端，同時(shí)保持平端。因此，可以通過這種末端置換的方法對雙鏈DNA末端進(jìn)行標(biāo)記。這一方法已經(jīng)被illumina公司的mate pair試劑盒使用進(jìn)行DNA末端標(biāo)記。然而，由于DNA片段末端核苷酸的不確定性，標(biāo)記效率很低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種對超聲破碎得到的DNA片段進(jìn)行3’末端生物素標(biāo)記的方法。通過靈活利用T4DN A聚合酶與Klenow片段的聚合酶與外切酶活性，本發(fā)明建立了一種可以對DNA片段進(jìn)行高效3’末端生物素標(biāo)記的方法。本發(fā)明提供的對DNA片段進(jìn)行3’末端生物素標(biāo)記的方法，為如下方法甲、方法乙、方法丙或方法丁:方法甲:采用Klenow片段和/或T4DNA聚合酶對DNA片段進(jìn)行處理(切割)的同時(shí)加入生物素標(biāo)記的dCTP，隨后再加入dATP、dGTP和dTTP進(jìn)行補(bǔ)平；方法乙:采用Klenow片段和/或T4DNA聚合酶對DNA片段進(jìn)行處理(切割)的同時(shí)加入生物素標(biāo)記的dATP，隨后再加入dCTP、dGTP和dTTP進(jìn)行補(bǔ)平；方法丙:采用Klenow片段和/或T4DNA聚合酶對DNA片段進(jìn)行處理(切割)的同時(shí)加入生物素標(biāo)記的dGTP，隨后再加入dCTP、dATP和dTTP進(jìn)行補(bǔ)平；方法丁:采用Klenow片段和/或T4DNA聚合酶對DNA片段進(jìn)行處理(切割)的同時(shí)加入生物素標(biāo)記的dTTP，隨后再加入dCTP、dATP和dGTP進(jìn)行補(bǔ)平。所述方法甲中:每微克所述DNA片段采用2.5-5U Klenow片段和/或0.18-2.1U(如 0.18U-0.3U.0.3-2.1U,0.6U-0.9U.0.9-1.5UU.5-2.1U,0.18U.0.3U,0.6U,0.9U、L 5U或2.1U)T4DNA聚合酶。所述方法乙中:每微克所述DNA片段采用2.5-5U Klenow片段和/或0.18-2.1U(如 0.18U-0.3U、0.3-2.1U、0.6U-0.9U、0.9-1.5U、1.5-2.1U、0.18U、0.3U、0.6U、0.9U、1.5U或2.1U)T4DNA聚合酶。所述方法丙中:每微克DNA所述片段采用2.5-5U Klenow片段和/或0.18-2.1U(如 0.18U-0.3U、0.3-2.1U、0.6U-0.9U、0.9-1.5U、1.5-2.1U、0.18U、0.3U、0.6U、0.9U、1.5U或2.1U)T4DNA聚合酶。所述方法丁中:每微克DNA所述片段采用2.5-5U Klenow片段和/或0.18-2.1U(如 0.18U-0.3U、0.3-2.1U、0.6U-0.9U、0.9-1.5U、1.5-2.1U、0.18U、0.3U、0.6U、0.9U、1.5U或2.1U)T4DNA聚合酶。·所述方法甲中，每微克所述DNA片段采用2Χ1(Γ3μπιο1生物素標(biāo)記的dCTP。所述方法乙中:每微克所述DNA片段采用2X 1(Γ3 μ mol生物素標(biāo)記的dATP。所述方法丙中，每微克所述DNA片段采用2X 1(Γ3 μ mol生物素標(biāo)記的dGTP。所述方法丁中:每微克所述DNA片段采用2 X 1(Γ3 μ mol生物素標(biāo)記的dTTP。所述方法甲、所述方法乙、所述方法丙或所述方法丁中:采用Klenow片段對所述DNA片段進(jìn)行處理(切割)時(shí)，所述處理(切割)的時(shí)間可為120-720分鐘。所述方法甲、所述方法乙、所述方法丙或所述方法丁中:采用T4DNA聚合酶對所述DNA片段進(jìn)行處理(切割)時(shí)，所述處理(切割)的時(shí)間可為2-20分鐘(如2-5min、5-10min、10_20min、2min、5min、IOmin 或 20min)o所述方法甲、所述方法乙、所述方法丙或所述方法丁中:采用Klenow片段和T4DNA聚合酶對所述DNA片段進(jìn)行處理(切割)時(shí)，所述處理(切割)的時(shí)間可為30-45分鐘。所述方法甲、所述方法乙、所述方法丙或所述方法丁中:所述處理(切割)的溫度可為37 °C或室溫。所述方法甲、所述方法乙、所述方法丙或所述方法丁中:所述補(bǔ)平的條件可為20-25 °C孵育15分鐘。所述方法甲中，每微克所述DNA片段采用dATP、dGTP和dTTP各2 X 10_3 μ mol。所述方法乙中:每微克所述DNA片段采用dCTP、dGTP和dTTP各2X 10_3μ mol。所述方法丙中，每微克所述DNA片段采用dCTP、dATP和dTTP各2 X 10_3 μ mol。
所述方法丁中:每微克所述DNA片段采用dCTP、dATP和dGTP各2 X 1(Γ3 μ mol。所述方法甲、所述方法乙、所述方法丙或所述方法丁均還可包括如下步驟:進(jìn)行所述補(bǔ)平后，加入EDTA并75°C孵育20min。所述EDTA具體可以以EDTA水溶液的形式加入。每微克所述DNA片段具體可采用0.2 μ mol EDTA。所述方法甲的初始反應(yīng)體系可由 所述DNA片段、Klenow片段和/或T4DNA聚合酶、生物素標(biāo)記的dCTP、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA Ligase Buffer和H2O至組成。所述方法甲的初始反應(yīng)體系還可由所述DNA片段、Klenow片段和/或T4DNA聚合酶、生物素標(biāo)記的
組成。所述方法甲中，每20μ I初始反應(yīng)體系采用2μ I dATP/dGTP/dTTP (各ImM)溶液，采用0.4 μ 10.5Μ EDTA水溶液。所述方法乙的初始反應(yīng)體系可由所述DNA片段、Klenow片段和/或T4DNA聚合酶、生物素標(biāo)記的dATP、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA Ligase Buffer和H2O至組成。所述方法乙的初始反應(yīng)體系還可由所述DNA片段、Klenow片段和/或T4DNA聚合酶、生物素標(biāo)記的dATP、NEBuffer2和H2O組成。所述方法乙中，每20 μ I初始反應(yīng)體系采用2 μ I dCTP/dGTP/dTTP (各ImM)溶液，采用0.4 μ 10.5Μ EDTA水溶液。所述方法丙的初始反應(yīng)體系可由所述DNA片段、Klenow片段和/或T4DNA聚合酶、生物素標(biāo)記的dGTP、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA Ligase Buffer和H2O至組成。所述方法丙的初始反應(yīng)體系還可由所述DNA片段、Klenow片段和/或T4DNA聚合酶、生物素標(biāo)記的dGTP、NEBuffer2和H2O組成。所述方法丙中，每20 μ I初始反應(yīng)體系采用2 μ I dCTP/dATP/dTTP (各ImM)溶液，采用0.4 μ 10.5Μ EDTA水溶液。所述方法丁的初始反應(yīng)體系可由所述DNA片段、Klenow片段和/或T4DNA聚合酶、生物素標(biāo)記的dTTP、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA Ligase Buffer和H2O至組成。所述方法丁的初始反應(yīng)體系還可由所述DNA片段、Klenow片段和/或T4DNA聚合酶、生物素標(biāo)記的dTTP、NEBuffer2和H2O組成。所述方法丁中，每20 μ I初始反應(yīng)體系采用2 μ I dCTP/dATP/dGTP (各ImM)溶液，采用0.4 μ 10.5Μ EDTA水溶液。所述DNA片段可為任何方法產(chǎn)生的DNA片段，如核酸酶酶切產(chǎn)生的DNA片段、限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的DNA片段，霧化法產(chǎn)生的DNA片段或者其它物理方法產(chǎn)生的DNA片段，不論其末端是已知還是未知，均可使用。所述DNA片段具體可為超聲破碎得到的DNA片段。所述DNA片段具體可為100-3000bp的DNA片段。所述DNA片段更具體可為100-2000bp 或 200-2000bp 的 DNA 片段。本發(fā)明提供的方法具有如下優(yōu)點(diǎn):(I)標(biāo)記效率高。這是本方法最突出的優(yōu)點(diǎn)，和經(jīng)典的末端置換方法相比，標(biāo)記效率可從少于10%提聞到大于60%。(2)適用范圍廣。本發(fā)明提供的方法可以替代目前對已知序列末端進(jìn)行直接標(biāo)記的fill-1n反應(yīng)。雖然理論上已知序列末端的dCTP可以充分暴露，因而標(biāo)記效率應(yīng)該較高，但事實(shí)上只達(dá)到10-15%，而采用本發(fā)明提供的的方法，可以使其增加至60%?？傊?，本發(fā)明提供的方法可以被廣泛應(yīng)用至fill-1n反應(yīng)、Mate pair、染色質(zhì)構(gòu)象俘獲技術(shù)等。(3) DNA片段的標(biāo)記、補(bǔ)平，5’ -P3’ -OH修飾可在同一步驟中完成。
為了方便下一步連接，可以在反應(yīng)中添加T4多聚核苷酸激酶，以對5’進(jìn)行磷酸化并去除3’的磷酸化，同時(shí)更換為T4DNA連接酶緩沖液，則超聲打碎DNA片段的標(biāo)記、補(bǔ)平，5’ -P3’ -OH修飾可在同一步驟中完成，極大的簡化了操作，同時(shí)對于減少樣品損失，尤其是樣品量較少的情況下減少損失有重要意義。由于T4DNA連接酶緩沖液中含有較高濃度的DTT,即使經(jīng)純化后也會(huì)有較高殘留，因而妨礙DNA定量；為了準(zhǔn)確定量，在建立方法的過程中使用NEBuffer2進(jìn)行反應(yīng)；按照NEB公司說明書，T4DNA聚合酶與Klenow片段在T4DNA連接酶緩沖液與NEBuffer2中具有同等活性。(4)與目前通行的添加接頭的方法相比，本方法步驟較少，減少了樣品損失與偏好。在添加接頭的方法中，添加接頭之前，需要先進(jìn)行末端補(bǔ)平與磷酸化修飾；添加之后，還需要進(jìn)行純化，去除未連接頭；在后續(xù)連接過程中，由于接頭末端往往設(shè)計(jì)成粘性末端，因而只有兩個(gè)末端都連上接頭，才能進(jìn)行連接；若只有一個(gè)末端有接頭，另一端沒有，則無法連接，這就不可避免的造成了信息丟失并帶來偏好。然而，在本方法中，標(biāo)記之后無需去除多余的Biotin-dCTP，因?yàn)門4DNA連接酶不能介導(dǎo)單核苷酸與DNA片段之間連接；在連接過程中，所有DNA末端都是平端，因此不管兩個(gè)相鄰的末端是否都有，或都沒有，或一個(gè)有一個(gè)沒有生物素標(biāo)記，都可以發(fā)生連接，連接形成的雜合分子中只要含有一個(gè)生物素分子，就可以在下一步操作中被捕獲，從而極大地保留了 DNA末端相互靠近的信息。(5)簡便易行。所需實(shí)驗(yàn)溫度為37°C或室溫，能夠輕易達(dá)到，且與多種試劑兼容，比如抗體，這非常有利于在實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合使用該標(biāo)記方法與其它操作。


圖1為方法I的生物素標(biāo)記效率和方法2的生物素標(biāo)記效率。圖2為方法3 的生物素標(biāo)記效率和方法4的生物素標(biāo)記效率。圖3為方法5的生物素標(biāo)記效率。圖4為實(shí)施例4中的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖5為實(shí)施例5中的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖6為實(shí)施例6中的生物素標(biāo)記效率。圖7為實(shí)施例7中的生物素標(biāo)記效率。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。米用 Nanodrop ND-1000 進(jìn)行 DNA 定量(NanoDrop Technologies, Rockland, DE, USA) 0MCF-7 細(xì)胞:ATCC，編號為 HTB-22。蛋白酶抑制劑:Roche，貨號為P/N11393100。PBS緩沖液的制備方法:在800ml蒸餾水中溶解NaC18g、KC10.2g、KH2PO40.24g、Na2HPO4.12H203.63g，用HCl調(diào)pH值至7.4，加水定容至1L，1.034X IO5Pa高壓蒸汽滅菌20min，室溫保存。細(xì)胞裂解液(pH8.0)由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為:10mMTris-HClUOmM NaCl、0.2% (體積比)Triton X-100 和 IX 蛋白酶抑制劑。細(xì)胞核裂解液(pH8.0)由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為:50mMTris-HClUOmM EDTAUg/1OOmL SDS 和 IX 蛋白酶抑制劑。2XBW緩沖液(pH8.0)由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為:IOmMTris-HCl、1.0mM EDTA 和 2.0M NaCl。TWB緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為:5mM Tris-HCl.0.5mMEDTA、IM NaCl 和 0.05% (體積比)Tween20。實(shí)施例1、制備超聲打碎的DNA片段—、甲醛交聯(lián)染色質(zhì)并收獲細(xì)胞核1、為了盡可能模仿染色質(zhì)構(gòu)象俘獲相關(guān)技術(shù)產(chǎn)生的DNA片段，用1%甲醛固定MCF-7細(xì)胞，室溫反應(yīng)10分鐘。2、吸棄上清，加入IOml含0.125M甘氨酸的PBS緩沖液，室溫反應(yīng)10分鐘。3、吸棄上清，加入Iml0.25%胰蛋白酶溶液，37°C孵育lOmin，然后加入0.4ml血清與10 μ I蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)。4、刮下細(xì)胞，用P BS緩沖液洗滌。5、加入40ml細(xì)胞裂解液和100 μ I蛋白酶抑制劑，充分混勻，4°C孵育10_30min。6、4°C、1500g離心5min，收集沉淀，即為具有被甲醛交聯(lián)固定的染色質(zhì)的細(xì)胞核。二、超聲破碎將步驟一收集的細(xì)胞核加入細(xì)胞核裂解液，通過超聲破碎制備200bp-2000bp的DNA片段(超聲條件:美國SONICS公司VCX750超聲儀，30%輸出功率，工作5秒停15秒，總工作時(shí)間為3分鐘)，4°C、12000g離心lOmin，收集上清液，即為含有DNA/蛋白復(fù)合物的溶液。三、DNA的解交聯(lián)與純化1、取步驟二得到的上清液,加入proteinase K并使其濃度為200 μ g/ml,且加入NaCl并使其濃度為200mM，且加入CaCl2并使其濃度為ImM，然后37°C孵育過夜。2、取完成步驟I的液相體系，通過酚氯仿抽提和乙醇沉淀收獲DNA片段。實(shí)施例2、制備酶切的DNA片段1、提取MCF-7細(xì)胞的基因組DNA，2、用限制性內(nèi)切酶酶切步驟I得到的基因組DNA，回收100_1500bp的DNA片段。實(shí)施例3、末端生物素標(biāo)記一、方法I (采用fill-1n反應(yīng)對DNA片段進(jìn)行直接標(biāo)記)分別對實(shí)施例1得到的DNA片段、采用限制性內(nèi)切酶DpnII (單酶切)進(jìn)行實(shí)施例2得到的DNA片段、采用限制性HindIII和NcoI (雙酶切)進(jìn)行實(shí)施例2得到的DNA片段進(jìn)行如下操作:反應(yīng)體系:DNA片段1μ g、Klenow片段(5U/μ I) I μ I,Biotin-dCTP (400 μ Μ) 5 μ 1、dATP/dTTP/dGTP (各 ImM) 2 μ 1、NEBuf fer22 μ I，加 H2O 至 20 μ I。將反應(yīng)體系37°C孵育45min，然后加入0.4μ 10.5Μ EDTA水溶液，75°C孵育20min。
二、方法2 (采用illumina Mate pair方法對DNA片段進(jìn)行標(biāo)記)分別對實(shí)施例1得到的DNA片段和采用限制性內(nèi)切酶Sma I (單酶切)進(jìn)行實(shí)施例2得到的DNA片段進(jìn)行如下操作:1、制備如下反應(yīng)體系:DNA片段1μ g、Klenow片段(5U/μ I) 0.2 μ 1、T4DNA聚合酶(3U/ μ 1) 1 μ 1、dATP/dTTP/dGTP/dCTP (各 2.5mM) 0.8 μ 1、NEBuf fer22 μ I，加 H2O 至 20 μ 1。2、將步驟I的反應(yīng)體系20°C孵育15min，然后加入Biotin-dCTP (400 μ M) 5 μ 1、dATP/dTTP/dGTP (各 ImM) 2 μ I 和 NEBuffer20.8 μ I，20。。孵育 15min。3、在完成步驟2的體系中加入0.6 μ 10.5Μ EDTA水溶液，75°C孵育20min。三、方法3(采用Klenow片段先在Biotin-dCTP存在的條件下進(jìn)行酶切再加入d3TP進(jìn)行fill-1n反應(yīng))對實(shí)施例1得到的DNA片段進(jìn)行如下操作:1、制備如下反應(yīng)體系:DNA片段lyg、Klenow片段(5υ/μ1)1μ1、Biotin-dCTP (400 μ Μ) 5 μ 1、NEBuffer22 μ I，加 H2O 至 20 μ I。2、將步驟I的反應(yīng)體系37°C孵育120min或720min。3、在完成步驟2的體系中加入dATP/dTTP/dGTP (各ImM) 2 μ I，20-25 V孵育15min。4、在完成步驟3的體系中加入0.4 μ 10.5Μ EDTA水溶液，75°C孵育20min。

四、方法4 (采用T4DNA聚合酶先在Biotin-dCTP存在的條件下進(jìn)行酶切再加入d3TP進(jìn)行fill-1n反應(yīng))對實(shí)施例1得到的DNA片段進(jìn)行如下操作:1、制備如下反應(yīng)體系:DNA片段I μ g、T4DNA聚合酶(0.3U/ μ I) 2 μ 1、10 X BSA2 μ 1、Biotin-dCTP (400 μ Μ) 5 μ 1、NEBuffer22 μ I，加 H2O 至 20 μ I。2、將步驟 I 的反應(yīng)體系 37°C孵育 2min、5min、IOmin 或 20min。步驟3和步驟4均同步驟三中的步驟3和步驟4。五、方法5 (聯(lián)合使用Klenow片段和T4DNA聚合酶先在Biotin-dCTP存在的條件下進(jìn)行酶切再加入d3TP進(jìn)行fill-1n反應(yīng))對實(shí)施例1得到的DNA片段進(jìn)行如下操作:1、制備如下反應(yīng)體系:DNA片段I μ g、Klenow片段(5U/ μ I) I μ 1、T4DNA聚合酶(0.09υ/μ 1、0.15υ/μ 1、0.3υ/μ 1、0.45υ/μ 1、0.75υ/μ I 或 1.05U/μ I) 2 μ 1、Biotin-dCTP (400 μ Μ) 5 μ 1、NEBuffer22 μ I，加 H2O 至 20 μ I。2、將步驟I的反應(yīng)體系37°C孵育30min。步驟3和步驟4均同步驟三中的步驟3和步驟4。六、標(biāo)記效率的確定1、分別取以上方法I至方法5完成后得到的液相體系，依次進(jìn)行酚氯仿抽提和乙醇沉淀，收獲DNA片段，采用Nanodrop ND-1000進(jìn)行定量。2、取10 μ I Dynabeads MyOne 鏈親和素Cl珠子，用200 μ I TffB緩沖液洗滌兩次，每次室溫浸泡5min，最后用20 μ 12 XBW緩沖液重懸。3、合并步驟I得到的DNA片段與步驟2得到的鏈親和素Cl珠子懸液，充分混勻后室溫孵育30min(含有生物素標(biāo)記的DNA片段會(huì)被鏈親和素珠子捕獲，未標(biāo)記DNA仍存在上清之中)。4、完成步驟3后，取鏈親和素Cl珠子，用TWB緩沖液洗滌兩次，TE緩沖液洗滌一次，然后加入 ο μ I去離子水，70°C孵育5min(含有生物素標(biāo)記的DNA片段從鏈親和素珠子上脫落)。5、收集上清(含生物素標(biāo)記的DNA片段)，采用Nanodrop ND-1000進(jìn)行定量。6、將步驟5得到的DNA片段的微克數(shù)除以步驟I得到的DNA片段的微克數(shù)，乘以100%，即為生物素標(biāo)記效率。方法I的生物素標(biāo)記效率見圖1，I代表實(shí)施例1得到的DNA片段進(jìn)行方法I的生物素標(biāo)記效率，2代表采用限制性內(nèi)切酶DpnII (單酶切)進(jìn)行實(shí)施例2得到的DNA片段進(jìn)行方法I的生物素標(biāo)記效率，3代表采用限制性HindIII和NcoI (雙酶切)進(jìn)行實(shí)施例2得到的DNA片段進(jìn)行方法I的生物素標(biāo)記效率。方法2的標(biāo)記效率見圖1，4代表實(shí)施例1得到的DNA片段進(jìn)行方法2的生物素標(biāo)記效率，5代表采用限制性內(nèi)切酶Sma I (單酶切)進(jìn)行實(shí)施例2得到的DNA片段進(jìn)行方法2的生物素標(biāo)記效率。方法3的生物素標(biāo)記效率和方法4的生物素標(biāo)記效率見圖2。方法5的生物素標(biāo)記效率見圖3。超聲破碎得到的DNA片段采用方法I的生物素標(biāo)記效率只有8.45%，DpnII酶解得到的DNA片段(末端GATC)采用方法I的生物素標(biāo)記標(biāo)記效率只有9.8%, Hindi 11和NcoI酶解得到的DNA片段(末端AGCT和末端CATG)采用方法I的生物素標(biāo)記標(biāo)記效率為14.3%。HindIII和NcoI酶解得到的DNA片段的生物素標(biāo)記效率高于DpnII酶解得到的DNA片段的生物素標(biāo)記效率，這可能與dCTP位置靠里有關(guān)，位于最末端的Biotin-dCTP由于缺少其它堿基保護(hù)，更易被外切酶活性切下。超聲破碎得到的DNA片段采用方法2的生物素標(biāo)記效率只有12%。Sma I酶解得到的DNA片段(其兩側(cè)3’末端都含有連續(xù)的3個(gè)dCTP,
權(quán)利要求
1.對DNA片段進(jìn)行3’末端生物素標(biāo)記的方法，為如下方法甲、方法乙、方法丙或方法丁 方法甲采用Klenow片段和/或T4DNA聚合酶對DNA片段進(jìn)行處理的同時(shí)加入生物素標(biāo)記的dCTP，隨后再加入dATP、dGTP和dTTP進(jìn)行補(bǔ)平； 方法乙采用Klenow片段和/或T4DNA聚合酶對DNA片段進(jìn)行處理的同時(shí)加入生物素標(biāo)記的dATP，隨后再加入dCTP、dGTP和dTTP進(jìn)行補(bǔ)平； 方法丙采用Klenow片段和/或T4DNA聚合酶對DNA片段進(jìn)行處理的同時(shí)加入生物素標(biāo)記的dGTP，隨后再加入dCTP、dATP和dTTP進(jìn)行補(bǔ)平； 方法丁 采用Klenow片段和/或T4DNA聚合酶對DNA片段進(jìn)行處理的同時(shí)加入生物素標(biāo)記的dTTP，隨后再加入dCTP、dATP和dGTP進(jìn)行補(bǔ)平。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于 所述方法甲中每微克所述DNA片段采用2. 5-5U Klenow片段和/或O. 18-2. IU T4DNA聚合酶； 所述方法乙中每微克所述DNA片段采用2. 5-5U Klenow片段和/或O. 18-2. IU T4DNA聚合酶； 所述方法丙中每微克DNA所述片段采用2. 5-5U Klenow片段和/或O. 18-2. IU T4DNA聚合酶； 所述方法丁中每微克DNA所述片段采用2. 5-5U Klenow片段和/或O. 18-2. IU T4DNA聚合酶。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于 所述方法甲中，每微克所述DNA片段采用2 X 10_3 μ mol生物素標(biāo)記的dCTP ； 所述方法乙中每微克所述DNA片段采用2X 1(Γ3μ mol生物素標(biāo)記的dATP ； 所述方法丙中，每微克所述DNA片段采用2X 1(Γ3μ mol生物素標(biāo)記的dGTP ； 所述方法丁中每微克所述DNA片段采用2X 1(Γ3μ mol生物素標(biāo)記的dTTP。
4.如權(quán)利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于 采用Klenow片段對所述DNA片段進(jìn)行處理時(shí)，所述處理的時(shí)間為120-720分鐘； 采用T4DNA聚合酶對所述DNA片段進(jìn)行處理時(shí)，所述處理的時(shí)間為2_20分鐘； 采用Klenow片段和T4DNA聚合酶對所述DNA片段進(jìn)行處理時(shí)，所述處理的時(shí)間為30-45分鐘。
5.如權(quán)利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于任一所述處理的溫度為37°C或室溫。
6.如權(quán)利要求I至5中任一所述的方法,其特征在于任一所述補(bǔ)平的條件為20_25°C孵育15分鐘。
7.如權(quán)利要求I至6中任一所述的方法，其特征在于 所述方法甲中，每微克所述DNA片段采用dATP、dGTP和dTTP各2 X 10_3 μ mol ； 所述方法乙中每微克所述DNA片段采用dCTP、dGTP和dTTP各2X 10_3 μ mol ； 所述方法丙中，每微克所述DNA片段采用dCTP、dATP和dTTP各2 X 10_3 μ mol ； 所述方法丁中每微克所述DNA片段采用dCTP、dATP和dGTP各2 X 1(Γ3 μ mol。
8.如權(quán)利要求I至7中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟進(jìn)行所述補(bǔ)平后，加入EDTA并75°C孵育20min。
9.如權(quán)利要求I至8中任一所述的方法，其特征在于所述DNA片段為超聲破碎得到的DNA片段。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述DNA片段為100-3000bp的DNA片段。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對超聲破碎得到的DNA片段進(jìn)行3’末端生物素標(biāo)記的方法。本發(fā)明提供的方法甲采用Klenow片段和/或T4DNA聚合酶對DNA片段進(jìn)行處理的同時(shí)加入生物素標(biāo)記的dCTP，隨后補(bǔ)平；乙采用Klenow片段和/或T4DNA聚合酶對DNA片段進(jìn)行處理的同時(shí)加入生物素標(biāo)記的dATP，隨后補(bǔ)平；丙采用Klenow片段和/或T4DNA聚合酶對DNA片段進(jìn)行處理的同時(shí)加入生物素標(biāo)記的dGTP，隨后補(bǔ)平；丁采用Klenow片段和/或T4DNA聚合酶對DNA片段進(jìn)行處理的同時(shí)加入生物素標(biāo)記的dTTP，隨后補(bǔ)平。本發(fā)明提供的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)標(biāo)記效率高；適用范圍廣；方法步驟較少，簡便易行。
文檔編號C12N15/10GK103255133SQ20131015282
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者師明磊, 趙志虎, 王東, 王洋 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所