專利名稱：禽流感h7n9病毒檢測(cè)試劑及檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑及包含該試劑的檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
禽流感(Bird Flu)是由禽流感病毒引起的一種急性傳染病，可以感染人類，感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎，嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很高。禽流感病毒屬于正粘病毒科甲型流感病毒屬。甲型流感病毒顆粒呈多形性，其中球形直徑80 120nm，有囊膜?；蚪M為分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA。依據(jù)其外膜血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前可分為16個(gè)H亞型(Hl H16)和9個(gè)N亞型(NI N9)。禽甲型流感病毒除感染禽外，還可感染人、豬、馬、水貂和海洋哺乳動(dòng)物?？筛腥救说那萘鞲胁《緛喰蜑镠5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3。2013年3月底在我國(guó)上海和安徽兩地發(fā)現(xiàn)的人感染H7N9禽流感病毒為新型重配病毒，是全球首次發(fā)現(xiàn)的新亞型流感病毒，尚未納入我國(guó)法定報(bào)告?zhèn)魅静”O(jiān)測(cè)報(bào)告系統(tǒng)，并且截至2013年4月初尚未有疫苗推出。感染該病毒的患者均在早期出現(xiàn)發(fā)熱等癥狀，至2013年4月尚未證實(shí)此類病毒是否具有人傳染人的特性。由于禽流感病毒H7N9亞型是一種新亞型流感病毒，對(duì)于該病毒，國(guó)家⑶C頒布了診斷標(biāo)準(zhǔn):(I)疑似病例:符合臨床癥狀及血常規(guī)(白細(xì)胞總數(shù)一般不高或降低。重癥患者多有白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞減少，并有血小板降低)、生化(多有肌酸激酶、乳酸脫氫酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高，C反應(yīng)蛋白升高，肌紅蛋白可升高)及胸部影像學(xué)特征(發(fā)生肺炎的患者肺內(nèi)出現(xiàn)片狀影像。重癥患者病變進(jìn)展迅速，呈雙肺多發(fā)磨玻璃影及肺實(shí)變影像，可合并少量 胸腔積液。發(fā)生ARDS時(shí)，病變分布廣泛)，甲型流感病毒通用引物陽性并排除了季節(jié)性流感，可以有流行病學(xué)接觸史。(2)確診病例:符合疑似病例診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且呼吸道分泌物標(biāo)本中分離出H7N9禽流感病毒或H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)陽性。(3)重癥病例:肺炎合并呼吸功能衰竭或其他器官功能衰竭者為重癥病例。由于禽流感H7N9患者通常病情發(fā)展迅速，且其出現(xiàn)的時(shí)間較短，因此如果能實(shí)現(xiàn)對(duì)禽流感H7N9病毒的快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，必將對(duì)病情的診斷治療起到很大輔助作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑及包含該檢測(cè)試劑的試劑盒，以便能快速準(zhǔn)確檢測(cè)禽流感H7N9病毒，以輔助禽流感的診斷和治療。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，包含PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶，還包含第一引物對(duì)(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)、第一探針SEQ IDNO:3、第二引物對(duì)(SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5)以及第二探針 SEQ ID NO:6。
本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒，包含本發(fā)明的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，還含有陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。本發(fā)明的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑及包含該試劑的檢測(cè)試劑盒，可用于禽流感H7N9病毒的檢測(cè)。利用本發(fā)明提供的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒通過熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)禽流感H7N9病毒進(jìn)行檢測(cè)，可將待檢測(cè)標(biāo)本提取RNA后直接進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)過程具有快速、安全、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。


圖1是利用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)禽流感H7N9病毒的流程圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例的禽流感H7N9病毒檢測(cè)陽性結(jié)果示意圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例的禽流感H7N9病毒檢測(cè)陰性結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例提供一種禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，包含PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶，還包含第一引物對(duì)(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)、第一探針SEQ ID NO:3、第二引物對(duì)(SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5)以及第二探針 SEQ ID NO:6。具體地，上述PCR緩沖液可以為自身含有鎂離子的緩沖液，也可以通過向不含鎂離子的緩沖液中加入MgCl2獲得。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該P(yáng)CR緩沖液通過向不含鎂離子的緩沖液中加入MgCl2獲得，更優(yōu)選地，該MgCl2的濃度為25mM。具體地，上述DNA聚合酶為Taq酶，優(yōu)選為Hot Start Taq酶，即熱啟動(dòng)Taq酶。具體地，上述第一引物對(duì)序列為:H7 上游引物:5’ -GTAAACACATTAACTGAAAGAGG-3’ SEQ ID NO:1H7 下游引物:5’-CAATGTGACCAATTCCTAGAAT-3’ SEQ ID NO:2，第一探針序列為:H7 探針:5’ -TCCCCAGGATCTGCTCAAAAGGGAAAAG-3’ SEQ ID NO:3 ；上述第二引物對(duì)序列為:N9 上游引物:5’ -CAGATGAATGCAGGTTCTATG-3’ SEQ ID NO:4N9 下游引物:5，-TATCGTGTATTGTTCCGTTTG-3，SEQ ID NO:5，第二探針序列為:N9 探針:5，-TCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGG-3，SEQ ID NO:6。上述探 針序列的5’端分別連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端分別連接有淬滅基團(tuán)。探針的5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)與3’端的淬滅基團(tuán)相互先靠近的時(shí)候，由于發(fā)生能量傳遞作用，熒光報(bào)告基團(tuán)不能發(fā)出熒光，但隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)隨著探針的水解而脫落下來，不再與淬滅基團(tuán)發(fā)生能量傳遞作用，從而能發(fā)出熒光，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的積累可以對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。本發(fā)明實(shí)施例中使用的熒光報(bào)告基團(tuán)可以選自FAM、VIC(HEX)和ROX中的兩種，其中VIC (HEX)是指VIC和HEX可以替換使用，但不同時(shí)使用。使用上述三種熒光報(bào)告基團(tuán)中的兩種可以產(chǎn)生兩種不同的熒光，以使檢測(cè)結(jié)果易于辨識(shí)。本發(fā)明實(shí)施例中的探針3’端連接的淬滅基團(tuán)為DABCYL，也可為BHQ。上述的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑可通過熒光定量PCR反應(yīng)對(duì)禽流感H7N9病毒的血凝素的H7亞型和神經(jīng)氨酸酶的N9亞型分別進(jìn)行檢測(cè)，以分別確定禽流感病毒H7亞型和N9亞型的存在。本發(fā)明實(shí)施例還提供另一種禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，其包含PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶，第一引物對(duì)(SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2)、第一探針 SEQ ID NO:3、第二引物對(duì)(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)、第二探針SEQ ID NO:6，還包含第三引物對(duì)(SEQID NO:7 和 SEQ ID NO:8)、第三探針 SEQ ID NO:9。上述另一種禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑中，第三引物對(duì)序列如下:甲型流感上游引物:5’-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’ SEQ ID NO:7甲型流感下游引物:5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’ SEQ ID NO:8，第三探針序列為:甲型流感探針:5’-TCATACCGTCAGGCCCCCTCAAAGC-3’ SEQ ID NO:9。本發(fā)明的實(shí)施例中，上述第一探針、第二探針、第三探針的5’端分別連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端分別連接有淬滅基團(tuán)。該熒光報(bào)告基團(tuán)可以選自FAM、VIC (HEX)和R0X。具體地，上述三種探針分別對(duì)應(yīng)三種不同的熒光報(bào)告基團(tuán)，例如，但不限于，第一探針序列5’端連接的熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC，第二探針序列5’端連接的熒光報(bào)告基團(tuán)為R0X，第三探針序列5’端連接的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，并且其中VIC可替換為HEX。三種探針序列分別對(duì)應(yīng)于三種不同的熒光報(bào)告基團(tuán) 可以在熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生三種不同的熒光，在讀取結(jié)果的時(shí)候?qū)?yīng)于三條不同的熒光通道，可以使檢測(cè)結(jié)果易于辨識(shí)。上述禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑可通過熒光定量PCR方法對(duì)待檢測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)試劑中第一引物對(duì)及第一探針對(duì)應(yīng)于禽流感病毒的H7亞型，第二引物對(duì)及第二探針對(duì)應(yīng)于禽流感病毒的N9亞型，第三引物對(duì)及第三探針對(duì)應(yīng)于甲型流感病毒的通用特征序列，可用于鑒定甲型流感病毒。利用該試劑檢測(cè)后可鑒定H7N9病毒感染的禽流感及其他甲型流感并將兩者區(qū)分開。具體地，在本發(fā)明的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑中還可包含逆轉(zhuǎn)錄酶，優(yōu)選該逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。因?yàn)榍萘鞲蠬7N9病毒為RNA病毒，因此將逆轉(zhuǎn)錄酶整合至禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑中可以將病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄與病毒特征序列的檢測(cè)在同一個(gè)反應(yīng)中完成，簡(jiǎn)化了反應(yīng)步驟，提高了檢測(cè)效率。該逆轉(zhuǎn)錄酶在本發(fā)明的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑中與DNA聚合酶相同，兩者可以等體積混合，得到混合酶液，然后與其他組分混合。在本發(fā)明實(shí)施例中，上述弓I物和探針在母液中儲(chǔ)存，儲(chǔ)存時(shí)的濃度為45-55 μ M0優(yōu)選地，該儲(chǔ)存濃度為50 μ M0在使用制備試劑盒時(shí)將各種母液加入至PCR反應(yīng)管中相互混合并與其它組分混合。本發(fā)明實(shí)施例中，上述禽流感Η7Ν9病毒檢測(cè)試劑還可包含PCR增強(qiáng)劑，即PCRenhancer。在PCR反應(yīng)過程中，PCR增強(qiáng)劑可以提高DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性，降低DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)對(duì)酶的活性沒有影響，因此在遇到一些復(fù)雜模板時(shí)(如GC含量高)，這可通過提高退火溫度，極大地減少DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR反應(yīng)的負(fù)面影響。
本發(fā)明實(shí)施例還提供一種禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包括含上述實(shí)施例的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，圖1顯示了利用該檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的一個(gè)實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例中，該檢測(cè)試劑盒還包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，其中陽性對(duì)照包括含有以下的一種或多種:針對(duì)甲型流感(甲流)特征序列的人工合成DNA片段，可以為，但不限于，SEQ ID NO: 10，含有H7亞型特征序列的人工合成DNA片段，可以為，但不限于，SEQID NO: 11，以及含有N9亞型特征序列的人工合成DNA片段，可以為，但不限于SEQ ID NO:12;陰性對(duì)照中可含有其他RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄得到的序列，如乙型流感病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA序列，或諾如病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA序列，也可不包含任何DNA片段。具體地，上述陽性對(duì)照中的H7亞型特征序列可被第一引物對(duì)通過PCR法檢測(cè)出，上述N9亞型特征序列可被第二引物對(duì)通過PCR法檢測(cè)出，上述甲型流感特征序列可被第三引物對(duì)通過PCR法檢測(cè)出。利用本發(fā)明的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒對(duì)待測(cè)樣品通過熒光定量PCR反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可利 用25 μ L的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，也可用其他本領(lǐng)域常用的反應(yīng)體積進(jìn)行檢測(cè)。具體地，25 μ L的PCR反應(yīng)體系可包含以下成分:
Η7上游引物(50μΜ )0.2-0.3微升
H7下游引翁(50μΜ )0.2-0.3微升
Η7 探針(50μΜ )0.2-0.3 微升
N9上游引物 (50μΜ )0.2-0.3微升
Ν9 T游引物(50μΜ )0.2-0.3 微升
Ν9 探針(50μΜ )0.2-0.3 微升
甲型流感上游引物(50μΜ )0.2-0.3微升
甲型流感下游引物(50μΜ )0.2-0.3微升
甲型流感探針(50μΜ )0.2-0.3微升
IOxb^tffer (不含錢離子)2-4微升MgCl2 (25mM)2-4 微升 dNTPs 2-4 微升
加滅菌超純水至19微升》在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒同時(shí)含有Hot StartTaq酶和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，其中將Hot Start Taq酶(5U/μ L)和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/μ L)各取0.2-0.3微升混合，然后加50%甘油補(bǔ)足體積至0.6微升(如需要)。將該混合酶液與
0.4ulPCR增強(qiáng)劑同時(shí)加入至上述19微升混合物中，總體積為20微升，在檢測(cè)過程中，向其中加入5微升待測(cè)樣品的RNA溶液。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒只含有M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，該檢測(cè)試劑盒制備過程中取0.2-0.3微升的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶加滅菌超純水或50%甘油補(bǔ)足至0.6微升，然后與0.4ulPCR增強(qiáng)劑同時(shí)加入至上述19微升混合物中，總體積為20微升，在檢測(cè)過程中，向其中加入5微升待測(cè)樣品的RNA溶液。具體地，在利用本發(fā)明的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，先利用PCR提取試劑(或試劑盒)對(duì)樣品提取RNA得到含RNA的溶液，然后將該RNA溶液加入至本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)反應(yīng)液中，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。具體地，在利用本發(fā)明的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒通過PCR進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，PCR反應(yīng)條件為:42-50 0C:10-30min ；92-95 °C:2_3min ；92-95°C:5_10s ；55-60°C:40_80s ；72°C:10-20s (40-50 循環(huán))。上述PCR反應(yīng)過程中，42-50°C的反應(yīng)步驟使得待檢測(cè)樣品的RNA能夠被逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過后續(xù)的PCR反應(yīng)檢測(cè)其中的特征序列。具體地，利用本發(fā)明的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR檢測(cè)之后，通過以下條件判斷陰性樣本和陽性樣本:陽性樣本:擴(kuò)增曲線圖Ct值彡40，并有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，如圖2所示。陰性樣本:擴(kuò)增曲線圖Ct值> 40或無Ct值，如圖3所示。檢測(cè)結(jié)果依據(jù)如表I所示:表IPCR檢 測(cè)結(jié)果判定
權(quán)利要求
1.一種禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，包含PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶，還包含第一引物對(duì) SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2、第一探針 SEQ ID NO:3、第二引物對(duì) SEQ ID NO:4 和SEQ ID NO:5 以及第二探針 SEQ ID NO:6。
2.如權(quán)利要求1所述的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，其特征在于，所述第一探針SEQIDNO:3和第二探針SEQ ID NO:6的5’端分別連接有不同的熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端分別連接有淬滅基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求1所述的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，其特征在于，還包含第三引物對(duì)SEQID NO:7 和 SEQ ID NO:8，以及第三探針 SEQ ID NO:9。
4.如權(quán)利要求3所述的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，其特征在于，所述第三探針SEQIDNO:9的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端連接有淬滅基團(tuán)。
5.如權(quán)利要 求2或4所述的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，其特征在于，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、VIC和ROX或選自FAM、HEX和R0X。
6.如權(quán)利要求1所述的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，其特征在于，還包含逆轉(zhuǎn)錄酶。
7.如權(quán)利要求1所述的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，其特征在于，還包含PCR增強(qiáng)劑。
8.一種禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒，包含如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑。
9.如權(quán)利要求8所述的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒還包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。
10.如權(quán)利要求8所述的禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述陽性對(duì)照包含序歹Ij SEQ ID NO: 10-SEQ ID NO:12 中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，提供了一種禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑，該試劑包含PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶，還包含第一引物對(duì)(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)、第一探針SEQ ID NO3、第二引物對(duì)(SEQ ID NO4和SEQ ID NO5)以及第二探針SEQ ID NO6。本發(fā)明還提供一種禽流感H7N9病毒檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒在對(duì)禽流感H7N9病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)具有快速、安全、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103225000SQ201310152230
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者盧柳燕, 郭永超, 莊利鴻 申請(qǐng)人:深圳聯(lián)合醫(yī)學(xué)科技有限公司