專利名稱：檢測禽流感病毒的膠體金免疫滲濾增敏方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒的檢測方法，尤其涉及一種檢測禽流感病毒的膠體金免 疫滲濾增敏方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
禽流感(AvianInfluenza, AI)是由A型流感病毒引起的禽類的一種從呼吸 病到嚴重敗血癥等多種癥狀的急性高致病性傳染病。除了禽類，A型流感病毒還 感染其他種屬的動物，如馬、豬等，1997年首次發(fā)現(xiàn)高致病性禽流感H5N1可 感染人類。自禽流感于1878年在意大利發(fā)現(xiàn)以來，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損 失。歷史上危害最大，經(jīng)濟損失最嚴重的一次禽流感(H5N1)爆發(fā)于1983年美 國濱州地區(qū)，美國政府為此共花費了 6000多萬美元，間接經(jīng)濟損失估計達3.48 億美元。我國香港地區(qū)近期爆發(fā)的禽流感，據(jù)估計損失約達8000萬港幣。1997 年及2003年在香港H5N1禽流感己干擾18人，4人死亡，2003年年底開始該病 毒在亞洲國家已造成上百人感染，幾十人死亡。2006年2月以來，禽流感疫情 愈演愈烈，馬來西亞、俄羅斯、中國、波黑、羅馬尼亞、法國、印度、埃及、德 國、奧地利、伊朗、希臘、斯洛文尼亞、意大利等國相繼報道了禽流感疫情。因 此對禽流感病毒簡便、快捷、高靈敏度、高特異性的檢測成為控制禽流感疫情擴 散的當(dāng)務(wù)之急。
現(xiàn)有禽流感病毒檢測方法主要分為抗體檢測及抗原檢測方法?？贵w檢測方法 包括血凝抑制試驗(Hemagglutination inhibition, HI)、瓊脂免疫擴散試驗 (Agarose gel immunodiffiision， AGID)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)、補體結(jié)合試驗(Complement Fixation Assays, CF)、 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(Neuraminidase inhibitor test, NIT)以及病毒中和試驗(Virus neutralization Test, VNT)等。由于抗體檢測方法不能區(qū)分人工注射疫苗和病毒感 染因而對動物檢疫缺乏實際應(yīng)用意義。因此，目前禽流感病毒檢測主要為抗原檢 測方法，相對快速的方法為ELISA和熒光RT-PCR，但這兩種方法在大范圍應(yīng)用 中存在以下缺陷(1)需要昂貴的儀器設(shè)備，檢測成本較高且不易在基層單位推
7廣；(2)所有這些技術(shù)方法都不能在基層生產(chǎn)場、檢疫站和臨床等現(xiàn)場使用，必 須有專門的實驗室；(3)操作較繁瑣，檢測時間均在數(shù)小時以上，直接影響了疫 情的防控速度。
由于膠體金顆粒對許多蛋白質(zhì)都有很強的吸附功作用，可與SPA、 IgG、毒 素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等多種物質(zhì)非共價結(jié)合，從而使其成為免疫反應(yīng) 的優(yōu)良標(biāo)記物，并使得固相膜免疫測定技術(shù)(Solid Phase Membrane-based Immunoassay)更加簡便。常用的固相膜為硝酸纖維素(nitrocellulose, NC)膜。 斑點免疫測定法(Dot-Immunoboding Assay, DIBA)是在免疫印跡技術(shù)基礎(chǔ)上改 良發(fā)展起來的一項技術(shù)。由于其敏感性、特異性與酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)相 當(dāng)，且操作簡單、快速而發(fā)展為不同的方法。其中包括斑點免疫滲濾測定法(Dot Immuno Filtration Assay, DIFA)和斑點免疫層析測定法(Dot Immuno Chromatographic Assay, DICA)。以膠體金為標(biāo)記物的斑點免疫滲濾測定法稱為 膠體金免疫滲濾測定法(Dot-Immunogold Filtration Assay, DIGFA)。然而，上述 幾種方法檢測禽流感病毒難以滿足高靈敏度的要求。以往人們主要利用銀染色技 術(shù)來提高DIGFA的檢測靈敏度。然而，該技術(shù)的缺點是背景模糊，增敏效果相 對不強，因而限制了其應(yīng)用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測禽流感病毒的膠體金免疫滲濾增敏方法及其 試劑盒。本發(fā)明是在膠體金斑點免疫滲濾測定法(雙抗體夾心)的基礎(chǔ)上，采用 納米金顆粒增敏技術(shù)，能顯著提高檢測禽流感病毒的靈敏度，具有敏感、快速和 特異性好等特點，并且價格低廉，能進行樣品的高通量篩査，適用于基層或現(xiàn)場 檢測禽流感病毒，從而克服了目前膠體金免疫滲濾測定法(DIGFA)檢測靈敏度 不高的問題。
本發(fā)明檢測禽流感病毒的膠體金免疫滲濾增敏測定方法，步驟如下
1.制備免疫滲濾試紙條 免疫滲濾試紙條為A或B之一；
制備免疫滲濾試紙條A:沿長為40-110mm、寬為3-6 mm的矩形聚乙烯 (PE)塑料基片長的方向設(shè)有孔間距為2—4 mm的8 — 15個呈一行分布的直徑 為0.5-3 mm的圓形進樣孔；將與聚乙烯(PE)塑料基片大小相同的硝酸纖維素(NC)膜片粘附于其下面；加樣時帶有進樣孔的聚乙烯(PE)塑料基片在上； 制備免疫滲濾試紙條B:切制8-15個直徑0.5-3 mm的圓形硝酸纖維素膜片 粘附于長為40-110mm、寬為3-6 mm的矩形聚乙烯(PE).塑料基片，膜片間距 為3—4mm;每個膜片下方的塑料基片上設(shè)有兩個吸水孔，吸水孔是將與膜片圓 心重疊、與塑料基片長平行的長軸比膜片圓的直徑長0.3mrn、與塑料基片寬平行 的短軸比膜片圓的直徑短0.2mm的橢圓未被膜片覆蓋的部分去除得到的孔，加 樣時帶吸水孔的塑料聚乙烯(PE)基片在下面；
2.禽流感病毒多克隆抗體在免疫滲濾試紙條上的固定化
1) 制備固定化禽流感病毒多克隆抗體的免疫滲濾試紙條
a. 制備禽流感病毒多克隆抗體溶液，用800mL蒸餾水溶解8g氯化鈉 (NaCl)、 0.2g氯化鉀(KCl)、 1.44g磷酸氫二鈉(Na2HP04)和0.24g磷酸二
氫鉀(KH2P04)，用鹽酸(HC1)調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,加水至1L，搖勻， 制成pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS， Phosphate Buffer Saline),用磷酸鹽緩沖液 PBS稀釋禽流感病毒多克隆抗體，使溶液中多克隆抗體重量百分比濃度為 0.05-0.3mg/mL,優(yōu)選重量百分比濃度為0.1-0.2 mg/mL，制得禽流感病毒多克隆 抗體溶液；
b. 禽流感病毒多克隆抗體在免疫滲濾試紙條上的固定化 禽流感病毒多克隆抗體在免疫滲濾試紙條上固定化采用點樣固定化
法或浸泡固定化法之一；
點樣固定化法向上述免疫滲濾試紙條A的每個進樣孔或免疫滲濾 試紙條B的每個膜片上點1-3 上述禽流感病毒多克隆抗體溶液；點樣可為1 次一3次，待滲，風(fēng)干；得到固定化試紙條A或B;
或浸泡固定化法取500-1000 上述禽流感病毒多克隆抗體溶液置 于小試管中，4'C浸泡5 — 10條免疫滲濾試紙條A或B 10—15小時，取出，風(fēng) 干；得到固定化試紙條A或B;
2) 試紙條的封閉
將上述用點樣法或浸泡法得到的固定化試紙條A或B，放入用雙蒸水 稀釋的重量百分比濃度為1-5%的牛血清白蛋白溶液(BSA)中，37。C反應(yīng) 20-60min;取出，風(fēng)干，得到待用固定化試紙條；4'C保存，備用；3.制備禽流感病毒金標(biāo)單克隆抗體探針
1) 制備膠體金溶液
a. 制備膠體金溶液的試劑及其體積配比
雙蒸水 lOOmL 、
新鮮制備的重量百分比濃度為1%的氯金酸水溶液lmL、 重量百分比濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液 1.0-1.5 mL;
其中重量百分比濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液的優(yōu)選配比為1.2 mL;
b. 制備膠體金溶液
將所需的雙蒸水加熱煮沸；加入所需的新鮮制備的重量百分比濃度為 1%的氯金酸水溶液，迅速加入所需的重量百分比濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶 液，不斷攪拌，得到酒紅色的膠體金溶液；
2) 膠體金標(biāo)記禽流感病毒單克隆抗體
a. 制備禽流感病毒單克隆抗體 用禽流感病毒免疫小鼠制備獲得能夠分泌禽流感單克隆抗體的雜交
瘤細胞株，獲得通用A型禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病 毒或H9亞型禽流感病毒的特異性單克隆抗體之一；各亞型禽流感病毒單克隆抗 體只與相應(yīng)亞型的禽流感病毒抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，從而決定了試紙條的特異 性；用上述膠體金標(biāo)記抗體，制成金標(biāo)抗體，可與待檢樣品中的禽流感病毒特異 性的結(jié)合；
b. 制備膠體金標(biāo)記禽流感病毒單克隆抗體 取上述制備的膠體金溶液10mL，用重量百分比濃度為1%的碳酸鉀
(K2C03)水溶液調(diào)節(jié)pH至8.5—9.2(用前調(diào)節(jié)，過早調(diào)節(jié)會出現(xiàn)聚集現(xiàn)象)，優(yōu) 選pH為8.7—9.0;用800mL蒸餾水溶解0.2g氯化鉀(KC1)， 1.44g磷酸氫二鈉
(Na2HP04)和0.24g磷酸二氫鉀(KH2P04)，用鹽酸(HC1)調(diào)節(jié)溶液的pH 值至7.4,加水至1L，搖勻，制成磷酸鹽緩沖液(PB， Phosphate Buffer);用磷 酸鹽緩沖液(PB)將上述制備獲得的禽流感病毒單克隆抗體稀釋至蛋白含量為 0.1 — lmg/mL、 pH與上述調(diào)節(jié)后的膠體金溶液的pH值相同，取0.1-0.5mL，在 13000rpm、 4'C下離心1小時，得到上清液；快速攪拌下將上清液逐滴加入到上 述調(diào)節(jié)過pH值的膠體金溶液中，至液體的最小蛋白量為10—20ng/mL，優(yōu)選最
10小蛋白含量為10—16ng/mL;室溫放置5min;再分別加入過濾后的重量百分比 濃度為10XBSA溶液lml，繼續(xù)攪拌10-15分鐘，然后在13000 rpm、 4'C離心1 小時，小心棄去上清液(應(yīng)無色液體，若出現(xiàn)紅色則說明離心速度和時間不夠)， 得到沉淀物；用10 ml濃度為O.01mol/L、 pH 8.2且其中BSA的重量百分比濃度 為1X的三羥甲基氨基甲烷溶液(TBS， Tris Buffered Saline)將上述沉淀物溶解， 再在1000rpm/min、 4'C離心下10分鐘，去除聚集物，留上清液，棄去底部的沉 淀，將上清液13000 rpm、 4'C離心1小時；用5 ml含有重量百分比濃度分別為 0.02%的疊氮鈉、1%的蔗糖、1X的BSA且pH為8.2的三羥甲基氨基甲垸溶液 (TBS)重新懸浮底部疏松沉淀，得到禽流感金標(biāo)單克隆抗體探針；置于4'C冰 箱保存?zhèn)溆茫?br> 4. 制備增敏試劑 增敏試劑為試劑A和試劑B;
配制試劑A:配制重量百分比濃度為1% — 10%的氯金酸水溶液；氯金酸水 溶液中氯金酸的優(yōu)選重量百分比濃度為1-2%;
配制試劑B:配制重量百分比濃度大于O. 1-0.5%的抗壞血酸水溶液；抗壞血 酸水溶液中抗壞血酸的優(yōu)選重量百分比濃度為0.15%;
5. 檢測禽流感病毒
1) 向上述制備的待用固定化試紙條A的進樣孔或B的膜片上分別滴加用 PBS稀釋成溶液中抗原重量百分比濃度為0.05-O.lmg/mL的通用A型、H5、 H7 或H9型禽流病毒抗原之一作為需要檢測的陽性對照、用洗脫離心稀釋常規(guī)方法 前處理后溶于PBS緩沖溶液的待測樣本、針對所要檢測的陽性對照抗原通過雞 胚獲得的未經(jīng)病毒感染的尿囊液的陰性對照，各滴加1一3 nL，每個樣品滴加l 一2份(即分別將2份相同的抗原、待測樣品或陰極對照細胞液分別滴入或2個 進樣孔或2個膜片上，可同時做平行樣)，待滲，在室溫下反應(yīng)l分鐘以上；得 到帶陽性對照抗原、待測樣本及陰性對照的試紙條；
2) 取與上述已選定的需要檢測的陽性對照抗原相對應(yīng)的金標(biāo)單克隆抗體探 針溶液，每份取1一3^L，滴加于上述帶陽性對照抗原、待測樣本及陰性對照的 試紙條A的每個已加過樣品的進樣孔或B的每個膜片上;室溫反應(yīng)0.5 2分鐘， 優(yōu)選時間為1—2分鐘；再分別加入含體積百分比濃度為0.02%的吐溫20的磷酸鹽洗液PBST，洗2-5次，每次三滴，每滴2 —lOpL，得到待檢測試紙條；
3)分別向上述待檢測試紙條A己加過金標(biāo)單克隆抗體探針的每個進樣孔或
試紙條B的每個膜片上先滴加1-3 nL上述增敏試劑的試劑A，然后再滴加3—8 增敏試劑的試劑B,待風(fēng)干后，再重復(fù)述操作1至2次；最后一次滴加后1
一2分鐘觀察結(jié)果，肉眼觀察若有灰黑色斑點，則認為該位置對應(yīng)的禽流感病毒
為陽性結(jié)果，與陰性對照顯色結(jié)果無明顯區(qū)別，則認為該位置對應(yīng)的禽流感病毒
為陰性結(jié)果。
若待測人或動物的分泌物、血清、尿液或者食品浸提液中含有禽流感病毒血 凝素亞型(H型)和神經(jīng)氨酸酶亞型(N型)的一種或數(shù)種，當(dāng)NC膜與分泌物、 血清、尿液或者食品浸提液等待測樣本接觸時，如果禽流感病毒單克隆抗體對應(yīng) 的斑點呈陽性時，則可特異性地確定禽流感病毒屬于某種或某些種病毒亞型。采 用增敏試劑進行一次或多次處理，與原有斑點免疫金測定法相比，禽流感檢測靈 敏度可顯著提高8~50倍。
本發(fā)明所需的通用A型禽流感病毒抗原和各亞型禽流感病毒抗原、禽流 感病毒多克隆抗體可到相關(guān)專業(yè)的研究單位、公司購買或定制；所需的儀器、設(shè) 備、藥品均有市售。


圖l:免疫滲濾試紙條為A的正視圖。 圖2:免疫滲濾試紙條為A的俯視圖。 圖3:免疫滲濾試紙條為B的正視圖。
圖羊免疫滲濾試紙條為B的俯視圖。
具體實施例方式
本發(fā)明通過以下實施例作進一步具體描述。
實施例l:各種試劑的配制
1. 氯金酸水溶液稱取1.0g氯金酸，溶解于100mL雙蒸水中，形成重量
百分比濃度為1%的氯金酸水溶液，搖勻。
2. 檸檬酸三鈉水溶液稱取1.0g檸檬酸三鈉，溶解于100mL雙蒸水中， 形成重量百分比濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液，搖勻。
3. 磷酸鹽緩沖液(PBS):用800mL蒸餾水溶解8g氯化鈉(NaCl), 0.2g
12氯化鉀(KC1)， 1.44g磷酸氫二鈉(Na2HP04)和0.24g磷酸二氫鉀(KH2P04), 用鹽酸(HC1)調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至1L，搖勻。
4. 磷酸鹽緩沖液(PB):用800mL蒸餾水溶解0.2g氯化鉀(KCl)， 1.44g磷 酸氫二鈉(Na2HP04)和0.24g磷酸二氫鉀(KH2P04)，用鹽酸(HC1)調(diào)節(jié)溶 液的pH值至7.4，加水至1L,搖勻。
5. 磷酸鹽洗液(PBST):用800mL蒸餾水溶解8g氯化鈉(NaCl), 0.2g氯 化鉀(KCl)， 1.44g磷酸氫二鈉(Na2HP04)和0.24g磷酸二氫鉀(KH2P04)， 用鹽酸(HC1)調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至1L，搖勻，加入200uL的吐溫 20，搖勻。
6. 禽流感多克隆抗體用PBS稀釋，搖勻，使溶液中多克隆抗體重量百分 比濃度為0.05-0.3mg/mL。
實施例2:禽流感病毒膠體金免疫滲濾增敏試劑盒及使用方法 1.禽流感病毒膠體金免疫滲濾增敏方法試劑盒的裝配
1)按上述方法制備的固定化滲濾試紙條A或B100條，平時于4'C冰箱 中保存；
下面結(jié)合附圖對試紙條A或B作進一步說明
如圖l、圖2,試紙條A的塑料基片1長為40mrn、寬為3 mm,沿長的 方向設(shè)有孔間距為2mm的8個呈一行分布的直徑為0.5mm的圓形進樣孔3，與 塑料基片大小相同的硝酸纖維素膜片2重疊置于其下面。或試紙條A的塑料基 片1長為llOmm、寬為6 mm，沿長的方向設(shè)有孔間距為4mm的15個呈一行分 布的直徑為3mm的圓形進樣孔3，與塑料基片大小相同的硝酸纖維素膜片2重 疊粘附于其下面；
如圖3、圖4，試紙條B為切制8個直徑0.5 mm的圓形硝酸纖維素膜片1 粘附于長為40mrn、寬為3 mm的塑料基片2上，各個膜片間距為3mm;每個 膜片下方的塑料基片上設(shè)有兩個吸水孔3，吸水孔是將與膜片圓心重疊、與塑料 基片長平行的長軸為比膜片圓的直徑長0.3mm即0.8mrn、與塑料基片寬平行的 短軸為比膜片圓的直徑短0.2mm即0.3mm的橢圓未被膜片覆蓋的部分去除得到 的孔，加樣時帶吸水孔的塑料聚乙烯(PE)基片在下面；或試紙條B為切制15 個直徑3 mm的圓形硝酸纖維素膜2片置于長為llOmm、寬為6 mm的塑料基片l上，各個膜片間距為4mm;每個膜片下方的塑料基片上設(shè)有兩個吸水孔3，吸 水孔是將與膜片圓心重疊、與塑料基片長平行的長軸為比膜片圓的直徑長0.3mm 即3.3mm、與塑料基片寬平行的短軸比膜片圓的直徑短0.2mm即2.8mm的橢圓 未被膜片覆蓋的部分去除得到的孔，加樣時帶吸水孔的塑料聚乙烯(PE)基片 在下面；
2) 磷酸鹽緩沖液(PBS) 100ml，置于塑料瓶中；
3) 按上述方法制備的增敏試劑試劑A;取氯金酸1.0g，用雙蒸水稀釋到 100 mL放在棕色試劑瓶中，分裝后每個試劑盒內(nèi)裝10 mL，可以同時檢測100 組試紙條。按上述方法制備的增敏試劑試劑B;取抗壞血酸1.0 g，用雙蒸水稀 釋到100—150mL放在棕色試劑瓶中，分裝后每個試劑包裝內(nèi)裝10mL;可檢測 100條試紙條；
4) 磷酸鹽洗液(PBST):取200pL吐溫20,用pH7.4、 0.01mol/L的PBS 緩沖液配制成1000mL，分裝后每個試劑盒內(nèi)裝100mL;
5) 陽性對照抗原液，用PBS稀釋成溶液中抗原重量百分比濃度為 0. 05-0. lmg/mL的通用A型、H5、H7或H9型禽流感病毒抗原之一的溶液lml;可 檢測100條試紙條；
6) 陰性對照液，針對所要檢測的陽性對照抗原通過雞胚獲得的未經(jīng)病毒 感染的尿囊液10mL;可檢測100條試紙條；
7) 金標(biāo)探針試劑，取蛋白含量為10—20pg/mL的針對陽性對照的禽流感病 毒單克隆抗體探針液1000 nL，放在小玻璃瓶中，抽成真空后封口，平時于4'C 冰箱中保存；可檢測100條試紙條；
8) 塑料滴瓶10個、l一25nL量程的移液槍；
9) 長、寬分別大于滲濾試紙條A或B的濾紙100張。 2.試劑盒的使用方法如下-
1) 取出上述試紙條A或B—條，放于平放在桌面上的一張濾紙上面；
2) 分別將需要檢測的陽性對照抗原液、用洗脫離心稀釋常規(guī)方法前處理 后溶于PBS緩沖溶液的待測樣本液及陰性對照液l一3 nL,滴入上述試紙條A 的進樣孔或試紙條B的膜片，每個樣品分別做2份，待滲；
3)向上述已加入樣品的紙條A的進樣孔或試紙條B的膜片上分別加入1 HL與上述需要檢測的禽流感抗原相對應(yīng)的金標(biāo)單克隆抗體探針溶液，置干；
4) 向上述已加入金標(biāo)單克隆抗體探針試劑的試紙條A的進樣孔或試紙條 B的膜片分別滴加10pL磷酸鹽洗液(PBST)洗NC膜，每次三滴，洗2-5次， 室溫下置干；
5) 向上述己用磷酸鹽洗液(PBST)洗過NC膜的試紙條A的進樣孔或試 紙條B的膜片上分別加入2 pL增敏試劑的試劑A,再加入5pL增敏試劑的試劑 B，顯色1一2分鐘；可重復(fù)該操作一次或數(shù)次；
6) 最后一次顯色l一2分鐘后觀察相應(yīng)位置有無灰黑色斑點，有則認為該 位置對應(yīng)的禽流感病毒為陽性結(jié)果，沒有或顏色與相應(yīng)陰性對照相比淡則認為該 位置對應(yīng)的禽流感病毒呈陰性結(jié)果。
以上檢測過程每次選定一種禽流感病毒的抗原做陽性的對照抗原，再選用與 這種抗原相對應(yīng)的膠體金標(biāo)記的單抗，用以確定待測樣本所含禽流感病毒的種 類。 一般首先選定通用A型禽流感病毒抗原做陽性的對照抗原，再選用與這種 抗原相對應(yīng)的的膠體金標(biāo)記的單抗稀釋液，進行篩査；檢測呈陽性，再分別選定 亞型病毒抗原做陽性對照及與其相對應(yīng)的膠體金標(biāo)記的單抗進一步檢測確定具 體的種類。因為每種試劑盒只能針對一種病毒進行檢測，如需現(xiàn)場進行種類的定 性甄別，則需攜帶所需檢測的病毒抗原相應(yīng)的檢測試劑盒。 實施例3:膠體金的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明以1%氯金酸、1%檸檬酸三鈉與雙蒸水為原料，采用檸檬酸三鈉還原 法制備膠體金顆粒，可通過改變檸檬酸三鈉的加入量，制備不同直徑且大小較為 均一 的膠體金顆粒(l 5-150nm);
取100mL雙蒸水，加熱煮沸，加入lmL新鮮制備的1%氯金酸水溶液 (HAuCU),迅速加入1.2mLP/。檸檬酸三鈉，不斷攪拌，制備成酒紅色的膠體 金用于測試效果最好，此時合成的膠體金較穩(wěn)定，在4'C下可保存12個月。
實施例4:膠體金標(biāo)記最適pH值的確定
取若干個5mL試管，分別加入lmL膠體金溶液，用0.1 mol/LHC1和25 mmol/LK2C03將溶液的pH值分別調(diào)為3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14;取一96孔培養(yǎng)板，按pH值從低到高將上述膠體金溶液各取100jiL加入孔 中，重復(fù)三次；每孔分別加入3nL重量百分比濃度為lmg/mL的純化好的禽流感單克隆抗體，孔內(nèi)混合均勻，室溫下放置15min;每孔分別加入2(HiL濃度為 10%NaCl,孔內(nèi)混合均勻，室溫下放置10min;觀察膠體金的顏色變化，并分別 測定其OD520 nm和OD580 m，記錄在OD520 和OD580 nm差值最大時的pH(X); 重復(fù)前面的步驟，再進一步細化pH值梯度，將pH值梯度設(shè)定為X-0.6; X-0.3;
X; X+0.3; X+0.6; X+l，觀察膠體金顏色變化，直到室溫下放置2小時，分別
測定其ODs2o腿和OD580nm值，記錄在OD520nm與OD580nm差值最大時的pH值， 據(jù)此判斷標(biāo)記時的適宜pH值為8.5-9.2，優(yōu)選pH值為8.7-9.2。 實施例5:確定膠體金標(biāo)記最低蛋白穩(wěn)定量
最低蛋白穩(wěn)定量的確定實驗，以0.1 mol/LK2C03溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液至pH 8.5進行標(biāo)記，稀釋后的抗體與其他有關(guān)試劑按下表逐項操作。 表2分光光度計測定穩(wěn)定膠體金最小蛋白計量
試劑 試驗管 對照管
12345678910
AVI抗體(n。0卯8070605040302010100(H2O)
緩沖液(pL)01020304050607080卯100
膠體金(mL)1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0
搖勻，放置2min
腦NaCl(nL)1001001001001001001001001001000
搖勻，放置5min后，OD580nm測定
以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線，取曲線與橫軸接近那一 點的蛋白質(zhì)用量即為最小蛋白質(zhì)穩(wěn)定量。在此基礎(chǔ)上再加10-20%即為實際蛋白 質(zhì)穩(wěn)定量。結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)鞍缀繛?0—20|ig/mL時，即認為合適；當(dāng)?shù)鞍缀?量為10—16嗎/mL時，更為合適。
實施例6:禽流感病毒NP表達蛋白增敏檢測敏感性和特異性試驗 將人工表達禽流感病毒NP蛋白用PBS稀釋200倍，后進行連續(xù)倍比稀釋，直至 稀釋至200X2S倍，在使用試紙條檢測時，即增敏前檢測底限為樣品800倍稀釋， 對檢測試紙條進行增敏處理后檢測底限為樣品6400倍稀釋，該金標(biāo)增敏方法可以 使禽流感病毒NP蛋白檢測底線提高8倍。同時用新城疫病毒(NDV)進行檢測，
16試紙條檢測含NDV的PBS稀釋液和正常細胞培養(yǎng)液，都為陰性。這說明NDV對 禽流感病毒通用型的檢測不產(chǎn)生干擾。
實施例7: H9N2亞型禽流感病毒膠體金免疫滲濾增敏檢測試驗 用H9N2亞型禽流感病毒接種雞胚，收獲雞胚尿囊液用PBS進行連續(xù)倍比 稀釋，利用本發(fā)明提供的增敏檢測方法，將增敏試劑A與增敏試劑B按照1: 1 的體積比混合，制成增敏試劑，分別取增敏試劑4UL處理。在使用試紙條檢測 時，即增敏前檢測底限為血凝素效價(HAU)為2'1,對檢測試紙條進行增敏處 理后HAU為2-5，比對試驗結(jié)果表明，對H9N2亞型禽流感病毒膠體金檢測可增 敏16倍以上。
權(quán)利要求
1. 一種檢測禽流感病毒的膠體金免疫滲濾增敏方法，步驟如下1)制備免疫滲濾試紙條免疫滲濾試紙條為A或B之一；制備免疫滲濾試紙條A沿長為40-110mm、寬為3-6mm的矩形聚乙烯塑料基片長的方向設(shè)有孔間距為2—4mm的8—15個呈一行分布的直徑為0.5-3mm的圓形進樣孔；將與聚乙烯塑料基片大小相同的硝酸纖維素膜片粘附于其下面；加樣時帶有進樣孔的聚乙烯塑料基片在上；制備免疫滲濾試紙條B切制8-15個直徑0.5-3mm的圓形硝酸纖維素膜片粘附于長為40-110mm、寬為3-6mm的矩形聚乙烯.塑料基片，膜片間距為3—4mm；每個膜片下方的塑料基片上設(shè)有兩個吸水孔，吸水孔是將與膜片圓心重疊、與塑料基片長平行的長軸比膜片圓的直徑長0.3mm、與塑料基片寬平行的短軸比膜片圓的直徑短0.2mm的橢圓未被膜片覆蓋的部分去除得到的孔，加樣時帶吸水孔的塑料聚乙烯基片在下面；2)禽流感病毒多克隆抗體在免疫滲濾試紙條上的固定化(1)制備固定化禽流感病毒多克隆抗體的免疫滲濾試紙條a. 制備禽流感病毒多克隆抗體溶液用磷酸鹽緩沖液PBS稀釋禽流感病毒多克隆抗體，使溶液中多克隆抗體重量百分比濃度為0.05-0.3mg/mL，制得禽流感病毒多克隆抗體溶液；b. 禽流感病毒多克隆抗體在免疫滲濾試紙條上的固定化禽流感病毒多克隆抗體在免疫滲濾試紙條上固定化采用點樣固定化法或浸泡固定化法之一；點樣固定化法向上述免疫滲濾試紙條A的每個進樣孔或免疫滲濾試紙條B的每個膜片上點1-3μL上述禽流感病毒多克隆抗體溶液；點樣可為1次—3次，待滲，風(fēng)干；得到固定化試紙條A或B；或浸泡固定化法取500-1000μL上述禽流感病毒多克隆抗體溶液置于小試管中，4℃浸泡5—10條免疫滲濾試紙條A或B10—15小時，取出，風(fēng)干；得到固定化試紙條A或B；(2)試紙條的封閉將上述用點樣法或浸泡法得到的固定化試紙條A或B，放入用雙蒸水稀釋的重量百分比濃度為1-5％的牛血清白蛋白溶液中，37℃封閉20-60min；取出，風(fēng)干，得到待用固定化試紙條；4℃保存，備用；3)制備禽流感病毒金標(biāo)單克隆抗體探針(1)制備膠體金溶液a. 制備膠體金溶液的試劑及其體積配比雙蒸水100mL、新鮮制備的重量百分比濃度為1％的氯金酸水溶液1mL、重量百分比濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液 1.0-1.5mL；b. 制備膠體金溶液將所需的雙蒸水加熱煮沸；加入所需的新鮮制備的重量百分比濃度為1％的氯金酸水溶液，迅速加入所需的重量百分比濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液，不斷攪拌，得到酒紅色的膠體金溶液；(2)膠體金標(biāo)記禽流感病毒單克隆抗體a. 制備禽流感病毒單克隆抗體用禽流感病毒免疫小鼠制備獲得能夠分泌禽流感單克隆抗體的雜交瘤細胞株，獲得通用A型禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒或H9亞型禽流感病毒的特異性單克隆抗體之一；b. 制備膠體金標(biāo)記禽流感病毒單克隆抗體取上述制備的膠體金溶液10mL，用重量百分比濃度為1％的碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)pH至8.5—9.2；用磷酸鹽緩沖液PB將上述制備獲得的禽流感病毒單克隆抗體稀釋至蛋白含量為0.1—1mg/mL、pH與上述調(diào)節(jié)后的膠體金溶液的pH值相同，各取0.1-0.5mL，分別在13000rpm、4℃下離心1小時，得到上清液；快速攪拌下將上清液逐滴加入到上述調(diào)節(jié)過pH值的膠體金溶液中，至液體的最小蛋白量為10—20μg/mL，室溫放置5min；再分別加入過濾后的重量百分比濃度為10％BSA溶液1ml，繼續(xù)攪拌10-15分鐘，然后在13000rpm、4℃離心1小時，小心棄去上清液，得到沉淀物；用10ml、濃度為0.01mol/L、pH8.2且其中BSA的重量百分比濃度為1％的三羥甲基氨基甲烷溶液將上述各沉淀物溶解，再在1000rpm/min、4℃離心下10分鐘，去除聚集物，留上清液，棄去底部的沉淀，將上清液13000rpm、4℃離心1小時；用5mL含有重量百分比濃度分別為0.02％的疊氮鈉、1％的蔗糖、1％的BSA且pH為8.2的三羥甲基氨基甲烷溶液重新懸浮底部疏松沉淀，得到禽流感金標(biāo)單克隆抗體探針；置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?)制備增敏試劑增敏試劑為試劑A和試劑B；配制試劑A配制重量百分比濃度為1％—10％的氯金酸水溶液；配制試劑B配制重量百分比濃度大于0.1-0.5％的抗壞血酸水溶液；5)檢測禽流感病毒(1)向上述制備的待用固定化試紙條A的進樣孔或B的膜片上分別滴加用PBS稀釋成溶液中抗原重量百分比濃度為0.05-0.1mg/mL的通用A型、H5、H7或H9型禽流病毒抗原之一作為需要檢測的陽性對照、用洗脫離心稀釋常規(guī)方法前處理后溶于PBS緩沖溶液的待測樣本、針對所要檢測的陽性對照抗原通過雞胚獲得的未經(jīng)病毒感染的尿囊液的陰性對照，各滴加1—3μL，待滲，在室溫下反應(yīng)1分鐘以上；得到帶陽性對照抗原、待測樣本及陰性對照的試紙條；(2)取與上述已選定的需要檢測的陽性對照抗原相對應(yīng)的金標(biāo)單克隆抗體探針溶液，每份取1—3μL，滴加于上述帶陽性對照抗原、待測樣本及陰性對照的試紙條A的每個已加過樣品的進樣孔或B的每個膜片上；室溫反應(yīng)0.5～2分鐘，再分別加入含體積百分比濃度為0.02％的吐溫20的磷酸鹽洗液PBST，洗2-5次，每次三滴，每滴2—10μL，得到待檢測試紙條；(3)分別向上述待檢測試紙條A已加過金標(biāo)單克隆抗體探針的每個進樣孔或試紙條B的每個膜片上先滴加1-3μL上述增敏試劑的試劑A，然后再滴加3—8μL增敏試劑的試劑B，待風(fēng)干后，再重復(fù)述操作1至2次；最后一次滴加后1—2分鐘觀察結(jié)果，肉眼觀察若有灰黑色斑點，則認為該位置對應(yīng)的禽流感病毒為陽性結(jié)果，與陰性對照顯色結(jié)果無明顯區(qū)別，則認為該位置對應(yīng)的禽流感病毒為陰性結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述一種檢測禽流感病毒的膠體金免疫滲濾增敏方法，其 特征在于，制備禽流感病毒多克隆抗體溶液的步驟中，溶液中多克隆抗體重量百 分比濃度為0.1-0.2 mg/mL。
3. 如權(quán)利要求2所述一種檢測禽流感病毒的膠體金免疫滲濾增敏方法，其特 征在于，制備膠體金溶液的的步驟中，試劑中重量百分比濃度為1%的檸檬酸三 鈉水溶液的配比為1.2mL。
4. 如權(quán)利要求3所述一種檢測禽流感病毒的膠體金免疫滲濾增敏方法，其 特征在于，制備膠體金標(biāo)記禽流感病毒單克隆抗體的步驟中，將膠體金溶液調(diào)節(jié) pH為8.7—9.0。
5.如權(quán)利要求4所述一種檢測禽流感病毒的膠體金免疫滲濾增敏方法，其 特征在于，制備膠體金標(biāo)記禽流感病毒單克隆抗體的步驟中，快速攪拌下將上清 液逐滴加入到上述調(diào)節(jié)過pH值的膠體金溶液中，至液體的最小蛋白量為10— 16(ig/mL。
6. 如權(quán)利要求5所述一種檢測禽流感病毒的膠體金免疫滲濾增敏方法，其 特征在于，制備增敏試劑A試劑的步驟中，氯金酸水溶液中氯金酸的重量百分 比濃度為1-2%。
7. 如權(quán)利要求6所述一種檢測禽流感病毒的膠體金免疫滲濾增敏方法，其特 征在于，制備增敏試劑B試劑的步驟中，抗壞血酸水溶液中抗壞血酸的重量百 分比濃度為0.15%。
8.如權(quán)利要求1所述一種檢測禽流感病毒的膠體金免疫滲濾增敏方法， 其特征在于，試劑盒的裝配包括1)按上述方法制備的固定化滲濾試紙條A或B100條，平時于4'C冰箱 中保存；2) 磷酸鹽緩沖液PBS100ml，置于塑料瓶中；3) 按上述方法制備的增敏試劑A試劑10mL,可檢測100組試紙條；按上 述方法制備的增敏試劑B試劑10 mL，可檢測100條試紙條；4) 磷酸鹽洗液PBST 100mL;5) 陽性對照抗原液，用PBS稀釋成溶液中抗原重量百分比濃度為 0. 05-0. lmg/mL的通用A型、H5、 H7或H9型禽流感病毒抗原之一的溶液lml;可 檢測100條試紙條；6) 陰性對照液，針對所要檢測的陽性對照抗原通過雞胚獲得的未經(jīng)病毒感 染的尿囊液10mL;可檢測100條試紙條；7)金標(biāo)探針試劑，取蛋白含量為10—20ng/mL的針對陽性對照的禽流感病 毒單克隆抗體探針液1000 nL,放在小玻璃瓶中，抽成真空后封口，平時于4'C 冰箱中保存；可檢測100條試紙條；8) 塑料滴瓶10個、l一25nL量程的移液槍；9) 長、寬分別大于滲濾試紙條A或B的濾紙100張。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測禽流感病毒的膠體金免疫滲濾增敏方法及其試劑盒，步驟如下1)制備免疫滲濾試紙條；2)禽流感病毒多克隆抗體在免疫滲濾試紙條上的固定化；3)制備禽流感病毒金標(biāo)單克隆抗體金標(biāo)探針；4)制備增敏試劑；5)檢測禽流感病毒。本發(fā)明利用氯金酸與抗壞血酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成金原子可被膠體金吸附的特點，來定位膠體金沉積部位進行顯色加強，提高了待檢抗原的檢測靈敏度8～50倍。本發(fā)明是在膠體金斑點免疫滲濾測定法(雙抗體夾心)的基礎(chǔ)上，采用納米金顆粒增敏技術(shù)，能提高檢測禽流感病毒的檢測靈敏度，能進行樣品的高通量篩查，適用于基層或現(xiàn)場檢測禽流感病毒。
文檔編號G01N33/577GK101470116SQ20081011476
公開日2009年7月1日 申請日期2008年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日
發(fā)明者李錦豐, 田世民, 強 薛, 鄒明強, 涌 金, 齊小花 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院