專(zhuān)利名稱(chēng)：多種抗原免疫高通量制備單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及多種抗原免疫高通量制備單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞株的方法。
背景技術(shù)：
隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展，數(shù)以千計(jì)的蛋白需要用親和試劑如單克隆抗體進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證，如蛋白的定性、定量分析、蛋白質(zhì)的分離純化、功能驗(yàn)證、蛋白質(zhì)間的相互作用驗(yàn)證及蛋白翻譯后修飾的識(shí)別等。單克隆抗體技術(shù)是產(chǎn)生具有蛋白質(zhì)識(shí)別功能的高度特異性抗體的基本方法，因此，單克隆抗體在蛋白質(zhì)的研究中已經(jīng)成為必不可少的工具。然而傳統(tǒng)的單抗制備耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，許多文章報(bào)道了在提高單克隆抗體生產(chǎn)速度和通量方面所做的嘗試。Ning等人采用組份化的血漿蛋白免疫小鼠，然后用免疫沉淀/質(zhì)譜法鑒定相應(yīng)的抗原。一些研究者采用蛋白混合物免疫小鼠然后用蛋白芯片和流式細(xì)胞術(shù)鑒定相應(yīng)的抗原，另外也有一些不依賴(lài)于細(xì)胞融合的方法，如重組抗體及噬菌體展示制備抗體的報(bào)道。不同的抗體適用于不同的檢測(cè)方法(如免疫印跡法、免疫沉淀法，免疫組織化學(xué)法、免疫熒光法及流式細(xì)胞術(shù)等等)，所以需要更多的抗體以適應(yīng)不同的需求。為滿(mǎn)足這種需要，建立高通量快速獲得單克隆抗體的方法是十分必要的。在之前的研究中曾用四種已知蛋白免疫小鼠并用ELISA法及蛋白芯片對(duì)單克隆抗體進(jìn)行篩選，但是免疫和篩選的種類(lèi)還是不夠多。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用多種抗原免疫高通量制備分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的方法。本發(fā)明的方法，包括如下步驟:I)用η種目標(biāo)蛋白的混合物作為免疫抗原免疫小鼠，得到免疫后小鼠；η大于4且小于15 ；所述η種目標(biāo)蛋白的混合物為將η種目標(biāo)蛋白混合，得到的混合物；2)收集處死后的步驟I)所得免疫小鼠的離體脾細(xì)胞；將所述脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到融合細(xì)胞；3)對(duì)所述融合細(xì)胞進(jìn)行第一輪ELISA檢測(cè)，選取發(fā)生免疫陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞；所述第一輪ELISA檢測(cè)中，將所述η種目標(biāo)蛋白混合物包被作為抗原、一抗為所述融合細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液、二抗為抗小鼠IgG的抗體；4)將所述第一輪ELISA檢測(cè)中發(fā)生免疫陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行第二輪ELISA檢測(cè)，選取針對(duì)單一抗原發(fā)生免疫陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞株，即為分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；所述第二輪ELISA檢測(cè)中，將η種目標(biāo)蛋白均單獨(dú)包被作為抗原、一抗為所述在第一輪ELISA檢測(cè)中發(fā)生免疫陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液、二抗為抗小鼠IgG的抗體；所述單一抗原為η種目標(biāo)蛋白中任一種。所述分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞為如下雜交瘤細(xì)胞中的一種或幾種:分
泌抗蛋白I的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞、分泌抗蛋白2的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞、......、
分泌抗蛋白η的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。上述方法中，所述η種目標(biāo)蛋白混合為等質(zhì)量混合；所述η種目標(biāo)蛋白之間的同源性小于34%，所述η種目標(biāo)蛋白之間的同源性為9-34% ；所述目標(biāo)蛋白為不含標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白或含有標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白；若作為免疫抗原的目標(biāo)蛋白為不含標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白，則所述第一輪ELISA檢測(cè)和第二輪ELISA檢測(cè)中作為抗原的目標(biāo)蛋白為不含標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白或含有標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白；若作為免疫抗原中的目標(biāo)蛋白為含標(biāo)簽A的目標(biāo)蛋白，則所述第一輪ELISA檢測(cè)和第二輪ELISA檢測(cè)中作為抗原的目標(biāo)蛋白為含標(biāo)簽B的目標(biāo)蛋白；且所述標(biāo)簽A和所述標(biāo)簽B不同。上述方法中，步驟I)中，所述免疫包括如下步驟:
Α、將所述免疫抗原首次免疫小鼠，得到首免小鼠；B、將所述免疫抗原加強(qiáng)免疫所述首免小鼠，得到免疫小鼠；所述加強(qiáng)免疫的時(shí)間為首次免疫第10-20天，所述加強(qiáng)免疫的時(shí)間具體為首次免疫第11天，將首次免疫開(kāi)始記作第I天；步驟I)中，所述首次免疫的免疫抗原的量為每250ul免疫抗原中含有質(zhì)量均為10 μ g的8種含有HIS標(biāo)簽的重組抗原蛋白；所述加強(qiáng)免疫的免疫抗原的量為每250ul免疫抗原中含有質(zhì)量均為10 μ g的8種含有HIS標(biāo)簽的重組抗原蛋白；所述免疫抗原中的η種抗原蛋白等質(zhì)量混合；步驟2)中，所述骨髓瘤細(xì)胞為SP2/0細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞；所述離體脾細(xì)胞與所述SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的個(gè)數(shù)比為5-10:1，所述離體脾細(xì)胞與所述SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的個(gè)數(shù)比具體為5:1;所述收集所述免疫小鼠的離體脾細(xì)胞為加強(qiáng)免疫第3天，將加強(qiáng)免疫開(kāi)始記作第I天;所述步驟3)或步驟4)中，所述抗小鼠IgG的抗體均為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG。上述方法中，在步驟I)和步驟2)之間，還包括如下步驟:用ELISA檢測(cè)所述免疫小鼠的離體血清的抗體效價(jià)，選取針對(duì)η種目標(biāo)蛋白均有特異性抗體的免疫小鼠；所述ELISA檢測(cè)中，將η種目標(biāo)蛋白均單獨(dú)包被作為抗原、一抗為所述免疫小鼠的離體血清、二抗為抗小鼠IgG的抗體。上述方法中，所述免疫抗原中的目標(biāo)蛋白為含標(biāo)簽A的目標(biāo)蛋白，則所述第一輪ELISA檢測(cè)和第二輪ELISA檢測(cè)中作為抗原的目標(biāo)蛋白為含標(biāo)簽B的目標(biāo)蛋白；且所述標(biāo)簽A和所述標(biāo)簽B不同；所述η為8 ;所述免疫抗原中的8種目標(biāo)蛋白分別為含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-TP53、含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-c_myc、含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A8、含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A9、含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白HIS-pCAF、含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-1、含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-2 和含有 HIS 標(biāo)簽的重組蛋白 Trx-HIS - S-PTEN ；所述第一輪ELISA檢測(cè)和第二輪ELISA檢測(cè)中作為抗原的8種目標(biāo)蛋白分別為含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-TP53、含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-c_myc、含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-S100A8、含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-S100A9、含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-pCAF、含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PCT-1、含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PCT-2和含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PTEN。上述方法中，所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-TP53為由序列I所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-c-myc為由序列2所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A8為由序列3所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A9為由序列4所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白HIS-pCAF為由序列5所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有HIS 標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-1為由序列6所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S_PCT_2為由序列7所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PTEN為由序列8所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-TP53為由序列9所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-c-myc為由序列10所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-S100A8為由序列11所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-S100A9為由序列12所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-pCAF為由序列13所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PCT-1為由序列14所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PCT-2為由序列15所示的核苷酸編碼的蛋白；所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PTEN為由序列16所示的核苷酸編碼的蛋白。上述方法中，所述η為8 ;8種不含標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白為蛋白ΤΡ53、蛋白c_myc、蛋白S100A8、蛋白 S100A9、蛋白 pCAF、蛋白 PCT-1、蛋白 PCT-2、蛋白 PTEN ；所述蛋白TP53為由序列表中序列I自5’末端第502-1329位核苷酸編碼的蛋白；所述蛋白c-myc為由序列表中序列2自5’末端第502-1392位核苷酸編碼的蛋白；
所述蛋白S100A8為由序列表中序列3自5’末端第496-777位核苷酸編碼的蛋白；所述蛋白S100A9為由序列表中序列4自5’末端第496-843位核苷酸編碼的蛋白；所述蛋白pCAF為由序列表中序列5自5’末端第109-699位核苷酸編碼的蛋白；所述蛋白PCT-1為由序列表中序列6自5’末端第502-852位核苷酸編碼的蛋白；所述蛋白PCT-2為由序列表中序列7自5’末端第502-774位核苷酸編碼的蛋白；所述蛋白PTEN基因?yàn)橛尚蛄斜碇行蛄?自5’末端第496-1122位核苷酸編碼的蛋白。由上述方法制備的雜交瘤細(xì)胞也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。由上述雜 交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于免疫的蛋白組合物。本發(fā)明提供的用于免疫的蛋白組合物，為如下I)或2):I)所示的蛋白組合物由8種不帶標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白組成，所述8種不帶標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白為所述蛋白TP53、所述蛋白c-myc、所述蛋白S100A8、所述蛋白S100A9、所述蛋白pCAF、所述蛋白PCT-1、所述蛋白PCT-2和所述蛋白PTEN ；2)所示的蛋白組合物由8種含標(biāo)簽A的目標(biāo)蛋白組成，所述8種含標(biāo)簽A的目標(biāo)蛋白為所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-TP53、所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-c-myc、所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A8、所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A9、所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白HIS-pCAF、所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-1、所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-2和所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PTEN0本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明選取在人類(lèi)生理或病理過(guò)程中起重要作用，且相互之間具有較低相似性的8種蛋白質(zhì)，將它們混合后免疫同一只小鼠，免疫10天并加強(qiáng)免疫3天后，通過(guò)細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)篩選，最終獲得了分別針對(duì)8種蛋白在ELISA水平陽(yáng)性的分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株，并且分別針對(duì)多種抗原的單抗在ELISA和免疫印跡檢測(cè)中均呈現(xiàn)陽(yáng)性。因此，本發(fā)明建立了一種通過(guò)一次細(xì)胞融合獲得多種蛋白的單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞株的高通量方法，為單抗制備節(jié)省了時(shí)間和人力成本，并為提高單克隆抗體的生產(chǎn)效率做出了貢獻(xiàn)。


圖1為8種His標(biāo)簽重組蛋白純化后的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖2為8種GST標(biāo)簽重組蛋白純化后的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖3為兩輪ELISA篩選后，針對(duì)不同抗原的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株數(shù)圖4為在第二輪ELISA篩選中部分單特異性細(xì)胞株的ELISA結(jié)果圖5為兩輪ELISA篩選后，部分單特異性細(xì)胞株在免疫印跡中進(jìn)一步驗(yàn)證其特異性
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中免疫用蛋白和檢測(cè)用蛋白的氨基酸及對(duì)應(yīng)的基因的核苷酸序列如下:序列I為免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-TP53的基因的核苷酸序列，其中，序列I自5’末端第346-366位核苷酸為HIS標(biāo)簽，序列I自5’末端第1-327位核苷酸為T(mén)rx (硫氧環(huán)蛋白)標(biāo)簽，序列I自5’末端第400-444位核苷酸為S標(biāo)簽，序列I自5’末端第502-1329位核苷酸為T(mén)P53基因；序列I所示的DNA分子編碼免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-TP53。序列2為免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-c-myc的基因的核苷酸序列，其中，序列2自5’末端第346-366位核苷酸為HIS標(biāo)簽，序列2自5’末端第1-327位核苷酸為T(mén)rx (硫氧環(huán)蛋白)標(biāo)簽，序列2自5’末端第400-444位核苷酸為S標(biāo)簽，序列2自5’末端第502-1392位核苷酸為c-myc基因；序列2所示的DNA分子編碼免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-c-myc ο

序列3為免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A8的基因的核苷酸序列，其中，序列3自5’末端第346-366位核苷酸為HIS標(biāo)簽，序列3自5’末端第1-327位核苷酸為T(mén)rx (硫氧環(huán)蛋白)標(biāo)簽，序列3自5’末端第400-444位核苷酸為S標(biāo)簽，序列3自5’末端第496-777位核苷酸為S100A8基因；序列3所示的DNA分子編碼免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A8。序列4為免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A9的基因的核苷酸序列，其中，序列4自5’末端第346-366位核苷酸為HIS標(biāo)簽，序列4自5’末端第1-327位核苷酸為T(mén)rx (硫氧環(huán)蛋白)標(biāo)簽，序列4自5’末端第400-444位核苷酸為S標(biāo)簽，序列4自5’末端第496-843位核苷酸為S100A9基因；序列4所示的DNA分子編碼免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A9。序列5為免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白HIS-pCAF的基因的核苷酸序列，其中，序列5自5’末端第13-30位核苷酸為HIS標(biāo)簽，序列5自5’末端第109-699位核苷酸為pCAF基因；序列5所示的DNA分子編碼免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白HIS-pCAF。序列6為免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-1的基因的核苷酸序列，其中，序列6自5’末端第346-366位核苷酸為HIS標(biāo)簽，序列6自5’末端第1-327位核苷酸為T(mén)rx (硫氧環(huán)蛋白)標(biāo)簽，序列6自5’末端第400-444位核苷酸為S標(biāo)簽，序列6自5’末端第502-852位核苷酸為PCT-1基因；序列6所示的DNA分子編碼免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-1。序列7為免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-2基因的核苷酸序列，其中，序列7自5’末端第346-366位核苷酸為HIS標(biāo)簽，序列7自5’末端第1-327位核苷酸為T(mén)rx (硫氧環(huán)蛋白)標(biāo)簽，序列7自5’末端400-444位核苷酸為S標(biāo)簽，序列7自5’末端第502-774位核苷酸為PCT-2基因；序列7所示的DNA分子編碼免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白 Trx-HIS - S-PCT-2。注:PCT_1為PCT全長(zhǎng)序列，PCT-2為PCT從5’端第52位核苷酸到3’末端。序列8為免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PTEN的基因的核苷酸序列，其中，序列8自5’末端第346-366位核苷酸為HIS標(biāo)簽，序列8自5’末端第1-327位核苷酸為T(mén)rx (硫氧環(huán)蛋白)標(biāo)簽，序列8自5’末端第400-444位核苷酸為S標(biāo)簽，序列8自5’末端第496-1122位核苷酸為PTEN基因；序列8所示的DNA分子編碼免疫用含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PTEN0序列9為檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-TP53的基因的核苷酸序列，其中，序列9自5’末端第1-660位核苷酸為GST標(biāo)簽，序列9自5’末端第688-1515位核苷酸為T(mén)P53基因；序列表中序列9所示的DNA分子編碼檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-TP53。序列10為檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-c-myc的基因的核苷酸序列，其中，序列10自5’末端第1-660位核苷酸為GST標(biāo)簽，序列10自5’末端第688-1578位核苷酸為c-myc基因；序列表中序列10所示的DNA分子編碼檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-c-mycο序列11為檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-S100A8的基因的核苷酸序列，其中，序列11自5’末端第1-660位核苷酸為GST標(biāo)簽，序列11自5’末端第679-960位核昔酸為S100A8基因；序列表中序列11所不的DNA分子編碼檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-S100A8。序列12為檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-S100A9的基因的核苷酸序列，其中，序列12自5’末端第1-660位核苷酸為GST標(biāo)簽，序列12自5’末端第679-1026位核昔酸為S100A9基因；序列表中序列12所不的DNA分子編碼檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-S100A9。序列13為檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-pCAF的基因的核苷酸序列，其中，序列13自5’末端第1-660位核苷酸為GST標(biāo)簽，序列13自5’末端第688-1278位核苷酸為pCAF基因；序列表中序列13所示的DNA分子編碼檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-pCAF。序列14為檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PCT-1的基因的核苷酸序列，其中，序列14自5’末端第1-660位·核苷酸為GST標(biāo)簽，序列14自5’末端第688-1038位核苷酸為PCT-1基因；序列表中序列14所示的DNA分子編碼檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PCT-1。序列15為檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PCT-2的基因的核苷酸序列，其中，序列15自5’末端第1-660位核苷酸為GST標(biāo)簽，序列15自5’末端第688-960位核苷酸為PCT-2基因；序列表中序列15所示的DNA分子編碼檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PCT-2。序列16為檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PTEN的基因的核苷酸序列，其中，序列16自5’末端第1-660位核苷酸為GST標(biāo)簽，序列16自5’末端第679-1305位核苷酸為PTEN基因；序列表中序列16所示的DNA分子編碼檢測(cè)用含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PTEN。實(shí)施例1、多種抗原免疫高通量制備分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞一、多種免疫抗原和檢測(cè)蛋白的獲得1、多種目標(biāo)蛋白的選取選取如下8種蛋白作為目標(biāo)蛋白:腫瘤蛋白p53 (TP53, NP_000537.3)、c-myc(NP_002458.2)、SlOO 鈣結(jié)合蛋白 A8 (S100A8, ΝΡ_002955.2)、SlOO 鈣結(jié)合蛋白 A9(S100A9，NP_002956.1)、組蛋白乙?；?pCAF (NP_003875.3)、降鈣素PCT-1 (ΝΡ_001732.I)、降鈣素截短體PCT-2 (NP_001732.1上部分片段，PCT-2蛋白)、蛋白酪氨酸磷酸酶 PTEN (PTEN, NP_000305.3)。上述各種蛋白的編碼基因的核苷酸序列如上文所示。任何兩個(gè)目標(biāo)蛋白的氨基酸序列相似性列在表1，PCT-1和PCT2由于具有一段相同的氨基酸序列，而具有較高的同源性(64%)，其它蛋白兩兩之間的氨基酸序列相似性均(34%ο表1為8種目標(biāo)蛋白中任何兩個(gè)蛋白的氨基酸序列相似性
權(quán)利要求
1.一種利用多種抗原高通量制備分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的方法，包括如下步驟 1)用η種目標(biāo)蛋白的混合物作為免疫抗原免疫小鼠，得到免疫后小鼠； η大于4且小于15 ； 所述η種目標(biāo)蛋白的混合物為將η種目標(biāo)蛋白混合，得到的混合物； 2)收集處死后的步驟I)所得免疫小鼠的脾細(xì)胞；將所述脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到融合細(xì)胞； 3)對(duì)所述融合細(xì)胞進(jìn)行第一輪ELISA檢測(cè)，選取發(fā)生免疫陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞； 所述第一輪ELISA檢測(cè)中，將所述η種目標(biāo)蛋白混合物包被作為抗原、一抗為所述融合細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液、二抗為抗小鼠IgG的抗體； 4)將所述發(fā)生免疫陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行第二輪ELISA檢測(cè)，選取針對(duì)單一抗原發(fā)生免疫陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞株,即為分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞； 所述第二輪ELISA檢測(cè)中，將η種目標(biāo)蛋白單獨(dú)包被作為抗原、一抗為所述發(fā)生免疫陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液、二抗為抗小鼠IgG的抗體； 所述單一抗原為η種目標(biāo)蛋白中任一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述η種目標(biāo)蛋白混合為等質(zhì)量混合； 所述η種目標(biāo)蛋白之間的同源性小于34%，所述η種目標(biāo)蛋白之間的同源性為9-34% ； 所述目標(biāo)蛋白為不含標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白或含有標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白； 若作為免疫抗原的目標(biāo)蛋白為不含標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白，則所述第一輪ELISA檢測(cè)和第二輪ELISA檢測(cè)中作為抗原的目標(biāo)蛋白為不含標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白或含有標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白； 若作為免疫抗原中的目標(biāo)蛋白為含標(biāo)簽A的目標(biāo)蛋白，則所述第一輪ELISA檢測(cè)和第_■輪ELISA檢測(cè)中作為抗原的目標(biāo)蛋白為含標(biāo)簽B的目標(biāo)蛋白；且所述標(biāo)簽A和所述標(biāo)簽B不同。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述免疫包括如下步驟 Α、將所述免疫抗原首次免疫小鼠，得到首免小鼠； B、將所述免疫抗原加強(qiáng)免疫所述首免小鼠，得到免疫小鼠； 所述加強(qiáng)免疫的時(shí)間為首次免疫第10-20天，所述加強(qiáng)免疫的時(shí)間具體為首次免疫第11天，將首次免疫開(kāi)始記作第I天；步驟2)中，所述骨髓瘤細(xì)胞為SP2/0骨髓瘤細(xì)胞；所述離體脾細(xì)胞與所述SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的個(gè)數(shù)比為5-10:1,所述離體脾細(xì)胞與所述SP20骨髓瘤細(xì)胞的個(gè)數(shù)比具體為5:1 ；所述收集所述免疫小鼠的離體脾細(xì)胞為加強(qiáng)免疫第3天，將加強(qiáng)免疫開(kāi)始記作第I天; 所述步驟3)或步驟4)中，所述抗小鼠IgG的抗體均為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 在步驟I)和步驟2)之間，還包括如下步驟用ELISA檢測(cè)所述免疫小鼠的離體血清的抗體效價(jià)，選取針對(duì)η種目標(biāo)蛋白均有特異性抗體的免疫小鼠； 所述ELISA檢測(cè)中，將η種目標(biāo)蛋白單獨(dú)包被作為抗原、一抗為所述免疫小鼠的離體血清、二抗為抗小鼠IgG的抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 所述免疫抗原中的目標(biāo)蛋白為含標(biāo)簽A的目標(biāo)蛋白，則所述第一輪ELISA檢測(cè)和第二輪ELISA檢測(cè)中作為抗原的目標(biāo)蛋白為含標(biāo)簽B的目標(biāo)蛋白；且所述標(biāo)簽A和所述標(biāo)簽B不同； 所述η為8 ;所述免疫抗原中的8種目標(biāo)蛋白分別為含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-TP53、含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-c_myc、含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A8、含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A9、含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白HIS-pCAF、含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-I、含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-2 和含有 HIS 標(biāo)簽的重組蛋白 Trx-HIS - S-PTEN ； 所述第一輪ELISA檢測(cè)和第二輪ELISA檢測(cè)中作為抗原的8種目標(biāo)蛋白分別為含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-TP53、含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-c_myc、含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-S100A8、含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-S100A9、含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-pCAF、含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PCT-I、含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PCT-2和含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PTEN。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于 所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS-S-TP53為由序列I所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-c-myc為由序列2所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A8為由序列3所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A9為由序列4所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白HIS-pCAF為由序列5所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-I為由序列6所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-2為由序列7所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PTEN為由序列8所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-TP53為由序列9所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-c-myc為由序列10所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-S100A8為由序列11所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-S100A9為由序列12所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-pCAF為由序列13所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PCT-I為由序列14所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PCT-2為由序列15所示的核苷酸編碼的蛋白； 所述含有GST標(biāo)簽重組蛋白GST-PTEN為由序列16所示的核苷酸編碼的蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述η為8 ;8種不含標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白為蛋白ΤΡ53、蛋白c-myc、蛋白S100A8、蛋白S100A9、蛋白 pCAF、蛋白 PCT-1、蛋白 PCT-2、蛋白 PTEN ； 所述蛋白TP53為由序列表中序列I自5’末端第502-1329位核苷酸編碼的蛋白； 所述蛋白c-myc為由序列表中序列2自5’末端第502-1392位核苷酸編碼的蛋白； 所述蛋白S100A8為由序列表中序列3自5’末端第496-777位核苷酸編碼的蛋白； 所述蛋白S100A9為由序列表中序列4自5’末端第496-843位核苷酸編碼的蛋白； 所述蛋白PCAF為由序列表中序列5自5’末端第109-699位核苷酸編碼的蛋白； 所述蛋白PCT-I為由序列表中序列6自5’末端第502-852位核苷酸編碼的蛋白； 所述蛋白PCT-2為由序列表中序列7自5’末端第502-774位核苷酸編碼的蛋白； 所述蛋白PTEN基因?yàn)橛尚蛄斜碇行蛄?自5’末端第496-1122位核苷酸編碼的蛋白。
8.由權(quán)利要求1-7所述方法制備的雜交瘤細(xì)胞。
9.由權(quán)利要求8所述雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。
10.一種用于免疫的蛋白組合物，為如下I)或2): I)所示的蛋白組合物由8種不帶標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白組成，所述8種不帶標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白為所述蛋白TP53、所述蛋白c-myc、所述蛋白S100A8、所述蛋白S100A9、所述蛋白pCAF、所述蛋白PCT-I、所述蛋白PCT-2和所述蛋白PTEN ； 2)所示的蛋白組合物由8種含標(biāo)簽A的目標(biāo)蛋白組成，所述8種含標(biāo)簽A的目標(biāo)蛋白為所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-TP53、所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS -S-c-myc、所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A8、所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-S100A9、所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白HIS-pCAF、所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-I、所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PCT-2和所述含有HIS標(biāo)簽的重組蛋白Trx-HIS - S-PTEN0
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種多種抗原免疫高通量制備單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞株的方法。本發(fā)明提供利用多種抗原免疫高通量制備分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的方法，包括如下步驟1)用n種抗原蛋白混合作為免疫抗原免疫小鼠，得到免疫后小鼠；2)所述免疫后小鼠的離體脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，得到融合細(xì)胞；3)將融合細(xì)胞進(jìn)行第一輪ELISA篩選，選取發(fā)生免疫陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞；4)將所述發(fā)生免疫陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行第二輪ELISA篩選，選取針對(duì)單一抗原免疫陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞；本發(fā)明建立了一種通過(guò)一次細(xì)胞融合獲得多種蛋白單克隆抗體的高通量技術(shù)方法，為單抗制備節(jié)省了時(shí)間和人力成本，并為提高單克隆抗體的生產(chǎn)效率做出了貢獻(xiàn)。
文檔編號(hào)C12N15/06GK103255128SQ20131015289
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者劉瑩, 劉靜, 左威, 郝露, 張莉莉, 甄蓓 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所