一種制備耐熱脂肪酶的方法及其專用表達載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備耐熱脂肪酶的方法及其專用表達載體。本發(fā)明提供了一種重組載體，為將脂肪酶Btl2編碼基因插入畢赤酵母表達載體中，得到的表達脂肪酶重組載體；所述脂肪酶Btl2的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過畢赤酵母異源蛋白表達系統(tǒng)胞外分泌獲得脂肪酶，使獲取方法更加簡單、降低該酶的生產(chǎn)成本，在耐熱脂肪酶的生產(chǎn)中具有廣闊的工業(yè)前景。
【專利說明】一種制備耐熱脂肪酶的方法及其專用表達載體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種制備耐熱脂肪酶的方法及其專用表達載體。

【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶是一種羧酸酯酶，能夠在油水界面催化長鏈甘油三酯的水解和合成反應(yīng)。許多脂肪酶具有高度的化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性、底物選擇性和立體選擇性，能夠在常溫常壓下反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化率高，不易產(chǎn)生副產(chǎn)物，因此脂肪酶在食品加工、手性化合物合成、環(huán)境治理、生物柴油合成等工業(yè)方面有著廣泛的應(yīng)用。脂肪酶的來源包括動物、植物和微生物。相對于動植物脂肪酶，微生物脂肪酶具有更廣的作用PH值，作用溫度范圍和底物特異性，是工業(yè)用脂肪酶的重要來源。脂肪酶Btl2的編碼基因btl2克隆自一種極端耐熱的細菌嗜熱鏈狀芽孢桿菌(Bacillus thermocatenulatus),該酶具有較高的溫度穩(wěn)定性，廣泛的PH穩(wěn)定性且在多種有機溶劑中保持酶活穩(wěn)定，在工業(yè)領(lǐng)域特別是生物柴油工業(yè)中具有巨大的應(yīng)用價值。
[0003]畢赤酵母異源蛋白表達系統(tǒng)是近年來應(yīng)用得比較多的酵母蛋白表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)被認為是表達外源蛋白的理想系統(tǒng)，具有很高的商業(yè)應(yīng)用價值。這個系統(tǒng)的優(yōu)點有以下幾個方面:畢赤酵母表達系統(tǒng)具有AOXl強啟動子，可以有效調(diào)控外源蛋白的表達；畢赤酵母的分子生物學(xué)背景清晰，遺傳操作簡單；該菌體比較容易實現(xiàn)高細胞密度培養(yǎng)，有利于發(fā)酵生產(chǎn)。這些優(yōu)點使得畢赤酵母表達系統(tǒng)成為被廣泛利用的外源基因表達系統(tǒng)，表達不同的蛋白質(zhì)。
[0004]目前，已經(jīng)有在大腸桿菌中表達嗜熱鏈狀芽孢桿菌脂肪酶Btl2的報道，雖然目的產(chǎn)物的表達量比較高，但表達產(chǎn)物主要集中在細胞內(nèi)，需要進行后續(xù)的分離純化，提高了成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種重組載體。
[0006]本發(fā)明提供的重組載體，為將脂肪酶Btl2編碼基因插入畢赤酵母表達載體中，得到的表達脂肪酶重組載體；
[0007]所述脂肪酶Btl2編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。
[0008]上述重組載體中，所述畢赤酵母表達載體為PPICZ α。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組菌。
[0010]本發(fā)明提供的重組菌，為將上述重組載體導(dǎo)入畢赤酵母菌中得到的重組菌。
[0011]在本發(fā)明的實施例中，畢赤酵母菌具體為畢赤酵母Χ33。
[0012]上述的重組載體或上述的重組菌在制備脂肪酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0013]上述應(yīng)用中，所述脂肪酶具有如下I)和/或2)所示的特征:1)胞外分泌；2)耐熱。
[0014]本發(fā)明的第三個目的是提供一種制備脂肪酶的方法。
[0015]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:發(fā)酵上述的重組菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物的上清液，得到脂肪酶。
[0016]上述方法中，所述發(fā)酵按照如下步驟進行:
[0017]I)將上述的重組菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中流加補料；
[0018]2)向I)培養(yǎng)得到的發(fā)酵體系中流加甲醇溶液誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0019]所述補料為含12ml/L PTMl的質(zhì)量百分含量為50%甘油水溶液；
[0020]每IL 的 PTMl 按照如下方法制備:6g CuSO4.5Η20、0.08g Nal、3g MnSO4.H2O,
0.2g NaMoO4.2Η20、0.02g 硼酸、0.5g CoCl、20g ZnCl2、65g FeSO4.7Η20、0.2g 生物素、5.0mlH2SO4，用水定容到IL ；
[0021]所述甲醇溶液為含有12ml/L PTMl的甲醇溶液。
[0022]上述方法中，步驟I)中，所述培養(yǎng)的pH值為5.0，所述培養(yǎng)的溶氧量為20% ;所述培養(yǎng)時間為30.5h ;所述流加補料為在所述培養(yǎng)開始24h后，流加補料4h ；
[0023]步驟2)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的pH值為6.0，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溶氧量為20% ;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為100h，自步驟I)的培養(yǎng)開始記作第Oh (請核實)；
[0024]所述流加甲醇溶液為待步驟I)培養(yǎng)30.5h后流加所述甲醇溶液，使甲醇在發(fā)酵體系的終濃度控制在0.2%-0.5% (體積百分含量)。
[0025]上述方法中，每IL所述發(fā)酵培養(yǎng)基按照如下方式制備:26.7ml 85%磷酸、
0.93gCaS04、18.2g K2S04、14.9g MgSO4.7Η20、4.13g K0H、40g甘油、3.5ml ΡΤΜ1，用水定容到IL0
[0026]由上述的方法制備的脂肪酶也是本發(fā)明保護的范圍；所述脂肪酶具體具有如下I)和/或2)所示的特征:1)胞外分泌；2)耐熱。。
[0027]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明將優(yōu)化后的脂肪酶編碼基因btl2利用基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了畢赤酵母表達載體PPICZ a -btl2,利用電穿孔轉(zhuǎn)化技術(shù)，得到多拷貝的重組畢赤酵母菌，將重組畢赤酵母菌在5升發(fā)酵罐內(nèi)經(jīng)過甲醇誘導(dǎo)100小時，細胞密度OD6tltl可以達到350，脂肪酶的分泌量達到300mg/L培養(yǎng)液，酶活達到1000U/ml。經(jīng)過檢測，該脂肪酶最適反應(yīng)溫度為60°C，在50°C保溫處理30分鐘后，酶活可以保持90%以上。在pH6.5-7.0范圍內(nèi)酶活保持穩(wěn)定。因此，本發(fā)明通過畢赤酵母異源蛋白表達系統(tǒng)胞外分泌獲得脂肪酶，使獲取方法更加簡單、降低該酶的生產(chǎn)成本，在耐熱脂肪酶的生產(chǎn)中具有廣闊的工業(yè)前景。

【具體實施方式】
[0028]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0029]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030]以下實施方式用來說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍
[0031]實施例1、重組畢赤酵母表達載體pPICZ a -btl2的構(gòu)建
[0032] 將btl2基因的序列進行優(yōu)化，根據(jù)優(yōu)化后的btl2基因(優(yōu)化后btl2基因的核苷酸序列作為序列表中的序列I ;編碼的蛋白btl2的氨基酸序列為序列表中序列2)以及畢赤酵母表達質(zhì)粒PPICZa上多克隆位點的特征，設(shè)計合成以下兩條引物:PB1:Fff:5’ - TTTgaattcGCTGCTTCTCCAAGAGC-3，(序列 3);PB2:REV:5’ - AAAggtaccTGGTCTCAAAGAAGCCAA-3’(序列4)。PB1、PB2兩端分別設(shè)計了 EcoRI和KpnI酶切位點，以小寫字體表示。
[0033]以人工合成的序列I所示的btl2基因為模板，用PB1、PB2為引物，通過PCR方法擴增出btl2基因。PCR條件:預(yù)變性95°C 5分鐘；再進行30個循環(huán)的95°C變性30秒，58°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘；最后72°C延伸10分鐘。
[0034]得到大小約1.2kb擴增產(chǎn)物；將擴增產(chǎn)物切膠回收后連接到pMD19-T-simple載體上，得到重組載體，將重組載體進行EcoRI和KpnI雙酶切驗證(得到1200bp的為陽性)和測序驗證(重組載體為將序列表中的序列I插入pMD19-T-simple載體的EcoRI和KpnI酶切位點間得到的載體)，將驗證正確的重組載體命名為pMD 19-T-s imp I e_bt 12。
[0035]分別將pMD19-T-simple-btl2 和酵母表達載體 pPICZ α(Invitrogen, USA, V19520)進行 EcoRI 和 KpnI 雙酶切；回收 1200bp 的 btl2 基因片段和3600bp的pPICZ α載體骨架；連接上述btl2基因片段和pPICZ α載體骨架，得到重組表達載體；將重組表達載體用EcoRI和KpnI雙酶切驗證，得到陽性重組表達載體(1200kb小片段和3600bp大片段)；將陽性重組表達載體進行測序分析，結(jié)果該陽性重組表達載體為將序列表中的序列I所示的btl2基因插入pPICZ α載體的EcoRI和KpnI雙酶切位點間得到的載體，命名為pPICZ a -btl2，為重組畢赤酵母表達載體。
[0036]實施例2、耐熱脂肪酶的制備
[0037]1、重組畢赤酵母的制備
[0038]將實施例1得到的重組畢赤酵母表達載體pPICZ a -btl2經(jīng)SacI酶切線性化后，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33 (Inv itrogen, USA, C188000)菌株，將轉(zhuǎn)化得到的菌液涂布于含有100μg/ml Zeocin的YPD平板上，30°C培養(yǎng)至發(fā)生同源重組的轉(zhuǎn)化子的菌落長出，隨機挑取40個轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接到含有2000 μ g/ml Zeocin的YPD平板上。
[0039]提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，該質(zhì)粒為pPICZ a _btl2，將含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子命名為X33-pPICZ a -btl2,即為重組畢赤酵母。
[0040]采用同樣的方法將空載體pPICZ α轉(zhuǎn)入畢赤酵母Χ33中，得到X33_pPICZ α。
[0041]2、重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達
[0042]挑取重組畢赤酵母X33-pPICZa-btl2，接種于25ml BMGY培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2% 蛋白胨、10mM 磷酸鉀 pH 6.0、1%ΥΝΒ (Yeast Nitrogen Base)、1% 甘油、4*1(T5% 生物素)，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)至0D_為2.0左右，離心收集菌體，轉(zhuǎn)接到10mlBMMY培養(yǎng)基(BMGY培養(yǎng)基中的甘油換成0.5%甲醇)，繼續(xù)培養(yǎng)，每24小時取樣1ml，并補加甲醇至終濃度0.5%，誘導(dǎo)表達7天，離心收集上清液，得到粗酶液(X33-pPICZa -btl2)。以X33-pPICZa和X33為對照。
[0043]將粗酶液(X33-pPICZ a _btl2)經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，得到分子量38KD的目的蛋白條帶，與脂肪酶Btl2理論分子量相同。
[0044]X33-pPICZ a和X33采用同樣的方法誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集上清液，經(jīng)過SDS-PAGE電泳檢測，均未得到分子量38KD的目的蛋白條帶，說明均沒有產(chǎn)生脂肪酶。
[0045]以三丁酸甘油酯為底物，檢測重組畢赤酵母X33_pPICZa _btl2得到的粗酶液的脂肪酶酶活，檢測方法如下:
[0046]取4ml pH 8.0、濃度為200mM Tris-HCl緩沖液于帶塞三角瓶中，加入1ml三丁酸甘油酯，于50°C，200rpm搖床預(yù)熱5分鐘，加入0.1ml粗酶液，50°C，200rpm搖床震蕩反應(yīng)5分鐘，立即取出加入20ml無水乙醇終止反應(yīng)，加入4滴酚酞指示劑，用0.1M NaOH溶液滴定?？瞻讓嶒炘诩尤朊笜悠泛罅⒓醇尤?0ml無水乙醇終止反應(yīng)。酶活計算公式如下:
[0047]

【權(quán)利要求】
1.一種重組載體，為將脂肪酶Btl2編碼基因插入畢赤酵母表達載體中，得到的表達脂肪酶重組載體； 所述脂肪酶Btl2編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其特征在于:所述畢赤酵母表達載體為pPICZa。
3.—種重組菌，為將權(quán)利要求1或2所述重組載體導(dǎo)入畢赤酵母菌中得到的重組菌。
4.權(quán)利要求1或2所述的重組載體或權(quán)利要求3所述的重組菌在制備脂肪酶中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述脂肪酶具有如下I)和/或2)所示的特征:1)胞外分泌；2)耐熱。
6.一種制備脂肪酶的方法，包括如下步驟:發(fā)酵權(quán)利要求3所述的重組菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物的上清液，得到脂肪酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于: 所述發(fā)酵按照如下步驟進行: 1)將權(quán)利要求3所述的重組菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中流加補料； 2)向I)培養(yǎng)得到的 發(fā)酵體系中流加甲醇溶液誘導(dǎo)培養(yǎng)； 所述補料為含12ml/L PTMl的質(zhì)量百分含量為50%甘油水溶液； 每 IL 的 PTMl 按照如下方法制備:6g CuSO4.5Η20、0.08g Nal、3g MnSO4.H20,0.2gNaMoO4.2Η20、0.02g 硼酸、0.5g CoCl、20g ZnCl2、65g FeSO4.7Η20、0.2g 生物素、5.0mlH2SO4，用水定容到IL ； 所述甲醇溶液為含有12ml/L PTMl的甲醇溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述培養(yǎng)的pH值為5.0，所述培養(yǎng)的溶氧量為20% ;所述培養(yǎng)時間為30.5h ；所述流加補料為在所述培養(yǎng)開始24h后，流加補料4h ； 步驟2)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的pH值為6.0，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溶氧量為20% ;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為100h，自步驟I)的培養(yǎng)開始記作第Oh ； 所述流加甲醇溶液為待步驟I)培養(yǎng)30.5h后流加所述甲醇溶液，使甲醇在發(fā)酵體系的終濃度控制在0.2%-0.5% (體積百分含量)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于:每IL所述發(fā)酵培養(yǎng)基按照如下方式制備:26.7ml 85% 磷酸、0.93g CaSO4'18.2g K2SO4'14.9g MgSO4.7Η20、4.13gK0H、40g 甘油、3.5ml PTM1，用水定容到1L。
10.由權(quán)利要求6-9所述的方法制備的脂肪酶； 所述脂肪酶具體具有如下I)和/或2)所示的特征:1)胞外分泌；2)耐熱。
【文檔編號】C12N1/19GK104073510SQ201310101480
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月27日
【發(fā)明者】印鐵, 劉德華, 歐先金, 杜偉 申請人:清華大學(xué)