一株臨床分離的放線菌樣菌種及其培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一株臨床分離的放線菌樣菌種，是從一名男性肺炎患者的痰中分離到的，該菌株為IFM10348，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的菌株保藏號：CCTCC?NO:M?2011245，于2011年7月10日保藏。培養(yǎng)方法是將分純的放線菌樣菌株IFM10348以分區(qū)劃線法接種于培養(yǎng)基平板上，置于溫箱中需氧培養(yǎng)；之后取培養(yǎng)物涂片，分別進行革蘭染色和抗酸染色；再將菌株點種于凹玻片的培養(yǎng)基內(nèi)，覆蓋蓋玻片，置濕盒內(nèi)于溫箱中需氧培養(yǎng)；待菌體生長后，取出蓋玻片，經(jīng)固定、脫水、干燥后在蓋玻片上噴金；又將菌株接種于培養(yǎng)基平板上進行需氧培養(yǎng)。本發(fā)明菌株的培養(yǎng)方法從而為加深對臨床病原放線菌的認識，為將來更好地預防和治療相關(guān)疾病提供依據(jù)。
【專利說明】一株臨床分離的放線菌樣菌種及其培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物，具體而言，涉及放線菌樣菌種。
【背景技術(shù)】
[0002]放線菌是原核生物的一個類群。大多數(shù)有發(fā)達的分枝菌絲。菌絲纖細，寬度近于桿狀細菌，約0.5~Iy m。放線菌因菌落呈放線狀而的得名，在自然界中分布很廣，主要以孢子繁殖。經(jīng)檢索，涉及放線菌的中國專利申請件很多，如93112750.5 號《制備馬杜拉放線菌屬新菌株的方法》、200410026093.1號《放線菌素D的類似物》、 200510011057.2號《一種篩選抗煙草黑脛病放線菌的方法》、200710156833.7號《一株生防放線菌-淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D》、200810123930.0號《產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)的極地海洋放線菌AFN1007》、201110007054.7號《一種防治油茶病害的生防放線菌菌株及其應用》、 201110261599.0號《一株海洋放線菌L131及其代謝物、代謝物的制法及應用》等，但迄今為止未見涉及從病人痰中臨床分離出的放線菌相關(guān)的專利申請件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一株臨床分離的放線菌樣新型菌種，以便對其進行生物學與
基因鑒定。
[0004]本發(fā)明的又一目的是提供該菌株的培養(yǎng)方法。
[0005]發(fā)明人提供的菌株為一臨床分離株，是2002年從日本的一名48歲男性肺炎患者的痰中分離到的。從該患者的痰中分離得到的這株放線菌，編號為IFM10211，經(jīng)過一系列的鑒定，已于2006年確定IFM10211為戈登氏菌屬的一個新種，并在IJSEM上發(fā)表文章，命名為Gordonia araiim。該患者經(jīng)過長期使用左氧氟沙星治療之后,發(fā)現(xiàn)患者表現(xiàn)對左氧氟沙星耐藥，從該患者的痰中重新分離得到一株菌，經(jīng)培養(yǎng)，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的菌株保藏號:CCTCC N0:M2011245，于2011年7月10日保藏，保藏單位的地址為:中國湖北省武漢市武昌洛珈山武漢大學保藏中心。保藏的培養(yǎng)物命名為`Gort/oflia iterum IFM10348。
[0006]發(fā)明人提供的放線菌樣菌種的培養(yǎng)方法是:將分離得到純的放線菌樣菌株 IFM10348以分區(qū)劃線法接種于腦心浸液瓊脂平板上，置于37°C溫箱中需氧培養(yǎng)2~4d，觀察IFM10348菌落的形成及特征；之后取培養(yǎng)物涂片，分別進行革蘭染色和抗酸染色；再將 IFM10348點種于凹玻片凹窩的腦心浸液培養(yǎng)基內(nèi)，覆蓋蓋玻片，置濕盒內(nèi)，于37 °C溫箱中需氧培養(yǎng)；待菌體長在蓋玻片上后，取出蓋玻片，經(jīng)固定、脫水、干燥后在蓋玻片上噴金，用掃描電鏡觀察、拍照；將IFM10348接種于腦心浸液瓊脂平板上，分別置于5°C、15°C、20°C、 25 °C、40°C、45 V需氧培養(yǎng)，觀察生長現(xiàn)象。
[0007]發(fā)明人通過碳源利用試驗及API細菌數(shù)值鑒定對IFM10348進行生化反應鑒定。 采用氣相色譜分析法對IFM10348進行脂肪酸分析，以了解其脂肪酸組成及含量；通過藥物敏感性試驗，觀察IFM10348對不同藥物的敏感性；通過研究IFM10348的形態(tài)、染色、培養(yǎng)特性、生化反應、脂肪酸組成，藥物敏感性，對IFM10348進行生物學特性的鑒定；通過對IFM10348的16S rRNA、和Md I基因序列進行測定及分析，對其進行基因鑒定；將IFM10348的生化反應及脂肪酸分析結(jié)果與其親緣關(guān)系最近菌種的模式菌株的實驗結(jié)果進行比較，進一步探討IFM10348的分類學地位。
[0008]結(jié)果是:菌株IFM10348在腦心浸液瓊脂平板上經(jīng)37°C需氧培養(yǎng)2d后，肉眼可見形成直徑1.5~3_的淡黃色、邊緣不整齊的粗糙菌落。革蘭染色陽性，抗酸染色陰性。掃描電鏡觀察到菌體為桿狀或短棒狀，未發(fā)現(xiàn)鞭毛。IFM10348在腦心浸液瓊脂平板上經(jīng)5°C、45°C需氧培養(yǎng)8d均未見生長。經(jīng)15°C、20°C需氧培養(yǎng)5-7d，25、40°C需氧培養(yǎng)2-3d，形成同37°C培養(yǎng)的菌落特征。IFM10348可利用L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、蛋氨酸、3-甲基戊二酸、D-葡糖酸、α -酮戊二酸、3-甲基-己二酸、亞氨基二乙酰乙酸、4甲基傘形酮基-磷酸鹽、對硝基苯基-a -D-葡糖苷、對硝基苯基-磷酸鹽、胸腺嘧啶脫氧核苷、粘菌素、D-果糖作為碳源?？蛇€原硝酸鹽、發(fā)酵葡萄糖，可與吡嗪酰胺、焦谷氨酸-萘胺、2-萘基-磷酸鹽、2-萘基-a D-吡喃型葡萄糖苷發(fā)生反應，觸酶試驗陽性。IFM10348主要含C16:(l和c18:1兩種脂肪酸，此外還有c16:1、c18:0, c18:2、C1813脂肪酸。藥物敏感性試驗顯示IFM10348對妥布霉素、卡那霉素、復方新諾明敏感，對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星耐藥。16S rRNA基因序列測定結(jié)果在Genebank上比對發(fā)現(xiàn)，分離菌株IFM10348屬于放線菌戈登氏菌屬。在系統(tǒng)發(fā)育樹上可見分離菌IFM10348與該菌屬的模式菌株hirsuta DSM 44140τ和Gmalaquae IMMIB WWCC-22T親緣關(guān)系最近。經(jīng)Genetyx軟件分析，分離菌IFM10348與G.hirsuta DSM 44140τ 和 malaquae IMMIB WWCC-22T 的 16S rRNA 基因序列相似度最高，分別為96.982%和97.402%。IFM10348的生化反應及脂肪酸分析結(jié)果與G.hirsuta DSM441401和61 malaquae IMMIB WWCC-22T 均有明顯差別。
[0009]根據(jù)國內(nèi)外的相關(guān)研究以及本文的研究結(jié)果，發(fā)明人認為:
1.通過生物學特性及16S rRNA基因鑒定，臨床分離的放線菌樣菌株IFM10348屬于戈登氏菌屬的放線菌。
[0010]2.通過對分離菌株IFM10348的基因鑒定發(fā)現(xiàn)，IFM10348與戈登氏菌屬各有效發(fā)表種的16S rRNA、和Md 2基因序列有一定的差異。其生物學特性與其親緣關(guān)系最近菌種的模式菌株也不完全相同，根據(jù)其在16S rRNA系統(tǒng)進化發(fā)育樹的位置分析，擬考慮為戈登氏菌屬的一個新菌種類型。對于菌種的最終確定還需通過國際論文發(fā)表來落實。
[0011]3.戈登氏菌屬中的大部分菌種屬于人類的條件致病菌，而且多與肺部感染有關(guān)。該菌株從肺部感染患者分離，提示可能與呼吸道感染有關(guān)。
[0012]發(fā)明人提供的放線菌樣菌種的培養(yǎng)方法培養(yǎng)結(jié)果是:菌株IFM10348在腦心浸液瓊脂平板上經(jīng)37°C需氧培養(yǎng)2d后，肉眼可見形成直徑1.5~3mm的淡黃色、邊緣不整齊的粗糙菌落；革蘭染色陽性，抗酸染色陰性；掃描電鏡觀察到菌體為桿狀或短棒狀，未發(fā)現(xiàn)鞭毛；IFM10348在腦心浸液瓊脂平板上經(jīng)5°C、45°C需氧培養(yǎng)8d均未見生長。經(jīng)15°C、20°C需氧培養(yǎng)5~7d，25、40°C需氧培養(yǎng)2~3d，形成同37°C培養(yǎng)的菌落特征。IFM10348可利用L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、蛋氨酸、3-甲基戊二酸、D-葡糖酸、α -酮戊二酸、3_甲基-己二酸、亞氨基二乙酰乙酸、4甲基傘形酮基-磷酸鹽、對硝基苯基-a -D-葡糖苷、對硝基苯基-磷酸鹽、胸腺嘧啶脫氧核苷、粘菌素、D-果糖作為碳源，可還原硝酸鹽、發(fā)酵葡萄糖，可與吡嗪酰胺、焦谷氨酸-P -萘胺、2-萘基-磷酸鹽、2-萘基-a D-吡喃型葡萄糖苷發(fā)生反應，觸酶試驗陽性。IFM10348主要含C16:Q和C18:1兩種脂肪酸，此外還有C16:1、C18:Q、C18:2、 〇18:3脂肪酸。藥物敏感性試驗顯示IFM10348對妥布霉素、卡那霉素、復方新諾明敏感，對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星耐藥。16S rRNA基因序列測定結(jié)果在Genebank上比對發(fā)現(xiàn)，分離菌株 IFM10348屬于放線菌戈登氏菌屬。在系統(tǒng)發(fā)育樹上可見分離菌IFM10348與該菌屬的模式菌株hirsuta DSM 441401 和malaquae IMMIB WWCC-221'親緣關(guān)系最近。經(jīng) Genetyx 軟件分析，分離菌 IFM10348 與 hirsuta DSM 441401^6 malaquae IMMIB WWCC-22T 的 16S rRNA基因序列相似度最高，分別為96.982%和97.402%。IFM10348的生化反應及脂肪酸分析結(jié)果與 G hirsuta DSM 441401 和 G malaquae IMMIB WWCC-22T 均有明顯差別。
[0013]通過培養(yǎng)的結(jié)果分析以及生物學特性及16S rRNA基因鑒定，臨床分離的放線菌樣菌株IFM10348屬于戈登氏菌屬的放線菌；通過對分離菌株IFM10348的基因鑒定發(fā)現(xiàn)， IFM10348與戈登氏菌屬各有效發(fā)表種的16S rRNA、^F_r5和Md 2基因序列有一定的差異。 其生物學特性與其親緣關(guān)系最近菌種的模式菌株也不完全相同；戈登氏菌屬中的大部分菌種屬于人類的條件致病菌，而且多與肺部感染有關(guān)。該菌株從肺部感染患者分離，提示可能與呼吸道感染有關(guān)。
[0014]本發(fā)明提供一株臨床分離的放線菌樣菌種IFM10348，對該菌株進行了生物學特性及16S rRNA基因等鑒定，為其研究提供了基礎，了解其生理和化學分類學特征，本發(fā)明的培養(yǎng)方法從而為加深對臨床病原放線菌的認識，為將來更好地預防和治療相關(guān)疾病提供依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為腦心浸液瓊脂平板上IFM 10348的菌落；圖2為菌株IFM10348的革蘭染色結(jié)果(放大1000倍)，圖3為菌株IFM 10348的掃描電鏡照片(放大5000倍)，圖4為菌株 IFM 10348在16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進化樹上的位置，從圖4可知其與已知發(fā)現(xiàn)的戈登氏菌種之間存在著明顯的差異，屬于一株戈登氏新種。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述。
[0017]實施例
按照以下方法培養(yǎng)IFM10348放線菌，并進行生物學特性:
`I菌種與試劑
(I)菌種臨床分離株:IFM10348 ;模式菌株 'G.hirsuta DSM 441401、G.malaquae MMIB WWCC-22T，來自日本千葉大學真菌研究所；藥敏試驗質(zhì)控菌株:金黃色葡萄球菌 ATCC25923,大腸埃希菌 ATCC25922。
[0018](2)染色液革蘭染色液,抗酸染色液。
[0019](3)培養(yǎng)基腦心浸液瓊脂(Difco? Brain Heart Infusion agar),日本和光純藥工業(yè)株式會社提供，批號8198572 ;水解酪蛋白瓊脂(MH瓊脂)，杭州微生物試劑有限公司提供，批號20100716-00。
[0020](4) 棒狀桿菌鑒定試劑盒(API Coryne) 德國梅里埃公司提供，批號864773301。內(nèi)有API Coryne試條、GP培養(yǎng)基、懸浮培養(yǎng)基、麥氏管、培養(yǎng)盒。
[0021](5)藥敏紙片杭州微生物試劑有限公司提供。妥布霉素，批號110221;卡那霉素，批號110310 ;左氧氟沙星，110210 ;環(huán)丙沙星，110223 ;復方新諾明，110126。
[0022](6)聚合酶鏈反應(PCR)試劑DNA提取試劑盒，日本NIPPON GENE公司提供的ISOPLANT II kit試劑盒。PCR反應體系,英國GE Healthcare公司提供的Ready - To-GoPCR beads。PCR反應引物，由美國英杰生命技術(shù)公司合成。
[0023](7) DNA Marker北京天根生化科技有限公司提供。
[0024]2培養(yǎng)與鑒定方法
(I)IFM10348的形態(tài)與培養(yǎng)特性
形態(tài)及染色性:將已分純的IFM10348以分區(qū)劃線法接種于腦心浸液瓊脂平板上，置于37°C溫箱中需氧培養(yǎng)2-4d，肉眼觀察培養(yǎng)基上IFM10348的菌落形成及其菌落形態(tài)、大小、顏色、表面性狀、邊緣等特征。取培養(yǎng)物涂片后分別進行革蘭染色和抗酸染色；
掃描電鏡觀察:用無菌吸管取融化的腦心浸液培養(yǎng)基，加I滴于無菌凹玻片的凹窩中。待其凝固后，以無菌操作法用接種針取IFM10348培養(yǎng)物，點種于凹窩的培養(yǎng)基中心，覆蓋無菌蓋玻片，置濕盒內(nèi)，同法接種多份，于37°C溫箱中需氧培養(yǎng)。每日取出一塊蓋玻片，肉眼觀察培養(yǎng)物在蓋玻片上的生長情況。將蓋玻片上的培養(yǎng)物用接種環(huán)加入到生理鹽水中，制作涂片后進行革蘭染色，觀察其形態(tài)。待菌體生長在蓋玻片上后，將蓋玻片及培養(yǎng)物送本院電鏡室拍攝掃描電鏡。經(jīng)固定、脫水及干燥后，直接在蓋玻片上噴金，用掃描電鏡觀察，拍照。
培養(yǎng)特性:將IFM10348接種于腦心浸液瓊脂平板上，分別置于5°C、15°C、20°C、25°C、40°C、45°C溫箱中需氧培養(yǎng)，肉眼觀察培養(yǎng)基上IFM10348的菌落形成及特征至8d。
[0025](2) IFM10348的生化反應鑒定
碳源利用試驗:根據(jù)已知方法配制基礎培養(yǎng)基:0.1% NH4NO3,0.1% KH2PO4, 0.05%MgSO4.7H20, 0.02% KCl, ρΗ7.2。加入0.5%底物；底物濾過除菌；將在腦心浸液瓊脂平板上37°C培養(yǎng)2d的IFM10348加入到無菌生理鹽水中制成菌懸液，用麥氏管調(diào)整菌濃度為3個麥氏單位；用無菌吸管將菌懸液滴入準備好的基礎培養(yǎng)基試管內(nèi)，每管一滴；以不加底物的培養(yǎng)基作陰性對照；將所有試管置于37°C溫箱中靜置培養(yǎng)Iw后，將各試管內(nèi)的液體搖勻，觀察各試管內(nèi)液體的渾濁度?？梢岳孟鄳荚吹脑嚬軆?nèi)液體較對照管明顯渾濁，即為陽性。
[0026]API細菌數(shù)值鑒定:根據(jù)棒狀桿菌鑒定試劑盒說明書方法，將在腦心浸液瓊脂平板上37°C培養(yǎng)2d的IFM10348加入懸浮培養(yǎng)基中制成菌懸液，用麥氏管調(diào)整菌濃度為6個麥氏單位；將配制好的菌懸液用移液器加入試條的前11個試驗(NIT到GEL)管內(nèi)；將余下的菌懸液倒入API GP培養(yǎng)基中，混勻；將新制的菌懸液加入試條后9個試驗(O到GLYG)管內(nèi)；在有下劃線的試驗的杯中(URE和(^IjGLYG)加入礦物油，形成新月狀凸起；將試條置濕盒內(nèi)，于36°C ±2°C培養(yǎng)24h;培養(yǎng)之后分別加試劑，等待IOmin后根據(jù)說明書上的結(jié)果判讀表判讀結(jié)果。
[0027](3)脂肪酸分析:將IFM10348接種于大量腦心浸液瓊脂平板上，于37°C培養(yǎng)2~3d后，將培養(yǎng)好的菌苔用接種環(huán)刮取后裝于離心管，加入5mL無菌蒸餾水，于3000r / min離心15 min，倒去上清液，菌體沉淀用蒸餾水洗滌3次，真空干燥。收集一個青瓶量的菌干粉送貴州師范大學分析測試中心采用氣相色譜分析法進行脂肪酸分析。
[0028](4)藥物敏感性試驗；以金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，根據(jù)抗微生物藥物敏感性試驗的執(zhí)行標準CLSI M100-S20,對培養(yǎng)基及藥敏紙片進行監(jiān)測；將在腦心浸液瓊脂平板上37°C培養(yǎng)2d的IFM10348加入到無菌生理鹽水中，制成菌懸液，用麥氏管調(diào)整菌濃度為0.5個麥氏單位；用無菌棉簽蘸取菌液在管壁上擠去多余菌液，涂布整個MH瓊脂平板表面，反復3次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60°，保證涂布均勻； 將藥敏紙片貼于平板上，置于37°C溫箱中培養(yǎng)48h，取出測量抑菌圈；參考CLSI 執(zhí)行標準判斷IFM10348對不同藥物的敏感性。
【權(quán)利要求】
1.一株臨床分離的放線菌樣菌種，其特征在于是2002年從日本的一名48歲男性肺炎患者的痰中分離到的，該菌株為IFM10348，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的菌株保藏號:CCTCC N0:M2011245，于2011年7月10日保藏，保藏單位的地址為:中國湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心。
2.如權(quán)利要求1所述放線菌樣菌種的培養(yǎng)方法，其特征是:將分離得到純的放線菌樣菌株IFM10348以分區(qū)劃線法接種于腦心浸液瓊脂平板上，置于37°C溫箱中需氧培養(yǎng)2~4d，觀察IFM10348菌落的形成及特征；之后取培養(yǎng)物涂片，分別進行革蘭染色和抗酸染色；再將IFM10348點種于凹玻片凹窩的腦心浸液培養(yǎng)基內(nèi)，覆蓋蓋玻片，置濕盒內(nèi)，于37°C溫箱中需氧培養(yǎng)；待菌體長在蓋玻片上后，取出蓋玻片，經(jīng)固定、脫水、干燥后在蓋玻片上噴金，用掃描電鏡觀察、拍照；又將IFM10348接種于腦心浸液瓊脂平板上，分別置于5°C、15°C、20°C、25°C、4(TC、45°C需氧培養(yǎng)，觀察生長現(xiàn)象；培養(yǎng)結(jié)果是:菌株IFM10348在腦心浸液瓊脂平板上經(jīng)37°C需氧培養(yǎng)2d后，肉眼可見形成直徑1.5~3mm的淡黃色、邊緣不整齊的粗糙菌落；革蘭染色陽性，抗酸染色陰性；掃描電鏡觀察到菌體為桿狀或短棒狀，未發(fā)現(xiàn)鞭毛；IFM10348在腦 心浸液瓊脂平板上經(jīng)5°C、45°C需氧培養(yǎng)8d均未見生長。
【文檔編號】C12R1/01GK103525716SQ201310087202
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月19日
【發(fā)明者】康穎倩 申請人:康穎倩