專利名稱：保護(hù)動(dòng)物對(duì)抗由屬于諾卡氏菌型放線菌組的細(xì)菌感染引起的疾病的藥物組合物的制作方法
保護(hù)動(dòng)物對(duì)抗由屬于諾卡氏菌型放線菌組的細(xì)菌感染引起
的疾病的藥物組合物本發(fā)明涉及一種保護(hù)動(dòng)物對(duì)抗由屬于諾卡氏菌型放線菌組的細(xì)菌感染引起的疾病的藥物組合物。本發(fā)明還涉及該組的活減毒細(xì)菌用于制造所述組合物的用途和用該組合物治療動(dòng)物的方法。在放線菌綱的細(xì)菌中，存在稱為放線菌目的細(xì)菌目，通常稱為放線菌類。屬于該目的細(xì)菌是具有高G+C含量的絲狀革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(然而，幾個(gè)種具有復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，這使得經(jīng)典的革蘭氏染色不太合適或甚至不合適，例如，屬于放線菌目分枝桿菌科的許多種通常就是這樣)。它們最為人所知的是作為土壤居住生物體，盡管各種菌株存在于植物和動(dòng)物，包括人中。它們產(chǎn)生抗性孢子，其通常粘附于氣生菌絲體或菌絲。放線菌目在有機(jī)材料的分解中起著重要作用。由于它們的典型特性，將幾個(gè)種用于工業(yè)和制藥研究中。大部分放線菌對(duì)于動(dòng)物是非致病性的(結(jié)合本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)動(dòng)物包括人)。 然而，在許多放線菌的亞目(例如，鏈孢囊菌亞目、微球菌亞目、鏈霉菌亞目和弗蘭克氏菌亞目)中，存在一個(gè)亞目，即，棒桿菌亞目，其僅次于大量的非致病細(xì)菌，包含相當(dāng)大數(shù)量的動(dòng)物病原體。顯示出這些病原體存在于稱為諾卡氏菌型放線菌的系統(tǒng)發(fā)生組中，其包括分枝桿菌科、諾卡氏菌科和棒桿菌科(參見，例如，第11章，標(biāo)題為Ahodococus equi Pathogenesis and Replication in Macrophages (馬紅球菌巨噬細(xì)胞中的發(fā)病機(jī)理和 MM ) JAL "Opportunistic Intracellular Bacteria and Immunity，，(機(jī)會(huì)個(gè)生胞內(nèi)細(xì)菌和免疫)，Lois J. Paradise等(編輯)，紐約，1999)。顯然，對(duì)抗較大部分的與這些病原體感染相關(guān)的疾病，幾乎不存在任何合適的預(yù)防性處理(即，暴露于引起疾病的病原體之前或幾乎同時(shí)的處理，這可能能夠預(yù)防感染的疾病，或至少減輕疾病的影響)。在近些年中，已經(jīng)證實(shí)了諾卡氏菌型放線菌的系統(tǒng)發(fā)生組的分枝桿菌科、諾卡氏菌科和棒桿菌科是棒桿菌亞目?jī)?nèi)非常相關(guān)的科(請(qǐng)參閱，University of California, San Diego, Outline of Senior Project, Marelle L. Yehuda，2005年6月2日)。還變得清楚的是特別是該組中的致病細(xì)菌，至少對(duì)于其沒有合適的預(yù)防性處理可用的致病細(xì)菌(如，例如，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、黃尾脾臟諾卡氏菌(Nocardia seriolae)禾口馬紅球菌(I h0d0C0CCUS equi))，具有重要的共有特性感染通常通過皮膚或粘膜發(fā)生，接著該細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)傳播并且在這些巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制(參見，例如，Microbes and Infection 7,2005,1352-1363 ；Proceedings of the National Academy of Sciences, 2005 ^6^7 日，Vol. 102，no 23，pp 8327-8332 ；Nature Medicine 13,282-284,2007 ；Transplantation Proceedings, Vol. 36, Issue 5，2004 年 6 月，ppl415_1418)。實(shí)際上，巨噬細(xì)胞是在對(duì)抗微生物感染的宿主免疫防御的前線，但與依賴于避免噬菌作用以在宿主中存活的細(xì)菌不同， 目前設(shè)想的該組內(nèi)的致病細(xì)菌靶向巨噬細(xì)胞以存活，甚至在宿主中復(fù)制。本發(fā)明與這些具有在動(dòng)物的巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力的細(xì)菌有關(guān)，并且結(jié)合本發(fā)明將被稱為巨噬細(xì)胞存活諾卡氏菌型放線菌。顯然，巨噬細(xì)胞存活諾卡氏菌型放線菌已經(jīng)進(jìn)化以逃避動(dòng)物對(duì)抗微生物的防御的關(guān)鍵功能。特別地，肺結(jié)核分枝桿菌，即肺結(jié)核的成因微生物，是已經(jīng)成功地利用巨噬細(xì)胞作為其體內(nèi)的主要小生境的種，但屬于諾卡氏菌型放線菌組的其他細(xì)菌種，包括分枝桿菌科、諾卡氏菌科和棒桿菌科，已經(jīng)采用了相同策略。這些是例如引起布路里潰瘍的潰瘍分枝桿菌(Mycobacterium ulcerans)，引起牛約內(nèi)氏病的鳥副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium avium paratuberculosis)并且這與人的節(jié)段性回腸炎相關(guān)，引起牛肺結(jié)核的牛分枝桿菌(MyccAacterium bovis)，與免疫受損患者(如，AIDS病人)的機(jī)會(huì)感染相關(guān)的鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)，引起魚諾卡氏病的黃尾脾臟諾卡氏菌和皮諾卡氏菌 (Nocardia farcinia)，引起腎移植接受者感染的星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroides)， 引起馬駒肺炎的馬紅球菌(之前稱為棒桿菌)并且其也與免疫受損患者的機(jī)會(huì)感染相關(guān)， 引起綿羊、山羊、馬和偶爾還有人等中的例如肺部膿腫的假結(jié)核棒桿菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)。所有這些細(xì)菌種都具有共有的在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活，感染它們并在該類型的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的能力。這種典型的特性嚴(yán)重地妨礙了由屬于巨噬細(xì)胞存活諾卡氏菌型放線菌組的細(xì)菌感染引起的疾病的治療(在本說明書，術(shù)語(yǔ)“病癥(disorder)”用作“疾病(disease) ”的等價(jià)體)。在許多病例中，當(dāng)臨床體征實(shí)際存在時(shí)，治療是使用抗生素。然而，這是麻煩的， 因?yàn)橄喈?dāng)大量的細(xì)菌存在于巨噬細(xì)胞內(nèi)，并且抗生素難以到達(dá)。因此，使用抗生素的治療常?；ㄙM(fèi)很長(zhǎng)的治療時(shí)間，并且成效不一。對(duì)于諸如人的肺結(jié)核、魚諾卡氏病和馬駒肺炎這樣的疾病，預(yù)防性處理將是優(yōu)選的。這樣的預(yù)防性處理通常依賴于使用包含源自野生型細(xì)菌的殺滅的或活的減毒細(xì)菌的疫苗。關(guān)于巨噬細(xì)胞存活諾卡氏菌型放線菌，已經(jīng)證明了殺滅的疫苗(即，包含殺滅的細(xì)菌或其一個(gè)或多個(gè)亞基作為治療劑的疫苗)是不成功的。目前， 通常認(rèn)為對(duì)于成功的對(duì)抗巨噬細(xì)胞存活諾卡氏菌型放線菌的預(yù)防性處理需要活細(xì)菌，因?yàn)橹挥羞@些才能具有到達(dá)巨噬細(xì)胞并模擬野生型細(xì)菌足以引發(fā)合適的免疫應(yīng)答的能力。實(shí)際上，為了治療肺結(jié)核，基于牛分枝桿菌種的活疫苗(BCG，卡介苗)是可用的，該種與肺結(jié)核分枝桿菌密切相關(guān)。然而，保護(hù)作用并不令人印象深刻。對(duì)于諸如馬紅球菌和黃尾脾臟諾卡氏菌這樣的諾卡氏菌科種，目前沒有可購(gòu)得的疫苗。對(duì)于假結(jié)核棒桿菌，已經(jīng)嘗試了使用自體疫苗的控制，然而，成效不一(RUMA Guidelines,National Office of Animal health, Hertfordshire，英國(guó)，2006)。顯然，對(duì)保護(hù)動(dòng)物對(duì)抗由巨噬細(xì)胞存活諾卡氏菌型放線菌感染引起的疾病的合適的預(yù)防性處理存在著需求。該意義上的處理意思是刺激靶動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，足以至少降低野生型微生物攻擊的負(fù)面影響。目標(biāo)是這導(dǎo)致對(duì)抗疾病的保護(hù)，即，預(yù)防疾病，或至少減輕動(dòng)物中感染的水平或疾病的臨床體征，并且因此也減輕了疾病的嚴(yán)重性。巨噬細(xì)胞存活諾卡氏菌型放線菌為了在宿主中存活已經(jīng)采用了相同的策略這一事實(shí)產(chǎn)生了用于對(duì)抗這些細(xì)菌感染的預(yù)防性處理的共有策略的想法。在這點(diǎn)上，注意到已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述了膽固醇代謝在諾卡氏菌型放線菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活中起著關(guān)鍵作用，并且可能是重要的毒力因子(Proceedings of the National Academy of Science，2007 年 2 月 6 日，2007，vol. 104，no. 6，ppl947_1952)。還表明了該代謝提供了用于對(duì)抗引起疾病的菌株的新治療劑的邏輯上的靶，即，發(fā)生感染后用于治療的藥物。實(shí)際上，事后使用時(shí)，對(duì)于以下確定的事實(shí)存在其他支持的證據(jù)對(duì)于所有巨噬細(xì)胞存活諾卡氏菌型放線菌，膽固醇代謝在細(xì)菌在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活和持久性中起著作用。例如，從第 11 章(題目為Rhodococus equi !Pathogenesis and Replicationin Macrophages (馬紅球菌巨噬細(xì)胞中的發(fā)病機(jī)理和復(fù)制)，見“Opportunistic Intracellular Bacteria and Immunity，，(機(jī)會(huì)性胞內(nèi)細(xì)菌禾口免疫)，Lois J. Paradise 等(編輯)，紐約，1999)，已知在由幾種諾卡氏菌型放線菌引起的感染之間存在很大的臨床癥候?qū)W的相似性，并且確定了膽固醇氧化酶是毒力因子的酶成分。在Veterinairy Microbiology (獸醫(yī)微生物學(xué))，Volume 56，Issue 3-4,1997 年 6 月，269-276 中，顯示了假結(jié)核棒桿菌與馬紅球菌一起參與膽固醇氧化酶過程。因此，在最初考慮下，似乎試圖利用膽固醇代謝在這些細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活中起著關(guān)鍵作用的認(rèn)識(shí)研發(fā)藥物組合物來(lái)保護(hù)動(dòng)物對(duì)抗由巨噬細(xì)胞存活諾卡氏菌型放線菌感染引起的疾病(這樣的組合物還可以稱為疫苗)。然而，一旦實(shí)現(xiàn)以上提及的PNAS論文(2007論文)中提出的有關(guān)藥物的建議，并因此針對(duì)通過干擾膽固醇代謝完全殺滅細(xì)菌， 執(zhí)行相同的策略似乎對(duì)于活疫苗是不合適的如果嘗試通過在復(fù)制的必需位點(diǎn)切斷其存活來(lái)使細(xì)菌減毒，則該細(xì)菌將不會(huì)在宿主動(dòng)物中復(fù)制和持久。實(shí)際上，對(duì)于使用藥物的治療， 這是理想的情況。然而，對(duì)于活疫苗，如果完全阻斷細(xì)菌的存活，預(yù)期可模擬包含殺滅的細(xì)菌的疫苗。已經(jīng)證明了這樣的疫苗對(duì)于處理巨噬細(xì)胞存活諾卡氏菌型放線菌是不成功的。盡管如此，已經(jīng)進(jìn)行了嘗試以評(píng)價(jià)在用于保護(hù)動(dòng)物對(duì)抗野生型的引起疾病的諾卡氏菌型放線菌攻擊的藥物組合物中膽固醇代謝削弱的活細(xì)菌的使用。這類嘗試的實(shí)例是基于野生型馬紅球菌株103+的膽固醇氧化酶(ChoE)突變體的活疫苗(Prescott in Veterinary Microbiology 118，2006，pp240_246)。這種嘗試是不成功的。然而，不是因?yàn)闆]有誘導(dǎo)保護(hù)作用，如人們基于以上提及的PNAS論文的技術(shù)教導(dǎo)(PNAS，2007年2月6日，vol. 104， no. 6, ppl947-1952)可以預(yù)期的，而是因?yàn)橥蛔兙耆匀惶?。該突變體仍能以與野生型馬紅球菌相當(dāng)?shù)乃皆诰奘杉?xì)胞中存活和擴(kuò)增。此外，該膽固醇削弱突變體的抗原負(fù)荷看來(lái)似乎與野生型生物體的相當(dāng)。因此，該突變體仍然能夠誘發(fā)疾病。實(shí)際上，同時(shí)還確定了活的突變體馬紅球菌根本不能吸收膽固醇(由Van der Geize等提出的固醇攝取透性酶突變體 supAB,見 4th, Havemeyer Workshop on Rhodococcus equi, Edinburgh, 2008 年 7 月 13-16 日；禾口Van der Geize等“A novel method to generate unmarked gene deletions in the intracellular pathogen Rhococcus equi using 5-fluorocytosine conditional lethality”(使用5_氟胞核嘧啶條件致死在胞內(nèi)病原體馬紅球菌中產(chǎn)生未標(biāo)記基因缺失的新方法)，見 Nucleic Acids Research 2008 ;doi :10. 1093/nar/gkn811，更多的還涉及“Van der Geize等，2008”)，這意味著阻斷了全部的膽固醇代謝(至少當(dāng)膽固醇被用作起始化合物時(shí))，仍然能夠在巨噬細(xì)胞中存活和持續(xù)存在(Van der Geize等，2008)，并因此仍然太毒。為了使活的馬紅球菌減毒，似乎需要具有膽固醇代謝以外的作用的額外突變 (Prescott =Veterinary Microbiology 125，2007，100-110)?；谶@些結(jié)果，推斷出膽固醇代謝同樣不是重要的毒力因子，并且可以被用于充分地使這些細(xì)菌減毒。具有膽固醇代謝突變的細(xì)菌明顯具有與野生型生物體相同或至少相當(dāng)?shù)目乖?fù)荷，因此，盡管能夠提供適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用(即受試動(dòng)物幸免于突變細(xì)菌的攻擊)，但毒性太強(qiáng)以致不能用于藥物組合物中。因此，認(rèn)為針對(duì)用于預(yù)防性處理的藥物組合物是一條死胡同，該組合物含有通過滅活膽固醇代謝中所涉及的基因來(lái)減毒的活細(xì)菌。然而，令人驚訝地，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)了為了保護(hù)動(dòng)物對(duì)抗由巨噬細(xì)胞存活諾卡氏菌型放線菌感染引起的疾病，可以使用包含諾卡氏菌型放線菌種活細(xì)菌(通常是與感染細(xì)菌相同的種，或可替換地，是非常密切相關(guān)的種，因此具有許多共有的T-細(xì)胞表位，結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌就是這種情況)和用于攜帶細(xì)菌的藥物學(xué)上可接受載體的藥物組合物，通過滅活編碼甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白的基因而使活細(xì)菌減毒。在該意義上“減毒的”意思是能夠誘導(dǎo)與減毒細(xì)菌的有毒(通常是野生型)致病相對(duì)物相關(guān)的疾病的全套癥狀。在本發(fā)明意義上的“滅活”表示基因，例如同時(shí)是操縱子的一部分(即，實(shí)際上在功能水平上表達(dá)蛋白所必需的一組基因)，從基因組中完全除去或改變(通過任何已知的或甚至需要設(shè)計(jì)的技術(shù)；參見，例如，Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering (生物技術(shù)和遺傳工程介紹)，A. J. Nair ,INFINITY SCIENCE PRESS LLC, 2008, 第 13 章，"Genetic Techniques” (遺傳技術(shù))，pp476_496 和第 15 章，"Recombinant DNA Technology"(重組DNA技術(shù))，pp563-612)，使得其不再編碼相應(yīng)的野生型蛋白，或不再易于完全轉(zhuǎn)錄，或基因組中的任何其他變化，使得通過體內(nèi)的減毒細(xì)菌將不會(huì)形成野生型蛋白，至少與其中基因(或操縱子，如果合適)是適于支持正常代謝的形式的情況相比是不適于支持正常甲基六氫茚滿二酮丙酸酯分解代謝的水平。在本發(fā)明意義上的“編碼蛋白”意思是基因(例如，同時(shí)是操縱子的一部分)直接編碼蛋白或蛋白的亞基(多個(gè)亞基一起形成酶活性蛋白)，或編碼一個(gè)或多個(gè)直接或通過多個(gè)步驟在蛋白或其亞基中轉(zhuǎn)化的中間體(多個(gè)亞基一起形成酶活性蛋白)?！八幬飳W(xué)上可接受的載體”可以是與靶動(dòng)物在生理上相容和靶動(dòng)物可接受的任何溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等，例如，通過無(wú)菌來(lái)制得。 這些攜帶介質(zhì)的一些實(shí)例是水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、細(xì)菌培養(yǎng)流體、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其組合。它們可以提供液體、半固體和固體劑型，這將取決于所打算的給藥模式。如通常所知的，攜帶介質(zhì)的存在對(duì)于疫苗的功效不是必需的，但可以顯著簡(jiǎn)化抗原的劑量和給藥。除了該載體和抗原，藥物組合物可以包含其他物質(zhì)，諸如加入佐劑、穩(wěn)定劑、粘度調(diào)節(jié)劑或其他成分，這取決于所打算的用途或所需的組合物特性。在本發(fā)明的藥物組合物中，存在活的細(xì)菌，該細(xì)菌是突變的，使得編碼甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白的基因被滅活。如通常所知的，在膽固醇通過放線菌 (包括巨噬細(xì)胞存活諾卡氏菌型放線菌)降解的過程中，形成了甲基六氫茚滿二酮丙酸酯 (也稱為HIP或3a α-H-4 α (3’-丙酸)_7α β -甲基六氫_1，5_茚滿二酮)和5_羥基-甲基六氫茚酮丙酸酯(也稱為HIL或3aa-H_4a (3’ -丙酸)_5 a -羥基-7 α β-甲基六氫-1-茚酮-δ -內(nèi)酯)。最近，已經(jīng)在屬于棒桿菌目的亞目的細(xì)菌種中鑒定出操縱子(稱為ipdAB 茚滿二酮丙酸酯降解α+β)，該操縱子編碼HIP降解中所涉及的轉(zhuǎn)移酶的α和 β亞基(參見共同未決的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/EP2008/060844，2008年8月19日提交，基于 2007年8月21日提交的US優(yōu)先權(quán)申請(qǐng))。已知的轉(zhuǎn)移酶敲除突變體不再能夠降解HIP和 HIL(參見以上提及的專利申請(qǐng)的圖幻，也不再在HIP、HIL或4-雄烯-3，17- 二酮上生長(zhǎng)。 在任何情況中，“涉及HIP降解”意思是敲除突變體不再能夠在作為唯一碳源和能源的HIP 上生長(zhǎng)，或至少不能夠在通過非突變細(xì)菌可獲得的水平下的HIP上生長(zhǎng)。目前，不清楚轉(zhuǎn)移酶是否使HIP降解自身異化，或是否催化HIP降解所依賴的反應(yīng)。盡管如此，HIP降解在膽固醇代謝中相對(duì)后的階段中發(fā)生，并且是膽固醇降解途徑中非常特別的步驟?；诠娍色@得的關(guān)于膽固醇代謝中的突變的知識(shí)(以上提及的I^rescott參考文獻(xiàn))，將預(yù)期這種突變會(huì)導(dǎo)致活細(xì)菌極其毒，盡管其提供了保護(hù)作用。然而，令申請(qǐng)人驚訝的是，這樣的突變體似乎得到了適當(dāng)減毒，這是由于突變體在巨噬細(xì)胞內(nèi)明顯降低的存活能力引起的。為什么涉及HIP降解的基因在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活中起著這種重要作用的原因是不清楚的。甚至看來(lái)與現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)果相抵觸，現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)果顯示了連膽固醇代謝的完全阻斷都具有差的減毒作用，這顯然是因?yàn)閷?duì)諾卡氏菌型放線菌的巨噬細(xì)胞存活能力沒有作用。因此，非常令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的突變，其影響膽固醇代謝途徑中的次要步驟，嚴(yán)重地阻礙致病諾卡氏菌型放線菌在巨噬細(xì)胞中的存活能力。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了突變的活細(xì)菌仍然能夠進(jìn)入巨噬細(xì)胞，并且在其中繼續(xù)存活(因此保證了保護(hù)性免疫應(yīng)答的刺激)，但在非常低的水平上，這看來(lái)似乎明顯降低了它們的毒力，這隨后使其適用于預(yù)防性處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，將一個(gè)操縱子中的多基因滅活。通過滅活多基因，細(xì)菌變成野生型(類似)表型的機(jī)會(huì)將降低。特別地，將基因ipdA和ipdB滅活。通過滅活這些基因， 可以提供有效且安全的減毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過未標(biāo)記基因缺失來(lái)缺失至少一個(gè)基因，以實(shí)現(xiàn)滅活。未標(biāo)記突變的優(yōu)點(diǎn)在于可以在相同菌株中重復(fù)引入突變。在引入突變的過程中除去外源DNA(載體DNA)。因此，用于引入第二個(gè)突變的新引入的載體DNA不能在之前的突變位點(diǎn)整合(通過載體DNA之間的同源重組)。如果載體DNA仍然存在于染色體中，將明確地發(fā)生整合，并將產(chǎn)生大量的假陽(yáng)性整合體。系統(tǒng)能夠使用唯一的抗生素基因， 用于引入無(wú)數(shù)的突變。未標(biāo)記突變還使得在工業(yè)中易于使用，因?yàn)椴淮嬖诋愒碊NA，使發(fā)酵液易于處置。通過基因缺失的基因滅活能夠構(gòu)建穩(wěn)定的、非回復(fù)變異的突變體。尤其是，與通過單重組整合的基因破壞相比，通過基因缺失更容易滅活小基因(< 500bp)?；蛉笔дT變還可以用于滅活來(lái)自基因組的幾個(gè)基因的簇?；蛉笔дT變策略還可以用于基因-置換(例如，將野生型變成突變基因)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌屬于諾卡氏菌科或分枝桿菌科。優(yōu)選，細(xì)菌屬于紅球菌屬。諾卡氏菌或分枝桿菌，特別是屬于馬紅球菌、黃尾脾臟諾卡氏菌、結(jié)核分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、牛分枝桿菌或鳥副結(jié)核分枝桿菌中的任一種。關(guān)于這些種，迄今為止沒有可購(gòu)得的合適疫苗。本發(fā)明提供了可以用作疫苗的藥物組合物以對(duì)抗這些細(xì)菌，并因此減輕它們?cè)趧?dòng)物中引起的相應(yīng)疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是適于口服給藥的形式。除了這是非常方便的給藥方式這一事實(shí)以外，特別變得清楚的是這種給藥方式是安全的。非腸道給藥可能產(chǎn)生膿腫。優(yōu)選，活細(xì)菌以IxlO4至IxIOltlCFU/劑的濃度存在。本發(fā)明還涉及源自以編號(hào)CNCM 1-4108或編號(hào)CNCM 1-4109保藏于法國(guó)巴黎的 Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes of the Institut Pasteur 白勺菌株的馬紅球菌，并且涉及屬于該菌株的細(xì)菌。本發(fā)明還涉及具有在動(dòng)物的巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力的屬于諾卡氏菌型放線菌組的活細(xì)菌的用途用于制造保護(hù)動(dòng)物對(duì)抗由相應(yīng)野生型細(xì)菌感染引起的疾病的藥物組合物，通過滅活編碼甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白的基因?qū)⒒罴?xì)菌減毒。本發(fā)明還涉及治療動(dòng)物的方法，以保護(hù)其對(duì)抗由具有在動(dòng)物的巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力的屬于諾卡氏菌型放線菌組的細(xì)菌感染引起的疾病，該方法包括將包含諾卡氏菌型放線菌種的活細(xì)菌的藥物組合物給予動(dòng)物，該活細(xì)菌通過滅活編碼甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白的基因來(lái)減毒。將使用以下描述本發(fā)明特定實(shí)施方案的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施方案覆蓋三個(gè)部分部分A 菌株的鑒定和構(gòu)建部分B 作為體內(nèi)減毒模型的巨噬細(xì)胞存活部分C 突變細(xì)菌在對(duì)抗野生型感染的保護(hù)中的功效部分A 菌株的鑒定和構(gòu)建Al培養(yǎng)基和牛長(zhǎng)條件使馬紅球菌菌株在30°C (200rpm)下生長(zhǎng)于由Bacto-胰蛋白胨(BD)、酵母提取物(BD)和1 % NaCl (Merck)組成的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基或礦物醋酸鹽培養(yǎng)基中。使恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)mc2155 (Snapper 等，1990，Mol. Microbiol. 4 1911-1919)在37°C (200rpm)下生長(zhǎng)于補(bǔ)充了 0. 05 %吐溫80的BBL胰胨豆胨培養(yǎng)液 (TSB ； BD)中。礦物醋酸鹽培養(yǎng)基(MM-Ac)含有 K2HPO4 (4. 65g/l)、NaH2PO4 · H2O (1. 5g/ 1)、醋酸鈉(2g/l)、NH4Cl (3g/l)、MgSO4 · 7H20(lg/l)、硫胺素(40mg/l，無(wú)菌過濾；Sigma) 和 Vishniac 儲(chǔ)液(lml/1)。如下制備儲(chǔ)液(修改自 Vishniac 和 Santer, 1957，Rev. 21 195-213)將 EDTA(10g/l)和 ZnSO4 · 7H20(4. 4g/l)溶解于蒸餾水中(pH8，使用 2M Κ0Η)。 然后，依次加入 pH6 的 CaCl2 · 2Η20(1· 47g/l)、MnCl2 · 7H20(lg/l)、FeSO4 · 7H20(lg/l)、 (NH4)6Mo7O24 · 4H20 (0. 22g/l)，CuSO4 · 5H20 (0. 315g/l)和 CoCl2 · 6H20 (0. 32g/l)，并且最終在PH4儲(chǔ)存。對(duì)于在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)，加入Bacto-瓊脂(15g/l ；BD)。在蒸餾水中制備 5-氟胞嘧啶(Sigma-Aldrich)儲(chǔ)液(10mg/ml)，通過加熱至50°C來(lái)溶解，無(wú)菌過濾并加入高壓滅菌的培養(yǎng)基中。使黃尾脾臟諾卡氏菌菌株INS436常規(guī)地在(200rpm)下生長(zhǎng)于補(bǔ)充了吐溫 80(0. 05% )的Eugon肉湯(BD)中。對(duì)于在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)，加入Bacto-瓊脂(15g/ 1 ；BD)。將蔗糖)加入瓊脂培養(yǎng)基中，用于sacB依賴性蔗糖選擇。A2馬紅球菌菌株103+中的ipdA、ipdB和fadE30以及黃尾脾臟諾卡氏菌INS436 中的ipdAB的鑒定如以上所示，發(fā)現(xiàn)在甲基六氫茚滿二酮丙酸酯(HIP ；3a α _Η_4 α (3’ -丙酸)-7 α β -甲基六氫-1，5-茚滿二酮)和5-羥基-甲基六氫茚酮丙酸酯(HIL或 3a α -Η-4 α (3’ -丙酸)_5 α -羥基-7 α β -甲基六氫茚酮-δ -內(nèi)酯)的降解中涉及紅球菌的ipdA和ipdB基因?；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)中紅串紅球菌(R. erythropolis)菌株SQl的 IpdA和IpdB的蛋白序列的生物信息分析揭示了編碼IpdA和IpdB的基因及其表現(xiàn)操縱子組織在馬紅球菌103+(獲自J. F. I^rescott，Ontario，加拿大的野生型菌株；如Veterinary Microbiology 118 (2006) 240-246中所提及的)的基因組中是保守的。已經(jīng)通過Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, UK的馬紅球菌測(cè)序組確定了馬紅球菌103+基因組序列 (公開為“馬紅球菌103S”的基因組)。基因組分析進(jìn)一步揭示了馬紅球菌103+帶有ipdA 和ipdB的其他平行進(jìn)化同源基因，各自稱為ipdA2和ipdB2。這些基因位于膽固醇分解代謝基因簇外。IpdA、IpdB、IpdA2和IpdB2的氨基酸序列各自描述于所附的SEQ ID N0. 1、2、 3和4中。馬紅球菌103+的IpdA和IpdB蛋白與這些平行進(jìn)化同源物和幾個(gè)其他的放線菌定向進(jìn)化同源物的氨基酸序列識(shí)別號(hào)列于表6中。該表給出了諾卡氏菌型放線菌其他基因組中鑒定的基因的概覽，編碼馬紅球菌103+的IpdA和IpdB的定向進(jìn)化同源物。結(jié)合本發(fā)明，將這些和其他定向進(jìn)化同源物稱為IpdA和IpdB。蛋白同一性表示與馬紅球菌103S的 IpdA和IpdB的百分比全長(zhǎng)氨基酸序列同一性。放線菌基因組序列獲自國(guó)際生物技術(shù)信息中心(NCBI)的微生物基因組的基因組BLAST服務(wù)器。通過Sanger Institute的馬紅球菌測(cè)序組產(chǎn)生了馬紅球菌103+序列數(shù)據(jù)。將菌株103+的基因組(稱為103 用于這些鑒定目的。如此后舉例說明的，使用馬紅球菌菌株REl (分離自患有由馬紅球菌感染引起的肉芽腫型肺炎的馬駒)進(jìn)行了使用馬紅球菌的實(shí)踐工作。在甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解中所涉及的第二個(gè)基因是fadE30。Δ fadE30突變體在HIL和HIP上的生長(zhǎng)嚴(yán)重受損，顯示出在培養(yǎng)M小時(shí)后實(shí)際上沒有生長(zhǎng)。通過在 Sanger Institute (http //www. sanger. ac. uk)獲得的對(duì)馬紅球菌103+基因組進(jìn)行的蛋白序列相似性搜尋鑒定出馬紅球菌103+的fadE30基因。將Iihodococcus jostii菌株RHAl 的 ^ (1Ε30的注釋蛋白序列(Ro4596，Genbank登錄號(hào)ABG96382)用作蛋白序列模板(McLeod 等，2006，見 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 103 15582-15587 ；和 Van der Geize 等，2007，見 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 104 :1947-1952)。用 Ro04596 的數(shù)據(jù)庫(kù)相似性搜尋揭示了馬紅球菌103S的基因，編碼顯示出與Ro04596為73%氨基酸序列同一性的蛋白。將該蛋白注釋為馬紅球菌103S的i^adE30 (SEQ ID No 43)，并將其相應(yīng)的基因稱為fadE30?？梢砸韵嗨频姆椒ㄨb定編碼其他放線菌中的 ^(1Ε30的定向進(jìn)化同源基因。這些的選擇列于表8 中。使用放線菌ipdAB基因座的高保守核苷酸序列上產(chǎn)生的寡核苷酸引物，在三個(gè)部分中通過PCR擴(kuò)增了黃尾脾臟諾卡氏菌的ipdAB基因組基因座。通過幾個(gè)已知的ipdAB基因的放線菌序列的核苷酸序列比對(duì)鑒定了這些保守區(qū)域。將皮諾卡氏菌的ipdAB區(qū)的核苷酸基因組序列(nfa05080-nfa05090) (DDBJ登記號(hào)AP006618)用作初級(jí)模板來(lái)產(chǎn)生寡核苷酸PCR引物。所用的引物寡核苷酸序列列于表5中。將黃尾脾臟諾卡氏菌INS436的染色體組DNA用作PCR的模板。使用引物ipdA-actino-F和ipdB_actino-R(PCR22)擴(kuò)增了黃尾脾臟諾卡氏菌的ipdAB基因，使用ipd-actino-F2和ipd_actino-R(PCR23)擴(kuò)增了 ipdAB 的上游區(qū)域，并且使用ipdB-actino-F和ipd_actino-R(PCR21)擴(kuò)增了下游區(qū)域。將PCR 產(chǎn)物克隆至PGEM-T克隆載體中，并測(cè)定了插入片段的核苷酸序列。隨后在所獲得的DNA序列上產(chǎn)生了不同的引物對(duì)并用于再克隆和再測(cè)序ipd基因組。這形成了涵蓋4，139bp的黃尾脾臟諾卡氏菌的ipdAB基因組的完整核苷酸序列。測(cè)序的DNA片段含有黃尾脾臟諾卡氏菌的ipdA和ipdB基因及其鄰近的基因。推定的黃尾脾臟諾卡氏菌INS436的IpdA和IpdB 的蛋白序列各自顯示于SEQ ID NO 58和SEQ ID NO 59中。A3克隆、PCR和基因組DNA分離將大腸桿菌DH5a用作所有克隆程序的宿主。限制性酶獲自i^ermentas GmbH0根據(jù)制造商的說明，使用GenElute細(xì)菌基因組DNA試劑盒(Sigma-Aldrich)分離了細(xì)胞培養(yǎng)物的染色體組DNA。在反應(yīng)混合物1)中進(jìn)行了 PCR，反應(yīng)混合物由Tris-HCl (10mM，pH8)、l X標(biāo)準(zhǔn)聚合酶緩沖液、dNTP (0. 2mM)、DMSO (2% )、PCR引物(各自IOng/ μ 1，表5)和高保真DNA 聚合酶(Fermentas)或 Pwo DNA 聚合酶(Roche Applied Science)。對(duì)于菌落 PCR，將細(xì)胞材料與100 μ 1的氯仿和100 μ 1的IOmM Tris-HCl ρΗ8混合，徹底渦旋并離心O分鐘， 14，OOOXg)。隨后將上層水相樣品(1 μ 1)用作PCR的模板。標(biāo)準(zhǔn)PCR包括5分鐘，95°C， DNA解鏈步驟，接著95°C 45秒變性、60°C 45秒退火和72°C 1-3分鐘延伸的30個(gè)循環(huán)。所用的延伸時(shí)間取決于預(yù)期的PCR擴(kuò)增子的長(zhǎng)度，按照一般規(guī)則取1. 5分鐘/11Λ。A4后乂遍干翩齙若誠(chéng)麵申撒基本上按照所述的(Van der Geize等，見以上提及的公認(rèn)的NAR論文；Navas等， 2001，J. Bacteriol. 183 :4796-4805)，通過電穿孔轉(zhuǎn)化馬紅球菌菌株的細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，使細(xì)胞培養(yǎng)物在30°C下生長(zhǎng)于50ml LB中，直至OD600達(dá)到0. 8-1. 0。將細(xì)胞沉淀(4，500 Xg, 20分鐘)并用10%的冰冷甘油洗滌兩次。將沉淀的細(xì)胞重懸浮于0. 5-lml冰冷的10%甘油中，并分成200 μ 1等份?；旧习凑账龅?Jacobs等，1991，Methods Enzymo 1. 204 :537-555)，通過電穿孔轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌mc2155的細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，使細(xì)胞培養(yǎng)物O50ml)在37°C下生長(zhǎng)于 TSB培養(yǎng)基+0. 05 %吐溫80中，直至OD6tltl達(dá)到0. 8，置于冰上一個(gè)半小時(shí)并離心(5，000 X g， 10分鐘)以沉淀細(xì)胞。用蒸餾水將細(xì)胞沉淀洗滌兩次并重懸浮于Iml 10%甘油的最終體積中，并分成200 μ 1等份。將MilliQ-洗脫的質(zhì)粒 DNA(5-10y 1 ;GenElute Plasmid Miniprep Kit, Sigma-Aldrich)加入2mm有裂口的比色皿中的200 μ 1細(xì)胞中。使用12. 5kV/cm, 1000 Ω 和25 μ F的單脈沖進(jìn)行了電穿孔。將電穿孔的細(xì)胞與Iml LB培養(yǎng)基(馬紅球菌)或Iml TSB+0. 05%吐溫80 (恥垢分枝桿菌)溫和地混合，并使其在37°C和200rpm下回收2小時(shí) (馬紅球菌)或5小時(shí)(恥垢分枝桿菌)。將等份QOO μ 1)的回收細(xì)胞涂布于選擇性瓊脂培養(yǎng)基上。在含有阿泊拉霉素(50yg/ml)的LB瓊脂上選擇馬紅球菌轉(zhuǎn)化體，并在30°C下培養(yǎng)2-3天后顯示出來(lái)。在含有卡那霉素(10 μ g/ml)的TSB+0. 05%吐溫80瓊脂上選擇恥垢分枝桿菌轉(zhuǎn)化體，并在37°C下培養(yǎng)4-5天后顯示出來(lái)對(duì)于黃尾脾臟諾卡氏菌，使菌株INS436的預(yù)培養(yǎng)物QOml)在下在Eugon肉湯+0. 05%吐溫80中生長(zhǎng)5天(200rpm) (OD600nm = 6)，并用于接種IOOml的新鮮Eugon肉湯+0. 05%吐溫80培養(yǎng)基(1 100)。將初級(jí)培養(yǎng)物在下生長(zhǎng)過夜，持續(xù)20小時(shí)，至
OD600nm = 1.3。將細(xì)胞在4°C沉淀(20分鐘，4000g)并用50ml冰冷的10%甘油洗滌兩次。將沉淀的細(xì)胞重懸浮于500 μ 1 10%甘油中，分成200 μ 1等份，并立即用于電轉(zhuǎn)化。將Milli-Q 洗脫的質(zhì)粒 DNA (5-10 μ 1 ；GenElute Plasmid Miniprep 試劑盒，Sigma-Aldrich)加入 2mm 有裂口的比色皿中的200 μ 1細(xì)胞中，混合并在冰上靜置1分鐘。使用1. 75kV/cm, 200 Ω和 50 μ F的單脈沖進(jìn)行了電穿孔(大約脈沖時(shí)間9. 3ms)。將電穿孔的細(xì)胞與Iml補(bǔ)充0. 05% 吐溫80的Eugon肉湯培養(yǎng)基溫和地混合，并使其在和220rpm下回收3. 5小時(shí)。將50 和100 μ 1等份的回收細(xì)胞涂布于補(bǔ)充了 0. 05%吐溫80和卡那霉素(20 μ g/ml)的選擇性 Eugon瓊脂上。在培養(yǎng)7天后顯示出轉(zhuǎn)化體。A5使用5-氟胞嘧啶(5-FC)選擇的在馬紅球菌菌株中的未標(biāo)記基因缺失基本上按照所述的(Van der Geize等，2008)，制得馬紅球菌的未標(biāo)記基因缺失突變體。將從野生型或突變細(xì)胞的電穿孔獲得的馬紅球菌轉(zhuǎn)化體在補(bǔ)充了阿泊拉霉素的LB 瓊脂培養(yǎng)基上劃線，以證實(shí)阿泊拉霉素抗性(ApraK)。使每個(gè)轉(zhuǎn)化的四個(gè)化體在30°C和200rpm下在25mL LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過夜QO-M小時(shí))，并以IO1-IO3倍稀釋涂布于 100 μ 1等份中補(bǔ)充了 5-FC(100 μ g/ml)的MM-Ac瓊脂平板上的MM-Ac培養(yǎng)基中。將在30°C 下培養(yǎng)3天后顯示出的5-FC抗性克隆重復(fù)劃線于LB瓊脂和補(bǔ)充阿泊拉霉素(50 μ g/ml) 的LB瓊脂上，以選擇阿泊拉霉素敏感性(Apras)和5-FC抗性(5_FCK)克隆。使用擴(kuò)增基因缺失的基因座的引物(表5)，通過克隆PCR，檢測(cè)了 Apra75-FCK菌落中所需基因缺失的存在。從可能的基因缺失突變體分離出基因組DNA，并用于證實(shí)基因缺失，使用擴(kuò)增ipdAB或 ipdAB2基因座的引物，以及這些基因座的上游和下游區(qū)域和表5中所述的引物。A6用于在馬紅球菌中的iodAB和iDdAB2基因缺失的質(zhì)粒的構(gòu)津如下構(gòu)建了質(zhì)粒的elAct-ipdl，用于產(chǎn)生馬紅球菌REl中ipdAB操縱子的未標(biāo)記基因缺失。通過PCR(表5，PCRl和PCR2)擴(kuò)增了 ipdAB基因的上游(1，368bp ； 引物 ipdABequiUP-F 和 ipdABequiUP-R)和下游(1，396bp ；弓丨物 ipdABequiDOWN-F 和 ipdABequiDOWN-R)側(cè)翼區(qū)域。將所獲得的擴(kuò)增子連接EcoRV消化的pBluescript (II) KS，分別產(chǎn)生用于上游和下游區(qū)域的質(zhì)粒pEquil4和pEquil6。將pEquil4的1. 4kb Spel/EcoRV 片段連接Spel/EcoRV消化的pEquil6，產(chǎn)生了 pEquil8。用Klenow片段處理帶有ipdAB基因缺失及其側(cè)翼序列的pEquil8的2. 9kb EcoRI/HindHI片段并連接SmaI消化的pSeIAct 自殺載體(Van der Geize等，2008)。將所得到的質(zhì)粒稱為pSeIAct_ipdl，用于構(gòu)建ipdAB 基因缺失突變馬紅球菌Δ ipdAB (也稱為RG1341)。將該突變體以編號(hào)CNCM 1-4108保藏于法國(guó)巴黎的 Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes of the Institut Pasteur。使用質(zhì)粒pSeIAct-Δ ipdAB2，通過馬紅球菌Δ ipdAB突變菌株中ipdAB2操縱子的未標(biāo)記基因缺失形成了雙基因缺失突變馬紅球菌Δ ipdAB Δ ipdAB2 (也稱為RG^37)。如下構(gòu)建了質(zhì)粒pSeIAct- Δ ipdAb2。使用基因組DNA作為模板，通過PCR(表5，PCR6和PCR7)擴(kuò)增了 ipdAB2 的上游(1，444bp ；引物 ipdAB2equiUP_F，ipdAB2equiUP-R)和下游(1，387bp ； ipdAB2equiD0WN-F, ipdAB2equiD0WN-R)區(qū)域。將擴(kuò)增子連接 SmaI 消化的的elAct，各自形成質(zhì)粒 pklAct-ipdABkquiUP 和 pklAct-ipdABkquiDOWN。用 Bglll/Spel 消化兩個(gè)質(zhì)粒后，將 pklAct-ipdABkquiDOWN 的 1，381bp 片段連接 pklAct-ipdABkquiUP， 形成pSeIAct-AipdAB2，用于Δ ipdAB2基因缺失的構(gòu)建。將所得到的突變馬紅球菌 Δ ipdAB Δ ipdAB2 以編號(hào) CNCMI-4109 保藏于法國(guó)巴黎的 Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes of the Institut Pasteur。A7用于在恥垢分枝桿菌mc/155中的ipdAB基因缺失的質(zhì)粒的構(gòu)建如下構(gòu)建了質(zhì)粒pK18-ipdABsmeg，用于恥垢分枝桿菌mc2155中ipdAB基因的未標(biāo)記基因缺失。使用恥垢分枝桿菌mc2155的基因組DNA作為模板，通過PCR(表5，PCR12和 PCR13)擴(kuò)增了 ipdAB 基因的上游(1，502bp ；引物 ipdABsmegUP-F 禾Π ipdABsmegUP-R) 和下游(1，431bp ；引物 ipdABsmegDOWN-F 和 ipdABsmegDOWN-R)側(cè)翼區(qū)域。將所獲得的擴(kuò)增子連接 SmaI 消化的 pK18mobsacB ( Schafer 等，1994, Genel45 :69-73)，分別產(chǎn)生 pK18-ipdABsmegUP 和 pK18_ipdABsmegD0WN。隨后將獲自 BamHI/Spel 消化的 pK18-ipdABsmegUP 的 1，5kbDNA 片段連接用 BamHI/Spel 線性化的 pK18_ipdABsmegUP，導(dǎo)致構(gòu)建了用于ipdAB基因缺失的pK18-ipdABsmeg。
A8用于在馬紅球菌中的fadE30基因缺失的質(zhì)粒的構(gòu)津如下構(gòu)建了質(zhì)粒pSeIAct_fadE30，用于產(chǎn)生馬紅球菌REl中fadE30的未標(biāo)記基因缺失。使用高保真DNA聚合酶(Fermentas GmbH)，通過標(biāo)準(zhǔn)PCR(表5 ；PCR15和PCR16)，擴(kuò)增了 fadE30 的上游(1，511bp ；引物 fadE30equiUP_F和 fadE30equiUP_R)和下游(1，449bp ； 引物fadE30equiD0WN_F和fadE30equiD0WN_R)側(cè)翼基因組區(qū)域。將所獲得的擴(kuò)增子連接 pGEM-T 克隆載體(Promega Benelux)，產(chǎn)生了 pGEMT_fadE30UP 和 pGEMT_fadE30D0WN。 從 pGEMT-fadE30D0WN 切出 1. 4kb Bcul/Bglll DNA 片段，并連接 Bcul/Bglll 線性化 pGEMT-fadE30UP,產(chǎn)生 pGEMT_fadE30。為了構(gòu)建 pkIAct_fadE30，用 NcoI 和 BcuI 消化 pGEMT-afdE30，并用Klenow片段處理。將攜帶fadE30基因缺失的2. 9kb平端DNA片段連接 SmaI 消化的 pkIAct (van der Geize 等，2008)。將所得到的質(zhì)粒稱為 pkIAct_fadE30， 并用于構(gòu)建突變馬紅球菌AfadE30。A9用干在昔尾脾若卡氏菌INS436中的it)dAB某因缺失的質(zhì)粒的構(gòu)律如下構(gòu)建了質(zhì)粒pK18ipdABNser，用于黃尾脾臟諾卡氏菌INS436中ipdAB基因的未標(biāo)記基因缺失。使用黃尾諾卡氏菌INS436的基因組DNA作為DNA模板，通過PCR(圖 5)擴(kuò)增了 ipdAB 基因的上游(1，487bp ；引物 ipdABNserUP-F 和 ipdABNserUP-R ；PCR24) 和下游(1，049bp ；引物 ipdABNserDOWN-F 和 ipdABNserDOWN-R ；PCR25)側(cè)翼區(qū)域。將所獲得的擴(kuò)增子連接 SmaI 消化的 pK18mobsacB( SchMfer等，1994，Gene 145 :69-73)， 分別產(chǎn)生 pK18-ipdABNserUP 和 pK18_ipdABNserD0WN。隨后將獲自 Smal/PstI 消化的 pK18-ipdABNserD0WN 的 1. 07kbDNA 片段連接用 Smal/PstI 線性化的 pK18_ipdABNserUP，導(dǎo)致構(gòu)建了用于ipdAB基因缺失的質(zhì)粒pK18-ipdABNser。AlO突變株馬紅球菌Δ ipdAB和馬紅球菌Δ ipdAB Δ ipdAB2的構(gòu)建使用對(duì)馬紅球菌產(chǎn)生的5-氟胞嘧啶反選擇(Van der Geize等，2008)，使用兩步同源重組策略，構(gòu)建了 ipdAB (RG1341)和ipdABipdAB2 (RG^37)的馬紅球菌未標(biāo)記基因缺失突變體。對(duì)于Δ ipdAB突變馬紅球菌菌株RG1341的構(gòu)建，通過電轉(zhuǎn)化將非復(fù)制性質(zhì)粒 pSelAct-ipdl調(diào)動(dòng)至馬紅球菌菌株REl。隨后將從質(zhì)粒pSeIAct_ipdl和REl基因組之間的同源重組得到的四個(gè)ApraK轉(zhuǎn)化體接受5-FC選擇，以選擇導(dǎo)致基因缺失的第二個(gè)罕見同源重組事件的出現(xiàn)。將十八個(gè)隨機(jī)挑選的Apras/5FCK克隆接受克隆PCR并且三個(gè)FC7Apras 菌落產(chǎn)生了預(yù)期大小的擴(kuò)增子Q96bp，表5，PCR5)。從這三個(gè)Δ ipdAB突變體分離出基因組DNA，并接受ipdAB基因座及其上游和下游側(cè)翼區(qū)域的PCR分析(表5，PCR3和PCR4)。 該分析證實(shí)了在三種情況的兩種里面，存在真正的ipdAB基因缺失，并揭示了在ipdAB基因座沒有異常的基因組重排。通過PCR(表5，PCRl 1)證實(shí)了作為毒性質(zhì)粒標(biāo)記的vapA的存在。選擇了一個(gè)ipdAB突變株，稱為馬紅球菌RG1341，并用于進(jìn)一步的工作?；旧习凑諏?duì)Δ ipdAB單突變體所述的，使用質(zhì)粒pSeIAct-Δ ipdAB2，從菌株 RG1341構(gòu)建了雙基因缺失突變株RG2837。將獲自用的eIAct-Δ ipdAB2電穿孔菌株RG1341 細(xì)胞的四個(gè)ApraK轉(zhuǎn)化體接受5-FC選擇，以選擇Apras/5-FCK菌落。隨后十八個(gè)Apras/5-FCK 菌落的PCR分析證實(shí)了兩個(gè)菌落帶有Δ ipdAB2基因缺失，如從所獲得的123bp擴(kuò)增子明顯的，使用產(chǎn)生來(lái)擴(kuò)增ipdAB2操縱子的寡核苷酸(表5，PCR10)。此外，通過PCR的ipdAB2基因座的上游和下游區(qū)域的分析證實(shí)了 ipdAB2基因缺失的存在并且揭示了沒有異常的基因組重排(表5，PCR8和PCR9)。此外，通過PCR證實(shí)了 vapA毒性基因的存在(表5，PCR11)。選擇了一個(gè)Δ ipdAB Δ ipdAB2雙基因缺失突變株RG^37，用于進(jìn)一步的工作。All突變株恥垢分枝桿菌AiDdAB的構(gòu)津如下，使用sacB 反選擇系統(tǒng)(Pelicic 等，1996，Mol. Microbiol. 20 :919-925 ；Van der Geize 等，2001，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 205 197-202)，構(gòu)建了恥垢分枝桿菌 mc2155 的未標(biāo)記ipdAB基因缺失突變體。對(duì)于恥垢分枝桿菌菌株mc2155的Δ ipdAB突變體的構(gòu)建， 通過電轉(zhuǎn)化將非復(fù)制性質(zhì)粒pKlS-ipdABsmeg調(diào)動(dòng)至恥垢分枝桿菌。獲得了幾個(gè)轉(zhuǎn)化體。將一個(gè)卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體在37°C下在含有0. 05%吐溫80的TSB培養(yǎng)基中非選擇性地生長(zhǎng)2天，并隨后涂布于含有2%蔗糖的TSB瓊脂平板上，以通過sacB反選擇來(lái)選擇卡那霉素敏感性(Kms)和蔗糖抗性(Suck)雙重組體。將培養(yǎng)3天后顯示出的菌落在TSB瓊脂和補(bǔ)充卡那霉素(10yg/ml)的TSB瓊脂上重復(fù)劃線，以選擇Km7SuCR菌落。通過克隆PCR進(jìn)一步檢查真實(shí)的Kms/SucK菌落，以檢測(cè)ipdAB基因缺失的存在(表5，PCR14)。從三個(gè)可能的 ipdAB突變體分離出基因組DNA。PCR分析證實(shí)了 ipdAB基因缺失的存在，并且選擇了一個(gè) ipdAB突變株，用于進(jìn)一步的工作，并稱為恥垢分枝桿菌Δ ipdAB。A12突變株馬紅球菌AfadE30的構(gòu)津使用對(duì)馬紅球菌產(chǎn)生的5-氟胞嘧啶反選擇(Van der Geize等，2008)，使用兩步同源重組策略，產(chǎn)生了馬紅球菌REl中fadE30的未標(biāo)記基因缺失。對(duì)于Δ fadE30突變株的構(gòu)建，通過電轉(zhuǎn)化將非復(fù)制性質(zhì)粒PSeIACt-fadE30調(diào)動(dòng)至馬紅球菌菌株REl。隨后將從質(zhì)粒pSeIACt-fadE30和REl基因組之間的同源重組得到的兩個(gè)ApraK轉(zhuǎn)化體接受5-FC選擇， 以選擇導(dǎo)致fadE30基因缺失的第二個(gè)罕見同源重組事件的出現(xiàn)。使用引物fadE30COnt-F 和fadE30COnt-R(表5 ；PCR19)，將十八個(gè)隨機(jī)挑選的Apras/5FCK克隆接受克隆PCR，并且十三個(gè)FC7Apras菌落產(chǎn)生了預(yù)期大小的擴(kuò)增子(428bp)。從兩個(gè)可能的AfadE30突變體分離出基因組DNA，并接受PCR分析。使用寡核苷酸弓I物fadE30contr-F和fadE30contr_R (表 5)，fadE30基因座的PCR分析證實(shí)了 fadE30基因缺失的存在和野生型fadE30基因的不存在。通過PCR的上游和下游側(cè)翼區(qū)域的分析各自形成了預(yù)期的1.861Λ和1.761Λ產(chǎn)物。分析證實(shí)了兩種情況中真實(shí)的fadE30基因缺失的存在，并揭示了在fadE30基因座沒有異常的基因組重排。通過PCR證實(shí)了作為毒性質(zhì)粒標(biāo)記的vapA的存在。將一個(gè)fadE30突變株稱為馬紅球菌AfadE30，并用于進(jìn)一步的工作。A13突變株黃尾脾臟諾卡氏菌AipdAB的構(gòu)建如下，使用sacB 反選擇系統(tǒng)(Pelicic 等，1996，見 Mol. Microbiol. 20 :919-925 ； Van der Geize 等，2001，見 FEMS Microbiol Lett. 205 197-202)，構(gòu)建了黃尾脾臟分枝桿菌INS436的未標(biāo)記ipdAB基因缺失突變體。通過電轉(zhuǎn)化將非復(fù)制性質(zhì)粒pK18-ipdABNser 調(diào)動(dòng)至黃尾脾臟分枝桿菌INS436。然后將幾個(gè)卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體在^TC下在含有 0.05%吐溫80的Eugon肉湯培養(yǎng)基中非選擇性地生長(zhǎng)7天。隨后通過涂布于含有2% 蔗糖的Eugon瓊脂平板上，進(jìn)行了通過sacB反選擇的卡那霉素敏感性(Kms)和蔗糖抗性 (Suce)雙重組體的選擇。將在^TC下培養(yǎng)7天后顯示出的菌落在Eugon瓊脂平板和補(bǔ)充卡那霉素(20yg/ml)的Eugon瓊脂平板上重復(fù)挑選，以選擇Km7SuCR菌落。使用引物 ipdABNser-F和ipdABNser-R，通過克隆PCR進(jìn)一步檢查真實(shí)的Kms/SucK菌落，以檢測(cè)ipdAB 基因缺失的存在(表5)。從三個(gè)可能的ipdAB突變體分離出基因組DNA。使用引物對(duì) ipdABNser-F 和 ipdABNser-R (PCR23)的 PCR 分析(PCR23)形成了 222bp PCR 產(chǎn)物和野生型l，634bp PCR產(chǎn)物的不存在，證實(shí)了 ipdAB基因缺失的存在。使用引物對(duì)IpdABNser_F2和 IpdABNserDOffN-Contr-R(PCR26)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)ipdAB基因缺失。對(duì)于ipdAB突變體，該引物對(duì)形成了預(yù)期的1，148bp的PCR產(chǎn)物，而對(duì)于野生型菌株，僅獲得2，560bp PCR產(chǎn)物。將一個(gè)突變株稱為黃尾脾臟諾卡氏菌Δ ipdAB，并選擇用于進(jìn)一步的工作。部分B 作為體內(nèi)減毒模型的巨噬細(xì)胞存活Bl使用的菌株有毒菌株菌株REl 野生型親本株。該菌株在膽固醇上生長(zhǎng)。菌株REl Δ supAB :supAB基因的缺失。該菌株不能在膽固醇上生長(zhǎng)。無(wú)毒菌株菌株103-缺乏80-至90-1Λ有毒質(zhì)粒，并且已知在馬中是無(wú)病原性的(Takai等 2000，Infect. Immun. 68 :6840-6847)。該菌株在膽固醇上生長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明的菌株菌株REl Δ ipdAB (RG1341)缺失了膽固醇分解代謝簇中的ipdAB基因。該菌株沒有在4-雄烯-3，17- 二酮(AD)上生長(zhǎng)。菌株REl Δ ipdAB-AD+ 適應(yīng)于在AD上生長(zhǎng)的菌株REl Δ ipdAB的細(xì)菌(如果將菌株REl Δ ipdAB涂布于作為唯一碳源的高濃度(超過106CFU/ml)AD下，則出現(xiàn)少數(shù)幾個(gè)能在AD上生長(zhǎng)的菌落)。菌株REl Δ ipdABipdAB2 (RG2837)還缺失了第二組ipdAB基因(不是膽固醇分解代謝簇的一部分)。該菌株沒有在AD上生長(zhǎng)。菌株馬紅球菌AfadE30。該菌株對(duì)于在HIP/ HIL和AD上的生長(zhǎng)嚴(yán)重受損。B2用于巨噬細(xì)胞感染的馬紅球菌培養(yǎng)物使在巨噬細(xì)胞存活試驗(yàn)中測(cè)試的不同馬紅球菌菌株在37°C和IOOrpm下在營(yíng)養(yǎng)肉湯(Difco)中生長(zhǎng)過夜(17小時(shí))，目標(biāo)在于1-2X 108CFU/ml的終濃度。只使用了新鮮制備的培養(yǎng)物。在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)后，進(jìn)行了活計(jì)數(shù)測(cè)定(平板計(jì)數(shù))，以證實(shí)感染性滴度。B3用于馬駒攻擊的紅球菌培養(yǎng)物將馬紅球菌菌株RE1、REl Δ ipdAB和REl Δ ipdAB-AD+涂布于血液瓊脂上，并在 37°C下培養(yǎng)M小時(shí)。收集細(xì)菌，細(xì)1無(wú)菌等滲PBS/平板。用無(wú)菌等滲PBS稀釋細(xì)菌懸浮液，目標(biāo)在于4X 104CFU/ml的終濃度。在環(huán)境溫度下轉(zhuǎn)運(yùn)；在制備后4小時(shí)內(nèi)使用了稀釋的培養(yǎng)物。攻擊后，進(jìn)行了活計(jì)數(shù)測(cè)定(平板計(jì)數(shù))，以證實(shí)感染性滴度?；钣?jì)數(shù)分別為REl 4. 35X 104CFU/ml, REl Δ ipdAB 7. 1 X 104CFU/ml, REl Δ ipdAB-AD+5. 8 X 104CFU/ml。B4測(cè)試系統(tǒng)巨噬細(xì)胞細(xì)胞系將細(xì)胞系U937(人單核細(xì)胞)用于測(cè)試馬紅球菌菌株的存活。使單核細(xì)胞生長(zhǎng)于 RPMI 1640+NaHC03+NAPYR+葡萄糖培養(yǎng)基(RPMI 1640培養(yǎng)基)，用IOmM HEPES緩沖并補(bǔ)充了 200IU/ml青霉素和鏈霉素以及10%胎牛血清(FBS)。將細(xì)胞在37°C和5% CO2下在懸浮液中生長(zhǎng)。馬駒使用了八匹馬駒七匹3至5周大的馬駒，一匹7周大(都伴隨著母馬)。將馬駒分成3組，3，3和2匹馬駒，估計(jì)年齡在組里的平均分布。在隔離的設(shè)備中圈養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)過
程中，給馬駒吮奶，并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)喂養(yǎng)母馬。新鮮自來(lái)水可以隨意飲用。
權(quán)利要求
1.一種保護(hù)動(dòng)物對(duì)抗由屬于具有在動(dòng)物的巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力的諾卡氏菌型放線菌組的細(xì)菌感染引起的疾病的藥物組合物，其包含諾卡氏菌型放線菌種的活細(xì)菌和用于這些活細(xì)菌的藥物學(xué)上可接受的載體，該活細(xì)菌通過滅活編碼甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白質(zhì)的基因來(lái)減毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其特征在于將操縱子中的多基因滅活。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物組合物，其特征在于將基因ipdA和ipdB滅活。
4.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求的藥物組合物，其中通過未標(biāo)記基因缺失來(lái)缺失至少一個(gè)基因而實(shí)現(xiàn)滅活。
5.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求的藥物組合物，其特征在于細(xì)菌屬于諾卡氏菌科或分枝桿菌科。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其特征在于細(xì)菌屬于紅球菌屬、諾卡氏菌屬或分枝桿菌屬。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，其特征在于細(xì)菌屬于馬紅球菌(Iihodococcus equi)、黃尾脾臟諾卡氏菌(Nocardia seriolae)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、饋蕩分枝桿菌(Mycobacterium ulcerans)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)或鳥苜 1J結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium avium paratuberculosis)。
8.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求的藥物組合物，其特征在于它是適于口服給藥的形式。
9.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求的藥物組合物，其特征在于活細(xì)菌以IXlO4與 1 X IO10CFU/劑之間的濃度存在。
10.源自以編號(hào)CNCM1-4108或編號(hào)CNCM 1-4109保藏于法國(guó)巴黎的Collection Nationale de Culture de Micro-organismes of the Institut Pasteur 的菌株的馬紅球菌細(xì)菌。
11.以編號(hào)CNCM1-4108或編號(hào)CNCM 1-4109保藏于法國(guó)巴黎的Collection Nationale de Culture de Micro-organismes of the Institut Pasteur 的菌株的馬紅球菌細(xì)菌。
12.屬于具有在動(dòng)物的巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力的諾卡氏菌型放線菌組的活細(xì)菌用于制造保護(hù)動(dòng)物對(duì)抗由相應(yīng)野生型細(xì)菌感染引起的疾病的藥物組合物的用途，該活細(xì)菌通過滅活編碼甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白質(zhì)的基因來(lái)減毒。
13.治療動(dòng)物以保護(hù)其對(duì)抗由屬于具有在動(dòng)物巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力的諾卡氏菌型放線菌組的細(xì)菌感染引起的疾病，包括將包含諾卡氏菌型放線菌種的活細(xì)菌的藥物組合物給予動(dòng)物，該活細(xì)菌通過滅活編碼甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白質(zhì)的基因來(lái)減
全文摘要
本發(fā)明涉及一種保護(hù)動(dòng)物對(duì)抗由屬于具有在動(dòng)物巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力的諾卡氏菌型放線菌組的細(xì)菌感染引起的疾病的藥物組合物，其包含諾卡氏菌型放線菌種的活細(xì)菌和用于這些活細(xì)菌的藥物學(xué)上可接受的載體，該活細(xì)菌通過滅活編碼甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白的基因來(lái)減毒。
文檔編號(hào)A61K35/74GK102271693SQ201080004294
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月12日
發(fā)明者A·A·C·雅各布斯, L·戴克休伊曾, R·范德蓋澤 申請(qǐng)人:英特威國(guó)際有限公司