專利名稱：微量測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌和最小殺菌濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種測(cè)定微量抗菌物質(zhì)最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，特別是適用于陽(yáng)離子抗菌肽測(cè)定的方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽是動(dòng)物體內(nèi)一大類具有抗菌活性和免疫功能的生物活性物質(zhì)?？咕木哂袕V譜抗菌活性和豐富的作用機(jī)制。不僅和傳統(tǒng)抗菌活性物質(zhì)一樣，具有胞內(nèi)作用機(jī)制，包括:與核酸物質(zhì)結(jié)合，阻斷DNA復(fù)制、RNA合成；影響蛋白質(zhì)合成；抑制隔膜、細(xì)胞壁合成，阻礙細(xì)胞分裂；抑制胞內(nèi)酶的活性?？咕挠绕涫顷?yáng)離子抗菌肽有膜作用機(jī)制，目前認(rèn)為存在:“桶板”模型、“毯式”模型，“環(huán)形孔”模型和“凝聚”模型等理論。由于抗菌肽的來(lái)源天然和作用機(jī)制特殊，不易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)人和動(dòng)物的副作用小，所以備受關(guān)注，是抗生素的理想替代品。研究其菌株耐藥性、殺菌效果及其殺菌機(jī)制則尤為重要，而最小抑菌濃度和最小殺菌濃度是評(píng)價(jià)抗菌物質(zhì)抗菌效果和進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)指標(biāo)。由于陽(yáng)離子抗菌肽攜帶有正電荷，一般檢測(cè)方法使用的抗生素敏感測(cè)定培養(yǎng)基中的陽(yáng)離子濃度以及所用器皿的吸附作用對(duì)檢測(cè)會(huì)造成較大影響。加之一般抗菌肽的待測(cè)樣品量微少，不能滿足一般檢測(cè)方法的需求量。所以找到一種能夠適用于陽(yáng)離子抗菌肽的，檢測(cè)干擾小、微量樣品即可操作，并且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)需要可以相應(yīng)調(diào)節(jié)的方法，顯得尤為迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種干擾小、微量、方便、快捷的測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的方法。為了解決上述 技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的方法，包括以下步驟:
O試劑配制
MHBCMueller Hinton Broth)培養(yǎng)基:21 g MHB培養(yǎng)基粉末溶于I L蒸餾水中，121°C滅菌20 min，室溫冷卻，4 °C保存?zhèn)溆谩＂贛HB瓊脂培養(yǎng)基:21 g MHB培養(yǎng)基粉末、15 g瓊脂粉溶于I L蒸餾水中，121 V滅菌20 min，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，以剛好覆蓋培養(yǎng)皿底部為宜，室溫冷卻凝固，4°C保存?zhèn)溆?。③藥劑?chǔ)存液:準(zhǔn)確稱取2 mg待測(cè)藥劑，用無(wú)菌水溶解至4 mg/ml,4 °C保存?zhèn)溆谩?)細(xì)菌懸液制備
①選取-80 °C保存的測(cè)試菌種的甘油菌，室溫解凍后混懸，用接種環(huán)劃線MHB瓊脂培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)12 hr，待長(zhǎng)出單菌落后，4 °C保存?zhèn)溆?。②用接種環(huán)挑取步驟2)①中的單菌落，接種于5 ml MHB培養(yǎng)基試管，37 °C>250rpm培養(yǎng)12 hr，待菌液渾濁后，4 °C保存?zhèn)溆?。③混懸步驟2)②中的菌液，移取50 μ I接種于5 ml MHB培養(yǎng)基試管，37 °C >250rpm培養(yǎng)約2 hr ο④測(cè)定步驟2)③中菌液的0D600值，0D600值約為0.5時(shí)可使用。0.6〈0D600〈1.0
時(shí)，可用MHB培養(yǎng)基稀釋至適宜范圍。⑤將步驟2)④中的菌液與MHB培養(yǎng)基以30 μ 1:30 ml混合制成細(xì)菌懸液，制備好的細(xì)菌懸液應(yīng)在30 min內(nèi)使用完畢。3)細(xì)菌懸液計(jì)數(shù)
①步驟2)⑤中的細(xì)菌懸液與MHB培養(yǎng)基以10 μ 1:90 μ I混合稀釋，連續(xù)4次，分別得到10、10~2、10~3和 10~4倍稀釋細(xì)菌懸液。②取I塊MHB瓊脂培養(yǎng)基(提前2 hr在37 °C培養(yǎng)箱中緩解)，記號(hào)筆在底部外側(cè)畫十字分為4個(gè)相等扇區(qū)。從步驟3)①中的10、10~2、10~3和10~4等4個(gè)濃度稀釋梯度細(xì)菌懸液中移10 μ I滴加在MHB瓊脂培養(yǎng)基標(biāo)記好的對(duì)應(yīng)扇區(qū)，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)。③待步驟3)②中的細(xì)菌懸液被培養(yǎng)基吸收，37 °C培養(yǎng)12 hr，選取3個(gè)重復(fù)菌落總數(shù)為3(Γ200的扇區(qū)計(jì)數(shù)，計(jì)算CFU=3個(gè)重復(fù)菌落總數(shù)/30 X稀釋倍數(shù)X 1000，CFU值在0.5 lX10~6/ml 為宜。4)藥劑稀釋
取I塊未經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)處理的聚丙烯材質(zhì)的96孔板，第I列每孔加入32 μ I步驟I)③中的藥劑儲(chǔ)存液和168 μ I無(wú)菌水，終濃度為640 μ g/ml。第2 10列每孔加入100 μ I無(wú)菌水。從第I列起移取100 μ I加入次列，如此逐級(jí)等比稀釋至第10列，第10列移去100μ I。得到640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25共10個(gè)濃度梯度，每孔100 μ 1，現(xiàn)用現(xiàn)配。5)最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定
①取I塊未經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)處理的聚丙烯材質(zhì)的96孔板，每行作為I個(gè)測(cè)試，第f 10列每孔加入90 μ I細(xì)菌懸液，第11列加入100 μ I細(xì)菌懸液作為有菌對(duì)照，第12列加入100μ I MHB培養(yǎng)基作為無(wú)菌對(duì)照。②從步驟4)中的藥劑稀釋板移取10 μ I稀釋藥劑加入步驟5)①中96孔板對(duì)應(yīng)的孔中，終濃度為64、32、16、8、4、2、1、0.5,0.25和0.125 μ g/ml以及有菌和無(wú)菌對(duì)照，終體積100 μ I。每種藥劑對(duì)每種細(xì)菌進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)試。③步驟5)②中的96孔板用保鮮膜包好，放入濕盒(置于容器中覆蓋濕潤(rùn)紗布即可)，37 °C培養(yǎng)12 hr。肉眼無(wú)可見(jiàn)細(xì)菌沉淀的孔所對(duì)應(yīng)的最小濃度數(shù)值即為最小抑菌濃度(MIC)。6)最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定
①M(fèi)HB瓊脂培養(yǎng)基提前2 hr在37 °C培養(yǎng)箱中緩解，記號(hào)筆在底部外側(cè)畫十字分為4個(gè)相等扇區(qū)。②從步驟5)③中最小抑菌濃度對(duì)應(yīng)的孔起，向高濃度選取4個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度取 ο μ I滴加在步驟6)①中MHB瓊脂平板對(duì)應(yīng)扇區(qū)，做好標(biāo)記，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)。待細(xì)菌懸液被培養(yǎng)基吸收，37 °C培養(yǎng)12 hr。肉眼無(wú)菌落生長(zhǎng)的扇區(qū)所對(duì)應(yīng)的最小濃度數(shù)值即為最小殺菌濃度(MBC)。
作為本發(fā)明的微量測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的方法的改進(jìn):1)使用非陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，或者說(shuō)是低陽(yáng)離子培養(yǎng)基。作為本發(fā)明的微量測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的方法的改進(jìn):4)和5)使用未經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)處理的聚丙烯材質(zhì)的96孔板。本發(fā)明中，待測(cè)藥劑是各類具有抗菌活性的物質(zhì)，特別是陽(yáng)離子抗菌肽。本發(fā)明方法的檢測(cè)結(jié)果表明:測(cè)試方法能夠滿足微量抗菌活性物質(zhì)的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測(cè)定的需求，結(jié)果重復(fù)性好。本發(fā)明具有如下有益效果:
I可以微量測(cè)定，滿足抗菌活性物質(zhì)樣品少時(shí)的測(cè)定需求，2 mg即可測(cè)定，且節(jié)約試 劑。2可以測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽，排除了反應(yīng)體系中陽(yáng)離子的干擾，以及96孔板對(duì)陽(yáng)離子抗菌肽的吸附作用。3本方法操作簡(jiǎn)便，所用設(shè)備簡(jiǎn)單常見(jiàn)，所用試劑經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，方法簡(jiǎn)單易行。


圖1是細(xì)菌懸液計(jì)數(shù)滴板培養(yǎng)后培養(yǎng)皿照片。圖2是藥劑稀釋及與細(xì)菌懸液混合鋪96孔板的結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1
2012年9月18日，測(cè)定抗菌肽PR-39和抗生素金霉素、新霉素及硫酸粘菌素對(duì)大腸桿菌CMCC 44103和ATCC 25922的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。)試劑配制
①M(fèi)HB培養(yǎng)基:21 g MHB培養(yǎng)基粉末(BD Difco，貨號(hào)275730 )溶于I L蒸餾水中，121°C滅菌20 min，室溫冷卻，4 °C保存?zhèn)溆?。②MHB瓊脂培養(yǎng)基:21 g MHB培養(yǎng)基粉末、15 g瓊脂粉溶于I L蒸餾水中，121 V滅菌20 min，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，以剛好覆蓋培養(yǎng)皿底部為宜，室溫冷卻凝固，4°C保存?zhèn)溆?。③藥劑?chǔ)存液:準(zhǔn)確稱取2 mg待測(cè)藥劑，用無(wú)菌水溶解至4 mg/ml,4 °C保存?zhèn)溆谩?細(xì)菌懸液制備
①選取-80 °C保存的甘油菌，室溫解凍后混懸，用接種環(huán)劃線MHB瓊脂培養(yǎng)基，37 V培養(yǎng)12 hr，待長(zhǎng)出單菌落后，4 °C保存?zhèn)溆?。②用接種環(huán)挑取步驟2)①中的單菌落，接種于5 ml MHB培養(yǎng)基試管，37 °C>250rpm培養(yǎng)12 hr，待菌液渾濁后，4 °C保存?zhèn)溆?。③混懸步驟2)②中的菌液，移取50 μ I接種于5 ml MHB培養(yǎng)基試管，37 °C >250rpm培養(yǎng)約2 hr ο④測(cè)定步驟2)③中菌液的0D600值，大腸桿菌CMCC 44103的0D600值為0.456，大腸桿菌A細(xì)胞培養(yǎng)C 25922的0D600值為0.476。⑤將步驟2)④中的菌液與MHB培養(yǎng)基以30 μ 1:30 ml混合制成細(xì)菌懸液，制備好的細(xì)菌懸液應(yīng)在30 min內(nèi)使用完畢。)細(xì)菌懸液計(jì)數(shù)
①步驟2)⑤中的細(xì)菌懸液與MHB培養(yǎng)基以10 μ 1:90 μ I混合稀釋，連續(xù)4次，分別得到10、10~2、10~3和10~4倍稀釋細(xì)菌懸液。②取I塊MHB瓊脂培養(yǎng)基(提前2 hr在37 °C培養(yǎng)箱中緩解)，記號(hào)筆在底部外側(cè)畫十字分為4個(gè)相等扇區(qū)。從步驟3)①中的10、10~2、10~3和10~4等4個(gè)濃度稀釋梯度細(xì)菌懸液中移10 μ I滴加在MHB瓊脂培養(yǎng)基標(biāo)記好的對(duì)應(yīng)扇區(qū)，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)。方法如圖1所示。③待步驟3)②中的細(xì)菌懸液被培養(yǎng)基吸收，37 °C培養(yǎng)12 hr，選取3個(gè)重復(fù)菌落總數(shù)為3(Γ200的扇區(qū)計(jì)數(shù)，計(jì)算CFU=3個(gè)重復(fù)菌落總數(shù)/30 X稀釋倍數(shù)X 1000，CFU值在
0.5 I X 10~6/ml為宜。結(jié)果如下表I所示:
表 I _____
權(quán)利要求
1.一種微量測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的方法，其特征在于，包括以下步驟: `1)試劑配制:配制MuellerHinton Broth培養(yǎng)基； `2)細(xì)菌懸液制備:培養(yǎng)細(xì)菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制備細(xì)菌懸液； `3)細(xì)菌懸液計(jì)數(shù):倍比稀釋所述的步驟2)中的細(xì)菌懸液后滴板計(jì)數(shù)； `4)陽(yáng)離子抗菌肽稀釋:倍比稀釋陽(yáng)離子抗菌肽至不同測(cè)試濃度梯度； `5)測(cè)定最小抑菌濃度:將所述的步驟4)中的不同測(cè)試濃度梯度的陽(yáng)離子抗菌肽與步驟2)中制備的細(xì)菌懸液混合后培養(yǎng)，觀察是否有肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌沉淀，無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)菌沉淀的孔對(duì)應(yīng)的最小濃度即為最小抑菌濃度； `6)測(cè)定最小殺菌濃度:將所述的步驟5)中有抑菌效果的測(cè)試滴板后培養(yǎng)，觀察是否有菌落生長(zhǎng)無(wú)菌落 生長(zhǎng)扇區(qū)對(duì)應(yīng)的最小濃度即為最小殺菌濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟I)中的試劑配制過(guò)程如下: `1.1)MHB培養(yǎng)基:21 g MHB培養(yǎng)基粉末溶于I L蒸餾水中，121 °C滅菌20 min，室溫冷卻，4 1:保存?zhèn)溆茫? `1.2)MHB瓊脂培養(yǎng)基:21 g MHB培養(yǎng)基粉末、15 g瓊脂粉溶于I L蒸餾水中，121 V滅菌20 min，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，以剛好覆蓋培養(yǎng)皿底部為宜，室溫冷卻凝固，4°C保存?zhèn)溆茫? `1.3)藥劑儲(chǔ)存液:準(zhǔn)確稱取2mg待測(cè)藥劑，用無(wú)菌水溶解至4 mg/ml, 4 °C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟2)中細(xì)菌懸液制備過(guò)程如下: `2.1)選取-80 °C保存的測(cè)試菌種的甘油菌，室溫解凍后混懸，用接種環(huán)劃線MHB瓊脂培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)12 hr，待長(zhǎng)出單菌落后，4 1:保存?zhèn)溆茫? `2.2)用接種環(huán)挑取步驟2.1)中的單菌落，接種于5 ml MHB培養(yǎng)基試管，37 °C>250rpm培養(yǎng)12 hr，待菌液渾濁后，4 1:保存?zhèn)溆茫? `2.3)混懸步驟2.2)中的菌液，移取50 μ I接種于5 ml MHB培養(yǎng)基試管，37 °C >250rpm培養(yǎng)約2 hr ； `2.4)測(cè)定步驟2.3)中菌液的0D600值，0D600值約為0.5時(shí)可使用，0.6<0D600<1.0時(shí)，可用MHB培養(yǎng)基稀釋至適宜范圍； `2.5)將步驟2.4)中的菌液與MHB培養(yǎng)基以30 μ 1:30 ml混合制成細(xì)菌懸液，制備好的細(xì)菌懸液應(yīng)在30 min內(nèi)使用完畢。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟3)中細(xì)菌懸液計(jì)數(shù)過(guò)程如下: `3.1)所述的2.5)中的細(xì)菌懸液與MHB培養(yǎng)基以10 μ 1:90 μ I混合稀釋，連續(xù)4次，分別得到10、10~2、10~3和10~4倍稀釋細(xì)菌懸液； `3.2)取I塊MHB瓊脂培養(yǎng)基，記號(hào)筆在底部外側(cè)畫十字分為4個(gè)相等扇區(qū)，從步驟3.1)中的10、10~2、10~3和10~4等4個(gè)濃度稀釋梯度細(xì)菌懸液中移10 μ I滴加在MHB瓊脂培養(yǎng)基標(biāo)記好的對(duì)應(yīng)扇區(qū)，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)； `3.3)待步驟3.2)中的細(xì)菌懸液被培養(yǎng)基吸收，37 °C培養(yǎng)12 hr，選取3個(gè)重復(fù)菌落總數(shù)為3(Γ200的扇區(qū)計(jì)數(shù)，計(jì)算CFU=3個(gè)重復(fù)菌落總數(shù)/30 X稀釋倍數(shù)X 1000，CFU值在·0.5 lX10~6/ml 為宜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟4)中藥劑稀釋過(guò)程如下: 取I塊未經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)處理的聚丙烯材質(zhì)的96孔板，第I列每孔加入32 μ I步驟1.3)中的藥劑儲(chǔ)存液和168 μ 1無(wú)菌水，終濃度為640 μ g/ml ;第2 10列每孔加入100 μ I無(wú)菌水-J人第I列起移取100 μ 1加入次列，如此逐級(jí)等比稀釋至第10列，第10列移去100μ I ;得至IJ 640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 共 10 個(gè)濃度梯度，每孔 100 μ 1，現(xiàn)用現(xiàn)配。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟5)中最小抑菌濃度的測(cè)定過(guò)程如下: 5.1)取I塊未經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)處理的聚丙烯材質(zhì)的96孔板，每行作為I個(gè)測(cè)試，第f 10列每孔加入90 μ I細(xì)菌懸液，第11列加入100 μ I細(xì)菌懸液作為有菌對(duì)照，第12列加入100μ I MHB培養(yǎng)基作為無(wú)菌對(duì)照； 5.2)從步驟4)中的藥劑稀釋板移取10 μ I稀釋藥劑加入步驟5.1)中96孔板對(duì)應(yīng)的孔中，終濃度為64、32、16、8、4、2、1、0.5,0.25和0.125 μ g/ml以及有菌和無(wú)菌對(duì)照，終體積100 μ I ;每種藥劑對(duì)每種細(xì)菌進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)試； 5.3)步驟5.2)中的96孔板用保鮮膜包好，放入濕盒(置于容器中覆蓋濕潤(rùn)紗布即可)，37 °C培養(yǎng)12 hr，肉眼無(wú)可見(jiàn)細(xì)菌沉淀的孔所對(duì)應(yīng)的最小濃度數(shù)值即為最小抑菌濃度(MIC)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟6)中最小殺菌濃度的測(cè)定過(guò)程如下: 6.1) MHB瓊脂培養(yǎng)基提前2 hr在37 1:培養(yǎng)箱中緩解，記號(hào)筆在底部外側(cè)畫十字分為4個(gè)相等扇區(qū)； 6.2)從步驟5.3)中最小抑菌濃度對(duì)應(yīng)的孔起，向高濃度選取4個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度取10 μ I滴加在步驟6.1)中MHB瓊脂平板對(duì)應(yīng)扇區(qū)，做好標(biāo)記，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)；待細(xì)菌懸液被培養(yǎng)基吸收，37 °C培養(yǎng)12 hr ;肉眼無(wú)菌落生長(zhǎng)的扇區(qū)所對(duì)應(yīng)的最小濃度數(shù)值即為最小殺菌濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度方法，其特征在于，所述的步驟4)和步驟4) 5)使用未經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)處理的聚丙烯材質(zhì)的96孔板。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種微量測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的方法，包括以下步驟1)試劑配制配制MHB培養(yǎng)基；2)細(xì)菌懸液制備復(fù)蘇細(xì)菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制備濃度一定的細(xì)菌懸液；3)細(xì)菌懸液計(jì)數(shù)倍比稀釋步驟2)中的細(xì)菌懸液后滴板計(jì)數(shù)；4)藥劑稀釋倍比稀釋藥劑至不同測(cè)試濃度梯度；5)測(cè)定最小抑菌濃度將步驟4)中稀釋好的藥劑與步驟2)中制備的細(xì)菌懸液混合后培養(yǎng)，觀察是否有肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌沉淀；6)測(cè)定最小殺菌濃度將步驟5)中有抑菌效果的測(cè)試滴板后培養(yǎng)，觀察是否有菌落生長(zhǎng)。采用該方法測(cè)定陽(yáng)離子抗菌肽最小抑菌濃度和最小殺菌濃度具有干擾小、微量、方便、快捷的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK103173517SQ20131006581
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者汪以真, 李治學(xué), 韓菲菲, 黃霞, 劉丹 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)