專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新的腺病毒載體及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種新的腺病毒載體及其生產(chǎn)方法，具體涉及一種高通量腺病毒載體及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
腺病毒載體是轉(zhuǎn)染人類(lèi)細(xì)胞最有效的，多樣化的系統(tǒng)，它被廣泛的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)研究和基因療法領(lǐng)域。腺病毒載體能夠有效的轉(zhuǎn)染分裂或不分裂的細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到百分之百。腺病毒載體進(jìn)入細(xì)胞后不整合到人類(lèi)基因組，所以它相對(duì)比較安全。腺病毒的生產(chǎn)比較容易達(dá)到很高的滴度，并且能夠容納多達(dá)30kb以上的外源基因。腺病毒重組蛋白的表達(dá)可以達(dá)到20-30%的細(xì)胞重量。盡管腺病毒載體有很多優(yōu)點(diǎn)，但是它的生產(chǎn)過(guò)程比較繁瑣，生產(chǎn)周期也比較長(zhǎng)。一個(gè)腺病毒的生產(chǎn)大約需要6-8周的時(shí)間。到目前為止還沒(méi)有高通量的生產(chǎn)技術(shù)。腺病毒是線(xiàn)性的，雙鏈DNA病毒。因?yàn)樗腥f(wàn)六千個(gè)堿基對(duì)，所以直接克隆外源的基因會(huì)非常困難?？寺⊥庠椿虻较俨《据d體有很多種不同的方式，但最常見(jiàn)的是Agilent的pAdEasy 系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)利用大腸桿菌{Escherichia co7i)BJ5183和同源重組的方式。重組是在一個(gè)含有外源基因的穿梭載體和含有腺病毒基因組的質(zhì)粒載體之間進(jìn)行的。然而B(niǎo)J5183生長(zhǎng)緩慢，質(zhì)粒產(chǎn)量非常微量。因?yàn)橛脕?lái)重組的一整套酶在該細(xì)胞株中一直處于表達(dá)狀態(tài)并始終存在于細(xì)胞內(nèi)，所以重組后的腺病毒在該細(xì)胞內(nèi)非常不穩(wěn)定。為了對(duì)重組后的DNA做酶切或測(cè)序分析，BJ5183提到的微量質(zhì)粒必須再次轉(zhuǎn)化到一個(gè)常用的細(xì)菌株里面去獲得更多的質(zhì)粒。在穿梭載體和腺病毒骨架載體在BJ5183細(xì)菌內(nèi)重組之后，正確的重組一般是在瓊脂盤(pán)上看上去比較小的菌落，但小的菌落很多時(shí)候并不是正確的重組。為了找到一個(gè)正確的重組，需要挑8-12個(gè)菌落做質(zhì)粒提取，酶切和測(cè)序分析。整個(gè)重組的效率非常低，過(guò)程繁瑣復(fù)雜。pAdEasy 系統(tǒng)中的穿梭載體含有非常有限的幾個(gè)酶切點(diǎn)，它不能滿(mǎn)足對(duì)整個(gè)人源基因組的克隆。且重組之前穿梭載體需要用PmeI酶切，線(xiàn)性化，但是許多人類(lèi)的基因本身含有Pmel。重組之后，含有外源基因的腺病毒載體需要用PacI線(xiàn)性化，同樣很多人類(lèi)的基因含有該酶切點(diǎn)。該系統(tǒng)中的穿梭載體遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足對(duì)人類(lèi)整個(gè)基因組的腺病毒基因克隆的生產(chǎn)。此外，其他的常用的腺病毒生產(chǎn)方式雖各有優(yōu)缺點(diǎn)，但都不能用來(lái)做高通量腺病毒的生產(chǎn)。而且與pAdeasy 系統(tǒng)相比，其他幾種方式更難操作，更不可靠。

發(fā)明內(nèi)容

由于目前腺病毒載體的生產(chǎn)過(guò)程比較繁瑣，生產(chǎn)周期也比較長(zhǎng)。一個(gè)腺病毒載體的生產(chǎn)大約需要6-8周的時(shí)間。到目前為止還沒(méi)有高通量的生產(chǎn)技術(shù)。所以本發(fā)明要解決的主要的技術(shù)問(wèn)題就是提供一種高通量高效率的生產(chǎn)腺病毒載體的方法。由于現(xiàn)有的常用的穿梭載體只有幾個(gè)常見(jiàn)的酶切點(diǎn)，重組之前和之后分別需要用PmeI和PacI線(xiàn)性化質(zhì)粒，但很多人類(lèi)的基因含有這兩個(gè)酶切點(diǎn)。故需要設(shè)計(jì)新的少見(jiàn)的酶切點(diǎn)去覆蓋人類(lèi)基因組里面所有的克隆。所以本發(fā)明解決的另一個(gè)問(wèn)題是構(gòu)建一個(gè)可以用來(lái)克隆整個(gè)人類(lèi)基因組的穿梭載體?，F(xiàn)有穿梭載體的構(gòu)建效率低，目前的穿梭載體除了不能用來(lái)克隆人類(lèi)所有的基因以外，也無(wú)法用來(lái)做高通量的生產(chǎn)。所以本發(fā)明解決的再一個(gè)問(wèn)題就是提供一種高通量腺病毒穿梭載體的構(gòu)建方法。傳統(tǒng)的方式是用BJ5183細(xì)菌株來(lái)做重組。因?yàn)橹亟M的整個(gè)機(jī)制一直處于表達(dá)狀態(tài)，重組后的腺病毒載體在BJ5183細(xì)菌內(nèi)也不穩(wěn)定。為了達(dá)到既可以用來(lái)重組，又可以用來(lái)做質(zhì)粒的擴(kuò)增的目的，就要求參與重組的幾個(gè)酶只在重組之前作簡(jiǎn)短的表達(dá)，重組之后不再表達(dá)，這樣腺病毒在這個(gè)細(xì)菌株內(nèi)可以穩(wěn)定擴(kuò)增。所以本發(fā)明解決的還一個(gè)問(wèn)題是采用一種可用于穿梭載體和腺病毒骨架載體重組的細(xì)菌株，使其不僅能夠用來(lái)做腺病毒載體重組，又能夠用來(lái)進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增?，F(xiàn)有的穿梭載體和腺病毒骨架載體之間的重組方法時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用高。目前常用的重組方法有兩步，一是穿梭載體和腺病毒骨架載體先在BJ5183細(xì)菌中重組，挑8-12個(gè)菌體質(zhì)粒小提；二是再轉(zhuǎn)化到另外一個(gè)普通的菌種中作培養(yǎng)，質(zhì)粒小提，酶切和測(cè)序。目前的技術(shù)是對(duì)基因一個(gè)一個(gè)的重組，整個(gè)周期需要8-10天時(shí)間，并需要大量試驗(yàn)試劑。所以本發(fā)明解決的最后一個(gè)問(wèn)題是提供一個(gè)新的高通量的重組方法，利用本發(fā)明方法進(jìn)行重組，不僅縮短時(shí)間，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)際的重組效率也大大提高。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)施:
本發(fā)明高通量穿梭載體的克隆方法是:首先將人類(lèi)每個(gè)基因的ORF用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，然后把50個(gè)大小相似的ORF的PCR產(chǎn)物合到一起，酶切，連接到穿梭載體；轉(zhuǎn)化，細(xì)菌培養(yǎng)后，挑96個(gè)菌體，質(zhì)粒小提，進(jìn)行測(cè)序和序列分析；一個(gè)96孔板可以得到30-35個(gè)不同的克隆，第一輪就能把9，000-10，000個(gè)人源的基因克隆到穿梭載體內(nèi)；對(duì)第一輪沒(méi)有克隆到的基因，根據(jù)大小 重新把50個(gè)克隆合到一起，酶切，連接和轉(zhuǎn)化；重復(fù)操作至第五輪就可以把99%的基因克隆到穿梭載體內(nèi)。本發(fā)明高通量的穿梭載體和腺病毒骨架載體的重組方法是:首先將50個(gè)不同的穿梭載體克隆合到一起，用PmeI或ISceI酶切線(xiàn)性化之后，轉(zhuǎn)化到含有腺病毒載體的感受態(tài)細(xì)菌之內(nèi)；平板過(guò)夜培養(yǎng)，然后挑96個(gè)菌體作質(zhì)粒小提，測(cè)序和序列分析；一次轉(zhuǎn)化和96樣品分析可以獲得30-35個(gè)不同的重組腺病毒克隆；對(duì)第一次沒(méi)有得到重組的克隆，再合到一起進(jìn)行第二輪的重組；以此重復(fù)操作至第五輪就可以把99%的穿梭載體克隆重組到腺病毒載體之內(nèi)。本發(fā)明穿梭載體是在pShuttle-CMV (Agilent Technologies, USA)載體基礎(chǔ)上改進(jìn)的一pCMV-HL對(duì)pShuttle-CMV載體的改造包括在PacI的外面添加SwaI酶切位點(diǎn)，在PmeI之內(nèi)添加IsceI酶切位點(diǎn)，和外源基因插入酶切點(diǎn)的改變。其中外源基因插入酶切點(diǎn)的改變是把T7細(xì)菌啟動(dòng)子、Kozak序列和用來(lái)插入外源基因的 5 個(gè)酶的組合:AsiSI/MluI, AsiSI/RsrII, AsiSI/Notl, Ascl/Mlul, AsiSI/XhoI,以及His和Flag標(biāo)簽合成之后，用KpnI/Xbal酶切，然后連接到KpnI/Xbal酶切的穿梭載體上。對(duì)pShuttle-CMV載體的改造還包括縮短左、右同源臂和在5’端增加了一個(gè)Kozak序列。對(duì)pShuttle-CMV載體的改造還包括插入嘌呤霉素Puromycin的基因、SV40啟動(dòng)子和BGH PolyA信號(hào)。本發(fā)明所用腺病毒骨架載體是在現(xiàn)有腺病毒骨架載體內(nèi)克隆進(jìn)了一個(gè)表達(dá)ISceI的酵母基因。并將該基因置于一個(gè)常用的細(xì)菌的啟動(dòng)子之下。在重組過(guò)程中，當(dāng)穿梭載體轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架載體的細(xì)菌之后，腺病毒骨架載體表達(dá)的ISceI酶會(huì)及時(shí)把沒(méi)有酶切完全的穿梭載體在細(xì)菌活體內(nèi)線(xiàn)性化。這樣既增加了重組的效率，也大大減少了背景里沒(méi)有重組的菌體的數(shù)量。因?yàn)镮SceI酶一直在含有腺病毒骨架載體的感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)。在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明優(yōu)選了一個(gè)與現(xiàn)有技術(shù)不同的細(xì)菌株做重組。本發(fā)明穿梭載體和腺病毒骨架載體的重組是在細(xì)菌株SW102 (美國(guó)國(guó)家健康總署(National Institutes of Health, N.1.Η.))中進(jìn)行的。該細(xì)菌株 SW102 是對(duì)大腸桿菌DHlOB改造而來(lái)。該細(xì)菌株SW102含有一個(gè)有缺失的原噬菌體λ，其基因型是DHlOB Ucl85Z(cro~biok) Otet]，具有抗四環(huán)素藥性。有缺失的原噬菌體λ含有三個(gè)必要的重組酶:Gam, Beta,和Exo，并且該原噬菌體已經(jīng)整合到了細(xì)菌的染色體上了。Gam，Beta,和Exo三個(gè)酶的表達(dá)是在一個(gè)很?chē)?yán)格，可被抑制的啟動(dòng)子控制之下的?？杀徽{(diào)控的PL啟動(dòng)子是由一個(gè)對(duì)溫度敏感的λ cI857抑制因子調(diào)控的。在32度的時(shí)候，抑制因子很活躍，它抑制PL下面三個(gè)重組基因的表達(dá)。當(dāng)?shù)?2度的時(shí)候，抑制因子失去活性，致使Gam，Beta, Exo得到很高的表達(dá)。因?yàn)樵?2度的時(shí)候，啟動(dòng)子被抑制，重組的Ex0，Bet，Gam三種酶不能表達(dá)。在42度誘導(dǎo)的時(shí)候，三種重組的酶才能表達(dá)。所以細(xì)胞內(nèi)重組的三個(gè)酶在制作感受態(tài)細(xì)胞之前作短暫的誘導(dǎo)，重組之后就不再表達(dá)。重組酶在正常生長(zhǎng)情況下不再表達(dá)，重組后的腺病毒載體也會(huì)相對(duì)穩(wěn)定。本發(fā)明腺病毒克隆與質(zhì)粒克隆一樣有很多種用途，且完全可以替代傳統(tǒng)的質(zhì)粒克隆。腺病毒載體可以用來(lái)做成基因芯片，進(jìn)行基因功能和蛋白功能等的研究。本發(fā)明不僅用于人類(lèi)全基因組腺病毒載體的生產(chǎn)，也適用于其他哺乳動(dòng)物基因組腺病毒載體的生產(chǎn)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下突出的優(yōu)點(diǎn):
第一、新構(gòu)建的穿梭載體為高通量生產(chǎn)提供了條件。我們選擇了最稀少的3-4個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶作為外源DNA片段的插入。人類(lèi)幾乎所有基因都可以通過(guò)這幾個(gè)組合插入到我們的穿梭載體?，F(xiàn)有的穿梭載體只有幾個(gè)最常見(jiàn)的酶切位點(diǎn)，不能夠滿(mǎn)足人類(lèi)所有基因的克隆。且只用PmeI線(xiàn)性化，但人類(lèi)的許多基因內(nèi)部含有該酶切點(diǎn)。新構(gòu)建的載體利用ISceI線(xiàn)性化，因?yàn)槿祟?lèi)基因組中不含有該酶切位點(diǎn)。除了 PacI用來(lái)做重組后腺病毒的線(xiàn)性化以夕卜，新的穿梭載體還有一個(gè)稀少的SwaI酶切點(diǎn)。第二、采用新的重組菌株和方法大大提高了重組效率。新的重組菌株有很多優(yōu)點(diǎn)。新的重組方法效率在85-90%，而傳統(tǒng)的的重組效率只有40-50%。由于質(zhì)粒在細(xì)菌株BJ5183中不穩(wěn)定，并且該菌株不能 用來(lái)擴(kuò)增質(zhì)粒，重組后的質(zhì)粒需轉(zhuǎn)染到另外一個(gè)普通的菌株中擴(kuò)增，整個(gè)過(guò)程是8-10天。用細(xì)菌株SW102作重組，從兩步變成一步，并且只需要2-3天時(shí)間。不僅僅是時(shí)間的縮短，實(shí)驗(yàn)步驟也大大簡(jiǎn)化。試驗(yàn)試劑也只需原來(lái)的1/5-1/8。用新的菌株和方法重組整個(gè)成本也會(huì)降低，是現(xiàn)有技術(shù)的1/5-1/8。第三、高通量穿梭載體的構(gòu)建?，F(xiàn)有的技術(shù)是每次做一個(gè)穿梭載體克隆。我們把50個(gè)不同的克隆合在一起，每次能得到30-35個(gè)穿梭載體克隆。依人類(lèi)15，000個(gè)基因計(jì)算，如果一個(gè)一個(gè)做的話(huà)，需要15，000次克隆。如果用我們高通量的方式，只需要500-600次克隆。整個(gè)生產(chǎn)成本會(huì)是以往技術(shù)的1/10-1/20。不僅僅是生產(chǎn)成本，生產(chǎn)時(shí)間會(huì)是以往技術(shù)的1/5-1/10。第四、高通量腺病毒重組。與高通量穿梭載體的構(gòu)建相似，最后腺病毒的重組也是把50個(gè)不同的克隆合在一起。其效率增加20-30倍，其成本是現(xiàn)有技術(shù)的1/10-1/20。采用現(xiàn)有技術(shù)，把人類(lèi)所有的基因制成腺病毒粒子是不太可能的。利用我們新的高通量技術(shù)，人類(lèi)所有的基因可以在6-10個(gè)月內(nèi)制成腺病毒粒子。其成本和時(shí)間只是以往技術(shù)的1/10。第五、含有ISceI的腺病毒骨架載體。用現(xiàn)有的技術(shù)重組，50%以上的菌落是不正確的重組，重組效率低。用新的腺病毒載體，重組成功率在90%以上。高成功率是我們高通量重組的前提。現(xiàn)有的技術(shù)和載體不能用來(lái)做高通量重組。


圖1為穿梭載體圖譜。圖2為腺病毒骨架載體圖譜。圖3為傳統(tǒng)的穿梭載體構(gòu)建和本發(fā)明高通量穿梭載體構(gòu)建程序和時(shí)間比較。圖4為傳統(tǒng)腺病毒重組和本發(fā)明高通量腺病毒重組程序和時(shí)間比較。圖5為所用人全基因組ORF引物。圖6為NM_000632克隆序列和源基因序列的對(duì)比。Query:本發(fā)明克隆獲得的序列；Sbjct:人 NM_000632 序列
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求的保護(hù)范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，
通常按照常規(guī)條件如:J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)或按照制造廠(chǎng)商的操作指南所建議的方法進(jìn)行。實(shí)施例1.穿梭載體pCMV-FH
本發(fā)明穿梭載體pCMV-FH是在pCMV-Shuttle的基礎(chǔ)上采用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)改造而成的，具體的步驟是:
(0.縮短左、右同源臂。將載體的左面和右面的重組序列縮短成800個(gè)堿基。保留了原質(zhì)粒1243-2043堿基的右面同源臂和3545-4428堿基的左面的同源臂。采用普通分子生物學(xué)引物設(shè)計(jì)方法來(lái)設(shè)計(jì)引物。在PCR引物兩端加入一個(gè)PmeI酶切點(diǎn)。PCR擴(kuò)增之后，把PCR產(chǎn)物自連，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，小提和測(cè)序。(2).在PmeI酶切點(diǎn)加入一個(gè)嘌呤霉素Puromycin基因。把Puromycin的基因、SV40啟動(dòng)子和BGH PolyA信號(hào)，進(jìn)行體外基因合成。合成產(chǎn)物用PmeI酶切之后，連接到PmeI酶切的縮短后的穿梭載體。該結(jié)構(gòu)的兩端除了原有的PmeI酶切點(diǎn)以外，又加了一個(gè)IsceI酶切點(diǎn)在PmeI之內(nèi)。(3).外源基因插入酶切點(diǎn)的改變。把基因片段、含有T7細(xì)菌啟動(dòng)子、Kozak序列和用來(lái)插入外源基因的 5 個(gè)酶的組合:AsiSI/MluI，AsiSI/RsrII，AsiSI/NotI，AscI/MluI，AsiSI/XhoI,以及His和Flag標(biāo)簽合成之后，用KpnI/Xbal酶切，然后連接到KpnI/Xbal酶切的上述穿梭載體。(4).SwaI酶切點(diǎn)的插入。PacI酶切點(diǎn)旁邊增加一個(gè)SwaI酶切點(diǎn)和BstBI酶切點(diǎn)。首先在PacI交界處設(shè)計(jì)PCR引物，該引物加上了 PacI和BstBI。然后用兩對(duì)引物和上述穿梭載體做PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在純化之后，酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，小提，和序列分析。實(shí)施例2.高通量穿梭克隆的構(gòu)建
采用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)改造而成完成的，具體的步驟是:
(I).PCR用的全長(zhǎng)DNA模板(人類(lèi)全長(zhǎng)基因來(lái)自:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/RefSeq/的RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù))先排列到96孔PCR盤(pán)上。3萬(wàn)個(gè)ORF引物(購(gòu)自美國(guó)Eurofins/MWG/Operon生物公司，基因及相應(yīng)引物見(jiàn)附圖5)也按照DNA模板的順序設(shè)計(jì)。(2).以96孔板的模式對(duì)15，000個(gè)現(xiàn)有的克隆(12，000個(gè)來(lái)自美國(guó)國(guó)家健康總署，3，000個(gè)來(lái)自青島麥克利生物科技有限公司)進(jìn)行擴(kuò)增。為減少PCR過(guò)程中的突變，每個(gè)基因只擴(kuò)增15個(gè)回合，并且應(yīng)用高保真聚合酶。(實(shí)施例3以NM_000632基因?yàn)槔龑?duì)人類(lèi)全基因組基因PCR進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明)
(3).根據(jù)ORF的大小，每個(gè)PCR產(chǎn)物取2微升，把50個(gè)大小相似的基因合到一個(gè)試管，然后純化。(4).按照酶切點(diǎn)酶切 ，瓊脂膠分離，純化。(5).連接到穿梭載體pCMV-FH并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。(6).挑96個(gè)菌體，用96孔深孔板細(xì)胞培養(yǎng)，質(zhì)粒小提和測(cè)序。(7).5'端的序列與原來(lái)50個(gè)ORF的序列對(duì)比。(8).5'端正確的克隆，然后進(jìn)行3'端測(cè)序。(9).5'和3'端都正確的克隆確定為克隆到穿梭載體的克隆。一次能得到30-35個(gè)正確的穿梭載體克隆。實(shí)施例3.人NM_000632基因的克隆
本發(fā)明以NM_000632基因?yàn)槔龑?duì)人類(lèi)全基因組基因PCR進(jìn)行說(shuō)明，5 ‘端引物名:NM_000632_SgfI,序列為:GAGAGCGATCGCCATGGCTCTCAGAGTCCTTCTG (SEQ ID N0.2)； 3 ‘端引物名:NM_000632_MluI，序列為:GAGAACGCGTCTGGGGTTCGGCCCCCGGGGGAC (SEQ ID N0.3)。(I)采用 Fisher Scientific 的 Phusion 高保真酶進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系 30 μ I
FastStart High Fidelity buffer, 5X6 μ I
Nucleotide Mix, 2.5mM each2.4 μ I
Downstream Primer (10 μ M)I μ I
Upstream Primer(10 μ M)I μ I
DNA2 μ I
Phusion High Fidelity Enzyme Blen (5U/μ L) 0.3 μ IWater, PCR-Gradeup to 30 μ IPCR反應(yīng)條件:98°C預(yù)變性I min ;98°C變性20 sec，60°C退火30 sec，72°C延伸6min，15個(gè)循環(huán)；72°C保溫IOmin ;擴(kuò)增結(jié)束后取部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖膠檢驗(yàn)擴(kuò)增條帶。(2) PCR產(chǎn)物純化
米用 Roche 公司的 High pure PCR product purification 試劑盒進(jìn)行:
1)上述PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加無(wú)菌去離子水至100 μ L，加 500 μ I Binding buffer，充分混勻；
2)將過(guò)濾柱插入收集管中，將步驟I的溶液全部轉(zhuǎn)移到柱子里，最大轉(zhuǎn)速(至少13，000 X g),離心 30-60 sec ；
3)棄掉收集管中的液體，再將過(guò)濾柱插入原收集管中，向柱中加入500μI Washbuffer,最大轉(zhuǎn)速(至少13, 000 X g),離心Imin ；
4)棄掉收集管中的液體，再將過(guò)濾柱插入原收集管中，向柱中加入200μI Washbuffer,最大轉(zhuǎn)速(至少13, 000 X g),離心Imin ；
5)棄掉收集管,將過(guò)濾柱插入新的1.5ml離心管中，向柱中加入50-100 μ I無(wú)菌去離子水，最大轉(zhuǎn)速(至少13，000 Xg),離心Imin ；
6)離心管中的即為純化后的PCR產(chǎn)物。(3)將純化后的PCR產(chǎn)物(SEQ ID N0.1)測(cè)序表明，該P(yáng)CR產(chǎn)物與ΝΜ_000632基因完全一致(如附圖6所示)，說(shuō)明本方法可以成功擴(kuò)增人類(lèi)基因。

實(shí)施例4.將表達(dá)ISceI的酵母基因克隆進(jìn)腺病毒骨架載體
(I)骨架載體的構(gòu)建。首先采用普通分子生物學(xué)方法來(lái)設(shè)計(jì)兩個(gè)PCR引物，兩個(gè)PCR引物中間加入一個(gè)PmeI酶切點(diǎn)，把一個(gè)含有左面和右面腺病毒基因組500個(gè)堿基(為pAdEasy右面同源臂:3716-4216堿基；左面同源臂:32971-33471堿基)和整個(gè)質(zhì)粒載體的片段PCR擴(kuò)增，純化，然后進(jìn)行自身連接，轉(zhuǎn)化，小提，測(cè)序和序列分析。(2) IsceI引物設(shè)計(jì)。引物采用普通分子生物學(xué)引物設(shè)計(jì)方法來(lái)設(shè)計(jì)。5’端的引
物含有一個(gè)常用的細(xì)菌的啟動(dòng)子-NE0KAN_promoter (CCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGG
TAAG
GTTGGGAAGCCCTGCAA)以及24個(gè)與IsceI 5’端堿基配對(duì)的序列；3’端序列含有一個(gè)常用的PolyA信號(hào)序列和與IsceI3’端配對(duì)的序列。同時(shí)在兩個(gè)引物的兩端加了一個(gè)BsaI酶切點(diǎn)，確使酶切之后產(chǎn)生與KasI酶切點(diǎn)匹配的序列。(3)PCR擴(kuò)增。用以上兩個(gè)引物和一個(gè)合成的IsceI模板作PCR擴(kuò)增，30個(gè)回合。(4) PCR產(chǎn)物純化，酶切。PCR之后，用PCR純化柱子作純化，然后用BsaI酶切2小時(shí)。最后用瓊脂膠分離純化。(5)骨架載體酶切。用KasI把第(I)步的骨架載體酶切，去磷酸化，然后瓊脂膠分
離，純化。(6)酶連接，轉(zhuǎn)化，確定。把第(4)步和第(5)步的酶切的IsceI片段和骨架載體酶連接過(guò)夜，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，小提之后進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析。(7)腺病毒載體酶切。用Pacl/Clal兩個(gè)酶把腺病毒中的骨架載體切除，并進(jìn)行瓊脂膠分離，純化。(8)插入到原來(lái)的腺病毒載體。把含有IsceI片段的骨架載體用PmeI線(xiàn)性化之后，和第(7)步的Pacl/Clal酶切的腺病毒載體在SW102細(xì)胞中重組。(9)序列分析鑒定。重組后的菌體進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，小提和測(cè)序。最終的克隆經(jīng)過(guò)酶切鑒定，確定整個(gè)克隆的完整性和IsceI片段的存在。實(shí)施例5.腺病毒骨架載體轉(zhuǎn)染到細(xì)菌株SW102 (美國(guó)國(guó)家健康總署)里面
(I).從-70度冰箱取出保存的細(xì)菌株，劃在不含有抗生素的瓊脂盤(pán)上，32度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜(20-24小時(shí))。(2).第二天傍晚接種單獨(dú)的菌體到2毫升不含抗生素的培養(yǎng)液中，放到32度搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜(15-18小時(shí))。(3).制備電轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞。(4).用50微升的電轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞，加入0.5微升的腺病毒骨架載體。(5).電轉(zhuǎn)化到細(xì)菌里面，并鋪50微升的電轉(zhuǎn)化溶液到氨節(jié)西林Ampicillin(50ug/ml)的瓊脂膠培養(yǎng)盤(pán)上，32度培養(yǎng)過(guò)夜(20-24小時(shí))。(6).挑單個(gè)的菌體制作感受態(tài)細(xì)胞(實(shí)施例6)，然后與穿梭載體重組(實(shí)施例7)。實(shí)施例6.感受態(tài)細(xì)胞的制備
將實(shí)施例5里得到的已經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)了腺病毒骨架載體的細(xì)菌株SW102，制作成感受態(tài)細(xì)胞。具體步驟如下:
(0.制感受態(tài)細(xì)胞的前一天傍晚，用單個(gè)菌體或2-3個(gè)菌體接種2-3毫升CircleGrow 培養(yǎng)液(50ug/m l ampicillin)。(2).第二天一早用I毫升接種到100毫升新鮮的CircleGrow培養(yǎng)液,放到搖床(300rpm) 一直搖到 OD 0.3-0.4。(3).細(xì)胞長(zhǎng)好之后，升溫誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)。(4).然后把培養(yǎng)好的細(xì)菌迅速在冰水中冷卻到零度(用手在冰水中搖晃4-5分鐘)，之后放到冰上10-20分鐘，同時(shí)把10%甘油也要放到冰上至少半小時(shí)。(5).離心細(xì)胞用1200g (根據(jù)離心機(jī)，用盡量低的速度)，20分鐘，離心機(jī)也要冷卻到0-2度。(6).把上清液徹底倒掉，然后非常小心的用冷卻好的100ml，10%的甘油沖洗一次；小心地用移液管把沉淀的細(xì)胞攪起。(7).需要用IOOml 10%的甘油再?zèng)_洗一次(共兩次)。(8).最后加入2毫升10%甘油，每個(gè)1.5ml試管可以分裝40微升的細(xì)胞.事先把需要的試管放到冰上冷卻或放到-20度冰箱冷卻。(9).用酒精干冰浴迅速冷凍細(xì)胞5分鐘，然后在-80度冰箱保存。實(shí)施例7.高通量腺病毒載體的重組
(0.根據(jù)ORF的大小，把50個(gè)不同的穿梭克隆合到一起，PmeI酶切，或者ISceI酶切線(xiàn)性化。(2).瓊脂膠分離，純化。(3).轉(zhuǎn)化到實(shí)施例6制好的感受態(tài)細(xì)胞中。(4).挑96個(gè)菌體，96孔板細(xì)胞培養(yǎng)，質(zhì)粒小提，測(cè)序。(5).PacI酶切驗(yàn)證和序列分析。(6).PacI酶切正確和測(cè)序正確的為重組正確的克隆。一次重組能得到30_35個(gè)正確的腺病毒克隆。實(shí)施例8.電轉(zhuǎn)導(dǎo)法進(jìn)行重組
穿梭載體首先用PmeI或IsceI酶切，然后瓊脂膠電泳分離，純化。電轉(zhuǎn)導(dǎo)重組的程序跟一般的方法一樣。(I).首先把1.5毫升微試管和電轉(zhuǎn)導(dǎo)的Cuvettes放到冰上冷卻。(2).從-80度冰箱中取出實(shí)施例6制備好的感受態(tài)細(xì)胞，并在冰上讓細(xì)胞溶化。(3).用移液槍分裝40微升感受態(tài)細(xì)胞到每一個(gè)事先冷卻好的試管中。(4).用移液槍加入2微升瓊脂膠純化的穿梭載體到每一個(gè)試管，混勻，并保持在冰上。(5).把電轉(zhuǎn)儀設(shè)在以下程序:200Ω，2.5kV, 25 μ F或根據(jù)生產(chǎn)廠(chǎng)家的要求設(shè)置。(6).用移液槍把感受態(tài)細(xì)胞輕輕的轉(zhuǎn)移到事先冷卻好的Cuvette中，避免產(chǎn)生汽泡。(7).輕輕將Cuvette滑到電轉(zhuǎn)化的槽中,確信Cuvette兩邊的金屬與電轉(zhuǎn)化槽的
金屬接觸。⑶.按住電轉(zhuǎn)儀的按鈕，電擊一次，并迅速加入I毫升事先熱到37度的SOC培養(yǎng)基。(9).用移液槍把電轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15毫升的試管中在合適的溫度培養(yǎng)60分鐘，搖床速度設(shè)在250轉(zhuǎn)/分。(10).把100微升培 養(yǎng)后的電轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪到平板上(卡那霉素Kanamycin 30微克/毫升)過(guò)夜，或培養(yǎng)18-24小時(shí)。
權(quán)利要求
1.一種新的腺病毒載體，其特征在于，一是把外源的基因克隆到穿梭載體里面，二是穿梭載體和腺病毒骨架載體的重組，腺病毒骨架載體內(nèi)克隆進(jìn)了一個(gè)表達(dá)ISceI的酵母基因。
2.如權(quán)利要求1所述的一種新的腺病毒載體，其特征在于，所述的外源基因?yàn)椴溉閯?dòng)物的基因，或?yàn)槿祟?lèi)的基因。
3.如權(quán)利要求1所述的一種新的腺病毒載體，其特征在于，所述的穿梭載體是pCMV-HL
4.如權(quán)利要求3所述的一種新的腺病毒載體，其特征在于，所述的pCMV- 是對(duì)pShuttIe-CMV載體的改造而得,包括在PacI的外面添加SwaI酶切位點(diǎn)，在PmeI之內(nèi)添加IsceI酶切位點(diǎn)，和外源基因插入酶切點(diǎn)的改變；所述的外源基因插入酶切點(diǎn)的改變是把T7細(xì)菌啟動(dòng)子、Kozak序列和用來(lái)插入外源基因的5個(gè)酶的組合:AsiSI/MluI，AsiSI/RsrII,AsiSI/NotI,AscI/MluI,AsiSI/XhoI,以及 His 和 Flag 標(biāo)簽合成之后，用 KpnI/Xbal酶切，然后連接到KpnI/Xbal酶切的穿梭載體上；對(duì)pShuttle_CMV載體的改造還包括縮短左、右同源臂和在5’端增加了一個(gè)Kozak序列；對(duì)pShuttle-CMV載體的改造還包括插入嘌呤霉素Puromycin基因、SV40啟動(dòng)子和BGH PolyA信號(hào)。
5.一種權(quán)利要求1所述新的腺病毒載體的生產(chǎn)方法，其特征在于，穿梭載體克隆方法及穿梭載體和腺病毒骨架載體的重組方法均采用高通量的生產(chǎn)方法。
6.如權(quán)利要求5所述新的腺病毒載體的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的高通量穿梭載體的克隆方法是:首先將人類(lèi)每個(gè)基因的ORF用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，然后把50個(gè)大小相似的ORF的PCR產(chǎn)物合到一起，酶切，連接到穿梭載體；轉(zhuǎn)化，細(xì)菌培養(yǎng)后，挑96個(gè)菌體，質(zhì)粒小提，進(jìn)行測(cè)序和序列分析；一個(gè)96孔板可以得到30-35個(gè)不同的克隆，第一輪就能把9，000-10，000個(gè)人源的基因克隆到穿梭載體內(nèi)；對(duì)第一輪沒(méi)有克隆到的基因，根據(jù)大小重新把50個(gè)克隆合到一起，酶切，連接和轉(zhuǎn)化；重復(fù)操作至第五輪就可以把99%的基因克隆到穿梭載體內(nèi)。
7.如權(quán)利要求5所述新的腺病毒載體的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的高通量的穿梭載體和腺病毒骨架載體的重組方法是:首先將50個(gè)不同的穿梭載體克隆合到一起，用PmeI或ISceI酶切線(xiàn)性化之后，轉(zhuǎn)化到含有腺病毒載體的感受態(tài)細(xì)菌之內(nèi)；平板過(guò)夜培養(yǎng)，然后挑96個(gè)菌體作質(zhì)粒小提，測(cè)序和序列分析；一次轉(zhuǎn)化和96樣品分析可以獲得30-35個(gè)不同的重組腺病毒克??；對(duì)第一次沒(méi)有得到重組的克隆，再合到一起進(jìn)行第二輪的重組；以此重復(fù)操作至第五輪就可以把99%的穿梭載體克隆重組到腺病毒載體之內(nèi)。
8.如權(quán)利要求1所述的一種新的腺病毒載體，其特征在于，所述的腺病毒載體可用來(lái)做成基因芯片。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的腺病毒載體及其生產(chǎn)方法。該載體生產(chǎn)包括兩個(gè)主要步驟，一是把外源的基因克隆到穿梭載體里面，二是穿梭載體和腺病毒骨架載體的重組。本發(fā)明所用穿梭載體是在pShuttle-CMV載體基礎(chǔ)上改進(jìn)的—pCMV-FH；所用腺病毒骨架載體是在現(xiàn)有腺病毒骨架載體內(nèi)克隆進(jìn)了一個(gè)表達(dá)ISceI的酵母基因；所用重組菌株是SW102。本發(fā)明穿梭載體克隆方法及穿梭載體和腺病毒骨架載體的重組方法均采用高通量的生產(chǎn)方法。采用高通量穿梭載體的克隆方法和高通量的重組方法重復(fù)操作至第五輪就可以把99%的穿梭載體克隆重組到腺病毒載體之內(nèi)。本發(fā)明的高通量腺病毒載體生產(chǎn)方法重組效率高達(dá)85-90%，大幅簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，時(shí)間也大大縮短，且實(shí)驗(yàn)成本明顯降低。
文檔編號(hào)C12N15/66GK103146753SQ201310064880
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者孫在仁 申請(qǐng)人:山東維真生物科技有限公司