專利名稱：一種具有高轉(zhuǎn)化率的反式-4-羥基-l-脯氨酸羥化酶改造基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有高轉(zhuǎn)化率的反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶改造基因及其應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
反式-4-輕基-L-脯氨酸(L-輕脯氨酸，trans-4-hydroxy-L-proline,Hyp)不屬于20種常見的氨基酸，是羥化酶對脯氨酸羥基化修飾的結(jié)果，主要存在于膠原蛋白中，其作用是加強了結(jié)締組織的彈性和韌性。膠原蛋白含量最豐富的材料為骨膠和明膠。骨膠、明膠中羥脯氨酸含量為10-10.5%，脯氨酸含量為12-13%。近些年來，Hyp的研究和開發(fā)已經(jīng)引起醫(yī)藥、生化、食品及美容業(yè)等方面的廣泛關(guān)注。在醫(yī)藥領(lǐng)域，Hyp具有多種生理功能與獨特的生物活性，既可作為各種軟組織疾病的藥物，如結(jié)締組織受損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，又可加快傷口愈合，以及治療各種皮膚疾?。蛔鳛榘被嶙⑸湟旱闹匾M分，它對急慢性肝病所導(dǎo)致的低蛋白血癥有一定的療效；Hyp參與脂肪的乳化及紅細胞血紅素和球蛋白的形成，具有調(diào)節(jié)脂肪乳化等作用；它還是多種藥物，如第三代抗生素、抗腫瘤、抗高血壓及新型胃藥等的合成原料。它具有減肥作用，可望成為比較理想的減肥藥物。在化妝品添加劑領(lǐng)域，由于其具有抗氧化、抗輻射的作用，是化妝品的重要添加劑。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，主要用作殺蟲劑和抗旱劑。反式-4-羥基-L-羥脯氨酸存在兩個手性中心，易于衍生化，藥理活性多樣，近年來逐漸被應(yīng)用到醫(yī)藥原料藥手性中間體領(lǐng)域，用于合成新一代培南類抗生素和多種新創(chuàng)制藥物的合成。目前，反式-4-羥基-L-羥脯氨酸的世界用量為500噸/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趨勢。我國反式-4-羥基-L-羥脯氨酸的生產(chǎn)采用化學(xué)水解提取工藝，以動物膠原蛋白為原料，通過強酸水解、亞硝酸氧化和離子交換等過程，收率僅為5%，存在原料消耗量大、“三廢”排放量大、能耗高、純度低及生產(chǎn)成本高等不足。由于該工藝采用的是動物源原料，生產(chǎn)過程采用亞硝酸氧化工藝，該工藝的微量殘存物或雜質(zhì)會對后續(xù)衍生化的中間體或原料藥產(chǎn)生潛在的危害。國內(nèi)外許多制藥公司已經(jīng)提出了對于反式-4-羥基-L-羥脯氨酸的生物源來源要求，這種要求限制了動物源反式-4-羥基-L-羥脯氨酸的使用。目前國內(nèi)所有采用化學(xué)水解工藝生產(chǎn)的企業(yè)均無法滿足上述要求，再加上“三廢”排放不達標(biāo)，隨時面臨著關(guān)停的窘境。因此，急需開發(fā)一種污染小、能耗低、產(chǎn)品純度高，具備規(guī)?；a(chǎn)的技術(shù)，以替代目前的化學(xué)法水解提取工藝。生物法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)反式-4-羥基-L-羥脯氨酸，是當(dāng)前世界上解決當(dāng)前化學(xué)法能耗高、污染大、成本高等問題的最佳途徑。目前用于生物法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)反式-4-羥基-L-羥脯氨酸的酶主要來自指孢囊菌sp.RHl),該菌株的反式_4_輕基-L-脯氨酸羥化酶基因(GenBank ID:BAA20094.1)長816bp核苷酸，編碼272個氨基酸殘基，GC含量為66.67%, Klein等研究發(fā)現(xiàn)該酶蛋白主要以包涵體形式出現(xiàn)(Klein et al.2010),通過加入伴因子PG-KJE后目的蛋白的可溶性有所提升；以活菌體作為催化劑，添加低濃度底物L(fēng)-脯氨酸(6.25mM), 28°C下培養(yǎng)3d，反式-4-羥基-L-羥脯氨酸的最高轉(zhuǎn)化率為63%。從以上結(jié)果可以看出，要利用該基因生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)反式-4-羥基-L-羥脯氨酸還存在著如下三個問題:1)需要添加伴因子，這將導(dǎo)致生產(chǎn)工藝復(fù)雜；2)轉(zhuǎn)化率還比較低，導(dǎo)致產(chǎn)物中成分較多，尤其是L-脯氨酸的大量存在，給產(chǎn)物分離帶來困難；3)轉(zhuǎn)化反應(yīng)中目的產(chǎn)物濃度低，導(dǎo)致分離成本上升。這三個問題的存在必將導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，必須發(fā)明更為高效的生物轉(zhuǎn)化方法，為工業(yè)化服務(wù)。本發(fā)明提供了一種含有反式-4-羥基-L-羥脯氨酸酶的改造基因，可用于高效制造反式-4-羥基-L-脯氨酸，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有高轉(zhuǎn)化率的反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶改造基因序列。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的一種反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。本發(fā)明還提供含有上述基因的載體及宿主細胞。本發(fā)明還提供含有上述基因的工程菌。 本發(fā)明還提供上述反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶工程菌的培養(yǎng)方法和酶蛋白的誘導(dǎo)條件。本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟:
(I)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公開的來自Dactylosporangium鄧.RHl的反式-4-輕基-L-脯氨酸羥化酶的基因Mf -1序列信息，依據(jù)大腸桿菌的密碼子頻率進行調(diào)整，降低整個DNA序列的GC含量，獲得優(yōu)化后的反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因(/7知_2)。(2)將優(yōu)化后的基因/7知-2與表達載體連接，構(gòu)建反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的表達載體；
(3 )將上述表達載體轉(zhuǎn)化可表達目的基因的工程菌中，隨工程菌的復(fù)制表達該酶蛋白。制備方法的優(yōu)選條件:步驟(2)中所述表達載體為pET系列的pET_28a或PET-M-3C ；
步驟(3)中所述工程菌為大腸桿菌萬.co7i BL21(DE3)或BL21_CodonPlus (DE3)。本發(fā)明進一步提供上述反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的應(yīng)用，具體是將菌體作為反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的酶源用于生物法生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸。具體地,本發(fā)明是從指孢囊菌w sp.RHl)中獲得反式_4_輕基-L-脯氨酸羥化酶基因/7知-1 (GenBank ID: D78338.1)，所構(gòu)建基因/7知_1的表達載體做為對照；根據(jù)基因P知-1的序列信息，依據(jù)大腸桿菌的密碼子頻率進行調(diào)整，降低整個DNA序列的GC含量，獲得優(yōu)化的反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因/7知_2，構(gòu)建其表達載體，將表達載體分別轉(zhuǎn)化到宿主菌中，菌株培養(yǎng)在相應(yīng)培養(yǎng)基中在28°C培養(yǎng)，經(jīng)擴大培養(yǎng)0D_至0.5-1.0時，加入0.1-0.5mM的IPTG在16_20°C低溫誘導(dǎo)表達8_12h，收集菌體作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)酶源，以轉(zhuǎn)化率表示，含改造基因/7知-2的表達載體的轉(zhuǎn)化率最高達91%，而含基因Phy-1的表達載體的轉(zhuǎn)化率僅為62%。指孢囊菌iPactylosporangiums^.RHl)反式_4_輕基-L-脯氨酸輕化酶改造基因phy-2的核苷酸序列為:SEQ ID NO:1。本發(fā)明取得的有益效果:本發(fā)明通過優(yōu)化反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因，構(gòu)建其工程菌株，并誘導(dǎo)表達反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶蛋白，以菌體作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)酶源，催化L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥基-L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化率得到了很大提高，降低了反應(yīng)產(chǎn)物中L-脯氨酸的量，有利于反應(yīng)產(chǎn)物反式-4-羥基-L-脯氨酸的純化分離，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。


圖1A為含反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因/7知-1的表達載體雙酶切電泳圖譜，圖1A 中 I:pET-28a-Phy-l ；M:lKb Marker ；
圖1B為含優(yōu)化基因#7-2的表達載體雙酶切電泳圖譜，圖1B中1:pET-28a-Phy-2 ；2:pET-M-3C-Phy-2 ；M:Transl5K Marker。圖2A-圖2C為以BL21 (DE3)為宿主進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)的HPLC檢測其中:圖 2A 為萬.coli BL21(DE3)/pET-28a-Phy-l ；
圖 2B 為萬.coli BL21 (DE3) /pET-28a-Phy-2 ；
圖 2C 為萬.coli BL21 (DE3)/pET-M-3C_Phy-2。圖3A和圖3B為以BL21-CodonPlus (DE3)為宿主進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)的HPLC檢測圖； 其中:圖 3A 為疋 coli BL21-CodonPlus(DE3)/pET-28a-Phy-l ； 圖 3B 為疋 coli BL21-CodonPlus(DE3)/pET-28a-Phy-2。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因優(yōu)化及工程菌株的構(gòu)建
(I)基因優(yōu)化
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公開的來自Dactylosporangium鄧.RHl的反式-4-輕基-L-脯氨酸羥化酶基因P知-1序列信息(GenBank ID: D78338.1)，按照以下原則進行基因優(yōu)化:①參照表達物種的密碼子頻率進行調(diào)整并替換頻率在10%以下的密碼子，以使基因序列的密碼子使用頻率盡可能的與物種的最優(yōu)密碼子頻率一致；②盡可能的降低序列中的堿基重復(fù)結(jié)構(gòu)，使RNA 二級結(jié)構(gòu)相對簡單、穩(wěn)定；@讓整個DNA序列的GC含量盡可能的接近50%。(2)質(zhì)粒構(gòu)建
將優(yōu)化好的反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因/7知-2分別與表達載體pET-28a和PET-M-3C相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌疋coli DH5a，篩選陽性克隆，獲得相應(yīng)的表達質(zhì)粒pET-28a-Phy-2和pET-M-3C_Phy-2 ;將反式_4_羥基-L-脯氨酸羥化酶原始基因/7知_1連接到表達載體pET-28a上，得到表達載體pET-28a-Phy-l ;表達載體雙酶切驗證圖譜見附圖1A和圖1B0實施例2不同表達載體在宿主疋BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化實驗
將上述3種表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，28°C 140rpm搖菌約2-3h (OD600達到0.5-1.0)，添加0.1-0.5mM的IPTG，20°C誘導(dǎo)表達8_12h，離心收集菌體，稱取Ig菌體并重新懸浮于IOmL轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中(含有200mM L-脯氨酸、200mM α-酮戊二酸、6mM硫酸亞鐵、6mM L-抗壞血酸、80mM pH 6.5 MES 緩沖液及 1% Nonidet P-40)，于 35°C 140rpm 振蕩反應(yīng)72h，離心去除菌體，通過HPLC檢測上清中反式-4-羥基-L-脯氨酸的生成情況，其轉(zhuǎn)化率如表I所示。其中含表達載體pET-28a-Phy-l菌株的轉(zhuǎn)化率最低，僅為62.0%，含優(yōu)化基因/7知-2的菌株轉(zhuǎn)化率明顯提高，其中含表達質(zhì)粒pET-28a-Phy-2菌株的轉(zhuǎn)化率最高，為79.1% (圖 2A-圖 2C)(表 I)。表I不同表達載體在宿主BL21 (DE3)中的轉(zhuǎn)化率
權(quán)利要求
1.一種具有高轉(zhuǎn)化率的反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶改造基因序列，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.含有權(quán)利要求1記載的反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶改造基因的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:將所述改造基因構(gòu)建于表達載體中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中；所述表達載體為 pET-28a 或 pET-M-3C，所述大腸桿菌為 E.coli BL21 (DE3)或 BL21-CodonPlus (DE3)。
3.含有權(quán)利要求1記載的反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶改造基因的工程菌的培養(yǎng)方法，其特征在 于:在LB培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng)至OD600為0.5-1.0時，加0.1-0.5mM的IPTG，于16-20°C低溫誘導(dǎo)8-12h，收集菌體作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶源。
4.權(quán)利要求1所述改造基因的應(yīng)用，其特征在于用于生物法生產(chǎn)反式-4-羥基-L-羥脯氨酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有高轉(zhuǎn)化率的反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶改造基因及其應(yīng)用。通過優(yōu)化指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.RH1)中反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶(GenBankID:D78338.1)的核苷酸序列，構(gòu)建優(yōu)化基因的表達載體，通過原核表達，收集菌體作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶源，實驗結(jié)果表明，以L-脯氨酸為底物，生成反式-4-羥基-L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化率高達91%。本發(fā)明可用于生物法生產(chǎn)反式-4-羥基-L-羥脯氨酸，具有較好的工業(yè)應(yīng)用價值。
文檔編號C12N1/21GK103146720SQ201310064338
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者李瑋, 鞠建松, 薛張偉, 張金秀, 王立安, 張琳琳, 李天云, 張慶, 陳嬌嬌 申請人:河北博倫特藥業(yè)有限公司, 河北師范大學(xué)