專利名稱：中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)與損傷修復(fù)藥物研究模型構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, E)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes, A)及神經(jīng)元細(xì)胞(neuron, N)三種基本細(xì)胞形成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型及構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)是世界上最重要、最復(fù)雜的生命組織，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病則是健康負(fù)擔(dān)和醫(yī)學(xué)難題之一，所以對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)與損傷修復(fù)藥物研究一直是生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，其技術(shù)瓶頸即迫切需要建立一種既可以維持細(xì)胞在體內(nèi)的正常形態(tài)及功能，又可以對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行簡(jiǎn)單調(diào)節(jié)控制的細(xì)胞生長(zhǎng)載體。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境雖然能完整地保留細(xì)胞的各種 特征，但是過于復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境和體內(nèi)大量不可控因素以及動(dòng)物之間的個(gè)體差異將導(dǎo)致相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差，同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也很難實(shí)現(xiàn)對(duì)一種細(xì)胞進(jìn)行基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)分析，這對(duì)以后的網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)、精神藥理學(xué)研究造成了很大的障礙。另外，通過外科手術(shù)獲得的人腦與脊髓活體組織標(biāo)本，其組織活性難以保證而且多為病理組織，無法滿足深入研究(如藥物靶點(diǎn)、藥物效應(yīng)、藥物毒副作用、藥代動(dòng)力學(xué)等對(duì)比研究與評(píng)價(jià))的需要，因此利用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)與損傷修復(fù)藥物研究已越來越受到廣泛關(guān)注。毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種基本細(xì)胞，三者關(guān)系非常密切，相互作用，相互影響。如不同的影響因子，其作用的靶細(xì)胞也不盡相同，有的可通過作用于神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮作用，有的作用于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞，有的在生理?xiàng)l件下則可能無法通過血腦屏障和血脊屏障。然而，目前該類研究相關(guān)的體外細(xì)胞培養(yǎng)方式主要為兩大類:一類是對(duì)某一細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，如單獨(dú)培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞，這種方法雖然避免了體內(nèi)環(huán)境中大量不可控因素，但是過于簡(jiǎn)單的培養(yǎng)環(huán)境，往往導(dǎo)致所培養(yǎng)細(xì)胞喪失其體內(nèi)的部分生物學(xué)特性，忽略了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元細(xì)胞周圍的其他兩種重要細(xì)胞(毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞)，無法滿足關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)與損傷修復(fù)藥物研究的全部需要。另一類為兩細(xì)胞共培養(yǎng)，如神經(jīng)元細(xì)胞與星形膠質(zhì)原代細(xì)胞混合共培養(yǎng)以及利用Transwell系統(tǒng)將星形膠質(zhì)細(xì)胞等與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，借以研究血腦屏障和血脊屏障。此種方法只側(cè)重研究了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞的相互作用，也忽略了毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞三者相互作用的系統(tǒng)關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種基于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, E)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes, A)及神經(jīng)元細(xì)胞(neuron, N)三種基本細(xì)胞形成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型及構(gòu)建方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型，在24孔培養(yǎng)板中有神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物及神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基，在神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基中插有Transwell Insert,所述TranswelI Insert的濾膜內(nèi)室面涂有膠原蛋白IV，在TranswellInsert的內(nèi)室面有毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物,在Transwell Insert的外室面有星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，所述星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的突起通過Transwell Insert的濾膜孔徑穿向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物，所述神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基的組分及體積百分比如下:98%神經(jīng)元細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1%雙抗、1% L-谷氨酰胺。一種上述中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型的構(gòu)建方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行:
a.分別提取同一種屬同一部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞并分別進(jìn)行原代培養(yǎng)；
b.在TranswellInsert濾膜內(nèi)室面涂膠原蛋白IV,備用；
c.先用質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋白酶消化原代培養(yǎng)9天的星形膠質(zhì)細(xì)胞，用星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸至密度為I X IO5個(gè)/ml,取100 μ I種植于的Transwell Insert的外室面，倒置于無菌容器中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，然后將TranswellInsert正置于24孔培養(yǎng)板中，外室與內(nèi)室都加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入37°C, 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，倒置培養(yǎng)及正置培養(yǎng)共2天；其次用質(zhì)量濃度為0.05%的胰蛋白酶消化原代培養(yǎng)5天的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，用毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸至密度為IXlO5個(gè)/ml，吸出Transwell Insert內(nèi)室中DMEM培養(yǎng)基，取200 μ I毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液種植于已生長(zhǎng)有大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的TranswelI Insert的內(nèi)室面,然后再將Transwell Insert正置于24孔培養(yǎng)板中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2天；最后將在24孔培養(yǎng)板中原代培養(yǎng) 6天的神經(jīng)元細(xì)胞的完全培養(yǎng)基更換為所述神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基，再將培養(yǎng)有毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的Tanswell Insert插入神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)I天。本發(fā)明是按照體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, E)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes, A)及神經(jīng)元細(xì)胞(neuron, N)的相對(duì)空間結(jié)構(gòu)，首次利用Transwell將來源于同一種屬動(dòng)物(包括大鼠、小鼠及人等各種高級(jí)動(dòng)物)同一部位的三種原代細(xì)胞進(jìn)行立體共培養(yǎng)，構(gòu)建原代同源EAN三細(xì)胞四維模型。本發(fā)明所采用的細(xì)胞來源于同一種屬同一部位，避免了不同種屬細(xì)胞來源所造成的差異性；本發(fā)明運(yùn)用原代細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，比細(xì)胞系更直接來源于機(jī)體組織，生物性狀尚未發(fā)生大的變化，在一定程度上更能夠準(zhǔn)確反映體內(nèi)的狀態(tài)；本發(fā)明最大限度地保留了三種基本細(xì)胞在體內(nèi)的整體關(guān)聯(lián)特性，可作為藥物靶點(diǎn)(疾病靶點(diǎn)、細(xì)胞靶點(diǎn)、分子靶點(diǎn)及其作用機(jī)制)、藥物效應(yīng)、藥物毒副作用、藥代動(dòng)力學(xué)等對(duì)比研究與評(píng)價(jià)的新細(xì)胞模型。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例EAN三細(xì)胞四維模型構(gòu)造示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例EAN三細(xì)胞四維模型構(gòu)建方法示意圖。圖3為單獨(dú)培養(yǎng)大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫熒光染色圖。
圖4為本發(fā)明實(shí)施例共培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫熒光染色圖。圖5為單獨(dú)培養(yǎng)與本發(fā)明實(shí)施例共培養(yǎng)大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)構(gòu)長(zhǎng)短軸比值示意圖。圖6為單獨(dú)培養(yǎng)大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色圖。圖7為本發(fā)明實(shí)施例共培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色圖。圖8為單獨(dú)培養(yǎng)與本發(fā)明實(shí)施例共培養(yǎng)大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的中心聚集面積比值示意圖。圖9為單獨(dú)培養(yǎng)與本發(fā)明實(shí)施例共培養(yǎng)大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的周圍投射面積比值示意圖。圖10為單獨(dú)培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光染色圖。圖11為本發(fā)明實(shí)施例共培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光染色圖。圖12為單獨(dú)培養(yǎng)與本發(fā)明實(shí)施例共培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度示意圖。圖13為本發(fā)明實(shí)施例EAN三細(xì)胞四維模型激光共聚焦3D重建后掃描圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型的構(gòu)建方法，是按如下步驟進(jìn)行:
a.分別提取SD大鼠大腦皮質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞并分別進(jìn)行原代培養(yǎng)；
具體操作如下:
al.提取SD大鼠大腦皮質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞(A)并進(jìn)行原代培養(yǎng)按照現(xiàn)有技術(shù)的方法提取一只24 h內(nèi)新生SD大鼠的大腦皮質(zhì)，用D-Hanks液漂洗皮質(zhì)組織3次，將大腦皮質(zhì)剪碎至Imm3左右的小塊，加入質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋白酶500μ I和D-Hanks 500 μ I放入37° C孵箱孵育30 min ；30 min后，用吸管小心的將組織塊移到盛有2 ml星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基的試管中，靜置2-3 min后，再將組織塊移到盛有2ml星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基的另一個(gè)試管中，進(jìn)行吹打；吹打結(jié)束后，靜止3 min左右后，用吸管輕輕吸取溶液上清，并用孔徑75 μ m的濾網(wǎng)過濾，收集濾液(SD大鼠大腦皮質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞液)到離心管中，定容至2 ml，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞密度，以2.5X IOVcm2的細(xì)胞密度接種到培養(yǎng)瓶中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；種植后第3天換星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基全液，此后每?jī)商鞊Q星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基全液一次；所述星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基的組分及體積百分比為87% DMEM、10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、1% HEPES及1%雙抗；
a2.提取SD大鼠大腦皮質(zhì)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(E)并進(jìn)行原代培養(yǎng)按照現(xiàn)有技術(shù)的方法提取一只6周齡SD大鼠的大腦皮質(zhì)，將皮質(zhì)放到盛有預(yù)冷BufferA的培養(yǎng)皿中，將所有的皮質(zhì)剪碎至Imm3左右的小塊,并移到15 ml離心管中，1500 rpm離心5 min ;去上清，加入10-15 ml的消`化酶，放入37°C培養(yǎng)箱中消化I h，消化期間，每10min輕輕搖動(dòng)一次；消化后用不同孔徑的滴管吹打，直到懸液呈奶黃色，再次1500 rpm離心5 min;去上清，用22% BSA溶液重懸沉淀，3000 rpm離心15 min，離心結(jié)束后，用滴管吸走液面上黃白色雜質(zhì)；再用Buffer A重懸沉淀，3000 rpm離心5 min;再次去上清，并加5 ml消化酶，放入37°C培養(yǎng)箱孵育2 h后，1500 rpm離心5 min后去上清，用I ml的Buffer A重懸沉淀,并將懸液輕輕地加到已經(jīng)做好的percoll梯度離心液中，1400 g,4°C,離心20 min ;可見明顯分層，將四層和五層之間的液體取出，并將液體倒入離心管中，加入10 ml的Buffer A, 1500 rpm離心5 min ;去上清，用加有嘌呤霉素的大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸沉淀并將細(xì)胞懸液(SD大鼠大腦皮質(zhì)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞液)種植于培養(yǎng)瓶中，嘌呤霉素的加入量為大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基體積的0.4%，第2天，將培養(yǎng)基換為大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基，之后每?jī)商鞊Q一次大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基全液；所述Buffer A和Buffer B按下列組分及體積百分比配制:Buffer A:10% 10 XD-Hanks,1% HEPES,1% 雙抗、1% NaHCO3>0.5% BSA、86.5% ddH20 ；Buffer B:10%10 XD-Hanks,1% HEPES,1% 雙抗、1% NaHCO3,87% ddH20 ;所述消化酶是在 Buffer B 中加Buffer B體積1%的膠原酶或分散酶、Buffer B體積0.1 % DNase和Buffer B體積0.1%的TLCK ;大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基的組分及體積百分比為:85% MCDB 131培養(yǎng)基、1%血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子ECGS、10%胎牛血清、1%雙抗、2%肝素、1% L-谷氨酰胺；a3.提取SD大鼠大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元細(xì)胞(N)并進(jìn)行原代培養(yǎng)按照現(xiàn)有技術(shù)的方法提取一只24 h內(nèi)新生SD大鼠的大腦皮質(zhì)，用D-Hanks液漂洗皮質(zhì)組織3次，將大腦皮質(zhì)剪碎至Imm3左右的小塊，加入質(zhì)量濃度0.25%的胰蛋白酶500 μ I和D-Hanks 500 μ I放入37° C孵箱孵育30 min ;用粗口吸管將組織塊移到盛有2 ml神經(jīng)元細(xì)胞種植培養(yǎng)基的試管中，輕輕吹打2-3次后，再將組織塊移到另一個(gè)盛有1.5 ml神經(jīng)元細(xì)胞種植培養(yǎng)基的試管中，靜止3 min左右后，吸組織到空管中吹打成懸液，直到大部分組織塊消失；用孔徑75 μ m的濾網(wǎng)過濾，收集過濾液(SD大鼠大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元細(xì)胞液)到離心管中，定容至2 ml，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞密度；以I X IO5個(gè)/ml細(xì)胞密度接種500口1到24孔板中，放入371:，5% CO2孵箱進(jìn)行培養(yǎng)；種植后第3天換成神經(jīng)元細(xì)胞完全培養(yǎng)基，每2天換神經(jīng)元細(xì)胞完全培養(yǎng)基一次，換液方式為半換液；所述神經(jīng)元細(xì)胞種植培養(yǎng)基的組分及體積百分比為:88% DNEM、10%胎牛血清、1%雙抗、1% L-谷氨酰胺；所述神經(jīng)元細(xì)胞完全培養(yǎng)基的組分 及體積百分比為:96%神經(jīng)元細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、2% B27、l%雙抗、1%L-谷氨酰胺。b.在Transwell Insert濾膜內(nèi)室面涂膠原蛋白IV (模擬E-A間隙基底膜),備用；c.先用質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋白酶消化原代培養(yǎng)9天的星形膠質(zhì)細(xì)胞，用星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸至密度為I X IO5個(gè)/ml,取100 μ I種植于的Transwell Insert的外室面，倒置于無菌容器中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，然后將TranswellInsert正置于24孔培養(yǎng)板中，外室與內(nèi)室都加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入37°C, 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，倒置培養(yǎng)及正置培養(yǎng)共2天；其次用質(zhì)量濃度為0.05%的胰蛋白酶消化原代培養(yǎng)5天的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，用毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸至密度為IXlO5個(gè)/ml，吸出Transwell Insert內(nèi)室中DMEM培養(yǎng)基，取200 μ I毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液種植于已生長(zhǎng)有大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的TranswelI Insert的內(nèi)室面,然后再將Transwell Insert正置于24孔培養(yǎng)板中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2天；最后將在24孔培養(yǎng)板中原代培養(yǎng)6天的神經(jīng)元細(xì)胞的完全培養(yǎng)基更換為所述神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基，再將培養(yǎng)有毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的Tanswell Insert插入神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)I天。具體操作方法如圖2所示:星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)第10天(已培養(yǎng)9天)，細(xì)胞鋪滿瓶底面積的80%后，吸走上清，加入2.5 ml星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基，擰緊培養(yǎng)瓶瓶口，并用封口膜密封。將盛培養(yǎng)瓶放置于氣浴搖床中，250 rpm，37°C過夜，然后吸去培養(yǎng)液，用D-Hanks液洗滌2次，加入質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋白酶I ml消化I min，在相差顯微鏡下可見細(xì)胞變圓，間隙變大，說明消化完全，吸出胰蛋白酶，加入星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，至細(xì)胞從瓶壁上脫落，收集細(xì)胞懸液，1500 rpm離心5 min。棄上清，加Iml星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基，吹打至細(xì)胞懸液。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞的接種密度為IX IO5個(gè)/ml，分別取100 μ I細(xì)胞液種植到備用的I μ m Transwell外室面及細(xì)胞爬片上，將Transwell Inser倒置于一體積合適的無菌容器中，放入37°C, 5% CO2孵箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁(1 2小時(shí)),然后將Transwell Insert按正常位置(正置)置于24孔培養(yǎng)板中，夕卜室與內(nèi)室都加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入37 V，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)46^47小時(shí)，即倒置培養(yǎng)及正置培養(yǎng)共2天。從星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)的第7天開始大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，當(dāng)原代培養(yǎng)5天后，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部。吸去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，并用D-Hanks液清洗，將質(zhì)量濃度為0.05%的胰蛋白酶作用于細(xì)胞的表面，室溫靜置1-2 min,同時(shí)在相差顯微鏡觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓，間隙增寬，說明消化充分，然后吸走胰蛋白酶，并加入大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基3 ml中止消化，同時(shí)用滴管吹打制成細(xì)胞懸液。然后1500 rpm離心5 min，棄上清，再加入I ml大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基，使細(xì)胞重懸，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至IXio5個(gè)/ml，吸出Transwell Insert內(nèi)室中DMEM培養(yǎng)基，分別取200 μ I毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液種植于已生長(zhǎng)有大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的Transwell Insert的內(nèi)室面及細(xì)胞爬片上，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2天；
從星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)的第8天開始大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)，當(dāng)原代培養(yǎng)6天，將培養(yǎng)有神經(jīng)元細(xì)胞的24孔板中神經(jīng)元細(xì)胞完全培養(yǎng)基更換為神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基，然后將大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的TanswelI Insert插入神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行三細(xì)胞四維共培養(yǎng)I天。即構(gòu)建了中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型，其構(gòu)造如圖1所示:在24孔培養(yǎng)板I的孔中有神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物2及神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基3，在神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基3中插有Transwell Insert 4,所述Transwell Insert4的濾膜內(nèi)室面涂有膠原蛋白IV 5,在Transwell Insert 4的內(nèi)室面有毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物6,在TranswellInsert 4的外室面有星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物7，所述星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物7的突起通過Transwell Insert 4的濾膜孔徑8穿向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物6。通過免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色方法對(duì)三種細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定分析，其中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定Marker為Glut-1 ;星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定Marker為GFAP ;神經(jīng)元細(xì)胞鑒定Marker 為 MAP-2。三個(gè)單細(xì)胞的熒光染色方法為:
(I)三個(gè)單細(xì)胞的細(xì)胞爬片均放入24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基及培養(yǎng)時(shí)間與共培養(yǎng)相同，將放有細(xì)胞爬片的24孔板從孵箱中取出，吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗爬片2次，每次I min。(2)用4%多聚甲醛固定20 min后，吸去4%多聚甲醛溶液，然后用PBS清洗細(xì)胞爬片3次，每次3 min，用封閉用羊血清溶液封閉細(xì)胞爬片，37°C，2 h。(3)2 h后，用 PBS稀釋的 1:1000兔抗大鼠Glut-1,1:1000兔抗大鼠GFAP及 1:1000小鼠抗大鼠MAP-2 —抗溶液分別孵育E、A、N三種單細(xì)胞爬片，4° C條件下，過夜。(4)用PBS清洗細(xì)胞爬片3次，每次4 min。(5)在避光條件下，加入用PBS稀釋的1:100羊抗兔TRITC標(biāo)記的IgG 二抗，常溫孵育I h后，加入Hochest33258溶液孵育10 min。(6)10 min后，避光條件下PBS清洗3次，每次3 min。然后用防淬滅封片劑封片。(7)在熒光顯微鏡下觀察。大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光染色圖分別如圖3、圖6及圖10所示。本發(fā)明構(gòu)建的EAN三細(xì)胞共培養(yǎng)四維模型中各細(xì)胞的熒光染色方法為:
Cl)對(duì)模型中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色時(shí)，先小心的將Transwell外室面的星形膠質(zhì)細(xì)胞用潤(rùn) 濕的棉簽擦掉，防止出現(xiàn)背景熒光。仔細(xì)的將半透膜從TranswellInsert上取下，開始對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，其方法與上述毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的熒光染色方法一樣，不再贅述。(2)對(duì)模型中星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色時(shí)，先小心的將Transwell內(nèi)室面的內(nèi)皮細(xì)胞用潤(rùn)濕的棉簽擦掉，防止出現(xiàn)背景突光。仔細(xì)的將半透膜從Transwell Insert上取下，開始對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，其方法與上述星形膠質(zhì)細(xì)胞的熒光染色方法一樣，不再贅述。(3)對(duì)模型中神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色時(shí)，小心的將培養(yǎng)孔中長(zhǎng)有神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞爬片取出，用預(yù)冷的PBS清洗后，進(jìn)行免疫熒光染色，其方法與上述神經(jīng)元細(xì)胞的突光染色方法一樣，不再贅述。本發(fā)明實(shí)施例的EAN三細(xì)胞共培養(yǎng)四維模型中的大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞鏡下圖分別如圖4、圖7及圖11所示。本實(shí)施例中原代同源EAN三細(xì)胞四維模型與單細(xì)胞培養(yǎng)條件下三種基本細(xì)胞的形態(tài)差異分別如圖5、圖8、圖9及圖12所示。如圖5所示:在四維模型系統(tǒng)中大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞Glut-1陽(yáng)性區(qū)的長(zhǎng)、短軸的比值明顯變大；如圖8、9所示:星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP陽(yáng)性結(jié)構(gòu)的中心聚集面積減小、周圍投射面積增大；如圖12所示:神經(jīng)元細(xì)胞樹突中MAP-2陽(yáng)性區(qū)長(zhǎng)度明顯變長(zhǎng)。如圖13所示，通過三維重建觀察發(fā)現(xiàn)在立體共培養(yǎng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起通過Insert的孔徑穿向大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞層。
權(quán)利要求
1.一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型，其特征在于:在24孔培養(yǎng)板(I)中有神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物(2)及神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基(3)，在神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基(3)中插有TranswelI 1]1861'1:(4),所述1'以118￥611 Insert(4)的濾膜內(nèi)室面涂有膠原蛋白IV (5),在Transwell Insert (4)的內(nèi)室面有毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物(6),在Transwell Insert (4)的外室面有星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(7)，所述星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(7)的突起通過TranswellInsert (4)的濾膜孔徑(8)穿向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物(6)，所述神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基(3)的組分及體積百分比如下:98%神經(jīng)元細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1%雙抗、1% L-谷氨酰胺。
2.一種如權(quán)利要求1所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型的構(gòu)建方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行: a.分別提取同一種屬同一部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞并分別進(jìn)行原代培養(yǎng)； b.在TranswellInsert濾膜內(nèi)室面涂膠原蛋白IV,備用； c.先用質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋白酶消化原代培養(yǎng)9天的星形膠質(zhì)細(xì)胞，用星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸至密度為I X IO5個(gè)/ml,取100 μ I種植于的Transwell Insert的外室面，倒置于無菌容器中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，然后將TranswellInsert正置于24孔培養(yǎng)板中，外室與內(nèi)室都加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入37°C, 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，倒置培養(yǎng)及正置培養(yǎng)共2天；其次用質(zhì)量濃度為0.05%的胰蛋白酶消化原代培養(yǎng)5天的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，用毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸至密度為IXlO5個(gè)/ml，吸出Transwell Insert內(nèi)室中DMEM培養(yǎng)基，取200 μ I毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液種植于已生長(zhǎng)有大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的TranswelI Insert的內(nèi)室面,然后再將Transwell Insert正置于24孔培養(yǎng)板中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2天；最后將在24孔培養(yǎng)板中原代培養(yǎng)6天的神經(jīng)元細(xì)胞的完全培養(yǎng)基更換為所述神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基，再將培養(yǎng)有毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的Tanswell Insert插入神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基中，放入37°C， 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)I天。
全文摘要
本發(fā)明公開一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型及構(gòu)建方法，中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型是在24孔培養(yǎng)板中有神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物及神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基，在神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基中插有TranswellInsert，所述TranswellInsert的濾膜內(nèi)室面涂有膠原蛋白Ⅳ，在TranswellInsert的內(nèi)室面有毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物，在TranswellInsert的外室面有星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，所述星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的突起通過TranswellInsert的濾膜孔徑穿向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物，所述神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基的組分及體積百分比如下98%神經(jīng)元細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1%雙抗、1%L-谷氨酰胺。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK103184188SQ201310065078
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者孫長(zhǎng)凱, 李彧媛, 鄭鐵錚, 范明, 趙慧 申請(qǐng)人:大連醫(yī)科大學(xué)