專利名稱：編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及ー種重組豬圓環(huán)病毒2型(PCV2) Cap蛋白的方法。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PWMS)的主要病原，它不但可以導(dǎo)致斷奶仔豬發(fā)生衰竭、死亡，還與仔豬A2型先天性震顫(All，CT)、懷孕母豬流產(chǎn)、成年豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)和呼吸道疾病綜合征(PRDS)密切相關(guān)。自1991年加拿大首次報(bào)道PMWS以來(lái)，該病現(xiàn)已波及世界各地，在我國(guó)豬群中流行十分嚴(yán)重，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。在2010年國(guó)際豬獸醫(yī)大會(huì)(IPVS)上，豬圓環(huán)病毒感染成為關(guān)注度最高的疾病，是全球公認(rèn)的危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)豬圓環(huán)病毒感染呈上升趨勢(shì)。PCV2含有兩個(gè)主要的開放閱讀框:0RF1和0RF2，ORFl編碼兩種復(fù)制酶蛋白，參與病毒復(fù)制；0RF2編碼核衣殼蛋白Cap，是病毒主要的免疫原性蛋白。McNeiUy等研究證實(shí)Cap蛋白免疫動(dòng)物可以產(chǎn)生病毒的中和抗體。0RF2基因已經(jīng)作為研制基因工程疫苗的重點(diǎn)對(duì)象。眾所周知，PCV2的檢測(cè)是防控PCV2相關(guān)疾病的重要組成部分。現(xiàn)行的PCV2檢測(cè)方法包括有PCR、免疫組化、原位雜交和ELISA技術(shù)等。ELISA技術(shù)具有高特異性、敏感性，操作簡(jiǎn)單、方便易行，便于大量樣品檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。Cap蛋白作為PCV2主要的免疫原性蛋白，可作為PCV2 ELISA檢測(cè)的診斷抗原。因此，獲得高純度的Cap蛋白是建立PCV2 ELISA檢測(cè)的關(guān)鍵。

但是，現(xiàn)有技術(shù)中Cap蛋白采用真核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量低，分離純化困難；而進(jìn)行原核表達(dá)則多以無(wú)活性的包涵體形式存在，所以Cap蛋白難以規(guī)?；a(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因，易于可溶性表達(dá)。本發(fā)明的另ー目的是提供含有上述基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的另一目的是提供含有上述基因的重組菌，目的蛋白的表達(dá)量高，表達(dá)產(chǎn)物易于純化。本發(fā)明的再一目的是提供含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物，該復(fù)合物具有良好的免疫原性，生產(chǎn)效率高，易于純化，制備方法簡(jiǎn)單，易于規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因，含有SEQ ID N0:1所示的序列。 還含有肽聚糖錨鉤PA蛋白的編碼基因。所述編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因序列如SEQ ID NO:3所示。ー種含有上述基因的重組表達(dá)載體。該重組表達(dá)載體是將所述基因插入pET_32a的Nde I和Xho I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間所得。
含有上述基因的重組菌。所述重組菌是將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21所得。ー種含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物，采用如下方法制備:培養(yǎng)所述重組菌，破碎后獲得裂解液上清，純化后獲得含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物。所述純化方法為:將乳酸乳球菌用酸煮沸后得到革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì)顆粒；將革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì)顆粒加入裂解液上清中進(jìn)行吸附，離心后取沉淀即得所述復(fù)合物。革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì)顆?？s寫為GEM顆粒。所述酸為鹽酸；革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì)顆粒的加入量為:含有0.5 2毫克蛋白的裂解液上清中加入2.5X IO9個(gè)革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì)顆粒。一種所述復(fù)合物在制備豬圓環(huán)病毒疫苗和豬圓環(huán)病毒診斷試劑盒方面的應(yīng)用。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)方法的有益效果:
1.本發(fā)明將豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白編碼基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，所以重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白能夠高產(chǎn)、高效、可溶表達(dá)，解決了 Cap蛋白在真核細(xì)胞中表達(dá)量低，在原核細(xì)胞中表達(dá)無(wú)活性的難題。由于大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)比較成熟，所以操作簡(jiǎn)單。2.本發(fā)明重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白含有肽聚糖錨鉤蛋白PA，可以與GEM顆粒相結(jié)合，有利于后續(xù)純化，生產(chǎn)成本低，易于規(guī)模化生產(chǎn)。3.本發(fā)明重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白活性良好，含有該重組蛋白的復(fù)合物免疫小鼠后可產(chǎn)生高水平的豬圓環(huán)病毒2型特異性抗體。因此，含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物可用于制備豬圓環(huán)病毒2型的診斷試劑盒及豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗。


圖1是肽聚糖錨鉤PA蛋白基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中M為DNA Marker, I為純水對(duì)照，2為肽聚糖錨鉤PA蛋白的基因擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2是重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果，其中M為DNA Marker,泳道I為質(zhì)粒PET_32a的雙酶切產(chǎn)物；2為陽(yáng)性重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物。圖3(A)和圖3(B)為重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的SDS-PAGE分析圖；其中M為蛋白相對(duì)分子量Marker ;圖3(A)中，泳道I和2均為誘導(dǎo)表達(dá)的重組表達(dá)菌株BL21_Cap_PA的裂解液上清；3為誘導(dǎo)表達(dá)的對(duì)照菌株的裂解液上清；圖3 (B)中，泳道I為未誘導(dǎo)表達(dá)的重組表達(dá)菌株BL21-Cap-PA全菌；泳道2為誘導(dǎo)表達(dá)的重組表達(dá)菌株BL21_Cap_PA全菌；泳道3為誘導(dǎo)表達(dá)的重組表達(dá)菌株BL21-Cap-PA裂解液上清；泳道4為誘導(dǎo)表達(dá)的重組表達(dá)菌株BL21-Cap-PA裂解液沉淀。圖4:重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的Western Blot鑒定結(jié)果，其中M為蛋白相對(duì)分子量Marker ；1為誘導(dǎo)表達(dá)的重組表達(dá)菌株BL21_Cap_PA裂解液上清；2為誘導(dǎo)表達(dá)的對(duì)照菌裂解液上清。圖5 (A)和圖5 (B)是乳酸乳球菌MG1363和GEM顆粒的透射電鏡圖，其中圖5 (A)為乳酸乳球菌MG1363，圖5 (B)為GEM顆粒。圖6是含重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物的SDS-PAGE電泳圖，其中M為蛋白相對(duì)分子量Marker，泳道I為含重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物，泳道2為GEM顆粒。圖7 (A)和圖7 (B)是GEM顆粒和含重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物的電鏡圖，其中圖7 (A)為GEM顆粒，圖7 (B)為含重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物。圖8是各組小鼠免疫后的血清抗體水平。
具體實(shí)施例方式 肽聚糖錨鉤PA蛋白是作為純化標(biāo)簽而設(shè)計(jì)的，可以處于重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的N端或C端，對(duì)其表達(dá)量、抗原性及疫苗免疫后抗體水平?jīng)]有影響。實(shí)施例1肽聚糖錨鉤PA蛋白、Cap蛋白基因片段及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 1.肽聚糖錨鉤PA蛋白基因片段的獲得
(I)引物設(shè)計(jì)
根據(jù)乳酸乳球菌MG1363的基因序列(U17696.1)，設(shè)計(jì)引物PAF (SEQ ID N0:4)和PAR(SEQ ID NO:5)，擴(kuò)增其肽聚糖錨鉤PA蛋白的基因片段。PAF 的序列為:5’ -ACTACTTATACCGTCAAATC-3’ ；
PAR 的序列為:5’ -TITTAITCGTAGATACTGAC-3’。(2) PCR擴(kuò)增目的片段
采用常規(guī)方法培養(yǎng)乳酸乳球菌MG1363，收獲菌體。采用RNAiso Plus (Takara)提取RNA，應(yīng)用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR反應(yīng)模板。反轉(zhuǎn)錄的體系及反應(yīng)程序:每份模板(3 4ug)加入隨機(jī)引物1W，11.75WRnase free H2O,低速瞬離，然后在70 °C條件下保溫IOmin ;再冰浴2min,低速瞬離，カロ入 2M-1 5 XM - MLV b uffer, 0.5M-1 dNTP Mix, 0.25M-1 RNase Inhibitor, 0.5M-1 ReverseTranscriptase,42°C, Ih ;接著70°C作用15min，冰浴后-20°C保存，作為cDNA模板備用。PCR 反應(yīng)體系為:引物 PAF、PAR (10pmol/L)各 ll^l，MgCl2 (25mmol/L)l.5m, dNTPs(2.5mmol/L) 2.0Pl，10 X PCR buffer 2.5^1，cDNA 模板 2.0Pl，Taq 酶(5UM ) 0.2^1，滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至25耵。PCR循環(huán)參數(shù):95°C預(yù)變性5min ;94°C 45s，54°C 45s, 72 °C 45s，進(jìn)行30次循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。對(duì)照中用純水替代cDNA。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定肽聚糖錨鉤PA蛋白的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。從圖1，可以看出擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為585bp?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，克隆到PMD18-T載體，進(jìn)行序列分析，肽聚糖錨鉤PA蛋白的基因序列如 SEQ ID N0:2 所示(585 bp)。反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)中所用試劑來(lái)源TAKARA。2.Cap蛋白基因片段的獲得
將PCV2 0RF2基因序列(GENEBANKii*:KC153106.1 )，截除N端41個(gè)氨基酸后進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，得到密碼子優(yōu)化的Cap蛋白基因片段，其序列如SEQ ID N0:1所示。在密碼子優(yōu)化的Cap蛋白基因片段5'端加CATATG，在3'端加上CTCGAG，(設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)，利用后續(xù)的連接和酶切)，交由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。3.重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
將肽聚糖錨鉤PA蛋白的基因與密碼子優(yōu)化的Cap蛋白編碼基因的3'端相連，得到重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因，其序列如SEQ ID N0:3所示。具體方法為:將肽聚糖錨鉤PA蛋白的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與本實(shí)施例標(biāo)題2中合成的片段經(jīng)T4 DNA連接酶連接，得到連接產(chǎn)物I。用Nde 1、Xho I對(duì)連接產(chǎn)物I和pET_32a進(jìn)行雙酶切并進(jìn)行連接。雙酶切體系:IOXH buffer 3^1,
Nde IIMl,
xho Im,
pET-32a或連接產(chǎn)物I8耵，
dH20補(bǔ)足體積至30M1。將雙酶切反應(yīng)體系在37°C條件下作用4h，然后用瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。連接體系:
10XT4 ligase buffer 2.5M-1,pET-32a雙酶切片段4 W，
連接產(chǎn)物I雙酶切片斷12.5W，
T4 DNA ligase1M-1,
dH20補(bǔ)足體積至25M1。將連接體系在16°C條件下連接過(guò)夜，得到連接產(chǎn)物2。將連接產(chǎn)物2轉(zhuǎn)染E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)Nde I /Xho I雙酶切鑒定，電泳后獲得圖2。從圖2可以看出，陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，獲得5366bp和1182bp兩條目的條帶。陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序正確后，命名為pET-32a-Cap-PA。實(shí)施例2重組表達(dá)菌株BL21-Cap-PA的構(gòu)建
1.將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)
將實(shí)施例1獲得的pET-32a-Cap-PA轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組表達(dá)菌株BL21-Cap-PA。將空質(zhì)粒pET_32a按照相同的方法轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，得到對(duì)照菌株。2.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
(I)分別挑取重組表達(dá)菌株BL21-Cap-PA和對(duì)照菌株的單菌落，接種于含有氨芐青霉素(100^g/mL)的液體LB培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。(2)取上述培養(yǎng)好的菌液IOW接種于4ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm條件下振搖培養(yǎng)約3h，使0D_達(dá)到0.6 0.8。(3)向上述菌液中加入終濃度為0.1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時(shí)間為24h。(4)將誘導(dǎo)表達(dá)后的發(fā)酵液在4°C、600(te 條件下離心5min，收集菌體；將菌體用PBS緩沖液(pH 7.2)洗滌2次后進(jìn)行重懸。(5)將菌體置于冰浴中，用超聲波裂解菌體，功率為200W，超聲裂解5s，停頓5s，直至菌液澄清。(6)將超聲裂解后的菌體， 在4°C、1200(te 條件下離心lOmin，分別收集裂解液上清和裂解液沉淀。將裂解液沉淀用與上清等體積的PBS緩沖液重懸。
3.SDS-PAGE電泳分析
為了分析重組表達(dá)菌株BL21-Cap-PA和對(duì)照菌株的目的蛋白表達(dá)水平，分別取其裂解液上清和沉淀各IOOW，加入6X蛋白上樣Buffer，充分混勻后95°C變性5min，上樣前瞬時(shí)離心，吸取上清點(diǎn)樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。從圖3 (A)可以看出，與誘導(dǎo)表達(dá)的對(duì)照菌裂解液上清相比，誘導(dǎo)表達(dá)的重組表達(dá)菌株BL21-Cap-PA裂解液上清在46kDa處有一條明顯的條帶。從圖3 (B)可以看出，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，重組表達(dá)菌株BL21-Cap-PA表達(dá)了大量的目的蛋白；目的蛋白中有一半實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)。實(shí)施例3重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的抗原性鑒定
1.將誘導(dǎo)培養(yǎng)的BL21-Cap-PA和對(duì)照菌的裂解液上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳；
2.轉(zhuǎn)印=SDS-PAGE電泳完畢后，采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白印跡轉(zhuǎn)至PVDF膜；
3.將PVDF膜用含有5%脫脂乳的PBST封閉液封閉，置于室溫條件下40min；
4.將封閉后的PVDF膜浸入1:200稀釋的豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性血清(購(gòu)自VeterinaryMedical Research & Development,美國(guó))，4°C 鮮育過(guò)夜；
5.用PBST緩沖液洗滌PVDF膜5次，5min/次；
6.將PVDF膜浸入1:10000稀釋的羊抗豬IgG-HRP (南京生興生物技術(shù)有限公司)，室溫孵育Ih ；
7.用PBST緩沖液洗滌PVDF膜5次，5min/次；
8.用DAB染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)顯色,結(jié)果見圖4。WesternBlot結(jié)果表明，表達(dá)的重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白可以與豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性血清反應(yīng)，具有良好的抗原性。實(shí)施例4重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白大量表達(dá)及其復(fù)合物的制備
1.重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白大量表達(dá)
按實(shí)施例2中誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)表達(dá)BL21-Cap-PA 200ml，離心收集菌體，加入50ml PBS緩沖液重懸菌體沉淀，超聲裂解后離心，收集裂解液上清。2.GEM顆粒的制備
(1)在厭氧條件下培養(yǎng)乳酸乳球菌MG1363，培養(yǎng)基為添加0.5%葡萄糖的GM17培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為16 18小時(shí)。(2)離心收集菌體:將發(fā)酵液在4000 g條件下離心5min，取菌體，用蒸餾水洗滌I次。(3)將乳酸乳球菌MG1363用原培養(yǎng)體積1/5的pH 1.0的鹽酸重懸菌體，煮沸30min,離心取沉淀即得到GEM顆粒。(4)用PBS (pH 7.2)洗滌GEM顆粒3次后重懸，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以IOU的濃度分裝(1U=2.5*109 個(gè)/ml)，_70°C保存?zhèn)溆?。將乳酸乳球菌MG1363和GEM顆粒分別用2.5%的戊ニ醛固定，用透射電鏡觀察鑒定GEM顆粒，如圖5 (A)和圖5 (B)所示。從圖5 (A)可見，乳酸乳球菌MG1363核區(qū)內(nèi)有核酸；從圖5 (B)可見，GEM顆粒的細(xì)胞質(zhì)為均質(zhì)，原有核區(qū)內(nèi)的核酸和蛋白已經(jīng)被去除。3.制備含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物
向誘導(dǎo)表達(dá)的BL21-Cap-PA裂解液上清中加入GEM顆粒，加入的量按照含有Img蛋白的裂解液上清中加入2.5X IO9個(gè)GEM顆粒。室溫孵育30min，在12000ダ條件下離心IOmin后收集沉淀，得到含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物。將該復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，復(fù)合物泳道上有一條46kDa的條帶，說(shuō)明復(fù)合物中含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白。將含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物適當(dāng)稀釋后，應(yīng)用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)測(cè)定蛋白濃度，_4°C或-20°C保存?zhèn)溆?。該重組Cap蛋白表達(dá)量 1.5g/L。GEM顆粒實(shí)際上是肽聚糖組成的外殼，所以含有肽聚糖錨鉤PA蛋白的重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白能夠結(jié)合在GEM顆粒的表面。4.電鏡觀察含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物
將GEM顆粒和含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物，分別用2.5%的戊ニ醛固定后，用透射電鏡觀察，結(jié)果如圖7 (A)和圖7 (B)。從這兩幅圖可以看出，GEM顆粒表面可以結(jié)合大量的含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物。實(shí)施例5重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的小鼠免疫試驗(yàn)
將含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物，用PBS緩沖液(pH=7.2^7.4)配制成蛋白濃度為0.5mg/mL的復(fù)合 物溶液，其中GEM顆粒的濃度為1.25 X IO9個(gè)/mL。配制GEM顆粒溶液，該溶液中GEM顆粒含量與復(fù)合物溶液相同。將復(fù)合物溶液和GEM顆粒溶液分別與鋁膠佐劑等體積混合，乳化后得到復(fù)合物疫苗和GEM顆粒對(duì)照疫苗。選取5周齡清潔級(jí)ICR小鼠30只，隨機(jī)分成3組，10只/組。第一組，免疫復(fù)合物疫苗；第二組，免疫GEM顆粒對(duì)照疫苗；第三組:不免作為空白對(duì)照組。免疫方法:每只小鼠，在背部皮下多點(diǎn)注射0.2mL疫苗。免疫后21天，將每只小鼠眼球采血分離血清，用豬圓環(huán)病毒2型ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢科前生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)血清抗體水平。檢測(cè)時(shí)，將試劑盒中的羊抗豬IgG-HRP替換為1:10000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP (南京生興生物技術(shù)有限公司)。計(jì)算各組小鼠的平均血清抗體水平，具體結(jié)果見圖8。從圖8可以看出，與對(duì)照組和免疫GEM顆粒對(duì)照疫苗的小鼠相比，含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物可以顯著誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的特異性抗體0° <0.01)。因此，該復(fù)合物可以用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型，或者用于制備豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗。
權(quán)利要求
1.編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因，其特征在于:含有SEQID N0:1所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因，其特征在于:還含有肽聚糖錨鉤PA蛋白的編碼基因。
3.根據(jù) 權(quán)利要求2所述編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因，其特征在于:其序列如SEQ ID NO:3所示。
4.ー種含有權(quán)利要求1-3之一所述基因的重組表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體，其特征在于:該重組表達(dá)載體是將所述基因插入pET_32a的Nde I和Xho I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間所得。
6.含有權(quán)利要求1-3之一所述基因的重組菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述重組菌，其特征在于:所述重組菌是將權(quán)利要求5所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21所得。
8.ー種含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物，其特征在于采用如下方法制備:培養(yǎng)權(quán)利要求7所述重組菌，破碎后獲得裂解液上清，純化后獲得含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物，其特征在于所述純化方法為:將乳酸乳球菌用酸煮沸后得到革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì)顆粒；將革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì)顆粒加入裂解液上清中進(jìn)行吸附，離心后取沉淀即得所述復(fù)合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物，其特征在于所述酸為鹽酸；革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì)顆粒的加入量為:含有0.5 2毫克蛋白的裂解液上清中加入2.5X IO9個(gè)革蘭氏陽(yáng)性增強(qiáng)基質(zhì)顆粒。
11.一種權(quán)利要求8所述復(fù)合物在制備豬圓環(huán)病毒疫苗和豬圓環(huán)病毒診斷試劑盒方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。編碼重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的基因，含有SEQ ID NO:1所示的序列。本發(fā)明還提供含有上述基因的重組表達(dá)載體，含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物。該復(fù)合物制備方法為培養(yǎng)重組菌，破碎獲得裂解液上清，純化后獲得含有重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的復(fù)合物。本發(fā)明將Cap蛋白編碼基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，所以重組Cap蛋白能夠高產(chǎn)、高效、可溶表達(dá)；由于上述復(fù)合物含有肽聚糖錨鉤蛋白PA，有利于后續(xù)純化。本發(fā)明重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白活性良好，含有該重組蛋白的復(fù)合物免疫小鼠后可產(chǎn)生高水平的豬圓環(huán)病毒2型特異性抗體。
文檔編號(hào)C12P21/02GK103103205SQ20131006518
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者李鵬成, 鄭其升, 喬緒穩(wěn), 陳瑾, 侯繼波 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院