專利名稱：一種區(qū)分大白菜eIF4E.c兩種新單倍型的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)基因的兩種不同單倍型及其相關(guān)位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記的開發(fā)，尤其涉及一種大白菜真核生物翻譯起始因子4E.c的兩種單倍型突變及其位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記開發(fā)和應(yīng)用。兩種單倍型能夠?yàn)檫x育含該位點(diǎn)的抗病毒大白菜種質(zhì)提供變異源，位點(diǎn)特異分子標(biāo)記能夠直接應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種來選擇含有該單倍型位點(diǎn)的大白菜材料，提高選擇效率，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大白菜(Brassica rapaL.ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物,原產(chǎn)于中國，目前在世界各地均有種植。尤其在我國蔬菜的常年供應(yīng)和淡季蔬菜調(diào)劑中已經(jīng)成為蔬菜產(chǎn)品供給的重要組成部分，因而對(duì)人們生活具有重要影響。我國大白菜生產(chǎn)常見病害有病毒病、霜霉病和軟腐病，其中病毒病的危害最為嚴(yán)重，且沒有普遍適用的抗病毒病藥劑或其它行之有效的控制技術(shù)。培育抗病毒大白菜新品種是應(yīng)對(duì)病毒病危害的首選途徑[王雪，劉玉梅，李漢霞，張揚(yáng)勇，方智遠(yuǎn).蕓薹屬作物抗蕪菁花葉病毒育種研究進(jìn)展.園藝學(xué)報(bào).2005，32 (5): 939-946]。苗立強(qiáng)等[苗立強(qiáng)，張耀偉，崔崇士.我國白菜抗病育種研究進(jìn)展.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2008，37 (4):529-533]研究發(fā)現(xiàn)，我國大白菜病毒病的病原分離物中70%是蕪菁花葉病毒(Turnip Mosaic Virus, TuMV)、還有少量黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV)和其它病毒。因此我國大白菜抗病毒病育種的主攻目標(biāo)是抗 TuMV。培育抗TuMV大白菜新品種的兩個(gè)關(guān)鍵要素是擁有豐富的抗TuMV種質(zhì)資源和高效的育種效率。我國是大白菜原產(chǎn)地，種質(zhì)資源非常豐富，其中不乏抗TuMV的優(yōu)良資源，同時(shí)也有更多品質(zhì)優(yōu)良但不抗病毒的資源。在常規(guī)育種實(shí)踐中，常通過回交轉(zhuǎn)育的手段獲得更多遺傳背景豐富的抗性材料。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的興起及研究的深入，標(biāo)記輔助選擇在常規(guī)育種操作中已經(jīng)成為提高選擇效率、縮短育種年限的主要手段。一些跨國的育種集團(tuán)更是不惜重金把創(chuàng)新資源和開發(fā)與重要農(nóng)藝性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記作為育種攻關(guān)的主要內(nèi)容。一般而言，要尋找與某農(nóng)藝性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，往往需要先選擇在目標(biāo)性狀方面存在顯著差異的親本，并構(gòu)建分離群體$2，1 1，8(:1，011等)，采用混合分群(BSA)和傳統(tǒng)的分子標(biāo)記(如RAPD，SRAP，AFL P，SSR等)技術(shù)進(jìn)行分析，用相應(yīng)的軟件分析所得標(biāo)記與性狀的連鎖距離，最終得到與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記。目前報(bào)道的與大白菜抗蕪菁花葉病毒(TuMV)性狀連鎖的分子標(biāo)記正是采用上述方法得到的。由于不同研究者所用材料和所選擇的標(biāo)記類型不同，所得到的與抗病毒特性連鎖的標(biāo)記距離亦不同，介于
3.8-15.36cM。由于這些標(biāo)記與性狀的連鎖程度不夠緊密，因而其用于大白菜抗TuMV輔助育種尚有一定的距離。另一方面，由于擬南芥與大白菜同屬十字花科，其抗病毒相關(guān)功能基因已有較深入的研究；同時(shí)大白菜的全基因組序列已經(jīng)公布(Wang et al.，2011，the genome ofthemesopolyploid crop species Brassica rapa.Nature Genetics.43(10):1035-1039)。所以可以將擬南芥功能基因研究的結(jié)果和大白菜基因組序列信息相結(jié)合，直接從抗病毒相關(guān)功能基因的角度入手，通過對(duì)大白菜自然群體在某一個(gè)重要功能基因位點(diǎn)的自然變異入手，尋找抗病毒相關(guān)功能基因的突變體；針對(duì)突變位點(diǎn)開發(fā)位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記(Allelespecific marker, ASM)，則這種標(biāo)記本身與性狀直接相關(guān)，這無疑會(huì)使標(biāo)記輔助選擇更加精準(zhǔn)。近年來在抗病毒功能基因研究方面發(fā)現(xiàn)，由隱性單基因控制的抗病毒性狀多與真核生物翻譯起始因子4E及其異構(gòu)體(iso4E)的突變有關(guān)。Wittmann等[WittmannS，Chatel H，F(xiàn)ortin MG，Laliberte JF.1nteraction of the viral protein genomelinked of Turnip mosaic virus with the translational eukaryotic initiationfactor(iso)4E of Arabidopsis thaliana using the yeast two-hybrid system.Virology.1997，234:84-92]和 L6onard等[L6onard S，Plante D, Wittmann S，DaigneaultN，F(xiàn)ortin MG，Laliberte JF.Complex formation between potyvirus VPg andtranslation eukaryotic initiation factor4E correlates with virus infectivity.J.Virol.2000，74:7730-7737]分別證明:擬南芥 eIF4E 和 eIF(iso)4E 可以同 TuMV 的病毒基因組結(jié)合蛋白(VPg)相互作用。這種相互作用的關(guān)鍵氨基酸與真核生物自身mRNA翻譯所需的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)不同，所以eIF4E及eIF(iso)4E的一些氨基酸突變不影響植物自身的生長發(fā)育、卻導(dǎo)致病毒與寄主不能發(fā)生互作，從而使寄主表現(xiàn)出抵抗病毒侵染的特性。Ryder 在生菜[Ryder EJ.1970.1nheritance of resistance tocommon lettuce mosaic.Am Soc Horticult Sc1.95:378379]、Ruffel 在辣椒[Ruffel S,DussaultMHj PalloixA, Moury B，Bendahmane A，Robaglia C，Caranta C.2002.A natural recessiveresistancegene against potato virus Y in peper corresponds to the eukaryotic initiationfactor4E(eIF4E).Plant J.2002Dec;32(6):1067-75]、Nieto 在甜瓜[Nieto C，PironF，Dalmais M，Marco C F， Moriones E,Gomez-Guillamon ML,Truniger V, Gomez P，Garcia-Mas J，Aranda MAj Bendahmane A.2007.EcoTILLING for the identification ofallelic variants of melon eIF4E，afactor that controls virus susceptibility.BMCPlant Biology.7，34-42]等重要蔬菜作用中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少這樣的突變體資源，Yeam等[Yeam I，Kang BCj Lindeman W, Frantz JDj Faber N，andjahn MM.2005.Allele-specificCAPS markers based on point mutations in resistance alleles at thepvrllocusencoding eIF4E in Capsicum.Theor.Appl.Genet.NN0，178-186]在辣椒中針對(duì)突變位點(diǎn)開發(fā)了相應(yīng)的位點(diǎn)特異性CAPs標(biāo)記并用于抗病毒材料轉(zhuǎn)育時(shí)的輔助選擇。我國大白菜種質(zhì)資源十分豐富，從其他作物的eIF4E和eIF(iso)4E突變及其在抗病毒中的作用推測(cè)，大白菜自然群體中也可能存在eIF4E和eIF(iso)4E的突變體，且這種突變可能與大白菜的抗病毒特性有關(guān)。目前，國內(nèi)外有關(guān)大白菜抗病毒特性與eIF4E和eIF(iso)4E關(guān)系的研究很少，涉及的材料極為有限。Rusholme等[Rusholme RL,Higgins EE, Walsh JA, Lydiate DJ.Genetic control of broad-spectrum resistanceto turnip mosaic virus in Brassica rapa (Chinese cabbage).Journal ofGeneralVirology.2007, 88:3177 - 3186]以高抗TuMV的大白菜自交系RLR22和病毒敏感材料R-O-18為親本，構(gòu)建BClFl群體，進(jìn)行抗TuMV(⑶NI和CZEl株系)遺傳研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)大白菜抗病毒隱性遺傳位點(diǎn)retrOl和一個(gè)顯性位點(diǎn)ConTROl，RFLP標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析分別發(fā)現(xiàn)了與retrOl連鎖的標(biāo)記pN202el和與ConTROl連鎖的標(biāo)記p085el。進(jìn)一步采用southern雜交的手段發(fā)現(xiàn)，在A基因組中分別有3個(gè)拷貝的eIF4E(分別位于染色體N1、N3和N8)和3個(gè)拷貝的eIF(iso)4E(分別位于染色體N4、N5和N8)。作者根據(jù)雜交結(jié)果，推測(cè)位于第8染色體上的eIF4E和eIF(iso)4E可能與ConTROl有關(guān)，而位于第4染色體上的eIF(iso)4E可能與retrOl有關(guān)。文中沒有關(guān)于兩個(gè)基因的序列信息報(bào)道。Jenner 等[Jenner CE, Nellist CF, Barker GC, Walsh JA.Turnip mosaic virus (TuMV)is able touse alleles ofboth eIF4E and eIF(iso)4E from multiple loci of thediploid Brassica rapa.Mol Plant Microbe Interact.2010,3(11):1498-1505]從病毒敏感材料R-0-18中克隆得到了 eIF4E和eIF (iso) 4E各三個(gè)拷貝，分別命名為BraA.eIF4E.a> BraA.eIF4E.b> BraA.eIF4E.c 和 BraA.eIF (iso) 4E.a> BraA.eIF (iso) 4E.b> BraA.eIF(iso)4E.c。除 BraA.eIF4E.b 和 BraA.eIF(iso)4E.b 以外，其余 4 個(gè)基因分別轉(zhuǎn)化擬南芥 At.eIF (iso) 4E 功能缺失突變體[DupratA, Caranta C，Revers F, Menand B, BrowningKS,Robaglia C.2002.The Arabidopsis eukaryotic initiation factor (iso)4E isdispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses.The Plant Journal, 32:927 - 934]，然后對(duì)所有轉(zhuǎn)基因株系接種TuMV加拿大株系⑶NI，進(jìn)行病毒敏感性互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)病情指數(shù)及ELISA結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所轉(zhuǎn)的四個(gè)基因均能使突變體完全或部分恢復(fù)對(duì)TuMV侵染的敏感性。這表明，在TuMV侵染白菜類蔬菜作物時(shí)，eIF4E和eIF(is0)4E都可能參與病毒與寄主的相互作用。同時(shí)作者指出，要想在大白菜中獲得與eIF4E和eIF (iso) 4E有關(guān)的抗病毒材料，則這幾個(gè)基因需同時(shí)喪失功能。截止目前，大白菜在上述兩個(gè)基因位點(diǎn)的突變及相關(guān)突變體檢測(cè)的標(biāo)記開發(fā)國內(nèi)外未見報(bào)道。鑒于此，有必要對(duì)我國豐富的大白菜抗/感TuMV材料中eIF4E和eIF(iso)4E各個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行廣泛篩查，以發(fā)現(xiàn)各位點(diǎn)可能存在的突變類型；同時(shí)針對(duì)突變位點(diǎn)與野生型的序列差異，開發(fā)與突變體檢測(cè)有關(guān)的位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記。有以下幾個(gè)方面的潛在益處:①可以將該標(biāo)記用于篩查大白菜種群，提供高效的大白菜突變體檢測(cè)手段；②當(dāng)其他位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變類型時(shí)，可以采用同樣的方法開發(fā)標(biāo)記；③當(dāng)多個(gè)位點(diǎn)的突變位于不同的材料中時(shí)，可以通過標(biāo)記輔助選擇手段將多位點(diǎn)突變聚合在一起，創(chuàng)造廣譜抗TuMV大白菜新種質(zhì)在培育廣譜抗TuMV大白菜新品種時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇，提高育種效率。由于這種標(biāo)記直接位于功能基因內(nèi)部，因此選擇的準(zhǔn)確率達(dá)100%。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，針對(duì)目前大白菜在eIF4E和eIF (iso) 4E基因位點(diǎn)突變體鑒定方面的空白，本發(fā)明首先獲得了 eIF4E.c位點(diǎn)的兩種新的單倍型，其次根據(jù)兩種單倍型的序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，開發(fā)了區(qū)分兩種單倍型的ASM共顯性標(biāo)記并用于標(biāo)記輔助選擇。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種區(qū)分大白菜eIF4E.c兩種單倍 型的共顯性ASM標(biāo)記:與抗性材料中eIF4E.c單倍型Haplr檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-R，片段大小187bp，如SEQ ID N0.1所示；與高感材料中eIF4E.c單倍型Haps檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-S，片段大小193bp，SEQ ID N0.2所示。

一種用于鑒別上述位點(diǎn)特異性共顯性分子標(biāo)記的引物是:正向引物Fdl:5’ -GGAGGCAAGTTTTGACAATGGCGG-3’ ；正向引物Fd2:5’ -TGTTCTTTCTTCGTGGGTTAAG-3’反向引物Rdl:5’ -TCAAGCGGTGTAAGCGCTCTTCGC-3'，反向引物Rd2:5’ -CAAAAAGAACATAACTTTCCT-3’ ；如SEQ ID N0.3、4、5、6 所示。本發(fā)明采用同源克隆技術(shù)從2份大白菜自交系材料Hel02(抗TuMV)和06_247(高感TuMV)中分別克隆到了 eIF4E.c基因全序列，將2個(gè)序列與GenBank中已經(jīng)報(bào)道的B.rapa自交系R-0-18的eIF4E.c比較后發(fā)現(xiàn)，二者均在內(nèi)含子處有小片段缺失，ORF預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)二者編碼的蛋白質(zhì)序列也同R-0-18中的不完全相同，存在多個(gè)氨基酸替換突變。我們將來自抗病毒材料Hel02中的eIF4E.c單倍型稱為Haplr,將來自病毒敏感材料06-247中的eIF4E.c單倍型稱為Haps，為了便于在聚丙烯酰胺凝膠上區(qū)分兩種單倍型，為以后分子標(biāo)記輔助選擇提供便利，我們采用了巢式PCR技術(shù)，首先在基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)了外側(cè)引物Fdl和Rdl，在兩份材料中進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，在內(nèi)側(cè)的小片段插入/缺失兩側(cè)相對(duì)保守區(qū)設(shè)計(jì)巢式引物Fd2和Rd2，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，結(jié)果在抗性材料中擴(kuò)增到187bp的片段，在感性材料中擴(kuò)增得到193bp的片段。為了驗(yàn)證該標(biāo)記的可用性，我們用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增了( He 102 X 06-247 ) X 06-247的回交群體，結(jié)果表明該標(biāo)記對(duì)純合Haplr、Haps以及雜合型鑒別的準(zhǔn)確率達(dá)100%。所述ASM標(biāo)記的篩選過程如下:(I)以大白菜抗TuMV自交系Hel02與06-247為材料，采用CTAB法，提取兩者的基因組DNA。(2)依據(jù)GenBank中已經(jīng)報(bào)道的B.rapa自交系R-0-18的eIF4E.c序列，在編碼區(qū)上下游設(shè)計(jì)引物。采用同源克隆技術(shù)，從中克隆得到了其eIF4E.c并進(jìn)行測(cè)序，得到了其基因組全序列。(3)將兩者的eIF4E.c與R-0-18的eIF4E.c序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了多處SNPs和小片段插入/缺失(InDels)。進(jìn)一步利用NCBI splign工具分析外顯子時(shí)發(fā)現(xiàn)，二者編碼產(chǎn)物的氨基酸順序與R-0-18的編碼產(chǎn)物不完全一致，Hel02的eIF4E.c存在兩個(gè)氨基酸替換，分別是Argl05-Lys, Lys201_Arg,用Haplr表示；06_247的eIF4E.c存在三個(gè)氨基酸替換,分別是Ala35-Val, Gly45_Thr, Argl05_Lys,用Haps表示。在這兩種單倍型中，小片段插入/缺失(InDels)在I 一 5bp之間，為了便于在聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)該差異，我們采用了巢式PCR策略，首先根據(jù)兩種單倍型的序列，在兩者InDels處上下游較遠(yuǎn)區(qū)域的基因組保守區(qū)設(shè)計(jì)外側(cè)引物Fdl和Rdl，以基因組DNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；在緊鄰InDels處相對(duì)保守區(qū)設(shè)計(jì)內(nèi)側(cè)引物Fd2和Rd2，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物小于200bp，便于在聚丙烯酰胺凝膠上分離。兩組引物同時(shí)在Haplr和Haps中擴(kuò)出不同的產(chǎn)物，此即為共顯性標(biāo)記。所述標(biāo)記可以作為分子標(biāo)記應(yīng)用于大白菜種質(zhì)資源鑒定和育種輔助選育，選擇含有Hel02中Haplr單倍型的種質(zhì)材料或轉(zhuǎn)育后代。具體應(yīng)用方式為:利用ASM標(biāo)記的兩個(gè)引物對(duì)待測(cè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增片段的大小，如果擴(kuò)增產(chǎn)物為187bp，則為單倍型Hap'如果擴(kuò)增產(chǎn)物為193bp，即為單倍型Haps ;如果擴(kuò)增出上述兩條帶，則為雜合型。本發(fā)明的有益效果是:由于大白菜eIF4E位點(diǎn)上受多個(gè)基因的控制，在同一份材料中多基因同時(shí)突變的頻率較低。如果能夠分別在各個(gè)位點(diǎn)鑒定出各自的抗/感單倍型，開發(fā)針對(duì)各種單倍型的位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記，則可以通過聚合雜交并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將多個(gè)突變位點(diǎn)聚合在同一份材料中。本發(fā)明利用同源克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)了 eIF4E.c位點(diǎn)的兩種新的單倍型并開發(fā)了鑒定這兩者的分子標(biāo)記。利用該標(biāo)記可以對(duì)回交后代的基因型進(jìn)行準(zhǔn)確選擇。同時(shí)該標(biāo)記還可用于對(duì)大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行篩查，以尋找遺傳背景更加豐富的突變體材料。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)具體如下:1.本發(fā)明獲得的與eIF4E.c兩種單倍型直接相關(guān)的標(biāo)記，結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確、操作簡便。適用于不同遺傳背景大白菜材料的篩選，是一個(gè)普遍性標(biāo)記。它能夠準(zhǔn)確鑒定大白菜種質(zhì)資源在該位點(diǎn)的基因型，極 大地提高了對(duì)大白菜種質(zhì)資源在eIF4E.c位點(diǎn)單倍型的篩選效率。2.在大白菜eIF4E基因序列及單倍型研究方面，僅Jenner等(2010)報(bào)道了B.rapa的一個(gè)自交系R-0-18的序列，其它單倍型未見報(bào)道。針對(duì)兩種新的單倍型的特異標(biāo)記，可以為種質(zhì)資源鑒定、通過回交轉(zhuǎn)育等手段篩選和培育不同遺傳背景的抗病毒材料提供輔助選擇工具。本發(fā)明的應(yīng)用可大大簡化篩選手段、縮短轉(zhuǎn)育年限，避免了常規(guī)育種方法中選擇的盲目性。


圖1:基因組特異引物在Hel02和06-247中的擴(kuò)增結(jié)果，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖2:來自 Hel02 和 06-247 以及 GenBank 檢索到的 R-O-18 的 eIF (iso) 4E.a 基因組序列比對(duì)。圖3 =ASM標(biāo)記的開發(fā)及標(biāo)記所述引物在Hel02和06-247中的擴(kuò)增結(jié)果。圖4:開發(fā)的ASM標(biāo)記在(Hel02X06-247) X06-247回叫群體中對(duì)部分單株的鑒定結(jié)果，根據(jù)擴(kuò)增片段判斷，圖中11、12、21、22是親本Pl即06-247中的單倍型，2、4、5、6、14、18是親本P2即Hel02中的單倍型，其余是雜合性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、不同大白菜自交系材料中eIF4E.c的克隆1.1大白菜基因組DNA提取(I)將大白菜幼苗葉片放入液氮預(yù)冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；(2)待液氮揮發(fā)干，立即轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中，每IOOmg材料約加入0.6ml預(yù)熱至65°C的CTAB提取液，融化后，劇烈振蕩混勻樣品，65°C水浴放置40-60分鐘使細(xì)胞裂解；(3)裂解結(jié)束后，取出樣品使其完全冷卻至室溫。加入等體積的氯仿(chloroform),輕輕顛倒使混勻，室溫放置10分鐘；(4)室溫，12000rpm 離心 15 分鐘；(5)用移液器小心吸出上層水相，加入新的1.5ml的離心管中，加入500 ii I的異丙醇(按1:1體積比例)，充分混勻，室溫沉淀IOmin ；(6)在4°C, 12000rpm離心IOmin,小心棄去上清液；(7) DNA沉淀用Iml的75%乙醇洗滌。4°C，8000rpm離心IOmin收集沉淀；(8)重復(fù)用75%乙醇洗滌一次DNA沉淀；(9)去上清，DNA沉淀于無菌操作臺(tái)上晾干約10_15分鐘，DNA略顯透明，加入適當(dāng)體積(30-50 yl)的IOmM的Tris.HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，pH8.0使沉淀溶解(可放于4°C冰箱溶解過夜)；(10)紫外分光光度計(jì)及PMgrose (瓊脂糖)凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量。1.2eIF4E.c的克隆及序列分析(I)檢索B.rapa自交系R-0-18的eIF4E.c基因全序列，在編碼區(qū)上游和下游分別設(shè)計(jì)正反向引物，正向引物:5’GGAGGCAAGITITGACAATGGCGG3’

反向引物:5’ TCAAGCGGTGTAAGCGCTCTTCGC3’，委托華大基因有限公司合成。引物序列如SEQ ID N0.7和8所示。(2) PCR 擴(kuò)增:在 20 U I 反應(yīng)體系中，包含 I X TransStart FastPfu buffer ；20ng的基因組DNA ;0.4 u M正反向引物；0.25mM dNTPmix; I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位的TransStart FastPfuDNA聚合酶(TransGenAP221)。PCR循環(huán)條件:95°C預(yù)變性5分鐘；接著是95°C變性30秒，57.5°C退火30秒，72 °C延伸I分鐘，35-38個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。 (3) PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè):PCR結(jié)束后，取IOiUPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入IiillOXloading buffer，在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后EB染色，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。結(jié)果見圖1。(4) PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序電泳確認(rèn)目的條帶被擴(kuò)增后，取I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加I UlpEasy-Blunt (TransGen CB101)載體室溫連接10分鐘，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Transl-Tl (TransGen:CD501)，轉(zhuǎn)化菌在含Kan50 u g/ml的LB固體平板上37°C倒置培養(yǎng)16小時(shí)左右。菌落PCR檢測(cè)后挑取陽性克隆委托北京華大基因有限公司進(jìn)行DNA序列的測(cè)定。(5)所克隆的大白菜eIF (iso) 4E.a序列分析及命名將來自TuMV敏感性材料06-247的eIF4E.c稱為單倍型s即Haps,其序列如SEQID N0.9所示;將來自抗TuMV材料Hel02的eIF4E.c稱為單倍型r即Hapr,其序列如SEQID N0.10所示。它們與GenBank中R-O-18的同源關(guān)系如圖2所示。實(shí)施例2共顯性ASM標(biāo)記的開發(fā)2.1引物設(shè)計(jì)仔細(xì)比較eIF4E.c的兩種單倍型Haplr和Haps的基因組序列，其差異主要在內(nèi)含子區(qū)域的InDels，針對(duì)這樣的差異，在缺失區(qū)域上游保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩套引物Fdl和Rdl，F(xiàn)d2和Rd2，委托華大基因有限公司合成。2.2ASM標(biāo)記的獲得
采用巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增該差異區(qū)域:(I)利用外側(cè)引物組合Fdl和Rdl擴(kuò)增Hel02及06-247基因組DNA，循環(huán)20次；以第一次PCR產(chǎn)物為模板，用內(nèi)側(cè)引物組合Fd2和Rd2進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)液的配制及擴(kuò)增條件如1.2第(2)條所述。(2)擴(kuò)增結(jié)果在8%非變形聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測(cè)。(3)擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，兩套引物組合在抗性材料He 102中擴(kuò)增出187bp的條帶，其序列如SEQ ID N0.1所示，在感病材料06-247中擴(kuò)出193bp的條帶，其序列如SEQ IDN0.2所示。此即共顯性ASM標(biāo)記。實(shí)施例3ASM標(biāo)記對(duì)回叫群體(Hel02X06_247) X06-247中的單株鑒定(I)回叫群體不同單株的基因組DNA提取如1.1所述。(2) PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)液的配制及擴(kuò)增條件如1.2第⑵條所述。(3) PCR產(chǎn)物的檢測(cè)如1.2第(3)條所述。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，Pl和P2分別是雙親06-247和Hel02，1-23是23份大白菜材料。圖中單株11、12、21、22是親本Pl即06-247中的單倍型，單株2、4、5、 6、14、18是親本P2即Hel02中的單倍型，其余單株是雜合性。
權(quán)利要求
1.一種區(qū)分大白菜eIF4E.c兩種單倍型的共顯性ASM標(biāo)記，其特征是，所述標(biāo)記為與抗性材料中eIF4E.c單倍型Haplr檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-R，片段大小187bp，含有如SEQID N0.1所示序列；與高感材料中eIF4E.c單倍型Haps檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-S，片段大小193bp，含有如SEQ ID N0.2所示序列。
2.一種擴(kuò)增區(qū)分大白菜eIF4E.c兩種單倍型的共顯性ASM標(biāo)記的引物，其特征是， 正向引物 Fdl:5’-GGAGGCAAGnTTGACAATGGCGG-3’ ；正向引物 Fd2:5’ -TGTTCTTTCTTCGTGGGTTAAG-3’ 反向引物 Rdl:5’ -TCAAGCGGTGTAAGCGCTCTTCGC-3'， 反向引物 Rd2:5’ -CAAAAAGAACATAACTTTCCT-3'。
3.—種區(qū)分 大白菜eIF4E.c兩種單倍型的共顯性ASM標(biāo)記，其特征是，它由權(quán)利要求2所述的引物對(duì)以大白菜基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到。
4.權(quán)利要求1或3所述的共顯性ASM標(biāo)記在大白菜eIF4E.c位點(diǎn)基因型鑒定中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征是，具體為:利用權(quán)利要求2所述的ASM標(biāo)記的引物對(duì)待測(cè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增片段的大小，如果擴(kuò)增產(chǎn)物為187bp，則為單倍型Haplr,如果擴(kuò)增產(chǎn)物為193bp，即為單倍型Haps ;如果擴(kuò)增出上述兩條帶，則為雜合型。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是，所述的兩次PCR擴(kuò)增為先利用外側(cè)引物組合Fdl和Rdl擴(kuò)增Hel02及06-247基因組DNA，循環(huán)20次；再以第一次PCR產(chǎn)物為模板，用內(nèi)側(cè)引物組合Fd2和Rd2進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增； PCR擴(kuò)增反應(yīng)液配制:在20 u I反應(yīng)體系中，包含I XTransStart FastPfu buffer ；20ng 的基因組 DNA ；0.4 u M 正反向引物；0.25mM dNTPmix ；I 個(gè)單位的 TransStartFastPfuDNA聚合酶； PCR循環(huán)條件:95°C預(yù)變性5分鐘；接著是95°C變性30秒，57.5°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，35-38個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種區(qū)分大白菜eIF4E.c兩種新單倍型的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，所述標(biāo)記為與抗性材料中eIF4E.c單倍型Hapr檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-R，片段大小187bp，含有如SEQ ID No.1所示序列；與高感材料中eIF4E.c單倍型Haps檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-S，片段大小193bp，含有如SEQ ID No.2所示序列。本發(fā)明利用同源克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)了eIF4E.c位點(diǎn)的兩種新的單倍型并開發(fā)了鑒定這兩者的分子標(biāo)記。利用該標(biāo)記可以對(duì)回交后代的基因型進(jìn)行準(zhǔn)確選擇。同時(shí)該標(biāo)記還可用于對(duì)大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行篩查，以尋找遺傳背景更加豐富的突變體材料。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103103188SQ20131005883
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月25日
發(fā)明者劉栓桃, 趙智中, 張志剛, 李巧云, 王淑芬, 盧金東, 徐文玲, 劉賢嫻 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所