專利名稱：：將患者鑒定為用長效beta激動(dòng)劑治療的候選者并用于通過分析beta2腎上腺素能受體基...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及鑒定單倍型之間的關(guān)系，所述單倍型在β2-腎上腺素能受體基因(beta2-adrenergicreceptorgene)中包含一些單核苷酸多態(tài)性，還涉及對(duì)患者體內(nèi)的長效beta激動(dòng)劑的反應(yīng)，其允許鑒定合適的候選者用于藥物治療。
背景技術(shù)：
：β2-腎上腺素能受體(ADRB2或B2AR)是G蛋白偶聯(lián)的受體，其介導(dǎo)許多組織中兒茶酚胺(catecholamine)的作用。ADRB2活性在調(diào)節(jié)心臟、血管、肺和代謝功能中起重要作用。相信ADRB2受體活性或表達(dá)的改變?cè)黾釉S多疾病和病癥的風(fēng)險(xiǎn)或嚴(yán)重性，所述疾病和病癥包括充血性心力衰竭(heartfailure)、心律失常(arrhythmia)、缺血性心臟病(ischemicheartdisease)、高血壓(hypertension)、偏頭痛(migraine)、哮喘(asthma)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、過敏反應(yīng)(anaphylaxis)、肥胖癥(obesity)、糖尿病(diabetes)、重癥肌無力(myastheniagravis)和早產(chǎn)(premature)。β-腎上腺素能激動(dòng)劑(“beta(β)激動(dòng)劑”)，包括beta-2(β2)激動(dòng)劑廣泛用于哮喘的治療。還將β2-激動(dòng)劑的支氣管擴(kuò)張效應(yīng)用于治療慢性阻塞性肺疾病(COPD)。支氣管擴(kuò)張藥代表COPD治療的基石，盡管事實(shí)根據(jù)定義的此患者群體具有有限的氣管可逆性。對(duì)哮喘患者的研究已表明對(duì)于特定激動(dòng)劑的個(gè)體反應(yīng)是可變的(例如，由Tanetal.，Associationbetweenbeta(2)-adrenoceptorpolymorphismandsusceptibilitytobronchodilatordesensitisationinmoderatelyseverestableasthmatics.Lancet350，995-999(1997)；Drysdale，C.M.etal.Complexpromoterandcodingregionbeta(2)-adrenergicreceptorhaplotypesalterreceptorexpressionandpredictinvivoresponsiveness.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica97，10483-10488(2000)，Taylor，D.R.etal.Theinfluenceofpolymorphismatposition16ofthebeta2-adrenoceptoronthedevelopmentoftolerancetobeta-agonist.JournalofAsthma.37，691-700(2000)，Israel，E.etal.Effectofpolymorphismofthebeta(2)-adrenergicreceptoronresponsetoregularuseofalbuterolinasthma.InternationalArchivesofAllergy&Immunology124，183-186(2001)描述)。ADRB2由染色體5q31-32上的無內(nèi)含子基因所編碼(Kobilka，B.K.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8446-50，1987)。已經(jīng)在所述基因的編碼模塊內(nèi)鑒定了許多單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，其在人群中的ADRB2蛋白的結(jié)構(gòu)中引起明顯的遺傳變異性(Reihsaus，E.etal.，AmJRespCellMolBiol8334-339，1993；Liggett，S.B.，NewsinPhysiologicSciences10265-273，1995；和GenBankaccessionnumbersAF022953.1GI2570526；AF022954.1GI2570528；和AF022956.1GI2570532)。已在啟動(dòng)子區(qū)中和5’和3’UTRmRNA中鑒定了許多其它的SNPs(參見，例如，McGraw，D.W.&Liggett，S.B.Codingblockand5’leadercistronpolymorphismsofthebeta(2)-adrenergicreceptor.Clinical&ExperimentalAllergy29，43-45(1999)；McGraw，D.W.，F(xiàn)orbes，S.L.，Kramer，L.A.，&Liggett，S.B.Polymorphismsofthe5’leadercistronofthehumanbeta(2)-adrenergicreceptorregulatereceptorexpression.JournalofClinicalInvestigation102，1927-1932(1998).)。通過分析研究樣品中的ADRB2的序列，已經(jīng)鑒定了許多ADRB2單倍型。不同群組之間ADRB2單倍型的頻率有所不同。已經(jīng)顯示了在對(duì)于β2-激動(dòng)劑的支氣管擴(kuò)張反應(yīng)中ADRB2單倍型與個(gè)體間變異之間的聯(lián)系(參見，Liggett，S.B.″Thegeneticsofβ2-adrenergicreceptorpolymorphismsrelevancetoreceptorfunctionandasthmaticphenotypes.″inLiggett，S.B.&Meyers，D.A.，TheGeneticsofAsthma(1996)pp.455-478)。迄今的結(jié)果已集中于短效β2-激動(dòng)劑(SABA)如硫酸舒喘靈(albuterolsulphate)(商標(biāo)名包括Salbutamol和Ventolin)，并且已經(jīng)于單一時(shí)間點(diǎn)或者于短期臨床反應(yīng)上進(jìn)行觀察。來自這些研究的結(jié)論是矛盾的，這部分地可以由樣品量不足來解釋。導(dǎo)致不一致的觀測(cè)結(jié)果的其它因素包括不同疾病表型的研究、不同藥物反應(yīng)結(jié)果的使用，和測(cè)定有效藥物反應(yīng)表型中的困難。最近，與短效β2-激動(dòng)劑相比，為了提供更便利的維持治療(maintenancetherapy)和更有效地控制夜間哮喘的癥狀，已經(jīng)將長效β2-激動(dòng)劑引入到治療方案中(Johnson，1995；AnnAllergyAsthmaImmunol.Aug；75(2)177-9)。長效β2-激動(dòng)劑提供至少12個(gè)小時(shí)的對(duì)于變應(yīng)原-、鍛煉-、組胺-和甲基膽堿(methocholine)-誘導(dǎo)的支氣管收縮的支氣管保護(hù)(NationalAsthmaCampaign1996，Asthmamanagementhandbook1996，MelbourneNationalAsthmaCampaign，Melbourne.)。這些長效β2-激動(dòng)劑包括Salmeterol(Serevent，SereventDiskus)和Formoterol(Foradil，和ForadilAerolizer，Oxis以及Symbicort)。例如Lotvall等(PulmPharmacolTher.2002；15(6)497-501；andRespiratoryMedicine2001；95SupplementB；S7-S11)和vanSchayck等(RespiratoryMedicine2002；Mar；96(3)155-62)綜述了短效和長效β2-激動(dòng)劑在作用機(jī)制上的差異。慢性阻塞性肺疾病(COPD)(或慢性阻塞性肺部疾病或慢性氣管疾病)指以受限的氣流為特征，具有不同程度的氣囊腫大和肺組織破壞的一組肺部疾病。COPD的主要原因是抽煙，這可能導(dǎo)致這種疾病的兩種最常見形式，肺氣腫和慢性支氣管炎。長期使用煙草引起肺部炎癥和不同程度的氣囊(氣泡)損壞。這導(dǎo)致氣管發(fā)炎和狹窄(慢性支氣管炎)；或伴隨肺彈性減小(肺氣腫)的肺氣囊永久性擴(kuò)大。15-20％的長期吸煙者將發(fā)展出COPD。罕見地，稱為α-1抗胰蛋白酶缺陷的酶缺陷能夠在非吸煙者中引起肺氣腫。COPD的其它風(fēng)險(xiǎn)因素是被動(dòng)抽煙(非吸煙者暴露于來自他人的香煙煙霧)、男性、和在污染的環(huán)境中工作。已經(jīng)開發(fā)了許多藥物用于治療COPD，包括支氣管擴(kuò)張藥如短效和長效β2-激動(dòng)劑(分別為SABA和LABA)。ViozanTM(SibenadetHCl)是在晚期臨床開發(fā)中用于COPD治療的新藥，并且為長效β2-激動(dòng)劑(LABA)。在許多試驗(yàn)中已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了ViozanTM的臨床用途(參見，例如，Calverlyetal.，RespiratoryMedicine，2003；Jan97SupplAS71-1；Hilleretal.RespiratoryMedicine，2003；Jan97SupplAS45-52)。在Cellietal.，RespiratoryMedicine，2003；Jan97SupplAS35-43；Hilleretal.，RespiratoryMedicine，2003；Jan97SupplAS45-52中討論了III期功效和安全性試驗(yàn)的結(jié)果，和決定中斷開發(fā)ViozanTM的根本原因。對(duì)于疾病諸如COPD，其為緩慢發(fā)展的疾病，患者將需要數(shù)年甚至數(shù)十年的進(jìn)行性治療處理。然而，任何藥物的長期使用對(duì)不同個(gè)體可能有不同的影響。特別是長期使用可能導(dǎo)致耐受和不良副作用如頭疼、震顫和心悸。預(yù)測(cè)患者對(duì)特定治療劑反應(yīng)的能力對(duì)于醫(yī)師作出如何治療患者的決定是有用的，所述患者患有呼吸道疾病如COPD或哮喘。如果能夠從遺傳學(xué)研究預(yù)測(cè)到良好的效果，那么可以選擇特異性藥物譜以匹配遺傳學(xué)譜，并因此增加良好的治療反應(yīng)的可能性并減小不良副作用的風(fēng)險(xiǎn)。該手段有助于開發(fā)個(gè)性化藥品，即基于遺傳藥理學(xué)和藥物基因組學(xué)信息，最適合于個(gè)體的特異性治療法或治療方案的處方。在施用藥物之前確定最可能對(duì)特定藥物反應(yīng)良好的那些患者還可以節(jié)約成本和時(shí)間。在這個(gè)方面，與可能顯示低或中度反應(yīng)的患者相比，對(duì)于特定變體或基因，其基因型或單倍型表明患者對(duì)特定治療劑將有良好反應(yīng)的哮喘患者或COPD患者；對(duì)于所述治療來說是更好的候選者。因此，需要大量的臨床試驗(yàn)以鑒定ADRB2多態(tài)性和/或單倍型與響應(yīng)β2-激動(dòng)劑的變異性之間的關(guān)聯(lián)。這種反應(yīng)可用于預(yù)測(cè)藥物配置(drugdisposition)、功效、耐受性和安全性。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明人已鑒定了對(duì)長效β2激動(dòng)劑的反應(yīng)與ADRB2基因單倍型之間的關(guān)聯(lián)。ADRB2基因單倍型的分析得以預(yù)測(cè)患者對(duì)長效β2激動(dòng)劑的反應(yīng)。具體地，本文描述的研究涉及患有COPD的患者。在白種人群中最常見的單倍型的頻率列于表4。鑒定為單倍型A、B和C的最常見的3種單倍型，在所報(bào)導(dǎo)的3種SNPs的每一種上均有所不同，以對(duì)所表達(dá)的蛋白具有功能性影響(參見圖1和表6)。本文提供的數(shù)據(jù)確定具有至少一個(gè)拷貝的ADRB2‘C’單倍型的患者對(duì)長效β2激動(dòng)劑具有“良好的”臨床反應(yīng)。同時(shí)從統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床觀點(diǎn)來看，與不具有單個(gè)拷貝的反應(yīng)者單倍型(responderhaplotype)(即“非C”單倍型)的患者相比，所述“良好的”反應(yīng)明顯更好。因此，在本發(fā)明的第一個(gè)方面提供將患者鑒定為用長效β2-激動(dòng)劑治療的候選者的方法，其包括a)從患者分離生物樣品；b)鑒定所述樣品中存在或缺失至少一個(gè)拷貝的ADRB2單倍型C；其中在患者樣品中存在至少一個(gè)單倍型C表明所述患者是良好的治療候選者?；趯?duì)所選功能性SNPs的ADRB2單倍型、或ADRB2基因型的認(rèn)識(shí)，這樣的方法也可用于確定最佳的劑量和治療方案。良好的治療候選者是具有ADRB2‘C’單倍型的一個(gè)或多個(gè)拷貝的個(gè)體。這樣的候選者對(duì)于那種治療可能是很好的反應(yīng)者。好的反應(yīng)者鑒定為施用長效β2激動(dòng)劑后顯示呼吸道疾病的“癥狀”改善的個(gè)體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在一段時(shí)間中，以施用長效β2激動(dòng)劑來維持“癥狀”的改善。癥狀可以是組合幾種疾病成分的定性分?jǐn)?shù)，或者可以是肺功能的定量測(cè)量值。減小惡化的發(fā)生率或嚴(yán)重程度也將被認(rèn)為是良好的反應(yīng)。顯示在體外和體內(nèi)具有功能性影響的ADRB2多態(tài)性是那些在編碼序列中的氨基酸16和27，以及beta-上游肽(BUP)中的多態(tài)性，如表4和6所示。對(duì)于這三個(gè)SNPs的每一個(gè)，在單倍型C中編碼的變體與不太常見的單倍型D所共有。因此，所述方法進(jìn)一步包括用單倍型D鑒定患者，所述單倍型D共享這同樣的三個(gè)SNPs。適合地，所述患者患有呼吸道疾病并且尤其是阻塞性氣管疾病。呼吸道疾病包括急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺病(COPD)(或慢性阻塞性肺部疾病或慢性氣管疾病)和哮喘。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述患者患有任何階段或嚴(yán)重程度的COPD或哮喘。COPD癥狀包括長期咳嗽(chroniccough)、長期生痰(chronicsputumproduction)、急性支氣管炎(acutebronchitis)、呼吸困難(dyspnea)，這些常常與暴露于風(fēng)險(xiǎn)因素的歷史相關(guān)，這些風(fēng)險(xiǎn)因素包括職業(yè)塵末(occupationaldust)和化學(xué)品、煙草煙霧和來自家庭烹飪和加熱燃料的煙霧?？梢杂梅位盍繙y(cè)定法(spirometry)測(cè)定用力肺活量(FVC)和一秒鐘用力呼氣量(FEV1)來證實(shí)診斷。對(duì)于患者的性別、年齡和身高來說，與正常值相比，患COPD的患者通常同時(shí)表現(xiàn)出FEV1和FEV1/FVC的減小。依照Gold分類法(Goldclassification)對(duì)COPD嚴(yán)重程度分類，并包括0期有風(fēng)險(xiǎn)、I期輕微、II期中度和III期嚴(yán)重。哮喘癥狀包括咳嗽、呼吸困難、胸悶、胸痛、呼吸噪音等等?？梢愿鶕?jù)癥狀、活性的缺損、肺功能、支氣管高反應(yīng)性程度、急診的次數(shù)、住院的次數(shù)和藥物應(yīng)用對(duì)哮喘嚴(yán)重程度進(jìn)行分類。所描述的嚴(yán)重程度的范圍包括嚴(yán)重持久的、中度持久的、輕度持久的和輕度間歇性哮喘。如以上所指出的，呼吸道疾病的癥狀可以用許多種方法評(píng)估。肺活量測(cè)定法常用于在阻塞性氣管疾病中監(jiān)測(cè)肺功能。例如，F(xiàn)EV1(1秒鐘用力呼氣量，以升為單位測(cè)量)廣泛用于臨床試驗(yàn)中以評(píng)估干預(yù)氣道阻塞的效果。例如，在AmRevRespirDisease19911441202-1218中描述了用于評(píng)估肺功能的FEV1測(cè)量值。例如，在AmericanThoracicSociety，StandardisationofspirometryAm.J.Resp.Crit.CareMed.1995，149，1107-1136中描述了測(cè)量FEV1的標(biāo)準(zhǔn)方法?；加蠧OPD的患者具有受限的氣管功能可逆性。僅50mL的FEV1變化就能夠代表肺功能的明顯臨床改善。認(rèn)為COPD癥狀包括氣促(breathlessness)、咳嗽和多痰的治療(management)提供了在COPD患者中干預(yù)的有效性的更好評(píng)估。已經(jīng)開發(fā)了氣促、咳嗽和多痰量度法(BCSS)作為工具用于評(píng)估治療COPD患者的癥狀性益處(Leidyetal，(2003)，RespiratoryMedicine，Vol97，SupplA，S59-S70)。因此，對(duì)施用長效β2激動(dòng)劑的良好反應(yīng)者將顯示FEV1的改善，所述的改善幾乎立即開始發(fā)生并持續(xù)超過幾個(gè)小時(shí)。如果將FEV1對(duì)時(shí)間作圖，同時(shí)反映初始反應(yīng)強(qiáng)度(最大FEV1)和作用持續(xù)時(shí)間的曲線下的面積(AUC)將是生理反應(yīng)的良好量度。此外，好的反應(yīng)者將顯示BCSS和/或全部癥狀的改善。全部癥狀可以相對(duì)于本文描述的標(biāo)準(zhǔn)“全部癥狀分?jǐn)?shù)”分析來測(cè)量。具體地，所述全部癥狀分?jǐn)?shù)將氣促、咳嗽和生痰的測(cè)量考慮在內(nèi)，它們每一種都對(duì)COPD表型作出貢獻(xiàn)?！伴L效beta2(β2)激動(dòng)劑”指與ADRB2受體相互作用的激動(dòng)劑，并且，與常用的短效beta2激動(dòng)劑(例如舒喘靈)相比，其產(chǎn)生具有更長的作用持續(xù)期的反應(yīng)。通常，對(duì)長效beta2激動(dòng)劑的反應(yīng)可持續(xù)12小時(shí)或更多。長效beta2激動(dòng)劑的范圍是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并包括ViozanTM(SibenadetHCl)、Bambuterol(Bambec，Oxeol)、Salmeterol和Formoterol。來自患者的生物樣品可以包括任何含DNA的生物材料，其包括血液或組織提取物如口腔刮取物(buccalscrape)。通常使用血液樣品。可以從許多類型的用于基因分型(genotyping)的生物樣品提取DNA用于分析。例如，通常使用商業(yè)試劑盒例如可由Qiagen或NucleonandPureGene(Flowgen)獲得的那些試劑盒從血液提取DNA，雖然直接從血液樣品確定基因型是可行的。如本文所討論的，單倍型是存在于單個(gè)染色體上的連鎖、連續(xù)SNPs的特定模式。測(cè)定患者樣品中的單倍型對(duì)(haplotypepair)涉及在單倍型模塊(haplotypeblock)中對(duì)于每個(gè)SNPs將患者的DNA進(jìn)行基因分型(參見表4)?？梢酝ㄟ^直接測(cè)定哪個(gè)SNP變體存在于每個(gè)染色體上而通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定單倍型。更常見地，使用統(tǒng)計(jì)算法間接測(cè)定單倍型，尤其是當(dāng)可以獲得大量受試者(subject)的基因型數(shù)據(jù)時(shí)。對(duì)于相同基因/基因座，必須進(jìn)行基因分型以將任何一個(gè)單倍型與所有其它單倍型相區(qū)分的SNPs的最小數(shù)目被稱為最小SNP組或單倍型標(biāo)記SNPs。單倍型標(biāo)記SNPs是區(qū)分單倍型最有效的手段，并可以組合到ADRB2單倍型的診斷測(cè)試中。這些最小SNPs或HAP-標(biāo)記SNPs是在特定群體中捕獲大多數(shù)單倍型多樣性的SNPs的亞組。因此可能需要許多不同的htSNPs組，以在不同群體內(nèi)捕獲相同程度的多樣性。例如WO01/79252中描述了合適的探針。在又一實(shí)施方案中，所述方法涉及確定單倍型對(duì)中的兩個(gè)等位基因的同一性(identity)。具體地，如本文所述，如果患者具有一個(gè)或多個(gè)拷貝的C單倍型，他們最可能對(duì)用長效β2激動(dòng)劑治療顯示良好的反應(yīng)。在沒有C單倍型拷貝的患者中反應(yīng)的強(qiáng)度較小。例如，如本文所示，與具有BB單倍型對(duì)的患者相比，具有單倍型BC的患者具有更高的最大FEV1反應(yīng)，并且所述反應(yīng)保持更長時(shí)間(FEV1在8小時(shí))。因此，患者的ADRB2單倍型對(duì)情況為醫(yī)師提供信息，該信息用于為每個(gè)獨(dú)特的患者對(duì)于施用哪種藥物、最合適的劑量和治療方案作出決定。測(cè)定個(gè)體樣品中的單倍型和/或基因型的許多方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。具體地，本發(fā)明涉及基于檢測(cè)特定核苷酸同一性的方法，所述特定核苷酸位于ADRB2基因內(nèi)已知多態(tài)性的確定位置。因此，在一個(gè)方面提供鑒定良好反應(yīng)者的方法，包括a)由已從患者去除的生物樣品中分離核酸；和b)在ADRB2基因組DNA的一個(gè)等位基因中檢測(cè)存在于下述位點(diǎn)的下述核苷酸(參見表4)位點(diǎn)核苷酸-47T46G79C合適地，這樣的方法能夠?qū)伪缎虲和D與單倍型A、B和E相區(qū)別。在又一個(gè)方面提供鑒定至少一個(gè)單倍型C存在或缺失的方法，包括a)由已從患者去除的生物樣品中分離核酸；和b)在ADRB2基因組DNA的一個(gè)等位基因中檢測(cè)存在于下述位點(diǎn)的下述核苷酸(參見表4)位點(diǎn)核苷酸-47T46G79C523A合適地，這樣的方法能夠?qū)伪缎虲與單倍型A、B和D相區(qū)別。合適地，所述方法進(jìn)一步包括附加地在ADRB2基因組DNA的一個(gè)等位基因中檢測(cè)存在于下述位點(diǎn)的下述核苷酸(參見表4)位點(diǎn)核苷酸-1429A-1023G-654G-367T-20T252A合適地，這樣的方法能夠?qū)伪缎虲與所有其它的ADRB2單倍型包括稀有單倍型(rarehaplotype)相區(qū)別。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述鑒定至少一個(gè)單倍型C存在或缺失的方法包括a)由已從患者去除的生物樣品中分離核酸；和b)在ADRB2基因組DNA的一個(gè)等位基因中檢測(cè)存在于下述位點(diǎn)的下述核苷酸位點(diǎn)核苷酸-1429A-1023G-654G-367T-47T-20T46G79C252A523A在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，為了區(qū)分單倍型，可以對(duì)HAP-標(biāo)記SNPs進(jìn)行基因分型。由于不同群體之間的多樣性，根據(jù)待治療的群體/個(gè)體的人種背景，需要包括于HAP-標(biāo)記SNP中的實(shí)際SNPs可有所不同。本文描述了鑒定存在于這些位點(diǎn)中每一個(gè)的核苷酸的合適方法，并包括TaqMan、SNaPshot、等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(allele-specificpolymerasechainreaction)、等位基因耐受性突變系統(tǒng)(allelerefractorymutationsystem，ARMS)、限制片段長度多態(tài)性分析和測(cè)序。這些方法可以利用基因分型探針或如本文所述的寡核苷酸。ADRB2cDNA具有可由NCBI獲得的Entrez核苷酸數(shù)據(jù)庫中以登錄號(hào)M15169列出的序列。Entrez核苷酸數(shù)據(jù)庫是來自幾種來源包括GenBank、RefSeq和PDB的序列的集合(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝Nucleotide)。ADRB2cDNA序列(M15169)以下稱為SEQ.IDNO1，在本說明書的最后給出。在另一實(shí)施方案中，所述鑒定至少一個(gè)單倍型C存在或缺失的方法包括a)由已從患者去除的生物樣品中分離蛋白質(zhì)；和b)檢測(cè)ADRB2蛋白的存在，所述ADRB2蛋白在位點(diǎn)16具有Gly，并在位點(diǎn)27具有Gln(參見表6)。在該實(shí)施方案中，鑒定C單倍型的表達(dá)的合適方法包括使用特異性識(shí)別ADRB2受體的抗體的方法，所述ADRB2受體在Gly16和Gln27具有氨基酸改變。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，鑒定至少一個(gè)單倍型C存在或缺失的方法進(jìn)一步包括檢測(cè)前導(dǎo)肽/順反子(LC)(beta-上游肽(BUP))中位點(diǎn)-47的Arg的存在。然而，此肽在成熟蛋白中是不存在的。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，鑒定至少一個(gè)單倍型C存在或缺失的方法包括對(duì)于任一患者，對(duì)多個(gè)cDNA克隆測(cè)序，以證實(shí)所述患者對(duì)于-47BUP多態(tài)性和5’UTR、編碼區(qū)和3’UTR中的其它變體而言是否為雜合(圖1)。此手段也將用于證實(shí)是否有ADRB2基因的差異等位基因表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，所述鑒定至少一個(gè)單倍型C存在或缺失的方法包括a)由已從患者去除的生物樣品中分離蛋白質(zhì)；和b)檢測(cè)ADRB2蛋白的水平，其中與正常個(gè)體相比，患者體內(nèi)表達(dá)水平的提高表明存在單倍型C。另一方面，本發(fā)明提供預(yù)測(cè)COPD或哮喘患者對(duì)長效β2激動(dòng)劑治療的反應(yīng)的方法，包括檢測(cè)患者ADRB2編碼序列的核苷酸-47、46和79處的基因型，其中如果患者在同一ADRB2等位基因上具有T(-47)、G(46)和C(79)變體，那么該患者可能對(duì)標(biāo)準(zhǔn)劑量的長效β2激動(dòng)劑顯示出良好的反應(yīng)。因此，在又一方面提供確定治療方案的方法，所述治療方案用于治療患者的COPD或哮喘，該方法包括a)從所述患者獲得樣品；b)從所述樣品分離基因組DNA；c)使用具有表2所列出的序列的任一對(duì)核苷酸引物將基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；d)確定患者在ADRB2基因中任一多態(tài)性變體的基因型e)根據(jù)基因分型數(shù)據(jù)確定患者的單倍型；和f)根據(jù)單倍型確定用于所述患者的治療方案。在本發(fā)明的又一方面，提供分離的核酸分子，其包括表2中列出的任何一個(gè)寡核苷酸探針的序列。合適地，這樣的探針的長度在10和30個(gè)堿基對(duì)之間。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述探針由表2列出的任何一個(gè)序列組成。表2提供如下序列十二個(gè)VIC探針(SEQ.IDNO2至SEQ.IDNO13)、十二個(gè)6FAM探針(SEQ.IDNO14至SEQ.IDNO25)、十二個(gè)正向(Fwd)引物(SEQIDNO26至SEQ.IDNO37)和十二個(gè)反向(Rev)引物(SEQ.IDNO38至SEQ.IDNO49)。在另一方面提供預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)長效β-激動(dòng)劑的反應(yīng)的診斷試劑盒，其包含一組基因分型探針。在另一方面提供檢測(cè)ADRB2單倍型的陣列。這樣的陣列將包含基因分型探針，所述基因分型探針特異于每個(gè)不同的ADRB2單倍型的SNPs特征。對(duì)任何ADRB2多態(tài)性進(jìn)行基因分型的方法可以是一系列(apanelof)基因分型測(cè)試的一部分，所述基因分型測(cè)試設(shè)計(jì)用于為患呼吸道疾病的個(gè)體確定最合適的治療方案。ADRB2SNPs可以與代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因中的SNPs一起，和/或與對(duì)于b2-激動(dòng)劑的反應(yīng)途徑中的其它基因和用于治療呼吸道疾病的其它藥物(例如吸入的皮質(zhì)類固醇(inhaledcorticosteroid)和白三烯抑制劑(leukotrieneinhibitor))一起包括在一個(gè)系列中。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中提供陣列，其還包含用于檢測(cè)其它SNPs的探針。合適地，所述治療方案涉及在定期日程基礎(chǔ)上施用長效beta2激動(dòng)劑作為維持治療和/或需要時(shí)施用LABA作為緩解(reliever)藥物。因此，本發(fā)明為藥物開發(fā)提供個(gè)性化的用藥(medicine)手段，由此根據(jù)ADRB2單倍型狀況，通過預(yù)期地(prospectively)招募受試者進(jìn)行臨床試驗(yàn)，而對(duì)C單倍型亞組開發(fā)LABA。合適地，ADRB2單倍型狀況用于選擇最合適的LABA、藥物的劑量和治療方案，例如定期或根據(jù)需要施用LABA。此外，確定ADRB2單倍型有助于確定合適的藥物、劑量和方案，其中ADRB2單倍型與其它基因的基因型/單倍型一起測(cè)定，所述的基因型/單倍型在對(duì)b2-激動(dòng)劑和其它用于治療COPD、哮喘和其它呼吸道疾病的治療劑的個(gè)體反應(yīng)測(cè)定中有作用。圖表簡述表1顯示ADRB2基因中的多態(tài)性、其在ADRB2cDNA參考序列(M15169)中的相對(duì)位點(diǎn)、氨基酸變體和在占優(yōu)勢(shì)的白種人群中每種多態(tài)性的頻率。表2顯示用于對(duì)ADRB2SNPs進(jìn)行基因分型的TaqMan引物和等位基因特異性探針。表3顯示用于對(duì)ADRB2SNPs進(jìn)行基因分型的SNaPshotPCR和引物延伸引物(primerextensionprimer)。表4顯示對(duì)于5種最常見的ADRB2單倍型，存在于每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的變體的ADRB2堿基，和占優(yōu)勢(shì)的白種人臨床試驗(yàn)群體中這些常見單倍型的頻率。表5顯示占優(yōu)勢(shì)的白種人臨床試驗(yàn)群體中ADRB2單倍型對(duì)的頻率，并概括了每種ADRB2單倍型對(duì)的觀測(cè)的頻率，其中單倍型對(duì)是2450個(gè)受試者的臨床試驗(yàn)群體中單倍型A、B、C、D和E的組合。表6顯示由最常見的ADRB2單倍型編碼的氨基酸變體，對(duì)于三種變體，被報(bào)導(dǎo)在之前的體外和體內(nèi)研究中，在功能上是顯著的。圖1為ADRB2基因的示意圖，其顯示該基因的編碼區(qū)、5’UTR和3’UTR區(qū)中多態(tài)性的相對(duì)位點(diǎn)。圖2顯示在招募進(jìn)行ViozanTM臨床試驗(yàn)的患者亞組中系列FEV1分析的結(jié)果。在首次用ViozanTM治療就診時(shí)測(cè)定系列FEV1反應(yīng)，其中用ADRB2單倍型對(duì)所述反應(yīng)進(jìn)行分層(stratify)。圖3顯示在3個(gè)月(SC-397-5098)和6個(gè)月(SC-397-5097)的臨床試驗(yàn)過程中，在劑量給藥前(pre-dose)基線測(cè)定的FEV1。該附圖顯示與后續(xù)就診時(shí)的劑量給藥前FEV1(波谷(trough)FEV1)相比，首次就診時(shí)治療前基線(FEV1)的變化。根據(jù)一個(gè)或多個(gè)拷貝的“C”單倍型的存在將患者分組。圖4顯示在3個(gè)月和6個(gè)月的功效研究中產(chǎn)生的組合的系列FEV1數(shù)據(jù)。圖表顯示對(duì)于分層到那些具有至少一個(gè)拷貝“C”單倍型的受試者和其余“非C”單倍型的受試者，首次就診時(shí)和3個(gè)月治療后的系列FEV1反應(yīng)。圖5顯示在3個(gè)月的功效試驗(yàn)(SC-397-5163)過程中，對(duì)于用ViozanTM治療并分層到基于ADRB2單倍型對(duì)的亞組中的患者自基線BCSS(氣促、咳嗽和多痰分?jǐn)?shù))的變化。圖6顯示在3個(gè)月的試驗(yàn)(SC-397-5163)中，自基線的BCSS平均變化，其中將對(duì)ViozanTM的反應(yīng)根據(jù)ADRB2“C”單倍型的存在分層到兩個(gè)亞組中。圖7顯示與未分層的患者群體(所有Haps組)的平均反應(yīng)相比，根據(jù)C單倍型的存在或缺失分層到2個(gè)組中的患者亞組自基線BCSS(氣促、咳嗽和多痰分?jǐn)?shù))的平均變化。當(dāng)把患者分層到C單倍型組和非C單倍型組中時(shí)，分析對(duì)ViozanTM(圖7A)和安慰劑(圖7B)的反應(yīng)，顯示具有至少一個(gè)“C”單倍型的患者對(duì)ViozanTM的反應(yīng)更好。組合SC-397-5163和SC-397-5098的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖8顯示對(duì)于用ViozanTM和安慰劑治療并分層到C單倍型和非C單倍型亞組中的患者，在初始(primary)臨床試驗(yàn)終點(diǎn)(治療9至12周(包含)的平均BCSS反應(yīng))時(shí)自基線的BCSS平均變化。組合SC-397-5163和SC-397-5098的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。與那些不具有單一拷貝的C單倍型(非CHaps)的受試者相比，在用ViozanTM治療的具有C單倍型的受試者中，BCSS反應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。發(fā)明詳述除非另外限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與一個(gè)本
技術(shù)領(lǐng)域：
(例如，在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)領(lǐng)域中)普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。將標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于分子的、遺傳學(xué)的和生物化學(xué)的方法。一般參見，Sambrooketal.，MolecularCloningALaboratoryManual，2ded.(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.andAusubeletal.，ShortProtocolsinMolecularBiology(1999)4thEd，JohnWiley&Sons，Inc.；以及Guthrieetal.，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology，MethodsinEnzymology，Vol.194，AcademicPress，Inc.，(1991)，PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications(Innis，etal.1990.AcademicPress，SanDiego，Calif.)，McPhersonetal.，PCRVolume1，OxfordUniversityPress，(1991)，CultureofAnimalCellsAManualofBasicTechnique，2ndEd.(R.I.Freshney.1987.Liss，Inc.NewYork，N.Y.)，和GeneTransferandExpressionProtocols，pp.109-128，ed.E.J.Murray，TheHumanaPressInc.，Clifton，N.J.)。通過引用將這些文獻(xiàn)并入本文。定義“等位基因”指遺傳基因座的特定形式，它在其特定核苷酸或氨基酸序列不同于其它形式?！翱贵w”可以是完整抗體或其抗原結(jié)合片段。例如，本發(fā)明包括片段如Fv和Fab、以及Fab’和F(ab’)2，和抗體變體如scFv、單域抗體、Dab抗體和其它抗原結(jié)合抗體類分子?！绊樂醋印笔蔷幋a單個(gè)蛋白質(zhì)鏈的DNA區(qū)段，即基因。它可能包括編碼DNA之前和之后的區(qū)域以及外顯子之間的內(nèi)含子。它被認(rèn)為是遺傳單位?！氨磉_(dá)”指轉(zhuǎn)錄基因DNA模板以產(chǎn)生相應(yīng)的mRNA，并翻譯該mRNA以產(chǎn)生相應(yīng)的基因產(chǎn)物(即，肽、多肽、或蛋白質(zhì))?！盎颉笔前糜谡{(diào)控RNA產(chǎn)物的生物合成的全部信息的DNA區(qū)段，包括啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子和其它控制表達(dá)的非翻譯區(qū)?！盎蛐汀笔窃趥€(gè)體中一對(duì)同源梁色體上的基因座中，存在于一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸對(duì)的非定相(unphased)5’到3’序列?！盎蚍中汀笔谴_定個(gè)體基因型的方法?！皢伪缎汀笔菃我粋€(gè)體的單個(gè)染色體上的基因座中，存在于兩個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸的定相(phased)5’到3’序列?！皢伪缎蛯?duì)”指存在于單一個(gè)體中的基因座的兩個(gè)單倍型。“單倍分型”是確定個(gè)體的單倍型的方法。“完全-單倍型”是單一個(gè)體的單個(gè)染色體上的基因座中，存在于所有已知的多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸的5’到3’序列?！皝?單倍型”是從單一個(gè)體的單個(gè)染色體上的位點(diǎn)中，于已知多態(tài)性位點(diǎn)的亞組上發(fā)現(xiàn)的核苷酸的5′到3′序列。如本文所定義的，單倍型“C”包括ADRB2基因內(nèi)許多多態(tài)性的組合。這些列于表4中。單倍型C最低限度地通過位點(diǎn)-47的T、位點(diǎn)46的G、位點(diǎn)79的C和位點(diǎn)523的A的存在來限定。由于位點(diǎn)523的核苷酸改變是同義的，因而通過單獨(dú)在位點(diǎn)-47、+46和+79的變體的組合來區(qū)分單倍型C是合理的。這些多態(tài)性導(dǎo)致氨基酸改變，使在-47有Cys/Arg改變、在氨基酸殘基16有Gly/Arg改變，和在氨基酸殘基27有Gln/Glu改變(表6)。類似地，本文表4中描述了包含單倍型A、B、C、D和E的變體。位點(diǎn)1是編碼區(qū)中的第一個(gè)核苷酸，并對(duì)應(yīng)于ATG的A。相對(duì)于ATG具有陰性位點(diǎn)(negativeposition)的變體位于beta-上游肽中的編碼區(qū)和5’UTR的上游(表1)。SEQ.IDNO1中列出了cDNA的完整序列?！巴N型”是基因、mRNA、cDNA或由其編碼的蛋白質(zhì)的特定形式，通過其特定序列和/或結(jié)構(gòu)與其它形式相區(qū)別?！胺蛛x的”應(yīng)用于生物分子如RNA、DNA、寡核苷酸、或蛋白質(zhì)時(shí)，指將所述分子從其初始環(huán)境去除，并出于實(shí)用目的不含有其它生物分子如非所需核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、或其它材料如細(xì)胞碎片和生長培養(yǎng)基。通常，術(shù)語“分離的”不意味著完全不存在這種材料或不存在水、緩沖液、或鹽，除非它們以實(shí)質(zhì)上干擾本發(fā)明所述方法的量存在?！盎蜃敝笇?duì)應(yīng)于基因或者物理特征或表型特征的染色體或DNA分子上的位置。本文所用“核酸”指單鏈或雙鏈DNA和RNA分子，包括自然界中發(fā)現(xiàn)的天然核酸和/或具有修飾的骨架或堿基的修飾的、人工的核酸，如本領(lǐng)域已知的?！岸ㄏ嗟摹庇糜诨蜃袃蓚€(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸對(duì)的序列時(shí)，意思是核苷酸的組合是已知的，所述核苷酸存在于基因座的單拷貝上的那些多態(tài)性位點(diǎn)。“多態(tài)性位點(diǎn)”是基因座內(nèi)的位置，在群體中，至少在所述基因座存在兩種可替換的序列。在描述本文鑒定的多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)，為方便起見參照基因的有義鏈。然而，技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到包含ADRB2基因的核酸分子可以是互補(bǔ)雙鏈分子。因此，參照有義鏈上特定位點(diǎn)還指互補(bǔ)反義鏈上的相應(yīng)位點(diǎn)?？梢詤⒄杖魏捂溕舷嗤亩鄳B(tài)性位點(diǎn)，并且可以設(shè)計(jì)寡核苷酸以在包含多態(tài)性位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域與任何一條鏈特異性地雜交。因此本發(fā)明還包括單鏈多核苷酸的用途，所述單鏈多核苷酸與本文所述ADRB2基因組變體的有義鏈互補(bǔ)?！岸鄳B(tài)性變體”是基因、mRNA、cDNA、多肽或肽，其核苷酸或氨基酸序列由于在基因中存在多態(tài)性而不同于參照序列。“多態(tài)性”是在個(gè)體中于多態(tài)性位點(diǎn)觀測(cè)到的序列變異。多態(tài)性包括核苷酸取代、插入、刪除和微衛(wèi)星，可能但不必然導(dǎo)致在基因表達(dá)或蛋白質(zhì)功能中的可探測(cè)的差異?！皢魏塑账岫鄳B(tài)性(SNP)”指在單一多態(tài)性位點(diǎn)觀測(cè)到的特異性核苷酸對(duì)。在罕見情況中，可發(fā)現(xiàn)三個(gè)或四個(gè)核苷酸。“嚴(yán)緊雜交條件”指在包含50％甲酰胺、5xSSC(750mMNaCl，75mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖(dextransulphate)和20pg/ml變性、剪切的鮭精DNA的溶液中，于42℃過夜溫育，然后于大約65℃在0.1xSSC中洗滌濾器?！胺嵌ㄏ嗟摹碑?dāng)應(yīng)用于基因座中兩個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸對(duì)的序列時(shí)，意思是存在于所述基因座的單拷貝上的那些多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸組合是未知的。測(cè)定SNPs和單倍型的方法目前使用用于在樣品中鑒定和表征SNPs的多種測(cè)試。這些測(cè)試包括限制片段長度多態(tài)性分析(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)(Oritaetal.P.N.A.S.USA，1989，862766-2770)、等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)(Saikietal.P.N.A.S.USA，1989，866230-6234)、寡核苷酸連接測(cè)試(OLA)(Landegrenetal.1988，Science241；1077-1080)、ARMS(擴(kuò)增耐受性突變系統(tǒng))、引物延伸或微測(cè)序類型測(cè)試(mini-sequencingtypeassay)，(Syvanenetal.1999；Hum.Mutat.131-10)、TaqMan(Livaketal.1995；Nat.Genet.9341-342)、分子信標(biāo)(molecularbeacons)(Tyagietal.1998；Nat.Biotechnol.1649-53)、核酸酶(Goldrick2001；Hum.Mutat.18；190-204)和結(jié)構(gòu)特異性核酸酶侵入物技術(shù)(structure-specificnucleaseinvadertechnology)(Forsetal.2000；Pharmacogenomics；1219-229)。從這些測(cè)試的讀出(readout)可以是以下許多類型的任一種放射性、熒光、化學(xué)發(fā)光、酶學(xué)、分析大小、電荷或質(zhì)量等。已經(jīng)開發(fā)了許多技術(shù)平臺(tái)以提高生產(chǎn)量。綜述了許多這樣的平臺(tái)，例如由Weiner和Hudson在BioTechniques32；S4-S13(2002年6月)中所述的。大多數(shù)用于SNP和單倍型分析的測(cè)試和平臺(tái)以基因組DNA開始，并需要一些形式的擴(kuò)增步驟。許多DNA擴(kuò)增方法是已知的，其大多數(shù)依賴于酶促鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(self-sustainedsequencereplication))或來自全部或部分載體的復(fù)制，所述載體中已克隆了該DNA。文獻(xiàn)中已描述了許多目標(biāo)和信號(hào)放大方法，例如，在Landegren，U.，etal.，Science242229-237(1988)和Lewis，R.，GeneticEngineeringNews101，54-55(1990)中的這些方法的概括性綜述。PCR是在美國專利4,683,195和4,683,202中特別描述的核酸擴(kuò)增方法。PCR可以用于擴(kuò)增任何診斷學(xué)情況(context)下已知的核酸(Moketal.，(1994)，GynaecologicOncology，52247-252)。自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(3SR)是TAS的變化，其涉及核酸模板通過反轉(zhuǎn)錄酶(RT)、聚合酶和核酸酶的活性(activity)的連續(xù)循環(huán)的等溫?cái)U(kuò)增，所述活性由酶雞尾酒和合適的寡核苷酸引物介導(dǎo)(Guatellietal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA871874)。連接擴(kuò)增反應(yīng)或連接擴(kuò)增系統(tǒng)使用DNA連接酶和四個(gè)寡核苷酸，每個(gè)目標(biāo)鏈兩個(gè)。此技術(shù)由Wu，D.Y.和Wallace，R.B.(1989)Genomics4560描述。在Qβ復(fù)制酶技術(shù)中，將復(fù)制單鏈RNA的用于噬菌體Qβ的RNA復(fù)制酶用于擴(kuò)增目標(biāo)DNA，如由Lizardietal.(1988)Bio/Technology61197所述。在本發(fā)明中可以利用替代的擴(kuò)增技術(shù)。例如，滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircleamplification)(Lizardietal.，(1998)NatGenet19225)是商業(yè)上可獲得的擴(kuò)增技術(shù)(RCATTM)，其由DNA聚合酶所驅(qū)動(dòng)并能夠在等溫條件下以線性或幾何動(dòng)力學(xué)(geometrickinetics)復(fù)制環(huán)形寡核苷酸探針。另一種技術(shù)，鏈置換擴(kuò)增(stranddisplacementamplification)(SDA；Walkeretal.(1992)PNAS(USA)80392)始于只有特定目標(biāo)才有的特別限定的序列。適合用于多種擴(kuò)增技術(shù)的引物可以按照本領(lǐng)域已知的方法制備。本文描述了特別有用的引物，其具有如表2和3列出的序列。用于檢測(cè)C單倍型的組合物可以包含至少一種ADRB2基因分型寡核苷酸。合適地，ADRB2基因分型寡核苷酸是能夠與目標(biāo)區(qū)域雜交的探針或引物，所述目標(biāo)區(qū)域位于靠近或其含有作為C單倍型的部分的本文所述的多態(tài)性位點(diǎn)。如本文所用，術(shù)語“寡核苷酸”指具有少于約100個(gè)核苷酸的多核苷酸分子。合適地，本發(fā)明的寡核苷酸為10至35個(gè)核苷酸長。更優(yōu)選地，所述寡核苷酸為15至30之間，并最優(yōu)選地，長度在20至25個(gè)核苷酸之間。所述寡核苷酸可以包括任何磷酸化狀態(tài)的核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸和非環(huán)狀核苷酸衍生物，以及其它功能上等同的衍生物?；蛘?，寡核苷酸可具有無磷酸的骨架，其可包括例如羧甲基、乙酰胺化物(acetamidate)、氨基甲酸酯(carbamate)、聚酰胺(肽核酸(PNA))等等的連接(Varma，R.inMolecularBiologyandBiotechnology，AComprehensiveDeskReference，Ed.R.Meyers，VCHPublishers，Inc.(1995)，pages617-620)。寡核苷酸可利用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法學(xué)通過化學(xué)合成制備，或者例如，通過限制性消化可得自生物樣品。所述寡核苷酸可按照本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記，包括使用放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶學(xué)標(biāo)記、蛋白質(zhì)、半抗原、抗體、序列標(biāo)簽等等。用于本發(fā)明所述方法的基因分型探針或寡核苷酸必須能夠與ADRB2多核苷酸的目標(biāo)區(qū)域特異性地雜交，單倍型C的多態(tài)性特征位于所述目標(biāo)區(qū)域中。如本文所用，特異性雜交的意思是所述寡核苷酸在一定雜交條件下與目標(biāo)區(qū)域形成反向平行雙鏈結(jié)構(gòu)，而在相同雜交條件下與非目標(biāo)區(qū)域或非ADRB2多核苷酸一起溫育時(shí)，不能形成這樣的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，所述寡核苷酸在常規(guī)的高嚴(yán)緊條件下與目標(biāo)區(qū)域特異性雜交。熟練技術(shù)人員能夠使用本文提供的多態(tài)性信息結(jié)合ADRB2基因已知的序列信息和常規(guī)技術(shù)，容易地設(shè)計(jì)和測(cè)試適用于檢測(cè)ADRB2基因中的多態(tài)性的寡核苷酸探針和引物。如果其中一個(gè)核酸分子的每個(gè)核苷酸與另一個(gè)核酸分子相應(yīng)位置上的核苷酸互補(bǔ)，那么核酸分子例如寡核苷酸或多核苷酸被稱為另一個(gè)核酸分子的“完美的”或“完全的”互補(bǔ)。如果一個(gè)核酸分子在常規(guī)的低嚴(yán)緊條件下以保持雙鏈形式的足夠穩(wěn)定性與另一個(gè)核酸分子雜交，那么核酸分子對(duì)另一個(gè)分子是“基本互補(bǔ)”。描述了常規(guī)雜交條件，例如，由SambrookJ.etal.在MolecularCloning，ALaboratoryManual，2ndEdition，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)中以及Haymes，B.D.etal.在NucleicAcidHybridization，APracticalApproach，IRLPress，Washington，D.C.(1985)中所述。盡管完美互補(bǔ)的寡核苷酸對(duì)于檢測(cè)多態(tài)性是優(yōu)選的，但完全互補(bǔ)的偏離(departure)是預(yù)期的，其中這樣的偏離不妨礙所述分子與目標(biāo)區(qū)域的特異性雜交。例如，寡核苷酸引物在其5’端可以具有非互補(bǔ)片段，引物的其余部分與目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)?；蛘?，非互補(bǔ)核苷酸可以散布在寡核苷酸探針或引物中，只要所得探針或引物仍然能夠與目標(biāo)區(qū)域特異性雜交。本發(fā)明優(yōu)選的基因分型寡核苷酸是等位基因特異性寡核苷酸。如本文所用，術(shù)語等位基因特異性寡核苷酸(ASO)的意思是寡核苷酸，其能夠在足夠嚴(yán)緊的條件下，在包含多態(tài)性位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域與基因的一個(gè)等位基因或其它基因座特異性雜交，而不與另一等位基因中的相應(yīng)區(qū)域雜交。如熟練技術(shù)人員所理解，等位基因特異性將依賴于許多容易優(yōu)化的嚴(yán)緊條件，包括鹽和甲酰胺濃度，以及雜交和洗滌步驟的溫度。通常用于ASO探針的雜交和洗滌條件的實(shí)例見于Kogan等，“GeneticPredictionofHemophiliaA”inPCRProtocols，AGuidetoMethodsandApplications，AcademicPress，1990和Ruano等，87Proc.Natl.Acad.Sci.USA6296-6300，1990中。通常，等位基因特異性寡核苷酸將與一個(gè)等位基因完美地互補(bǔ)，而對(duì)于另一等位基因含有單個(gè)錯(cuò)配。通常在不同等位基因之間提供良好的辨別力(discrimination)的等位基因特異性寡核苷酸探針是那些其中寡核苷酸探針的中心位置與目標(biāo)區(qū)域中的多態(tài)性位點(diǎn)(例如，15聚體(mer)中約第7或第8位置、16聚體中第8或第9位置、20聚體中第10或第11位置)對(duì)準(zhǔn)(align)的。用于檢測(cè)存在于單倍型C中的ADRB2基因多態(tài)性的優(yōu)選的ASO探針包含如表2列出的核苷酸序列。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，單倍分型方法使用具有表2所列序列的至少一個(gè)引物。合適地，使用最少2組引物。本發(fā)明的等位基因特異性寡核苷酸引物具有3’末端核苷酸或優(yōu)選3’倒數(shù)第二個(gè)核苷酸，其只與特定SNP的一個(gè)核苷酸互補(bǔ)，從而只有在含有所述核苷酸的等位基因存在時(shí)才能作為用于聚合酶介導(dǎo)的延伸的引物起作用。本發(fā)明預(yù)期了與編碼或非編碼鏈雜交的等位基因特異性寡核苷酸引物。本發(fā)明的其它基因分型寡核苷酸與目標(biāo)區(qū)域雜交，所述目標(biāo)區(qū)域位于本文鑒定的一個(gè)新的多態(tài)性位點(diǎn)下游的一至幾個(gè)核苷酸。這些寡核苷酸可用于聚合酶介導(dǎo)的引物延伸方法，該方法用于檢測(cè)ADRB2基因多態(tài)性，并因此在本文中被稱為“引物-延伸寡核苷酸”。在優(yōu)選實(shí)施方案中，引物-延伸寡核苷酸的3’-末端是脫氧核苷酸，其與位于所述多態(tài)性位點(diǎn)直接相鄰處的核苷酸互補(bǔ)。用于檢測(cè)ADRB2基因在位置-1429、-1023、-654、-367、-47、-20、46、79、252和523多態(tài)性的特別優(yōu)選的寡核苷酸引物通過引物延伸終止于選自下組的核苷酸序列具有如表2和3所列的序列的引物。在一些實(shí)施方案中，組合物含有兩種或兩種以上不同標(biāo)記的基因分型寡核苷酸，其用于同時(shí)在兩個(gè)或兩個(gè)以上多態(tài)性位點(diǎn)探測(cè)核苷酸的同一性。還預(yù)期引物組合物可以含有兩組或兩組以上等位基因特異性引物對(duì)，以允許同時(shí)靶向(target)和擴(kuò)增含有多態(tài)性位點(diǎn)的兩個(gè)或兩個(gè)以上區(qū)域。本發(fā)明的ADRB2寡核苷酸也可以排列(array)到固體表面上，以提供用于快速篩選樣品多態(tài)性的有序陣列(orderedarray)。陣列技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如，在WO98/20020和WO98/20019中描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)ADRB2單倍型可以與其它SNPs或單倍型的檢測(cè)組合，用于精確診斷或確定治療方案。合適的組合包括其它呼吸道疾病相關(guān)基因，例如，代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和/或涉及對(duì)β2-激動(dòng)劑的反應(yīng)途徑(responsepathway)的其它基因?；蚍中头椒ǖ囊粋€(gè)實(shí)施方案涉及從個(gè)體分離核酸混合物，所述核酸混合物包含存在于所述個(gè)體中的兩個(gè)拷貝的ADRB2基因或其片段，并在圖1鑒定的一個(gè)或多個(gè)位置測(cè)定在兩個(gè)拷貝中所述核苷酸對(duì)的同一性，從而為所述個(gè)體指定ADRB2基因型。如熟練技術(shù)人員所容易理解的，個(gè)體中兩個(gè)“拷貝”的基因可以是相同的等位基因(純合的)或可以是不同的等位基因(雜合的)。通常，所述核酸混合物從取自所述個(gè)體的生物樣品，例如血液樣品或組織樣品中分離。合適的組織樣品包括全血(wholeblood)、精液、唾液、淚液、尿、糞便材料、汗、口腔物(buccal)、皮膚和毛發(fā)。所述核酸混合物可以包括基因組DNA、mRNA或cDNA，并且在后兩種情況下，所述生物樣品必須從表達(dá)ADRB2基因的器官獲得。另外熟練技術(shù)人員會(huì)理解mRNA或cDNA的制備不能用于檢測(cè)位于內(nèi)含子中或5’和3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)中的多態(tài)性。如果分離ADRB2基因片段，它必須含有待進(jìn)行基因分型的多態(tài)性位點(diǎn)。如以下進(jìn)一步描述，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)患者對(duì)長效β2激動(dòng)劑的支氣管擴(kuò)張反應(yīng)可以通過鑒定單倍型C的存在而預(yù)測(cè)。這可以通過對(duì)ADRB2基因中僅三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)即位點(diǎn)-47(T)、46(G)和79(C)進(jìn)行基因分型而測(cè)定。因此，本發(fā)明還提供用于預(yù)測(cè)對(duì)長效beta-激動(dòng)劑的個(gè)體反應(yīng)的診斷試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包含一組包裝在容器中的基因分型寡核苷酸，其用于對(duì)ADRB2基因中的單倍型C進(jìn)行基因分型。所述試劑盒還可以含有其它成分例如雜交緩沖液，其中所述寡核苷酸將用作等位基因特異性探針，或雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)，其中將通過引物延伸檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)。所述試劑盒還可以含有聚合酶和反應(yīng)緩沖液，其經(jīng)優(yōu)化用于由所述聚合酶介導(dǎo)的引物延伸。優(yōu)選的試劑盒還可以包括檢測(cè)試劑，例如生物素或熒光標(biāo)記的寡核苷酸或ddNTPs和/或酶標(biāo)記的抗體和一種或多種底物，所述底物在被酶作用時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑盒中的每種基因分型寡核苷酸和所有其它試劑已對(duì)用于檢測(cè)單倍型C的基因分型測(cè)試中的最佳性能作了品質(zhì)檢測(cè)，并且所述試劑盒還包含用于實(shí)施所述測(cè)試并由結(jié)果指定ADRB2單倍型對(duì)的說明。熟練技術(shù)人員將會(huì)理解，適當(dāng)?shù)貫榱吮３稚飳W(xué)或化學(xué)活性并使之能夠適當(dāng)?shù)赜糜谒鰷y(cè)試中，可將用于實(shí)施基因分型測(cè)試的一組基因分型寡核苷酸和試劑在獨(dú)立的貯器(receptacle)中提供，所述貯器置于合適的容器中。在作為不同單倍型特征的多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)多態(tài)性的同時(shí)，將會(huì)認(rèn)識(shí)到特定的其它多態(tài)性位點(diǎn)高度預(yù)示著上游或下游的其它多態(tài)性的存在，即它們?cè)趥€(gè)體中是連鎖的(linked)；它們總是一起遺傳。因此，通過在不同位點(diǎn)鑒定另一個(gè)連鎖的多態(tài)性來檢測(cè)特定單倍型的存在包括于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這意味著除了在特定單倍型內(nèi)與感興趣的等位基因特異性結(jié)合的探針之外，本發(fā)明還包括檢測(cè)連鎖的多態(tài)性。在另一實(shí)施方案中，可以通過使用特異性結(jié)合到蛋白質(zhì)形式的抗體來測(cè)定單倍型C的存在，所述蛋白質(zhì)形式由具有氨基酸改變Gly16Arg和Gln27Glu的單倍型C的相應(yīng)cDNA表達(dá)。用于產(chǎn)生合適的抗體和用于檢測(cè)它們與樣品的結(jié)合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。檢測(cè)單倍型的存在的用途如下面更詳細(xì)公開的，至少一個(gè)拷貝的ADRB2C單倍型的存在預(yù)示對(duì)于長效β2激動(dòng)劑的臨床上顯著的支氣管擴(kuò)張反應(yīng)。因此，本發(fā)明在開β2激動(dòng)劑的處方用于支氣管痙攣(bronchospasm)的長期治療中是有用的。單倍型信息可用于確定合適的藥物治療方案。如本文所公開的，與在那些“非C”個(gè)體中觀測(cè)到的相比，單倍型C的存在導(dǎo)致對(duì)于用長效beta激動(dòng)劑治療更長期的反應(yīng)。如本文所公開的，C單倍型的存在與氣促、咳嗽和多痰(sputum)癥狀的臨床上顯著減輕相關(guān)。C單倍型組中患者之間BCSS反應(yīng)的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上好于非C單倍型亞組中那些患者的反應(yīng)。因此，醫(yī)生可以使用單倍型信息以確定待使用的恰當(dāng)藥物、最佳治療的劑量和所應(yīng)施用的藥物治療的頻率等等。單倍型狀態(tài)也可用于預(yù)測(cè)藥物配置、功效、耐受性和安全性。提供這種信息允許個(gè)性化的藥品。將遺傳藥理學(xué)引入到臨床試驗(yàn)中增加了對(duì)特定患者組進(jìn)行更安全和更有效治療的前景?，F(xiàn)在將進(jìn)一步以舉例方式描述本發(fā)明，所述例子意在幫助一個(gè)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明，并不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1用于基因分型的樣品取自四個(gè)ViozanTMIII期臨床試驗(yàn)即SC-397-5097、SC-397-5098、SC-397-5099和SC-397-5163中招募的2450個(gè)患者?；颊呷后w包括男性和女性患者，年齡40至80歲，患有穩(wěn)定的COPD，癥狀≥2年，并且有至少15年(packyears)的抽煙史。所述研究包括表現(xiàn)出支氣管擴(kuò)張前和支氣管擴(kuò)張后的FEV1/FVC(用力肺活量)小于(預(yù)測(cè)的正常水平的)65％，和預(yù)測(cè)的正常水平的20-70％的支氣管擴(kuò)張前和支氣管擴(kuò)張后FEV1的患者。有關(guān)患者群體的更多細(xì)節(jié)和研究設(shè)計(jì)描述于Laursen等.RespiratoryMedicine(2003)，Vol97，SupplA，S23-S33中。參與遺傳學(xué)子研究是自愿的?；颊邔?duì)于遺傳分析給出獨(dú)立的書面告知同意書?；颊呔馓峁〥NA用于在研究對(duì)ViozanTM的反應(yīng)。ViozanTM是雙重激動(dòng)劑(dualagonist)，靶向β2-腎上腺素能受體和多巴胺D2受體基因，被開發(fā)用于COPD的治療(Rennard，2003，RespiratoryMedicine，Vol97，SupplA，S1-S2)。ADRB2基因分型的方法使用TaqMan或SNaPshot(由AppliedBiosystems支持的基因分型方法學(xué))確定腎上腺素能受體中的14個(gè)SNPs的基因型，其位于編碼區(qū)和5’啟動(dòng)子區(qū)中(圖1)?；蚍中偷腟NPs的位置概括于表1。SNP位置是基于cDNA參照序列M15169，其序列列于SEQ.IDNO1，其中核苷酸位置與ATG相關(guān)并且A＝+1，而負(fù)數(shù)表示相對(duì)于翻譯起始密碼子的5’位置。等位基因頻率是以臨床試驗(yàn)群體為基礎(chǔ)，所述群體98％是白種人。TaqMan基因分型在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用在邊測(cè)試邊設(shè)計(jì)(assays-by-design)的服務(wù)下自ABI獲得的試劑來實(shí)施。用于通過TaqMan進(jìn)行基因分型的12個(gè)ADRB2SNPs的PCR引物和等位基因特異性探針概括于表2。SNaPshot基因分型用于對(duì)另外兩個(gè)SNPs(az0003873和az0003875)進(jìn)行基因分型，用于該基因分型的PCR引物和引物延伸探針概括于表3(兩個(gè)PCR正向，SEQ.IDNOs50，51；兩個(gè)PCR反向，SEQ.IDNos52，53；兩個(gè)SnaPshot引物反向，SEQ.IDNos54，55)。沒有優(yōu)化用于SNPaz0003873的測(cè)試，并且所述基因分型數(shù)據(jù)未用于任何進(jìn)一步分析。先前已報(bào)導(dǎo)過SNPaz0003873頻率為1％(參見，例如，AmJRespirCellMolBiol.1993Mar；8(3)334-9)。連鎖不平衡分析(linkagedisequilibriumanalysis)的方法使用修訂版的EH(Xie，Ott，AmJHumGenet，suppl，53，1107(1993))對(duì)于ADRB2中14個(gè)SNPs的12個(gè)計(jì)算成對(duì)連鎖不平衡測(cè)量值。SNPIDsaz0003873和az0003875未用于所述分析。未獲得az0003873的基因分型數(shù)據(jù)。基于在該臨床試驗(yàn)群體中的低等位基因頻率將SNPaz0003875排除。在所述基因的大部分都存在高度的連鎖不平衡，然而該連鎖不平衡確實(shí)在基因的3’端內(nèi)中止。因此將SNPIdsaz0003877和az0003878，二者均為同義SNPs，從任何進(jìn)一步的分析中排除。單倍型分析方法和指定單倍型對(duì)所分析的14個(gè)ADRB2SNPs中，將10個(gè)SNPs的基因型數(shù)據(jù)用于指定ADRB2單倍型?；诘偷任换蝾l率將SNPIDsaz0003873和az0003875的數(shù)據(jù)排除。SNPIDsaz0003877和az0003878，二者均為同義SNPs，從單倍型分析中排除，因?yàn)榛?’端的連鎖不平衡較不強(qiáng)烈。這兩個(gè)3’SNPs的包括具有增加預(yù)測(cè)的稀有單倍型數(shù)目的影響。程序包SNPHAP(http://www-gene.cimr.cam.ac.uk/clayton/software/)用于預(yù)測(cè)超過0.3％水平的單倍型。選擇0.3％的截止(cutoff)以優(yōu)化具有預(yù)測(cè)單倍型的個(gè)體的數(shù)目并減少稀有單倍型的數(shù)目。對(duì)于2412個(gè)受試者，這導(dǎo)致5種具有0.3％以上頻率的常見單倍型和預(yù)測(cè)的單倍型對(duì)。在被基因分型的2450個(gè)患者中，發(fā)現(xiàn)5種常見單倍型占臨床試驗(yàn)群體(98％的白種人)中單倍型多樣性的99％。將5種最常見單倍型的單倍型頻率，以及這些單倍型中在每個(gè)SNP的核苷酸變體概括于表4。將單倍型對(duì)指定給每個(gè)受試者。除了38個(gè)受試者之外的所有受試者均基于5種最常見單倍型指定了單倍型對(duì)。其余受試者具有至少一種稀有單倍型(＜0.3％)。將每種單倍型對(duì)的觀測(cè)到的頻率概括于表5。ADRB2基因型與對(duì)VIOZANTM的反應(yīng)的關(guān)聯(lián)在兩種非同義SNPsaz0003871和az0003872的每一種，以及在5’前導(dǎo)順反子(beta-上游肽，BUP)中的SNPaz0003869的氨基酸變體在ADRB2單倍型之間有所不同，如表6所概括。對(duì)β2-激動(dòng)劑藥物ViozanTM的反應(yīng)與ADRB2基因中的單個(gè)SNPs、與單倍型對(duì)和與“裝箱的(binned)”單倍型組相關(guān)連。例如，將包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的“C”單倍型的受試者分在一組(C單倍型組)，并將所述反應(yīng)與不含“C”單倍型拷貝的受試者(非C單倍型組)相比較。實(shí)施例2-單倍型-肺功能分析劑量給藥前(pre-dose)和劑量給藥后(post-dose)的FEV1(1秒鐘用力呼氣量)，即FVC操縱(manoeuvre)中在第一秒內(nèi)呼出空氣的體積(以升表示)，對(duì)于所有患者在每次研究就診時(shí)獲取其測(cè)量值，如臨床研究方案中所述。在每個(gè)中心使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施肺活量測(cè)定。有關(guān)所用的肺活量計(jì)和校準(zhǔn)記錄的詳情由每個(gè)中心提供。休息15分鐘后，測(cè)定緩慢肺活量(SVC；slowvitalcapacity)、用力肺活量(FVC)和FEV1，進(jìn)行至少三個(gè)獨(dú)立的操縱(manoeuvre)。記錄每個(gè)參數(shù)的最大值。在患者亞組中(其中的所有患者響應(yīng)吸入SABA柳丁氨醇(salbutamol)400μg，顯示≥5％的FEV1可逆性)，在8hr期間獲取系列FEV1測(cè)量值(于5、15、30、45、60、90和120分鐘時(shí)，并在此后每小時(shí)一次，直至給藥后(post-dosing)8小時(shí))。在第1天(研究SC-397-5097和SC-397-5098)、第8和12周(SC-397-5098)以及第14和26周(SC-397-5097)進(jìn)行系列測(cè)量。計(jì)算AUC0-8、8小時(shí)的平均FEV1和與給藥前(FEV1最大值)的平均最大變化(meanmaximumchange)。這些測(cè)量用于研究長效β2-激動(dòng)劑ViozanTM的支氣管擴(kuò)張?zhí)匦?。圖2顯示在SC-397-5097和SC-397-5098試驗(yàn)中，通過ADRB2單倍型對(duì)分層的患者中的系列FEV1反應(yīng)。所述單倍型對(duì)為AA(N＝21)；AC(N＝15)；BA(N＝35)；BB(N＝13)；BC(N＝21)。將CC組從分析中排除。如上所述于第一次暴露于ViozanTM時(shí)分析系列FEV1。治療后5分鐘觀測(cè)對(duì)ViozanTM的反應(yīng)。FEV1持續(xù)增加直至治療后2小時(shí)。最大增加處于研究藥物后一到兩個(gè)小時(shí)。8小時(shí)的FEV1顯示用ViozanTM治療的作用持續(xù)時(shí)間。在通過ADRB2單倍型對(duì)分層的亞組之間觀測(cè)到大約100cc的差異。由于COPD中肺功能的微弱可逆性，50cc的改變被認(rèn)為是臨床上顯著的。在具有特定ADRB2單倍型的受試者中，已表明對(duì)LABA反應(yīng)的強(qiáng)度(FEV1最大值)和作用持續(xù)時(shí)間(8小時(shí)的FEV1)二者均更大。AUC(曲線下的面積)分析與FEV1最大值和8小時(shí)的FEV1反應(yīng)相關(guān)。具有更高的FEV1最大值和8小時(shí)FEV1的患者也具有更高的AUC0-8值。在具有BC單倍型的患者中獲得最強(qiáng)反應(yīng)。具有BB單倍型對(duì)的患者確實(shí)對(duì)LABA作出反應(yīng)，但與具有其它單倍型對(duì)的受試者相比反應(yīng)“較小”。這與由Drysdale等PNAS，97，2000公開的研究廣泛一致，其中單倍型4/6和4/4分別相應(yīng)于BC和BB。由于只有少數(shù)受試者的系列FEV1測(cè)量值可以獲得，并且為了提高分析的能力，隨后在基于每個(gè)患者的單倍型對(duì)的兩個(gè)亞組(“裝箱的(binning)”)中分析數(shù)據(jù)；“C”單倍型(即患者具有至少一個(gè)拷貝的“C”單倍型)和“非C”單倍型(即患者不具有“C”單倍型)?！癈”單倍型組包括具有單倍型AC、BC和CC的患者，而非C單倍型組包括具有單倍型AA、BB和AB的受試者。為了“裝箱的”單倍型分析，不包括具有一個(gè)或多個(gè)拷貝的單倍型D和E的受試者，因?yàn)閹缀鯖]有患者具有這些單倍型對(duì)。通過比較治療前(pre-treatment)和給藥前的基線，完成對(duì)ADRB2單倍型和長期FEV1反應(yīng)之間關(guān)系的評(píng)估?！爸委熐啊盕EV1基線是用于先前沒有暴露于研究藥物，并且于第1天(第2次就診)用ViozanTM治療前立即測(cè)定?！敖o藥前”FEV1基線是于后續(xù)就診那天在施用藥物前，在試驗(yàn)過程中測(cè)定的，即在第8和12周(SC-397-5098)以及第14和26周(SC-397-5097)。在這些試驗(yàn)過程中分析在系列FEV1患者中基線(波谷)FEV1的變化，顯示C-單倍型亞組中基線的上升趨勢(shì)，并且在缺乏單拷貝C-單倍型的那些受試者中輕微下降。在3個(gè)月和6個(gè)月的治療期間，在2個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中均觀測(cè)到這樣的結(jié)果。觀測(cè)結(jié)果與C單倍型亞組中延長的支氣管擴(kuò)張趨勢(shì)和響應(yīng)用ViozanTM和長效β2-激動(dòng)劑定期治療的更好的整體長期肺功能一致。通過從第2次就診(第1天)時(shí)收集的絕對(duì)FEV1測(cè)量值和第12周(SC-397-5098)以及第14周(SC-397-5097)的組合數(shù)據(jù)中減去治療前的基線值(第2次就診)，測(cè)定了第一次治療和之后3個(gè)月的ViozanTM治療之間系列FEV1反應(yīng)的分析結(jié)果。圖4顯示組合的系列FEV1數(shù)據(jù)，自治療前的變化，用于SC-397-5098和SC-397-5087研究，其中通過單倍型組(初診-ChapN＝36；初診-非CN＝65；3個(gè)月-ChapN＝29；3個(gè)月-非ChapN＝54)分層反應(yīng)。圖4表明3個(gè)月后具有非C單倍型的患者可能具有較弱的反應(yīng)。對(duì)于“C”單倍型亞組中的患者，第1天(第2次就診)的系列FEV1反應(yīng)與治療后3個(gè)月時(shí)的反應(yīng)重疊。對(duì)于非C單倍型組在第1天(第2次就診)觀測(cè)到類似的反應(yīng)。然而，在非C單倍型組中，治療3個(gè)月后系列FEV1反應(yīng)出現(xiàn)減小。該觀測(cè)結(jié)果是在“C”單倍型和“非C”單倍型亞組之間觀測(cè)到的差異FEV1基線的反映。通過ADRB2單倍型對(duì)的肺功能反應(yīng)分層(stratification)表明在具有“C”單倍型的COPD患者中，對(duì)β2激動(dòng)劑的反應(yīng)更強(qiáng)，并在長期治療期間得以保持。在具有至少一個(gè)拷貝ADRB2“C”單倍型的COPD患者中，借助于延長的作用持續(xù)時(shí)間，LABA藥物可以提供更強(qiáng)的支氣管保護(hù)。概括地說，這些數(shù)據(jù)表明對(duì)于所有攜帶至少一個(gè)“C”單倍型的個(gè)體，具有一致的對(duì)于ViozanTM更好的臨床反應(yīng)的趨勢(shì)。具有“C”單倍型的受試者具有對(duì)于ViozanTM的最佳的初始反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)單倍型對(duì)BC在首次暴露于所述藥物時(shí)獲得的FEV1的最大值最高。在“C”對(duì)比“非C”單倍型組中，通過評(píng)估兩個(gè)獨(dú)立功效試驗(yàn)中用ViozanTM治療的受試者的給藥前FEV1測(cè)量值來表明延長的作用持續(xù)時(shí)間(殘余支氣管擴(kuò)張(residualbronchodilation))。實(shí)施例3-單倍型-癥狀分?jǐn)?shù)關(guān)聯(lián)使用BCSS(氣促、咳嗽和多痰分?jǐn)?shù))，也稱為TSS(整體癥狀分?jǐn)?shù))評(píng)估COPD癥狀的變化。每天由患者評(píng)估每種癥狀，即氣促、咳嗽和多痰，并使用5分Likert評(píng)分(Likertscale)(范圍從0到4，越高的分值表示越嚴(yán)重的癥狀)記錄在日志中。合計(jì)三個(gè)項(xiàng)目分?jǐn)?shù)以計(jì)算BCSS總分，得到介于0和12之間的數(shù)值。Leidy等，2003，RespiratoryMedicine，Vol97，SupplA，S59-S70中討論了用于評(píng)估COPD中癥狀的BCSS的可靠性和有效性。BCSS總分上±1分的平均改變代表患有中度至嚴(yán)重COPD的患者癥狀嚴(yán)重程度的實(shí)質(zhì)性改善(Cellietal.RespiratoryMedicine，(2003)Vol97，SupplA，S35-43)。圖5顯示對(duì)于通過ADRB2單倍型對(duì)分層的患者亞組自基線BCSS的改變。將患者用ViozanTM治療。所述單倍型對(duì)為AA(N＝61)；AC(N＝35)；BA(N＝100)；BB(N＝40)；BC(N＝41)；CC(N＝8)。在12周試驗(yàn)(SC-397-5163)中顯示患者自基線的改變，其中對(duì)于每種單倍型對(duì)顯示每2周間隔的平均BCSS分?jǐn)?shù)，(F-up指治療后的4周跟蹤期)。觀測(cè)到依賴于單倍型對(duì)的廣泛的反應(yīng)分層。于第1-2周觀測(cè)到BCSS反應(yīng)的分層，并在整個(gè)治療過程中保持。BCSS中0.3單位的差異被認(rèn)為是臨床上顯著的。因此顯示最好反應(yīng)的亞組(BC、CC和AC)與反應(yīng)不太好的那些患者(亞組AA和BA)之間的差異在臨床上是相關(guān)的。由于具有至少一個(gè)拷貝C單倍型的受試者看起來表現(xiàn)出最大的癥狀減輕，如先前(實(shí)施例2)所述使用“裝箱的”單倍型組分析數(shù)據(jù)。圖6顯示SC-397-5163研究中對(duì)于用ViozanTM治療的患者，BCSS自基線的平均改變，該研究中將患者分層到亞組?？梢詫Haps(N＝84)和非CHaps(N＝201)亞組中的BCSS反應(yīng)與未分層的患者群體(所有Haps，N＝285)中的平均反應(yīng)相比較。圖6顯示具有至少一個(gè)“C”單倍型的患者對(duì)ViozanTM的反應(yīng)更好。C單倍型亞組中的BCSS反應(yīng)比總體平均反應(yīng)(所有患者)更好，并且顯著好于非C單倍型亞組中的BCSS反應(yīng)。用ViozanTM治療時(shí)，具有“C”單倍型的患者經(jīng)歷更大的癥狀分?jǐn)?shù)減小。在一個(gè)獨(dú)立的3個(gè)月功效試驗(yàn)SC-397-5098中重復(fù)BCSS反應(yīng)的分層，但不在6個(gè)月功效試驗(yàn)SC-397-5097中重復(fù)。圖7顯示其中組合了兩個(gè)3個(gè)月功效研究數(shù)據(jù)的BCSS反應(yīng)(在ViozanTM研究SC-397-5163和SC-397-5098中的患者的BCSS自基線的平均改變，其中將患者分層到亞組中)?？梢詫Haps和非CHaps亞組中的BCSS反應(yīng)與未分層的患者群體中的平均反應(yīng)相比。圖7A顯示用ViozanTM治療的所有受試者的平均反應(yīng)，和基于ADRB2“C”單倍型的存在或缺失而分層患者后的BCSS反應(yīng)。圖7A顯示CHaps(N＝167)、非CHaps(N＝370)、所有Haps(N＝537)的數(shù)據(jù)。與“非C”Haps(AA、BB、BA)相比，具有“C”Haps(AC、BC、CC)的ViozanTM患者在平均BCSS中具有多達(dá)0.6的減小。圖7B顯示對(duì)用安慰劑處理的患者的相同分析，并且顯示幾乎沒有安慰劑反應(yīng)的分層的跡象(evidence)。圖7B顯示CHaps(N＝141)、非CHaps(N＝265)、所有Haps(N＝406)的數(shù)據(jù)。通過ADRB2單倍型分層顯示具有至少一個(gè)拷貝C單倍型的患者傾向于具有更好的癥狀分?jǐn)?shù)，并且這在整個(gè)治療過程中得以保持。C-單倍型組代表該臨床試驗(yàn)群體的大約30％。因此，與平均安慰劑反應(yīng)相比時(shí)，大約30％的患者對(duì)ViozanTM具有臨床上顯著的BCSS反應(yīng)。用ViozanTM進(jìn)行大規(guī)模臨床研究的其中一個(gè)主要終點(diǎn)是自基線到治療期最后4周的平均BCSS的改變。在未分層的患者群體中，ViozanTM和安慰劑治療組之間，自基線到治療期最后4周的變化的差異既在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著，也不被認(rèn)為具有臨床的重要性。分析相同的數(shù)據(jù)，顯示具有至少一個(gè)拷貝C單倍型的受試者對(duì)ViozanTM反應(yīng)良好，在所述數(shù)據(jù)中基于ADRB2C單倍型的存在或缺失將患者分層。在C單倍型亞組中，對(duì)ViozanTM的反應(yīng)顯著好于非C單倍型組中的反應(yīng)，并顯著好于對(duì)安慰劑的反應(yīng)。圖8顯示C單倍型和非C單倍型亞組之間以及ViozanTM和安慰劑治療之間BCSS反應(yīng)的統(tǒng)計(jì)比較。圖8顯示ViozanTMCHaps(N＝167)、ViozanTM非CHaps(N＝369)、安慰劑CHaps(N＝141)和安慰劑非CHaps(N＝265)的數(shù)據(jù)。ViozanTMC和非Chaps之間的差異是非常顯著的(p＝0.0023)?？偨Y(jié)對(duì)于臨床結(jié)果的肺功能和BCSS測(cè)量值來說，與非CHap個(gè)體相比，具有一個(gè)或多個(gè)“C”單倍型的患者均對(duì)ViozanTM反應(yīng)較好。我們已顯示ADRB2單倍型與用ViozanTM治療的COPD患者中癥狀減輕之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著關(guān)聯(lián)。C單倍型組中COPD癥狀的改善顯著大于ViozanTM非C單倍型組和安慰劑C單倍型組中的情況。BCSS分?jǐn)?shù)與COPD治療中的其它干預(yù)有效性的測(cè)量值包括FEV1和SGRQ(Leidyetal，2003，RespiratoryMedicine，Vol97，SupplA，S59-S70)有很好的關(guān)聯(lián)。因此高達(dá)30％的具有限定的ADRB2單倍型的COPD受試者具有臨床上顯著的對(duì)于β2-激動(dòng)劑的BCSS反應(yīng)的觀測(cè)結(jié)果是顯著的。支氣管擴(kuò)張持續(xù)時(shí)間增加的趨勢(shì)與定期暴露于LABA后C單倍型亞組中長期肺功能改善的觀測(cè)結(jié)果一致。本研究中，起反應(yīng)的亞組代表30％的患者。“反應(yīng)者組”中受試者的比例與98％的臨床試驗(yàn)群體為白種人來源相符。在C單倍型具有更高頻率的群體中，預(yù)期反應(yīng)者組的大小將更大。例如，在非洲裔美國人中C單倍型是最常見的ADRB2單倍型(Drysdaleetal.)。Drysdale等報(bào)導(dǎo)了哮喘中ADRB2單倍型和對(duì)于短效β2激動(dòng)劑舒喘靈的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)，這通過肺功能進(jìn)行評(píng)估。在所述研究中，用4/6單倍型觀測(cè)到最好的反應(yīng)。這與本文提供的對(duì)于長效β2激動(dòng)劑ViozanTM結(jié)果一致，其中BC單倍型顯示最好的反應(yīng)。類似地，用4/4單倍型觀測(cè)到最低反應(yīng)對(duì)應(yīng)于用BB單倍型獲得的ViozanTM結(jié)果，并且用2/2單倍型觀測(cè)到中度反應(yīng)，對(duì)應(yīng)于用AA單倍型獲得的ViozanTM結(jié)果。因此，這是在COPD群體中，有關(guān)長期維持治療的對(duì)于β2-激動(dòng)劑反應(yīng)的首個(gè)遺傳藥理學(xué)分層的實(shí)例。數(shù)據(jù)顯示可以使用基因分型手段鑒定COPD患者群體，其對(duì)用有定期預(yù)定的(regularlyscheduled)β2-激動(dòng)劑的長期治療反應(yīng)最佳。與C單倍型組相比，C單倍型亞組看起來明顯表現(xiàn)出對(duì)于b2-激動(dòng)劑的延長的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間?；颊逜DRB2單倍型的知悉可用于優(yōu)化對(duì)于單個(gè)患者的b2-激動(dòng)劑劑量和治療方案，因此對(duì)具有一個(gè)或多個(gè)拷貝C單倍型的那些個(gè)體減少總的藥物負(fù)載(load)和暴露(exposure)。表現(xiàn)在提供本文以上提到的表1至6。表1注基于cDNA參照序列M15169的SNP位點(diǎn)注意ADRB2是單一外顯子基因，此表中的SNPs聚集在3.2kb區(qū)域基于對(duì)2450個(gè)受試者的臨床試驗(yàn)群體進(jìn)行基因分型的等位基因頻率表2用于對(duì)ADRB2SNPs進(jìn)行基因分型的TaqMan引物和等位基因特異性探針表3用于對(duì)ADRB2SNPs進(jìn)行基因分型的SNaPshotPCR和引物延伸引物。表4在占優(yōu)勢(shì)的白種人臨床試驗(yàn)群體中最常見的ADRB2單倍型的頻率自2450個(gè)受試者的基因型數(shù)據(jù)測(cè)得表中沒有顯示稀有單倍型(頻率＜0.3)表5ADRB2單倍型對(duì)的頻率，其中單倍型對(duì)是單倍型A、B、C、D和E的組合表6由最常見的ADRB2單倍型編碼的氨基酸變體序列SEQ.IDNO1ADRB2cDNA序列(M15169)；長度34511CCCGGGTTCAAGAGATTCTCCTGTCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGACTACAGGTACGTG61CCACCACACCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGACAAGAGTTACACCATATTGGCC121AGGATCTTTTGCTTTCTATAGCTTCAAAATGTTCTTAATGTTAAGACATTCTTAATACTC181TGAACCATATGAATTTGCCATTTTGGTAAGTCACAGACGCCAGATGGTGGCAATTTCACA241TGGCACAACCCGAAAGATTAACAAACTATCCAGCAGATGAAAGGATTTTTTTTAGTTTCA301TTGGGTTTACTGAAGAAATTGTTTGAATTCTCATTGCATCTCCAGTTCAACAGATAATGA361GTGAGTGATGCCACACTCTCAAGAGTTAAAAACAAAACAACAAAAAAATTAAAACAAAAG421CACACAACTTTCTCTCTCTGTCCCAAAATACATACTTGCATACCCCCGCTCCAGATAAAA481TCCAAAGGGTAAAACTGTCTTCATGCCTGCAAATTCCTAAGGAGGGCACCTAAAGTACTT541GACAGCGAGTGTGCTGAGGAAATCGGCAGCTGTTGAAGTCACCTCCTGTGCTCTTGCCAA601ATGTTTGAAAGGGAATACACTGGGTTACCGGGTGTATGTTGGGAGGGGAGCATTATCAGT661GCTCGGGTGAGGCAAGTTCGGAGTACCCAGATGGAGACATCCGTGTCTGTGTCGCTCTGG721ATGCCTCCAAGCCAGCGTGTGTTTACTTTCTGTGTGTGTCACCATGTCTTTGTGCTTCTG781GGTGCTTCTGTGTTTGTTTCTGGCCGCGTTTCTGTGTTGGACAGGGGTGACTTTGTGCCG841GATGGCTTCTGTGTGAGAGCGCGCGCGAGTGTGCATGTCGGTGAGCTGGGAGGGTGTGTC901TCAGTGTCTATGGCTGTGGTTCGGTATAAGTCTGAGCATGTCTGCCAGGGTGTATTTGTG961CCTGTATGTGCGTGCCTCGGTGGGCACTCTCGTTTCCTTCCGAATGTGGGGCAGTGCCGG1021TGTGCTGCCCTCTGCCTTGAGACCTCAAGCCGCGCAGGCGCCCAGGGCAGGCAGGTAGCG1081GCCACAGAAGAGCCAAAAGCTCCCGGGTTGGCTGGTAAGGACACCACCTCCAGCTTTAGC1141CCTCTGGGGCCAGCCAGGGTAGCCGGGAAGCAGTGGTGGCCCGCCCTCCAGGGAGCAGTT1201GGGCCCCGCCCGGGCCAGCCCCAGGAGAAGGAGGGCGAGGGGAGGGGAGGGAAAGGGGAG1261GAGTGCCTCGCCCCTTCGCGGCTGCCGGCGTGCCATTGGCCGAAAGTTCCCGTACGTCAC1321GGCGAGGGCAGTTCCCCTAAAGTCCTGTGCACATAACGGGCAGAACGCACTGCGAAGCGG1381CTTCTTCAGAGCACGGGCTGGAACTGGCAGGCACCGCGAGCCCCTAGCACCCGACAAGCT1441GAGTGTGCAGGACGAGTCCCCACCACACCCACACCACAGCCGCTGAATGAGGCTTCCAGG1501CGTCCGCTCGCGGCCCGCAGAGCCCCGCCGTGGGTCCGCCCGCTGAGGCGCCCCCAGCCA1561GTGCGCTTACCTGCCAGACTGCGCGCCATGGGGCAACCCGGGAACGGCAGCGCCTTCTTG1621CTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGGACCACGACGTCACGCAGCAAAGGGACGAGGTG1681TGGGTGGTGGGCATGGGCATCGTCATGTCTCTCATCGTCCTGGCCATCGTGTTTGGCAAT1741GTGCTGGTCATCACAGCCATTGCCAAGTTCGAGCGTCTGCAGACGGTCACCAACTACTTC1801ATCACTTCACTGGCCTGTGCTGATCTGGTCATGGGCCTGGCAGTGGTGCCCTTTGGGGCC1861GCCCATATTCTTATGAAAATGTGGACTTTTGGCAACTTCTGGTGCGAGTTTTGGACTTCC1921ATTGATGTGCTGTGCGTCACGGCCAGCATTGAGACCCTGTGCGTGATCGCAGTGGATCGC1981TACTTTGCCATTACTTCACCTTTCAAGTACCAGAGCCTGCTGACCAAGAATAAGGCCCGG2041GTGATCATTCTGATGGTGTGGATTGTGTCAGGCCTTACCTCCTTCTTGCCCATTCAGATG2101CACTGGTACCGGGCCACCCACCAGGAAGCCATCAACTGCTATGCCAATGAGACCTGCTGT2161GACTTCTTCACGAACCAAGCCTATGCCATTGCCTCTTCCATCGTGTCCTTCTACGTTCCC2221CTGGTGATCATGGTCTTCGTCTACTCCAGGGTCTTTCAGGAGGCCAAAAGGCAGCTCCAG2281AAGATTGACAAATCTGAGGGCCGCTTCCATGTCCAGAACCTTAGCCAGGTGGAGCAGGAT2341GGGCGGACGGGGCATGGACTCCGCAGATCTTCCAAGTTCTGCTTGAAGGAGCACAAAGCC2401CTCAAGACGTTAGGCATCATCATGGGCACTTTCACCCTCTGCTGGCTGCCCTTCTTCATC2461GTTAACATTGTGCATGTGATCCAGGATAACCTCATCCGTAAGGAAGTTTACATCCTCCTA2521AATTGGATAGGCTATGTCAATTCTGGTTTCAATCCCCTTATCTACTGCCGGAGCCCAGAT2581TTCAGGATTGCCTTCCAGGAGCTTCTGTGCCTGCGCAGGTCTTCTTTGAAGGCCTATGGG2641AATGGCTACTCCAGCAACGGCAACACAGGGGAGCAGAGTGGATATCACGTGGAACAGGAG2701AAAGAAAATAAACTGCTGTGTGAAGACCTCCCAGGCACGGAAGACTTTGTGGGCCATCAA2761GGTACTGTGCCTAGCGATAACATTGATTCACAAGGGAGGAATTGTAGTACAAATGACTCA2821CTGCTGTAAAGCAGTTTTTCTACTTTTAAAGACCCCCCCCCCCCCAACAGAACACTAAAC2881AGACTATTTAACTTGAGGGTAATAAACTTAGAATAAAATTGTAAAAATTGTATAGAGATA2941TGCAGAAGGAAGGGCATCCTTCTGCCTTTTTTATTTTTTTAAGCTGTAAAAAGAGAGAAA3001ACTTATTTGAGTGATTATTTGTTATTTGTACAGTTCAGTTCCTCTTTGCATGGAATTTGT3061AAGTTTATGTCTAAAGAGCTTTAGTCCTAGAGGACCTGAGTCTGCTATATTTTCATGACT3121TTTCCATGTATCTACCTCACTATTCAAGTATTAGGGGTAATATATTGCTGCTGGTAATTT3181GTATCTGAAGGAGATTTTCCTTCCTACACCCTTGGACTTGAGGATTTTGAGTATCTCGGA3241CCTTTCAGCTGTGAACATGGACTCTTCCCCCACTCCTCTTATTTGCTCACACGGGGTATT3301TTAGGCAGGGATTTGAGGAGCAGCTTCAGTTGTTTTCCCGAGCAAAGGTCTAAAGTTTAC3361AGTAAATAAAATGTTTGACCATGCCTTCATTGCACCTGTTTGTCCAAAACCCCTTGACTG3421GAGTGCTGTTGCCTCCCCCACTGGAAACCGCSEQ.IDNO2至SEQ.IDNO13表2VIC探針序列2tgtcttaacattaagaacat203acagctgccgattt144agtctgagcatgtct155cagcctcaggagaa146tcagcaggcggac137agtgcgcttacctg148cccaatggaagcca149tcacgcagcaaag1310atgggcctggcagt1411tggtaccgggccac1412aggcctatgggaatg1513cactgctgtaaagc14SEQ.IDNO14至SEQ.IDNO25表26FAM探針序列14aagaatgtcttaactttaag2015agctgctgatttc1316aagtctaagcatgtctg1717cagccccaggaga1318tcagcgggcggac1319agtgcgctcacctg1420cccaatagaagccatg1621tcacgcaggaaag1322atgggcctagcagtg1523tggtacagggccacc1524ctatggcaatggc1325actcactgctataaag16SEQ.IDNO25至SEQ.IDNO37表2正向引物序列26gccaggatcttttgctttctatagc2527ggagggcacctaaagtacttgaca2428tgtctatggctgtggttcggtat2329gccctccagggagcagtt1830ccgctgaatgaggcttcca1931ccgctgaatgaggcttcca1932ggcagcgccttcttgct1733gcgccggaccacgac1534cactggcctgtgctgatctg2035ttcttgcccattcagatgca2036cctgcgcaggtcttctttg1937ataacattgattcacaagggaggaa25SEQ.IDNO38至SEQ.IDNO49表2反向引物序列38atggcaaattcatatggttcagagt2539gcaagagcacaggaggtgactt2240cgcacatacaggcacaaatacac2341aggcactcctcccctttcc1942ccatggcgcgcagtct1643ccatggcgcgcagtct1644acccacacctcgtcccttt1945aggacgatgagagacatgacgat2346ggcggccccaaagg1447gcatagcagttgatggcttcct2248gtgttgccgttgctggagta2049gttaaatagtctgtttagtgttctgttggg30SEQ.IDNO50至SEQ.IDNO51表3PCR正向序列50cacagccgctgaatgagg1851agtaccagagcctgctgacc20SEQ.IDNO52至SEQ.IDNO53表3PCR反向序列52aacttggcaatggctgtgat2053gacacgatggaagaggcaat20SEQ.IDNO54至SEQ.IDNO55表3SnaPshot引物反向序列54tgacgatgcccatgccca1855gcatctgaatgggcaagaaggag23序列表<110>阿斯利康(瑞典)有限公司(AstraZenecaAB)<120>將患者鑒定為用長效beta激動(dòng)劑治療的候選者并用于通過分析beta2腎上腺素能受體基因中的多態(tài)性來預(yù)測(cè)患者對(duì)長效beta2激動(dòng)劑治療的反應(yīng)的方法<130>101178<160>55<170>PatentInversion3.1<210>1<211>3451<212>DNA<213>人<400>1cccgggttcaagagattctcctgtctcagcctcccgagtagctgggactacaggtacgtg60ccaccacacctggctaatttttgtatttttagtagagacaagagttacaccatattggcc120aggatcttttgctttctatagcttcaaaatgttcttaatgttaagacattcttaatactc180tgaaccatatgaatttgccattttggtaagtcacagacgccagatggtggcaatttcaca240tggcacaacccgaaagattaacaaactatccagcagatgaaaggattttttttagtttca300ttgggtttactgaagaaattgtttgaattctcattgcatctccagttcaacagataatga360gtgagtgatgccacactctcaagagttaaaaacaaaacaacaaaaaaattaaaacaaaag420cacacaactttctctctctgtcccaaaatacatacttgcatacccccgctccagataaaa480tccaaagggtaaaactgtcttcatgcctgcaaattcctaaggagggcacctaaagtactt540gacagcgagtgtgctgaggaaatcggcagctgttgaagtcacctcctgtgctcttgccaa600atgtttgaaagggaatacactgggttaccgggtgtatgttgggaggggagcattatcagt660gctcgggtgaggcaagttcggagtacccagatggagacatccgtgtctgtgtcgctctgg720atgcctccaagccagcgtgtgtttactttctgtgtgtgtcaccatgtctttgtgcttctg780ggtgcttctgtgtttgtttctggccgcgtttctgtgttggacaggggtgactttgtgccg840gatggcttctgtgtgagagcgcgcgcgagtgtgcatgtcggtgagctgggagggtgtgtc900tcagtgtctatggctgtggttcggtataagtctgagcatgtctgccagggtgtatttgtg960cctgtatgtgcgtgcctcggtgggcactctcgtttccttccgaatgtggggcagtgccgg1020tgtgctgccctctgccttgagacctcaagccgcgcaggcgcccagggcaggcaggtagcg1080gccacagaagagccaaaagctcccgggttggctggtaaggacaccacctccagctttagc1140cctctggggccagccagggtagccgggaagcagtggtggcccgccctccagggagcagtt1200gggccccgcccgggccagccccaggagaaggagggcgaggggaggggagggaaaggggag1260gagtgcctcgccccttcgcggctgccggcgtgccattggccgaaagttcccgtacgtcac1320ggcgagggcagttcccctaaagtcctgtgcacataacgggcagaacgcactgcgaagcgg1380cttcttcagagcacgggctggaactggcaggcaccgcgagcccctagcacccgacaagct1440gagtgtgcaggacgagtccccaccacacccacaccacagccgctgaatgaggcttccagg1500cgtccgctcgcggcccgcagagccccgccgtgggtccgcccgctgaggcgcccccagcca1560gtgcgcttacctgccagactgcgcgccatggggcaacccgggaacggcagcgccttcttg1620ctggcacccaatagaagccatgcgccggaccacgacgtcacgcagcaaagggacgaggtg1680tgggtggtgggcatgggcatcgtcatgtctctcatcgtcctggccatcgtgtttggcaat1740gtgctggtcatcacagccattgccaagttcgagcgtctgcagacggtcaccaactacttc1800atcacttcactggcctgtgctgatctggtcatgggcctggcagtggtgccctttggggcc1860gcccatattcttatgaaaatgtggacttttggcaacttctggtgcgagttttggacttcc1920attgatgtgctgtgcgtcacggccagcattgagaccctgtgcgtgatcgcagtggatcgc1980tactttgccattacttcacctttcaagtaccagagcctgctgaccaagaataaggcccgg2040gtgatcattctgatggtgtggattgtgtcaggccttacctccttcttgcccattcagatg2100cactggtaccgggccacccaccaggaagccatcaactgctatgccaatgagacctgctgt2160gacttcttcacgaaccaagcctatgccattgcctcttccatcgtgtccttctacgttccc2220ctggtgatcatggtcttcgtctactccagggtctttcaggaggccaaaaggcagctccag2280aagattgacaaatctgagggccgcttccatgtccagaaccttagccaggtggagcaggat2340gggcggacggggcatggactccgcagatcttccaagttctgcttgaaggagcacaaagcc2400ctcaagacgttaggcatcatcatgggcactttcaccctctgctggctgcccttcttcatc2460gttaacattgtgcatgtgatccaggataacctcatccgtaaggaagtttacatcctccta2520aattggataggctatgtcaattctggtttcaatccccttatctactgccggagcccagat2580ttcaggattgccttccaggagcttctgtgcctgcgcaggtcttctttgaaggcctatggg2640aatggctactccagcaacggcaacacaggggagcagagtggatatcacgtggaacaggag2700aaagaaaataaactgctgtgtgaagacctcccaggcacggaagactttgtgggccatcaa2760ggtactgtgcctagcgataacattgattcacaagggaggaattgtagtacaaatgactca2820ctgctgtaaagcagtttttctacttttaaagacccccccccccccaacagaacactaaac2880agactatttaacttgagggtaataaacttagaataaaattgtaaaaattgtatagagata2940tgcagaaggaagggcatccttctgccttttttatttttttaagctgtaaaaagagagaaa3000acttatttgagtgattatttgttatttgtacagttcagttcctctttgcatggaatttgt3060aagtttatgtctaaagagctttagtcctagaggacctgagtctgctatattttcatgact3120tttccatgtatctacctcactattcaagtattaggggtaatatattgctgctggtaattt3180gtatctgaaggagattttccttcctacacccttggacttgaggattttgagtatctcgga3240cctttcagctgtgaacatggactcttcccccactcctcttatttgctcacacggggtatt3300ttaggcagggatttgaggagcagcttcagttgttttcccgagcaaaggtctaaagtttac3360agtaaataaaatgtttgaccatgccttcattgcacctgtttgtccaaaaccccttgactg3420gagtgctgttgcctcccccactggaaaccgc3451<210>2<211>20<212>DNA<213>人<400>2tgtcttaacattaagaacat20<210>3<211>14<212>DNA<213>人<400>3acagctgccgattt14<210>4<211>15<212>DNA<213>人<400>4agtctgagcatgtct15<210>5<211>14<212>DNA<213>人<400>5cagcctcaggagaa14<210>6<211>13<212>DNA<213>人<400>6tcagcaggcggac13<210>7<211>14<212>DNA<213>人<400>7agtgcgcttacctg14<210>8<211>14<212>DNA<213>人<400>8cccaatggaagcca14<210>9<211>13<212>DNA<213>人<400>9tcacgcagcaaag13<210>10<211>14<212>DNA<213>人<400>10atgggcctggcagt14<210>11<211>14<212>DNA<213>人<400>11tggtaccgggccac14<210>12<211>15<212>DNA<213>人<400>12aggcctatgggaatg15<210>13<211>14<212>DNA<213>人<400>13cactgctgtaaagc14<210>14<211>20<212>DNA<213>人<400>14aagaatgtcttaactttaag20<210>15<211>13<212>DNA<213>人<400>15agctgctgatttc13<210>16<211>17<212>DNA<213>人<400>16aagtctaagcatgtctg17<210>17<211>13<212>DNA<213>人<400>17cagccccaggaga13<210>18<211>13<212>DNA<213>人<400>18tcagcgggcggac13<210>19<211>14<212>DNA<213>人<400>19agtgcgctcacctg14<210>20<211>16<212>DNA<213>人<400>20cccaatagaagccatg16<210>21<211>13<212>DNA<213>人<400>21tcacgcaggaaag13<210>22<211>15<212>DNA<213>人<400>22atgggcctagcagtg15<210>23<211>15<212>DNA<213>人<400>23tggtacagggccacc15<210>24<211>13<212>DNA<213>人<400>24ctatggcaatggc13<210>25<211>16<212>DNA<213>人<400>25actcactgctataaag16<210>26<211>25<212>DNA<213>人<400>26gccaggatcttttgctttctatagc25<210>27<211>24<212>DNA<213>人<400>27ggagggcacctaaagtacttgaca24<210>28<211>23<212>DNA<213>人<400>28tgtctatggctgtggttcggtat23<210>29<21>18<212>DNA<213>人<400>29gccctccagggagcagtt18<210>30<211>19<212>DNA<213>人<400>30ccgctgaatgaggcttcca19<210>31<211>19<212>DNA<213>人<400>31ccgctgaatgaggcttcca19<210>32<211>17<212>DNA<213>人<400>32ggcagcgccttcttgct17<210>33<211>15<212>DNA<213>人<400>33gcgccggaccacgac15<210>34<211>20<212>DNA<213>人<400>34cactggcctgtgctgatctg20<210>35<211>20<212>DNA<213>人<400>35ttcttgcccattcagatgca20<210>36<211>19<212>DNA<213>人<400>36cctgcgcaggtcttctttg19<210>37<211>25<212>DNA<213>人<400>37ataacattgattcacaagggaggaa25<210>38<211>25<212>DNA<213>人<400>38atggcaaattcatatggttcagagt25<210>39<211>22<212>DNA<213>人<400>39gcaagagcacaggaggtgactt22<210>40<211>23<212>DNA<213>人<400>40cgcacatacaggcacaaatacac23<210>41<211>19<212>DNA<213>人<400>41aggcactcctcccctttcc19<210>42<211>16<212>DNA<213>人<400>42ccatggcgcgcagtct16<210>43<211>16<212>DNA<213>人<400>43ccatggcgcgcagtct16<210>44<211>19<212>DNA<213>人<400>44acccacacctcgtcccttt19<210>45<211>23<212>DNA<213>人<400>45aggacgatgagagacatgacgat23<210>46<211>14<212>DNA<213>人<400>46ggcggccccaaagg14<210>47<211>22<212>DNA<213>人<400>47gcatagcagttgatggcttcct22<210>48<211>20<212>DNA<213>人<400>48gtgttgccgttgctggagta20<210>49<211>30<212>DNA<213>人<400>49gttaaatagtctgtttagtgttctgttggg30<210>50<211>18<212>DNA<213>人<400>50cacagccgctgaatgagg18<210>51<211>20<212>DNA<213>人<400>51agtaccagagcctgctgacc20<210>52<211>20<212>DNA<213>人<400>52aacttggcaatggctgtgat20<210>53<211>20<212>DNA<213>人<400>53gacacgatggaagaggcaat20<210>54<211>18<212>DNA<213>人<400>54tgacgatgcccatgccca18<210>55<211>23<212>DNA<213>人<400>55gcatctgaatgggcaagaaggag2權(quán)利要求1.將患者鑒定為用長效beta激動(dòng)劑治療的候選者的方法，其包括a)從患者分離生物樣品；b)鑒定在所述樣品中存在或缺失至少一個(gè)單倍型C；其中在患者樣品中存在至少一個(gè)單倍型C表明所述患者是良好的治療候選者。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中用于鑒定存在或缺失至少一個(gè)單倍型C的方法包括a)由已從患者去除的生物樣品中分離核酸；和b)在ADRB2基因組DNA的一個(gè)等位基因中檢測(cè)存在于下述位點(diǎn)的下述核苷酸(參見表4)位點(diǎn)核苷酸-47T46G79C3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中用于鑒定存在或缺失至少一個(gè)單倍型C的方法包括a)由已從患者去除的生物樣品中分離核酸；和b)在ADRB2cDNA的一個(gè)等位基因中檢測(cè)存在于下述位點(diǎn)的下述核苷酸位點(diǎn)核苷酸-1429A-1023G-654G-367T-47T-20T46G79C252A523A4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中用于鑒定存在或缺失至少一個(gè)單倍型C的方法包括a)由已從患者去除的生物樣品中分離蛋白質(zhì)；和b)檢測(cè)ADRB2蛋白的存在，所述ADRB2蛋白在氨基酸位點(diǎn)16具有Gly，在氨基酸位點(diǎn)27具有Gln。5.如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者患有呼吸道疾病，優(yōu)選阻塞性氣管疾病，并最優(yōu)選COPD或哮喘。6.如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述長效beta2激動(dòng)劑是ViozanTM。7.用于預(yù)測(cè)哮喘患者對(duì)長效β2激動(dòng)劑治療的反應(yīng)的方法，其包括在ADRB2的編碼序列的核苷酸BUP、16和27檢測(cè)患者的基因型，其中如果所述患者具有Cys(BUP)、Gly16和Gln27，則該患者可能對(duì)標(biāo)準(zhǔn)劑量的長效β2激動(dòng)劑顯示良好的反應(yīng)。8.分離的核酸分子，其包含表2所列任一寡核苷酸探針的序列。9.用于預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)長效β2激動(dòng)劑的反應(yīng)的診斷試劑盒，其包含至少一種如權(quán)利要求8所述的分離的核酸分子。全文摘要本發(fā)明涉及用于將患者鑒定為用長效beta激動(dòng)劑治療的候選者的方法，其包括從患者分離生物樣品并鑒定至少一個(gè)單倍型C在beta2－腎上腺素能受體基因中的存在或缺失。在患者樣品中存在至少一個(gè)單倍型C表明所述患者是良好的治療候選者。例如，所述患者可患有呼吸道疾病，優(yōu)選阻塞性氣管疾病，并最優(yōu)選COPD或哮喘。本發(fā)明也涉及預(yù)測(cè)哮喘患者對(duì)長效beta2激動(dòng)劑治療的反應(yīng)的方法，其包括檢測(cè)beta2腎上腺素能受體基因中的多態(tài)性。文檔編號(hào)C07K14/705GK101056994SQ200580038840公開日2007年10月17日申請(qǐng)日期2005年9月12日優(yōu)先權(quán)日2004年9月13日發(fā)明者海倫·J·安布羅斯,米切爾·J·戈德曼申請(qǐng)人:阿斯利康(瑞典)有限公司