專利名稱：單倍型標(biāo)記和利用其確定對于治療的反應(yīng)的方法
相關(guān)申請本申請要求2004年5月4日遞交的美國臨時申請60/568,371的權(quán)益，特此將其全部內(nèi)容并入本文作為參考。
背景技術(shù)：
DNA的變異或突變幾乎與所有人類表型特征和疾病直接相關(guān)。最常見的DNA變異類型是單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其是在基因組中單一位置上的堿基對取代。據(jù)估計SNPs導(dǎo)致人之間大部分的DNA序列差異(Patil，N.等，Science，2941719(2001))。在基因組中緊密物理接近的這些SNPs組塊經(jīng)常是遺傳連鎖的，導(dǎo)致群體內(nèi)遺傳變異性減少并定義有限數(shù)目的″SNP單倍型″，其每一種都反映了來自單一的，古老染色體的血統(tǒng)(Stephens，J.C.，Molec.Diag.4(4)309-317；Fullerton，S.M.，等，Am.J.Hum.Genet.67881(2000))。
由SNPs，單倍型或者其它類型的變異定義的人DNA序列變異模式，對于鑒定表型特征和基因位點之間的關(guān)聯(lián)具有重要暗示。例如，可以進(jìn)一步分析具體的目標(biāo)基因組區(qū)以便將SNPs或者單倍型與表型特征-例如，疾病易感性或抗性，對于遺傳病癥的易感性，或藥物反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。這種信息可能在理解所述特征的生物學(xué)基礎(chǔ)以及鑒定可用于發(fā)展治療劑和診斷劑的候選基因中是無價的。
牛皮癬是一種最常見的皮膚病(dermatologic disease)(本文還稱作皮膚病(skin desease))，其影響高達(dá)1到2％的世界人群。它是一種慢性炎癥性皮膚病癥，臨床特征紅斑性的，明顯分界的丘疹和圓斑，覆以銀色的云母狀鱗屑。受損區(qū)域經(jīng)常發(fā)展成牛皮癬損傷(Koebner或者同形現(xiàn)象)。此外，包括感染，脅迫，和藥物的其它外部因素可以加劇牛皮癬。大約5到10％的牛皮癬患者有相關(guān)聯(lián)的關(guān)節(jié)疾病，這些大多數(shù)常常發(fā)現(xiàn)于具有染及指甲的患者中。盡管一些人同時患有典型的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，但許多人患有關(guān)節(jié)疾病。對于牛皮癬的病因仍然知之甚少。很明顯牛皮癬有遺傳性
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<221>等位基因<222>(12027)..(12027)<223>PS15多態(tài)堿基鳥嘌呤或者腺嘌呤<220>
<221>等位基因<222>(16448)..(16448)<223>PS21多態(tài)堿基鳥嘌呤或者腺嘌呤<220>
<221>不確定<222>(17114)..(17214)<223>N′s代表未知核苷酸<220>
<221>等位基因<222>(25065)..(25065)<223>PS26多態(tài)堿基腺嘌呤或者鳥嘌呤<220>
<221>等位基因<222>(25139)..(25139)<223>PS27多態(tài)堿基胞嘧啶或者胸腺嘧啶<220>
<221>等位基因<222>(25215)..(25215)<223>PS28多態(tài)堿基胞嘧啶或者胸腺嘧啶<400>1cactaatatt tagaggttaa tttatcacag acgcaagagt ttccataact aatgcatcca 60ggggttccct gtctatgatt ttagacaata cctgacaaag cagtgagtaa cttttaatca 120tttactgaga aagttgttcc ttttgcaatg ctgtggcgcc catgagagag tggatagaaa 180gaggtagctt gtgttttcta aacaacaaat actttgaata cacatacaaa gaagaaatac 240aaatggccaa caagcacatg aattgatgct taacatcatt tctcattcag gaagtacaaa 300tccaaaccac aatgagatat cacttcacac ccactaggat ggaacaaaac aaaaacagaa 360aataacaagt gttggcgatg atgtggggaa attggaaccc tttcattgtt ggcagaaatg 420taaatggtca cagctgctat ggaaatcagt tggttagtcc ctcaaaaagt taaacataga 480attattgtat gacccagcaa ttgcactgcc tgagtacata cctgaaagaa ttgaaaacag 540gcacccaaac atatatttgt acaagaatgt tcacagtagc attactcaca aaagtcaaaa 600agtagatata gtagcccact caaatgtcca tcattagatg aacagataaa gaaaatgtgg 660tatatacagg tacatacaca aaatattact caacaataag aagaaatggt gctataatgg 720ggatgaacct gaaaaacatt gcgctgagtc aaagaagcca ttcgctaaag accacacatt 780gtatgggagc caaggcagta tccagcgaga ctctggcctc tggctgggct gagtgacttc 840ttttccccca gtgcctttga actctctgca cccaactcag ccatgagcaa tgctgtcacc 900agcaatgggc agaggggctg gggcaagagt gggatggaaa gaatactgga tgtggagacc 960aaatgtgaca gtgtccttgc ccggctgcct gctttagatc tcaggggaca cgccatttcc 1020tctccgataa actctaagct cttagggtaa cccatggacc tgcctggctg ggtctttgtt 1080
內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上存在的核苷酸。在其它實施方案中，該方法包括分析來自所述受試者的樣品以確定對于T細(xì)胞激活或抑制單倍型來說受試者的拷貝數(shù)。所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型可以是，例如，在表1中給出的任何一種基因中的單倍型，例如，在CD8B1，SPR1，TCF19，或者HCR基因中的單倍型。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種方法，其通過測定基因型來確定受試者對治療的反應(yīng)，所述基因型例如，在來自受試者的樣品中T細(xì)胞激活或抑制單倍型內(nèi)，存在于一條或多條染色體上的一個或多個多態(tài)性位點上的核苷酸。所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型可以是這樣一種，對于它來說單倍型與受試者對于治療的反應(yīng)的關(guān)聯(lián)p值顯示高水平的顯著性。在一個實施方案中，所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在CD8B1基因中的單倍型，其中在單倍型和對治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)p值小于或等于大約0.005。在另一個實施方案中，所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在SPR1基因中的單倍型，其中在單倍型和對治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)p值小于或等于大約0.005。在又一個實施方案中，所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在TCF19基因中的單倍型，其中在單倍型和對治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)p值小于或等于大約0.010。在又一個實施方案中，所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在HCR基因中的單倍型并且其中在單倍型和對治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)p值小于或等于大約0.007。在一些實施方案，該方法可以進(jìn)一步包括利用在單倍型中一個或多個多態(tài)性位點上測定的受試者基因型來測定T細(xì)胞激活或抑制單倍型的拷貝數(shù)。
在一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含選自由一種或多種寡核苷酸組成的組的寡核苷酸，所述寡核苷酸適于對在CD8B1，HCR，SPR1，和TCF19基因中的T細(xì)胞激活或抑制單倍型中的SNP進(jìn)行基因型分型(genotyping)，由此T細(xì)胞激活或抑制單倍型的拷貝數(shù)對于一組患有T細(xì)胞關(guān)聯(lián)疾病，例如，牛皮癬，的受試者是否會對一種T細(xì)胞耗損劑，如Alefacept產(chǎn)生反應(yīng)提供統(tǒng)計學(xué)上的顯著關(guān)聯(lián)。在一個實施方案中，通過粗p-值(raw p-value)來確定受試者反應(yīng)和T細(xì)胞激活或抑制單倍型之間的關(guān)聯(lián)，所述粗p-值例如，小于或等于大約0.005的CDBB 1基因的粗p-值；小于或等于大約0.007的HCR基因的粗p-值；小于或等于大約0.005的SPR1基因的粗p-值；和小于或等于大約0.010的TCF19基因的粗p-值。
還在另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，用于檢測與對于T細(xì)胞耗損劑，如Alefacept的反應(yīng)或無反應(yīng)有關(guān)的T細(xì)胞激活或抑制單倍型的存在，所述試劑盒包含一組設(shè)計來對T細(xì)胞激活或抑制單倍型內(nèi)的多態(tài)性位點進(jìn)行基因型分型的寡核苷酸，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在選自由CD8B1，HCR，SPR1，和TCF19組成的組的基因中的單倍型。因而，所述單倍型可以是，例如，表1中的單倍型標(biāo)記1-5或者表3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中的單倍型；與表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中任一種單倍型連鎖的單倍型標(biāo)記；或者表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中任一種單倍型的取代單倍型標(biāo)記。
還在另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含選自由一種或多種寡核苷酸組成的組的寡核苷酸，所述寡核苷酸適于對在CD8B1，HCR，SPR1，和TCF19基因中的SNP進(jìn)行基因型分型，來診斷患有疾病的受試者對于治療方案的反應(yīng)。所述SNP可以，例如，選自以下位置上的多態(tài)性CD8B1基因中的位置-685，-255，25，8632，15080，19501，28589，28663和28739，HCR基因中的位置2173，2175，2360，5782，5787，6174，6666，8277，8440，8476，11565，11941，12152，13553，13892，14287，SPR1基因中的位置-119，-845，-455，-384，-228，161，627，739，913和1171，和TCF19基因中的-303，-210，316，2059，2365，2456和3340。此外，所述試劑盒可以進(jìn)一步包含使用說明書。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸能夠可檢測地與SNP雜交。
在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種寡核苷酸，其適于對在CD8B1，HCR，SPR1，或者TCF19基因中的T細(xì)胞激活或抑制單倍型中的SNP進(jìn)行基因型分型。所述SNP可以，例如，選自以下位置上的多態(tài)性CD8B1基因中的位置-685，-255，25，8632，15080，19501，28589，28663和28739，HCR基因中的位置2173，2175，2360，5782，5787，6174，6666，8277，8440，8476，11565，11941，12152，13553，13892，14287，SPR1基因中的位置-119，-845，-455，-384，-228，161，627，739，913和1171，和TCF19基因中的-303，-210，316，2059，2365，2456和3340。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種確定受試者對于T細(xì)胞耗損劑的反應(yīng)的方法。在一些實施方案中，該方法包括在來自受試者的樣品中T細(xì)胞激活或抑制單倍型內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上測定基因型。在其它實施方案中，該方法包括分析來自所述受試者的樣品以確定在受試者中T細(xì)胞激活或抑制單倍型的存在或缺失，或者確定對于T細(xì)胞激活或抑制單倍型來說受試者的拷貝數(shù)。所述單倍型可以是，例如，表1中的單倍型標(biāo)記1-5或者表3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中的單倍型；與表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中任一種單倍型連鎖的單倍型標(biāo)記；或者表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中任一種單倍型的取代單倍型標(biāo)記。T細(xì)胞耗損劑可以是，例如，LFA-3相關(guān)分子，或CD2受體阻抑劑，例如，Alefacept。例如，根據(jù)本發(fā)明，在受試者中CDBB1單倍型的存在表明受試者對于Alefacept不反應(yīng)，所述CDBB1單倍型包含位置-255上的胞嘧啶，位置25上的胸腺嘧啶和位置28589上的鳥嘌呤。同樣地，在受試者中兩個拷貝的HCR單倍型，所述HCR單倍型包含位置2175上的胞嘧啶，位置5787上的胸腺嘧啶和位置11565上的鳥嘌呤，或者HCR單倍型，所述HCR單倍型包含位置5782上的鳥嘌呤，位置11565上的鳥嘌呤，和位置14287上的胞嘧啶的存在表明受試者對于Alefacept不反應(yīng)。在受試者中SPR1單倍型的存在表明受試者對于Alefacept反應(yīng)，所述SPR1單倍型包含位置位置-845上的鳥嘌呤，位置-455上的鳥嘌呤和位置1171上的腺嘌呤。另外，在受試者中TCF19單倍型的存在表明受試者對于Alefacept不反應(yīng)，所述TCF19單倍型包含位置2365上的鳥嘌呤和位置3340上的鳥嘌呤。
在一個實施方案中，可以通過等位基因特異性寡核苷酸雜交，測序，引物特異性延伸，或蛋白質(zhì)檢測來實現(xiàn)檢測樣品中核苷酸的存在。
在另一個實施方案中，在連鎖的單倍型標(biāo)記和單倍型標(biāo)記之間的連鎖不平衡具有選自由至少0.75，至少0.80，至少0.85，至少0.90，至少0.95，和1.0組成的組的Δ2。在優(yōu)選的實施方案，Δ2為至少0.95。
還在另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，用于選擇合適的治療方案，例如，對患有疾病的受試者施用藥物，如Alefacept。該方法包括在來自受試者的樣品中，測定單倍型內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上受試者的基因型，包括表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中的單倍型標(biāo)記，與表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中任一種單倍型連鎖的單倍型標(biāo)記，或者表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中任一種單倍型的取代單倍型標(biāo)記；和基于單倍型內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上受試者的基因型選擇適合的治療方案。在一些實施方案中，由單倍型內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上受試者的基因型確定存在于受試者中的單倍型的拷貝數(shù)。事實上，可以將本文所述的方法用于選擇疾病的治療方案，如與T細(xì)胞激活或抑制相關(guān)聯(lián)的疾病，或與有害的T細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的疾病，炎性疾病，皮膚疾病，例如，牛皮癬或者濕疹。
可以通過收集來自受試者的樣品；在來自受試者的樣品中，測定單倍型內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上核苷酸的存在，例如，表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中的一種單倍型標(biāo)記；與表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中一種單倍型連鎖的單倍型標(biāo)記，或者表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中任一種單倍型的取代單倍型標(biāo)記；和基于單倍型內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上受試者的基因型選擇對于受試者適合的治療方案來完成對于患有疾病的受試者選擇適合的治療方案。
本發(fā)明還涉及通過在來自受試者的樣品中，測定單倍型內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上的基因型來確定患有疾病的受試者對于治療方案的反應(yīng)性的方法，所述單倍型，例如，表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中的一種單倍型標(biāo)記；與表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中一種單倍型連鎖的單倍型標(biāo)記，或者表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中一種單倍型的取代單倍型標(biāo)記。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述疾病是牛皮癬而治療方案包括Alefacept的給藥。
在又一方面，本發(fā)明涉及治療患有疾病的受試者的方法。該方法包括在來自受試者的樣品中，測定單倍型內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上的基因型來確定患有疾病的受試者對于治療方案的反應(yīng)性的方法，所述單倍型，例如，表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中的一種單倍型標(biāo)記；與表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中一種單倍型連鎖的單倍型標(biāo)記，或者表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中一種單倍型的取代單倍型標(biāo)記；基于單倍型內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上受試者的基因型選擇對于受試者適合的治療方案；和向受試者施用所述治療方案。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述疾病是牛皮癬而治療方案包括Alefacept的給藥。
本發(fā)明提供了一種方法，用于對個體測試與對于T細(xì)胞耗損劑有反應(yīng)或無反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的單倍型的存在，包括分析來自所述受試者的樣品，以確定受試者的T細(xì)胞激活或抑制單倍型拷貝數(shù)。所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型可以是任一種表3A和3B中所示的CD8B1單倍型，表7A和7B中所示的HCR單倍型，表12中所示的SPR1單倍型和表16A和B中所示的TCF19單倍型，與任一種表3A和3B中所示的CD8B1單倍型，表7A和7B中所示的HCR單倍型，表12中所示的SPR1單倍型和表16A和B中所示的TCF19單倍型連鎖的單倍型，或者任一種表3A和3B中所示的CD8B1單倍型，表7A和7B中所示的HCR單倍型，表12中所示的SPR1單倍型和表16A和B中所示的TCF19單倍型的取代單倍型。
在另一個方面，本發(fā)明涉及一種方法，用于通過在來自受試者的樣品中測定T細(xì)胞激活或抑制單倍型的受試者拷貝數(shù)來鑒定有可能對于Alefacept的治療不反應(yīng)或反應(yīng)的受試者。所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型可以是任一種表3A和3B中所示的CD8B1單倍型，表7A和7B中所示的HCR單倍型，表12中所示的SPR1單倍型和表16A和B中所示的TCF19單倍型，與任一種表3A和3B中所示的CD8B1單倍型，表7A和7B中所示的HCR單倍型，表12中所示的SPR1單倍型和表16A和B中所示的TCF19單倍型連鎖的單倍型，或者任一種表3A和3B中所示的CD8B1單倍型，表7A和7B中所示的HCR單倍型，表12中所示的SPR1單倍型和表16A和B中所示的TCF19單倍型的取代單倍型。
由下列詳細(xì)描述，以及由權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將是顯而易見的。
附圖簡述

圖1-7描繪了優(yōu)勢率(OR)曲線，其表示在特定基因中本發(fā)明的單倍型標(biāo)記與Alefacept反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。每幅圖的圖例如下。上版Alefacept處理組；下版安慰劑處理。OR值顯示于Y軸上。X軸表示標(biāo)記的拷貝數(shù)，其中括號里的數(shù)字是每組中受試者的數(shù)目。標(biāo)題中的數(shù)字指SNP在基因組序列中相對于起始子ATG的位置。在括號中的SNP數(shù)字指SNP在基
catcttggtg tattttcttc taatgtttta aaaacatttt ttacatttta catagttata 18180atcatgctga atgtatgttt atatcaagca tgctgtctgc gttttccttg tcaacctttc 18240cataggtttc ataattctaa aacatcatca tgttaatggc ctaaaattat attgaatgca 18300ttatcattgt ttacttaaat attgctttat ttctgaacat ttccattgct tttaacattt 18360aacatctctg ttcatactct attgtgccaa gactaagatt acatccactg gagaaatgtt 18420ccagaatgga ctactgaata tacaggtata aacattttga tagcttctga tattgctttc 18480tgaggtcatc atgactctta cctgaaacag atatcatctt tttttttttt cctgctgggg 18540tataagtgga aaacacattt tcagcactga tataattttg tgttagaaga ttgcagcact 18600ttaaaaccct ttttcccaag agctaaagga gagttgatgc tataaatatg gcaggaactc 18660aaaaccctgg gtacagtccc tggttcatct ctgccctgtg actggggcaa gtcagggcag 18720gactgttggg agctgcaatc caagcacaga gttgctcgga gttgcaaaag gagaagccac 18780agggcagaca tacaatacag aacctgaaag aagtgcccaa gcctgcgcca gcccttcaaa 18840atcagagaag agcgggcctc gaaaaggcaa agaaagaaag aaggcagaac gagctggagc 18900gaaggaatta accaggggga agagaagggt ggaggaagca gggggctcgg aacattccct 18960ttggagagga cggggtttgt gggggctttc ccctgctgca gcggggctct ttgctaaaag 19020tgaaactgcg attttcggag ggttccgaag gcgttcacct agggaaggaa aatgttccat 19080ttgggggtcc acactgggtt aaaaacaatg cctctgcctg ctctcagtta tggaggcccc 19140cgagtgtctt cagtcaactc tgggtggttc tgaggctaca gcaacaaccg aactcggcct 19200gtgccccaac ttggcccagg gcctgaagga gccccagtgt gatcttaact caagtgtgtc 19260cgcaggacaa ggccccatgt tgccttcccg gccacaatac aacgaagaac aaagctcccg 19320ccggctgagt gcctcacagg cgccagcact gtgctgggag ttgtgcgttc tttttcctgt 19380tggtttctta accgcagaac gaggtggata ttagcaactc ctttagcagg gctcaatggc 19440gtcttagaaa tcacaccaca tttgataaat ccgaaagctt cgattcaccc caggcggcct 19500cactccaacg ccttgagaat tgaaggagca gcaggcttca tgagtttgat gaaaaacttg 19560ggagaatgcc agtgtaacct aataaaaagt caaagttatt ggattatttg aaaaaaaaaa 19620aaaaagtaaa gttgatcctt tcaagagtac ctatataaaa agagcaccta tattcaaagc 19680cagctacacc gcctgtggtt cagaagtggg gagttgggtc agaaaaggtg ggacagacag 19740gatggctcag taattagggc tggcacatag cagatctggg ctacctgtgt gactctgagc 19800aagtgaatta acctctctga accttgaata taaaacaaga ataatgataa tatctacctc 19860acacatgagc attaataaaa tagtgcttgc agagtgcatg gcacatacta ctcagtcaat 19920ggtagctgct agcattgtta tcttaatgat cactgttatt acattatatt ctagttattt 19980tttatatttt tgagactagc ctaaatctca ccactcaggc tgcagaaagg atgtttcact 20040aaccttggaa attccagtat aggcaaacct cagagatatc tcaggttcag ttccagacca 20100ccacaataaa gcaaatatca caataaagcc agttacattc attttttggt ttcccagtgt 20160acataaaagt tatgtttacc ctataaggta gtctactaag tgtacaaaga cattatgtct 20220gaaaaaaaaa gtacgtctta atcaaaaaat aatttattac caaatacatg ctaaaatcac 20280ctgagctttc agtgagtcat aatttctttg ctgatggagg gcatcttgcc ttgatgtcaa 20340tggctgctga ctgatcagaa tggtggttgc caaaggctgg cgtggctgtg ccaatttcgt 20400aaaataggac aacaacaaat cttgccacat tgattgactc ttcctttcac aaaagattta 20460tctgtagcat gcgatgctgt ttgatagcat tttacctaca gtagaacagc attcaaaatt 20520ggagtcactc ctctcaaata ctgacgcctc tttctcaact aagtttatgt aacattctct 20580atcttctgtt gtcatttcaa caatgttcac accatcttca ccaggagtag attccatttc 20640aagaaaccac cttctttgct catcagagag aataaactcc tcatgtgtta agtttgatca 20700cgggattgca acaattcagc cacgtcttca gactccactt ctatctctag ttctcttgct 20760atttctacca tacttgcagt tacttcctcc actgaagtct tgaactcctc caactcatcc 20820aggagaattg gaatcacctg cttccaaact cctcctaatg ttggtattta tacctgctcc 20880catgaatcac aaatgttctt tgttgcatct agaatggtga atcctttcca gaaggtttca 20940cccagatcta tcagaggaat catcatctgt ggcagctcta gccttacgaa atgtatttct 21000taataagaat tgaaagtcaa aattactcct tggtccatgt aaaatcaatg ttgttttacc 21060agtcatgaaa aacaatatta atctccttgt acatctccat cagatctctt gggtgaccag 21120gcacattttc aatgagcagt aatattttga aaggaatctt ttttcctgag cgagtctcaa 21180cagtgggctt taaatattca gtaaaccatg ctctaaacag atgtgctgtc atccaggctt 21240tgctattcca tttacagagt ataagtagag tagacttagc ataattctta agggacttag 21300ggtttttaga atggtaaatg agcattggct tcaacttaaa gtcaccagct gcattagccc 21360ctaacaagag aggcaggctg tcctttgaag ccaggcattg acttctctct agctatgaaa 21420gacctagtag catcttcttc caatataagg ctgttttgtc tacattgaaa atctgttgtt 21480tagtgtagcc acctttgtca ataatcttag aaagctcttt tggataacct gctgtgctgc 21540
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發(fā)生的多態(tài)性。SNP的位點前后通常為高度保守的序列(例如，以小于{部分(1/100)}或{部分(1/1000)}群體成員變化的序列)。本文所用的″SNPs″是復(fù)數(shù)形式的SNP。SNPs最常為雙等位基因型。最常見的SNP的等位基因叫作“主要等位基因”而這種SNP的備選等位基因叫作“次要等位基因”。SNP通常是由于一個核苷酸對另一個核苷酸在多態(tài)性位點上的取代而產(chǎn)物的。轉(zhuǎn)換是一種嘌呤被另一種嘌呤或一種嘧啶被另一種嘧啶所代替。顛換是一種嘌呤被一種嘧啶所代替或反之亦然。SNPs還可以緣自相對于參照等位基因核苷酸的刪除或核苷酸的插入。″SNP位置″或″SNP位點″是發(fā)生SNP的多態(tài)性位點。
″單倍型標(biāo)記″，″HAP標(biāo)記″，或″單倍型″指在目標(biāo)核酸序列中一組多態(tài)性上等位基因的組合。特別地，本發(fā)明提供，至少部分地，表1，3A，3B，7A，7B，12，16A和16B中給出的單倍型標(biāo)記。本發(fā)明的單倍型標(biāo)記是基于基因中起作用的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的定位而進(jìn)行標(biāo)記的，使用本文對于所述基因所用的參照mRNA的起始密碼子(ATG)作為+1位置的參照。所用的符號給出SNPs的ATG偏移(5′-3′)，后接每個位置上的等位基因。例如，在CD8B1基因的單倍型標(biāo)記(-255，25，28589/CTG)，本文也稱作單倍型標(biāo)記1中，C是在-255上的啟動子SNP上的等位基因，而T和G分別是在所述基因中位置25和28589上的外顯子SNPs上的等位基因。對表1中的單倍型標(biāo)記2-5進(jìn)行類似定義。
″取代單倍型″包括類似于表1中所示單倍型標(biāo)記1-5的任一種或表3A，3B，7A，7B，12，16A和16B中的單倍型的多態(tài)性序列，但其中在該單倍型中的一個或多個特異性鑒定的多態(tài)性位點上的等位基因已經(jīng)在和所述特異性鑒定的多態(tài)性位點上的等位基因高度連鎖不平衡的多態(tài)性位點上被等位基因所取代。下面進(jìn)一步介紹取代單倍型。
“連鎖單倍型”包括與表1中所示單倍型1-5的任一種或表3A，3B，7A，7B，12，16A和16B中的單倍型高度連鎖不平衡的單倍型。連鎖單倍型可以包含其它類型的變異，包括indel。下面進(jìn)一步介紹連鎖單倍型。
本文所用的術(shù)語“T細(xì)胞激活或抑制單倍型”意在包括任何與T細(xì)胞激活或T細(xì)胞抑制相關(guān)聯(lián)的單倍型。T細(xì)胞激活或抑制單倍型可以是基因中的單倍型，其編碼導(dǎo)致T細(xì)胞激活或T細(xì)胞抑制的細(xì)胞途徑的部分的蛋白質(zhì)。例如，T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在T細(xì)胞受體基因、輔助受體基因、整合素基因或與天然殺傷(NK)細(xì)胞進(jìn)行的T細(xì)胞識別相關(guān)聯(lián)的基因中的單倍型。在優(yōu)選的實施方案中，T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在CD8B1，HCR，SPR1，或TCF19基因的單倍型(例如，在表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或16B中給出的單倍型的其中一種)。
本文所用的術(shù)語“T細(xì)胞損耗劑”意在包括任何能夠減少T淋巴細(xì)胞，例如，CD4+，CD8+或CD2+T淋巴細(xì)胞水平的試劑。本發(fā)明所包括的T細(xì)胞損耗劑可以通過抑制LFA-3/CD2相互作用而減少T淋巴細(xì)胞水平。例如，T細(xì)胞損耗劑可以通過結(jié)合CD20并抑制抗原呈遞細(xì)胞上的LFA-3和T淋巴細(xì)胞上的CD2之間的相互作用而減少T淋巴細(xì)胞水平。在優(yōu)選的實施方案中，T細(xì)胞損耗劑是CD2結(jié)合分子，如包含LFA-3分子的CD2結(jié)合部分的分子。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，所述T細(xì)胞損耗劑是Alefacept。
″連鎖″或″連鎖的″描述或涉及基因、等位基因、位點或遺傳標(biāo)記一代代在一起遺傳下去的趨勢，這種一起遺傳的趨勢是作為它們在相同染色體上的定位的結(jié)果，例如，非隨機(jī)性遺傳的遺傳位點。
″連鎖不平衡″或者″等位基因關(guān)聯(lián)″包括特定等位基因或遺傳標(biāo)記與附近染色體位置上的特異性等位基因或遺傳標(biāo)記的優(yōu)先關(guān)聯(lián)比在群體中通過偶然機(jī)會對于任何特定等位基因頻率所預(yù)期的更加頻繁。例如，如果位點X具有以等同頻率出現(xiàn)的等位基因a和b，而連鎖的位點Y具有以等同頻率出現(xiàn)的等位基因c和d，預(yù)計組合ac發(fā)生的頻率為0.25。如果ac發(fā)生地更加頻繁，那么等位基因a和c處于連鎖不平衡。連鎖不平衡可能緣自某些等位基因的組合的自然選擇或者因為一種等位基因在最近最導(dǎo)入群體中達(dá)到所連鎖等位基因的平衡。處于連鎖不平衡中的一種標(biāo)記與對于疾病(或其它表型)的其它引發(fā)標(biāo)記一起可以用于檢測對所述疾病(或其它表型)的易感性，盡管所述標(biāo)記并不引發(fā)所述疾病。例如，標(biāo)記(X)本身并非疾病的引發(fā)元素，但其與一種基因的作為一種表型的引發(fā)元素的同功型(包括調(diào)控序列)(Y)處于連鎖不平衡，可以用來預(yù)示在環(huán)境中對于疾病的易感性，其中所述基因Y可以未經(jīng)鑒定或者可以是不容易檢測到的。
″核酸″包括，但不限于，DNA，RNA，單鏈或雙鏈的，基因組的，克隆的，天然發(fā)生的或合成的分子并且可以是多核苷酸，擴(kuò)增子，RNA轉(zhuǎn)錄本，蛋白質(zhì)核酸，核酸類似物，等等。
″寡核苷酸″是本領(lǐng)域公知的并且包括通常介于5和100個連續(xù)堿基之間長度的核酸，經(jīng)常是介于5-10，5-20，10-20，10-50，15-50；15-100，20-50，或者20-100個連續(xù)堿基之間的長度。長于大約20個連續(xù)堿基的寡核苷酸可以稱作多核苷酸。多態(tài)性位點(多態(tài)性)可以出現(xiàn)在寡核苷酸內(nèi)的任何位置上。寡核苷酸可以包括多態(tài)性位點(多態(tài)性)的任一種等位基因形式。其它可用于實施本發(fā)明的寡核苷酸雜交到位于鄰近多態(tài)性位點一到小于或等于大約10個核苷酸的靶區(qū)，優(yōu)選≤大約5個核苷酸。這些在鄰近多態(tài)性位點一到幾個核苷酸處終止的寡核苷酸可以用于聚合酶-介導(dǎo)的引物延伸方法，來檢測本文所述的多態(tài)性的其中一種并且因此這些寡核苷酸在本文被稱作″引物-延伸寡核苷酸″。在優(yōu)選的實施方案中，引物-延伸寡核苷酸的3′末端是與位于緊鄰多態(tài)性位點的核苷酸互補(bǔ)的脫氧核苷酸。
″雜交探針″或者″探針″是能夠以堿基特異性的方式結(jié)合到核酸的部分或完全互補(bǔ)鏈寡核苷酸上的寡核苷酸。這些探針包括肽核酸，如Nielsen等，Science 2541497-1500(1991)中所述，以及所有其它種類的寡核苷酸。
″整體評估得分″指在醫(yī)生評估時測量牛皮癬嚴(yán)重性的7點數(shù)值范圍嚴(yán)重非常明顯的斑隆凸，起鱗屑和/或紅斑；中度到嚴(yán)重明顯的斑隆凸，起鱗屑和/或紅斑；中度中度斑隆凸，起鱗屑和/或紅斑；輕度到中度介于中度和輕度之間；輕度輕度斑隆凸，起鱗屑和/或紅斑；幾乎沒有(almost clear)介于輕度和沒有之間；沒有無牛皮癬征狀(炎癥后色素沉著不足或者色素沉著不足能夠存在)。
雜交通常是在嚴(yán)格條件下進(jìn)行的。嚴(yán)格條件是序列依賴型的并且根據(jù)環(huán)境而變化。一般，選擇嚴(yán)格條件為低于特定的離子強(qiáng)度和pH的特定序列熱熔點溫度(Tm)大約5℃。Tm是(在確定的離子濃度，pH和核酸濃度的條件下)50％的與靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列平衡雜交時的溫度。由于靶序列一般是過量存在的，在Tm上，50％的探針是平衡占位的。一般，嚴(yán)格條件包括鹽濃度為至少大約0.01到1.0M Na離子濃度(或其它鹽)于pH 7.0到8.3并且溫度是對于短探針(例如，10到50個核苷酸)為至少大約25℃。嚴(yán)格條件還可以通過添加去平衡劑如甲酰胺來實現(xiàn)。例如，5xSSPE(750mM NaCl，50mM磷酸鈉，5mM EDTA，pH 7.4)和25-30℃溫度的條件適于等位基因特異性探針雜交。
其他嚴(yán)格條件可以見于Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，第7，9和11章。嚴(yán)格雜交條件的一個優(yōu)選的非限制性例子包括在大約65-70℃，4×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交(或在大約42-50℃，4×SSC加50％甲酰胺中雜交)，然后在約65-70℃，于1×SSC中清洗一次或多次。高度嚴(yán)格雜交條件的一個優(yōu)選的非限制性的例子包括在大約65-70℃，1×SSC中雜交(或在大約42-50℃，1×SSC加50％甲酰胺中雜交)，然后在65-70℃，于0.3×SSC中清洗一次或多次。低度嚴(yán)格雜交條件的一個優(yōu)選的非限制性例子包括在大約50-60℃，4×SSC中雜交(或在大約40-45℃，6×SSC加50％甲酰胺中雜交)，然后在約50-60℃，于2×SSC中清洗一次或多次。介于上述數(shù)值之間的中間范圍，例如，65-70℃或42-50℃，也屬于本發(fā)明范疇。SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl，10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)可以取代為SSC(1×SSC是0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)作為雜交和清洗緩沖液；雜交完成后，進(jìn)行清洗每次15分鐘。如果預(yù)期雜交長度短于50個堿基對，雜交溫度應(yīng)比雜交熔點溫度(Tm)低5-10℃，其中Tm根據(jù)下述等式進(jìn)行計算。短于18個堿基對長度的雜交，Tm(℃)＝2(A+T堿基數(shù))+4(G+C堿基數(shù))。對于在18-49個堿基對之間長度的雜交，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是雜交中的堿基數(shù)，[Na+]是雜交緩沖液中鈉離子的濃度(1×SSC的[Na+]＝0.165M)。經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員還應(yīng)該認(rèn)識到，為了減少核酸分子與膜，例如硝酸纖維素或尼龍膜的非特異性雜交，可以往雜交和/或清洗緩沖液中添加其他試劑，包括但不限于封閉試劑(如BSA或鮭魚或鯡魚精液載體DNA)，去污劑(如SDS)，螯合劑(如EDTA)，F(xiàn)icoll，PVP等等。特別是在應(yīng)用尼龍膜時，另一個嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選非限制性例子為在大約65℃，0.25-0.5M NaH2PO4，7％SDS中雜交，然后在大約65℃，應(yīng)用0.02M NaH2PO4，1％SDS清洗一次或多次，見例如Church and Gilbert(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA811991-1995，或者是0.2×SSC，1％SDS。
牛皮癬面積和嚴(yán)重性指數(shù)(PASI)分值指牛皮癬嚴(yán)重性的測量(見例如，F(xiàn)leischer等(1999)，J.Dermatol.26210-215和Tanew等(1999)，ArchDermatol.135519-524)。PASI分值是軀體上牛皮癬損傷中皮膚起鱗屑的位置、大小和程度的測量。PASI是在牛皮癬治療臨床試驗中常用的測量。一般，在治療期之前，之中，和之后計算PASI以便確定牛皮癬對于治療的反應(yīng)程度如何(例如，較低的PASI意味著較少的牛皮癬)。對于PASI，一般將軀體分成四部分并且對每個區(qū)域由其自身進(jìn)行打分，隨后將四個分值合并成最后的PASI。對于每個皮膚部分，將涉及的皮膚量測量為在該軀體部分中皮膚的百分比。還對每一個皮膚部分測量嚴(yán)重性，例如，癢，紅斑(紅色)，起鱗屑，和厚度。
″強(qiáng)反應(yīng)者″指患者的反應(yīng)在任何時間都大于或等于由基線PASI的50％的減少。術(shù)語″部分反應(yīng)者″指患者的反應(yīng)在任何時間都大于或等于由基線的PASI的25％但＜50％的減少。術(shù)語″無反應(yīng)者″指患者的反應(yīng)在任何時間都小于由基線的PASI的25％的減少。
本文所用的術(shù)語″受試者″包括溫血動物，優(yōu)選哺乳動物，包括人。在優(yōu)選的實施方案中，所述受試者是靈長類。在還要更加優(yōu)選的實施方案中，所述靈長類是人。
本文所用的術(shù)語″治療上的有效量″指足以導(dǎo)致病癥的一種或多種癥狀改善的治療劑的量。關(guān)于牛皮癬的治療，治療上的有效量優(yōu)選指減少受試者的(例如，人的)PASI分值至少20％，至少35％，至少30％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，或者至少85％的治療劑的量。
或者，關(guān)于牛皮癬的治療，治療上的有效量優(yōu)選指提高受試者的(例如，人的)整體評估分值至少25％，至少35％，至少30％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，或者至少95％的治療劑的量。治療上的有效量包括在劑量上以及對于必需時期來說有效的量，以達(dá)到所需的結(jié)果，例如，足以治療患有疾病或病癥的受試者，所述疾病或病癥炎性疾病，例如，皮膚病。治療上有效量的化合物，如本文定義的T細(xì)胞耗損劑，例如，Alefacept，可以根據(jù)諸如疾病狀態(tài)、年齡，和受試者體重，以及所述化合物在受試者中引起所需反應(yīng)的能力的因素而變化。可能調(diào)節(jié)劑量方案以提供優(yōu)化的治療反應(yīng)。治療上的有效量還是這樣一種量，其中T細(xì)胞耗損劑，例如，Alefacept的任何毒性或有害作用(例如，副作用)都被治療上有益的作用所超過。
″預(yù)防上的有效量″指在劑量上以及對于必需時期來說有效的量，以達(dá)到所需的預(yù)防結(jié)果，如預(yù)防或抑制受試者中的炎性，如皮膚疾病，例如，牛皮癬，該受試者對于這種疾病易感。預(yù)防上的有效量可以如上對于治療上的有效量所述的那樣進(jìn)行確定。一般，由于預(yù)防劑量是在炎性疾病之間或早期使用的，所以預(yù)防上的有效量將小于治療上的有效量。
II.總述本發(fā)明是基于多種與對治療的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的單倍型的鑒定，并提供了確定受試者對于治療方案，例如，用T細(xì)胞耗損劑，如Alefacept進(jìn)行治療的反應(yīng)的新方法。
本發(fā)明包括任一種本發(fā)明的單倍型標(biāo)記的用途，包括在表1，3A，3B，7A，7B，12，16A或者16B中所示的那些，以及多態(tài)性，等位基因，或者具有這些標(biāo)記的連鎖不平衡中的標(biāo)記，作為診斷受試者對于治療方案的反應(yīng)的手段，或者作為設(shè)計對受試者特異性制作的有效治療方案的手段。本發(fā)明對于皮膚疾病，如牛皮癬和濕疹的治療特別有用。本發(fā)明的多態(tài)性和單倍型在表1，3A，3B，7A，7B，12，16A和16B中給出并如本文所述進(jìn)行鑒定。
表1
*單倍型標(biāo)記是基于基因中起作用的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的定位而進(jìn)行標(biāo)記的，使用本文對于所述基因所用的參照mRNA的起始密碼子(ATG)作為+1位置的參照。所用的符號給出SNPs的ATG偏移(5′-3′)，后接每個位置上的等位基因。例如，在CD8B1基因的單倍型標(biāo)記(-255，25，28589/CTG)，本文也稱作單倍型標(biāo)記1中，C是在-255上的啟動子SNP上的等位基因，而T和G分別是在所述基因中位置25和28589上的外顯子SNPs上的等位基因。
CD8B1基因CD8抗原，β多肽1(CD8B1)基因編碼CD8蛋白的β亞基；CD8β鏈?zhǔn)?4kDa的蛋白質(zhì)，其由四個分離的功能性結(jié)構(gòu)域組成，Ig樣外部結(jié)構(gòu)域，近膜莖狀(鉸鏈)區(qū)，跨膜結(jié)構(gòu)域，和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
人CD8是細(xì)胞表面糖蛋白，其表達(dá)于細(xì)胞毒性T細(xì)胞上并與T細(xì)胞抗原受體(TCR)一起充當(dāng)輔助受體。在成熟的外周I類MHC限制性T細(xì)胞上，CD8分子作為二硫鍵連接的α和β鏈的異二聚體存在。不過，CD8β分子可以在無CD8α鏈的細(xì)胞表面上表達(dá)。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以有效地與TCR/CD3復(fù)合物相互作用并且也能夠在CD8α不存在時獨立地與I類MHC/β2微球蛋白二聚體相互作用。所述胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域增強(qiáng)并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號分子的關(guān)聯(lián)，所述細(xì)胞內(nèi)信號分子對于有效信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是必需的，如淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶(LCK)和T細(xì)胞激活的銜接物(LAT)。
CD8B 1的基因組序列在本文中給出為SEQ ID NO1并衍生于草圖基因組序列編號AC111200.3(GI18873971)和AC112696.1(GI18860769)的組合，利用參照mRNA X13445.1確定重疊群(contigs)的排序。
HCR基因α螺旋卷曲的卷曲桿狀同族(HCR)基因是作為染色體6上PSORS1位點的部分的基因。HCR的基因組組成由編號AB029343.1(GI No.5360900)的注解所提供并在本文給出為SEQ ID NO2。
盡管HCR的功能作用仍然有待說明，但該基因顯示在正常和牛皮癬皮膚中差異表達(dá)。在HCR基因的的兩種SNP，C2175和T5787，導(dǎo)致氨基酸改變，其引起蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的顯著變化。
SPR1基因小的富含脯氨酸的蛋白質(zhì)1(SPR1)是在HLA-C基因周圍的稱作PSORS1的300kb區(qū)域的部分的基因，鑒定為與對牛皮癬的易感性相關(guān)聯(lián)。SPRI基因位于HCR基因末端大約3kb。數(shù)據(jù)表明在兩種基因之間的連鎖不平衡。SPR1的基因組序列在本文給出為SEQ ID NO3，并利用參照mRNA，NM-014069.1(GI No.7662664)和Genbank編號AP000510.2(GI No.7380878)作為基因組DNA得出。
TCF19基因轉(zhuǎn)錄因子19基因(TCF19)位于染色體6上，在HLA-C和S基因之間，一個涉及牛皮癬vulgaris的病理生理學(xué)的區(qū)域。
TCF19基因在不同組織中大量表達(dá)。有至少10不同的轉(zhuǎn)錄本，其通過選擇性的剪切產(chǎn)生，生成八種蛋白質(zhì)的同功型。
TCF19蛋白具有叉頭樣(Forkhead-associated)(FHA)基序，其發(fā)現(xiàn)于許多調(diào)控蛋白中，如激酶，磷酸酶，轉(zhuǎn)錄因子，和酶，其參與許多不同的細(xì)胞過程如DNA修復(fù)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，和蛋白質(zhì)降解。
TCF19的基因組序列是利用參照mRNA Genbank編號NM007109.1(GI No.6005891)和DNA編號AC004195.1得到的并在本文中給出為SEQ ID NO4。
在連鎖不平衡中的其它多態(tài)性對于表1中或表3A，3B，7A，7B，12，16A和16B中的每種單倍型標(biāo)記1到5，本發(fā)明在該基因中或該基因所在的染色體其它地方還包括其它的多態(tài)性，所述多態(tài)性與一種或多種包含所述單倍型標(biāo)記的多態(tài)性處于高度連鎖不平衡(LD)。據(jù)說在不同多態(tài)性位點上的兩種特定核苷酸等位基因是連鎖不平衡的，如果其中一個位點上的其中一個等位基因的存在趨于預(yù)測在相同染色體其它位點上其它等位基因的存在(Stevens，JC，Mol.Diag.4309-17，1999)。一種最常用的連鎖不平衡的測量是Δ2，其利用在Devlin，B.和Risch，N.(1995，Genomics，29(2)311-22)中所述的公式進(jìn)行計算?；旧?，Δ2測量在第一個多態(tài)性位點上的等位基因X在何種程度上能夠預(yù)測相同染色體的第二個多態(tài)性位點上出現(xiàn)等位基因。當(dāng)預(yù)測完美時測量僅達(dá)到1.0(例如，如果是X的話只有Y)。
因而，技術(shù)人員將會預(yù)計本文所述的本發(fā)明的所有實施方案經(jīng)常可以通過用另一個多態(tài)性位點上的等位基因取代本文公開的單倍型標(biāo)記中的任一個(或全部)特異性鑒定的多態(tài)性位點上的等位基因而得以實施，所述另一個多態(tài)性位點上的等位基因與所述特異性鑒定的多態(tài)性位點上的等位基因處于高度連鎖不平衡。這種″取代性的多態(tài)性位點″可以是當(dāng)前已知的或隨后發(fā)現(xiàn)的并且可以存在于與被替代多態(tài)性位點相同的基因中的多態(tài)性位點上或存在于與被替代多態(tài)性位點相同的染色體上的其它地方。優(yōu)選地，所述取代性多態(tài)性位點存在于距離所述多態(tài)性位點大約100千堿基之內(nèi)的基因組區(qū)。
另外，對于在表1或者在表3A，3B，7A，7B，12，16A和16B中給出的任何特定單倍型來說，本發(fā)明預(yù)期在該基因中或與該基因相同的染色體上的其它地方將會有其它的單倍型，其與包含所述單倍型標(biāo)記的一種或多種多態(tài)性處于高度連鎖不平衡，其因此也將可預(yù)測臨床表型(即，對于治療的反應(yīng)，例如，用進(jìn)行治療或者炎性或者皮膚疾病的發(fā)病年齡)。優(yōu)選地，連鎖的單倍型存在于所述基因中或存在于跨越所述基因大約100千堿基的基因組區(qū)域中。還可以利用Δ2來測量在公開的單倍型標(biāo)記和連鎖的單倍型之間的連鎖不平衡。
在優(yōu)選的實施方案中，在任一種公開的單倍型標(biāo)記中的多態(tài)性位點上的等位基因和在可以替代它的取代性多態(tài)性位點上的等位基因之間，或在任一種公開的單倍型標(biāo)記和連鎖的單倍型之間的連鎖不平衡，具有至少至少0.75，更加優(yōu)選至少0.80，甚至更加優(yōu)選至少0.85或者至少0.90，還要更加優(yōu)選至少0.95，最優(yōu)選1.0的Δ2值，如在合適的參照群體中所測量的。對于這種Δ2測量的合適參照群體優(yōu)選選自這樣一種群體，其成員的種族背景的分布反映了要用治療方案，例如，Alefacept治療的患者群體的分布。所述參照群體可以是普通群體，使用T細(xì)胞耗損劑，例如，Alefacept的群體；患有炎性疾病或皮膚疾病，如牛皮癬的群體；或?qū)τ诎l(fā)展成炎性或皮膚疾病有危險因素的群體。
基因組區(qū)域中的LD模式易于利用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)在適當(dāng)選擇的樣品進(jìn)行測定，所述技術(shù)用來測定任何兩種等位基因(在兩個不同的多態(tài)性位點或兩個單倍型上)是否處于連鎖不平衡(Weir B.S.1996 GeneticData分析II，Sinauer Associates，Inc.Publishers，Sunderland，MA)。熟練技術(shù)人員可以輕易選擇哪種測定LD的方法將最適于特定樣品大小和基因組區(qū)域。類似地，熟練技術(shù)人員也可以輕易地測試在一個或多個取代性多態(tài)性位點上包含等位基因的取代單倍型，或與表1，3A，3B，7A，7B，12，16A和16B中的一種或多種單倍型標(biāo)記處于高度連鎖不平衡的連鎖單倍型的能力，以預(yù)測對于T細(xì)胞耗損劑，例如，Alefacept的臨床反應(yīng)。
因而，本文提及T細(xì)胞激活或抑制單倍型被認(rèn)為包括與任何公開的單倍型連鎖的連鎖單倍型和任何公開的單倍型的取代單倍型，其在預(yù)測受試者對于T細(xì)胞耗損劑，例如，Alefacept的臨床反應(yīng)上的表現(xiàn)類似于所述公開的單倍型標(biāo)記。
III.包含本發(fā)明的多態(tài)性的核酸分子本發(fā)明是基于，部分地，在CD8B1，HCR，SPR1，和TCF19基因(SEQID NOS1-4)中的多態(tài)性和單倍型標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了這些基因(SEQ ID NOS1-4)的片段，其包含表1中所列出的至少一種單核苷酸多態(tài)性。
可以將包含本發(fā)明的多態(tài)性變異型核苷酸序列(SNP)的分離的多核苷酸可操作性地連接于重組表達(dá)載體中的一種或多種表達(dá)調(diào)控元件上，所述表達(dá)載體能夠在原核或真核宿主細(xì)胞中增殖并表達(dá)編碼的變異型蛋白。在重組表達(dá)載體內(nèi)，“可操作性地連接”意指目標(biāo)核苷酸序列以這樣一種方式連接到調(diào)控序列上，其允許所述載體序列的表達(dá)(例如，當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或在宿主細(xì)胞中)。術(shù)語″調(diào)控序列″意在包括啟動子，增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如，多腺苷化信號)。這些調(diào)控序列在，例如，Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中得以描述。調(diào)控序列包括那些在許多類型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的構(gòu)成性表達(dá)的序列和那些僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的表達(dá)的序列(例如，組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將要理解的是表達(dá)載體的設(shè)計可以依賴于這些因素，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，所需蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等等?？梢詫⒈景l(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，由此產(chǎn)生如本文所述的核酸編碼的變異型蛋白質(zhì)或肽。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以設(shè)計來在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)。例如，可以在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)，昆蟲細(xì)胞(利用桿狀病毒表達(dá)載體)，酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)。合適的宿主細(xì)胞在Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)中進(jìn)一步討論?；蛘?，重組表達(dá)載體可以在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如使用T7啟動子調(diào)控序列和T7聚合酶。
IV.使用方法本發(fā)明的方法可以用于鑒定生物學(xué)樣品中的多態(tài)性和單倍型。這種信息隨后可以任何數(shù)目的途徑來使用，包括，但不限于，對患有疾病，例如，牛皮癬的受試者選擇治療方案；治療效力和/或安全性試驗；表型特征(例如，疾病抗性或易感性，和藥物反應(yīng)，包括例如，效力和副作用)的遺傳圖譜繪制；診斷學(xué)；候選藥物靶標(biāo)的鑒定；研制蛋白質(zhì)，小分子，反義，抗體，或者其它治療；以提示表型特征的生物學(xué)基礎(chǔ)；關(guān)聯(lián)研究；法醫(yī)學(xué)；和親子測試。
A.檢測靶核酸分子中的本發(fā)明的單倍型標(biāo)記可以在來自待篩選的受試者，例如，對于疾病進(jìn)行治療的受試者或需要對疾病(例如，牛皮癬)進(jìn)行治療的受試者的樣品中對本發(fā)明的多態(tài)性和單倍型標(biāo)記進(jìn)行檢測。核酸樣品事實上可以獲自任何生物學(xué)樣品。例如，便利的樣品包括全血，血清，精液，口水，淚水，排泄物，尿液，汗，口頰物，皮膚和頭發(fā)。對于cDNA或者mRNA的測定，應(yīng)當(dāng)從表達(dá)所述靶核酸的器官中獲得組織。
還可以對獲自活組織檢查或切除術(shù)的患者組織的組織切片(固定的和/或冷凍的)在原位直接進(jìn)行診斷學(xué)操作。對于這些原位操作，可以將核酸試劑用作探針和/或引物(見，例如，Nuovo，G.J.，1992，PCR insituhybridizationprotocols and applications，Raven Press，N.Y.)。
可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)制備核酸樣品用于分析。優(yōu)選地，這些技術(shù)導(dǎo)致生產(chǎn)足夠純的核酸分子用于測定在核酸分子中一個或多個位置上一個或多個等位基因的存在或缺失。這些技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)于，例如，Sambrook，等，MolecularCloningA Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory，New York)(2001)，在此并入作為參考。
在測定核酸中一個或多個等位基因的存在或缺失之前，擴(kuò)增和/或標(biāo)記一種或多種目標(biāo)核酸可能是有利的。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的擴(kuò)增技術(shù)都可以結(jié)合本發(fā)明進(jìn)行使用，包括，但不限于，聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)技術(shù)。可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的材料和方法進(jìn)行PCR(一般參見PCRTechnologyPrincipals and Applications for DNA Amplification(ed.H.A.Erlich，F(xiàn)reeman Press，NY，N.Y.，1992)；PCR ProtocolsA Guide to Methodsand Applications(eds.Innis，等，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)；Matilla等，Nucleic Acids Res.194967(1991)；Eckert等，PCR Methodsand Applications 117(1991)；PCR(eds.McPherson等，IRL Press，Oxford)；和美國專利號4,683,202，將其每一篇的全部內(nèi)容都并入本文作為參考)。其它合適的擴(kuò)增方法包括連接式反應(yīng)(LCR)(見Wu and Wallace，Genomics4560(1989)and Landegren等，Science 2411077(1988))，轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173(1989))，自持序列復(fù)制(Guatelli等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，871874(1990))和基于核酸的序列擴(kuò)增(NASBA)。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)都可以實現(xiàn)核酸中一種或多種等位基因的存在或者缺失的測定?？梢允褂萌魏卧试S精確測定變異的技術(shù)。優(yōu)選的技術(shù)允許以最小量的樣品操作來快速，精確測定多個變異。適合技術(shù)的例子包括，但不限于，直接DNA測序，毛細(xì)管電泳，雜交，利用，例如，等位基因特異性探針或者引物，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，核酸陣列，引物特異性延伸，蛋白質(zhì)檢測，和本領(lǐng)域公知的其它技術(shù)。幾種用于DNA測序的方法是本領(lǐng)域公知的并且通?？梢岳玫?，并且可以用于測定給定個體中存在的等位基因。見，例如，Sambrook，等，Molecular CloningALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，New York)(2001)，和Ausubel，等，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，New York)(1997)，在此并入作為參考。對于用來檢測例如，SNPs的核酸陣列(DNA芯片)的使用細(xì)節(jié)見頒給Lipshultz等的美國專利號6,300,063，和頒給Chee等的美國專利號5,837,832，HuSNP Mapping Assays，試劑盒和用戶手冊，Affymetrix Part No.90094(Affymetrix，Santa Clara，Calif.)，在此全部并入本文作為參考。
本發(fā)明的檢測方法可以用于在體外或體內(nèi)檢測生物學(xué)樣品中核酸或多肽中的一種或多種等位基因的存在或者缺失。例如，用于檢測目標(biāo)核酸分子的體外技術(shù)包括RNA印跡雜交，DNA印跡雜交和原位雜交。用于檢測目標(biāo)多肽的體外技術(shù)包酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)，蛋白質(zhì)印跡，免疫沉淀反應(yīng)和免疫熒光檢驗法。
或者，可以通過向受試者體內(nèi)導(dǎo)入標(biāo)記的抗體來在受試者中體內(nèi)檢測多肽。例如，所述抗體可以用放射性標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，其在受試者體內(nèi)的存在和定位可以通過標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)進(jìn)行檢測。
可以利用DNA印跡或者RNA印跡分析，斑點印跡，或者其它基于膜的技術(shù)，量尺實驗(dipstick assay)，和利用提取自患者的體液或組織的微陣列來檢測本文所述的多態(tài)性。本發(fā)明的多核苷酸序列，以及由其衍生的較長或較短序列也可以用作微陣列，或其它基因型分型系統(tǒng)中的靶標(biāo)。這些系統(tǒng)可以用于同時檢測大量特定等位基因的存在或缺失或者監(jiān)測大量基因產(chǎn)物的表達(dá)。
在優(yōu)選的實施方案中，有可能使用等位基因特異性探針測定多態(tài)性的基因型以確定核酸樣品中的單倍型結(jié)構(gòu)。用于分析多態(tài)性的等位基因特異性探針的設(shè)計和使用由，例如，頒給Dong等的美國專利號6,361,947所描述。可以設(shè)計雜交到來自一個個體的靶核酸樣品，例如，DNA或RNA的片段上，但不雜交到來自另一個個體的相應(yīng)片段上的等位基因特異性探針，不雜交是由于在來自兩個個體的各自片段中存在不同的多態(tài)性形式(等位基因)。雜交條件應(yīng)當(dāng)足夠嚴(yán)格從而使得等位基因之間的雜交強(qiáng)度有顯著差異，并優(yōu)選基本上二進(jìn)位的反應(yīng)，由此探針僅雜交到其中一個等位基因上。設(shè)計一些探針來雜交到靶核酸分子的片段上，從而使得多態(tài)性位點能與探針的中心位置(例如，在15-mer中第7位置上；在25-mer中第13位置上)對齊。探針的這種設(shè)計能夠良好地區(qū)別不同的等位基因形式之間的雜交。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸特異性地結(jié)合到靶核酸上，作為檢測靶核酸中多態(tài)性的手段。還可以將這些等位基因特異性探針固定在核酸陣列上。與核酸陣列雜交的例子包括使用DNA芯片(寡核苷酸陣列)，例如，可獲自Affymetrix，Inc.Santa Clara，Calif的那些。在優(yōu)選的實施方案中，使用核酸陣列在靶DNA樣品中檢測本發(fā)明的單倍型標(biāo)記。
在其它實施方案中，可以用羥胺或四氧化鋨和用哌啶對DNA/DNA或者RNA/DNA雙螺旋進(jìn)行處理以便消化錯配的區(qū)域。在消化錯配區(qū)域后，隨后將得到的物質(zhì)根據(jù)大小在變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離以確定多態(tài)性位點。見，例如，Cotton等(1988)Proc.Natl Acad SciUSA 854397；和Saleeba等(1992)Methods Enzymol.217286-295.在優(yōu)選的實施方案中，可以標(biāo)記對照DNA或者RNA進(jìn)行檢測。
還在其它實施方案中，錯配剪切反應(yīng)采用一種或多種識別雙鏈DNA中錯配堿基對的蛋白質(zhì)(所謂″DNA錯配修復(fù)″酶)。例如，大腸桿菌的mutY酶剪切G/A錯配上的A而來自HeLa細(xì)胞的胸苷DNA糖基化酶剪切G/T錯配上的T(Hsu等(1994)Carcinogenesis 151657-1662)。根據(jù)例示性的實施方案，將基于本發(fā)明的單倍型標(biāo)記的等位基因的探針雜交到來自測試細(xì)胞的cDNA或者其它DNA產(chǎn)物上。用DNA錯配修復(fù)酶雙螺旋，并且可以由電泳方法等等檢測出剪切產(chǎn)物，如果有的話(見，例如，美國專利號5,459,039)。
在又一個實施方案中，利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)測定等位基因在包含梯度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中的運(yùn)動(Myers等(1985)Nature313495)。當(dāng)DGGE用作分析方法時，將對DNA進(jìn)行修飾以確保它不完全變性，例如通過加入大約40bp的GC夾鉗，其是PCR生成的高熔點富含GC的DNA。在又一個實施方案中，使用溫度梯度代替變性劑梯度以鑒定對照和樣品DNA的遷移性的差異(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys Chem 26512753)。
對于產(chǎn)生蛋白質(zhì)翻譯成熟前終止的多態(tài)性，蛋白質(zhì)截短測試(PTT)提供了有效的診斷方法(Roest，等，(1993)Hum.Mol Genet.21719-21；vander Luijt，等，(1994)Genomics 201-4)。對于PTT，開始將RNA從獲得的組織中分離并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段。隨后將逆轉(zhuǎn)錄PCR的產(chǎn)物用作模板以包含RNA聚合酶啟動子和序列起始真核翻譯的序列的引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。在目標(biāo)區(qū)的擴(kuò)增后，導(dǎo)入引物的獨特基序允許PCR產(chǎn)物的連續(xù)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。
還可以通過雜交到核酸陣列上來評估本發(fā)明的多態(tài)性和單倍型標(biāo)記，其實例在WO 95/11995中得以描述。WO 95/11995還描述了進(jìn)行優(yōu)選來檢測預(yù)先表征過的多態(tài)性的變異形式的亞陣列。這種亞陣列包含設(shè)計來與第二種參照序列互補(bǔ)的探針，所述第二種參照序列是第一種參照序列的等位基因變體。通過相同的原理設(shè)計第二組探針，除了所述探針展示與第二種參照序列的互補(bǔ)性。包括第二組(或其它組)可以對于分析起始參照序列中的短的亞序列特別有用，其中預(yù)期在與探針相同長度的短距離內(nèi)發(fā)生多個突變(例如，在9到21個堿基內(nèi)的兩個或多個突變)。
通過使用變性梯度凝膠電泳可以分析利用聚合式反應(yīng)生成的擴(kuò)增產(chǎn)物?；诓煌男蛄幸蕾囆腿劢馓匦院虳NA在溶液中的電泳遷移可以鑒定不同的等位基因(Erlich，ed.，PCR Technology，Principles and Applicationsfor DNA Amplification，W.H.Freeman and Co，New York，1992，第7章)。
利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析可以區(qū)分出靶序列的等位基因，所述單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析通過單鏈PCR產(chǎn)物的電泳遷移變化鑒定堿基差異，如在Orita等，Proc.Nat.Acad.Sci.86，2766-2770(1989)中所述?？梢匀缟纤錾蓴U(kuò)增PCR產(chǎn)物，并加熱或變性，以形成單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。單鏈核酸可以進(jìn)行再折疊或形成二級結(jié)構(gòu)，這部分取決于堿基序列。單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的不同電泳遷移性可以與靶序列的等位基因之間的堿基序列差異相關(guān)。
對于鑒定和分析多態(tài)性的一種備選方法是基于偶聯(lián)了熒光共振能量傳遞物(FRET)的熒光標(biāo)記引物的單堿基延伸(SBE)，所述熒光共振能量傳遞物是在添加堿基的標(biāo)記和引物標(biāo)記之間。一般，諸如由Chen等，(Proc.Nat.Acad.Sci.9410756-61(1997))所述的方法使用位點特異性寡核苷酸引物，其在5’端用羧基熒光素(FAM)進(jìn)行標(biāo)記。設(shè)計這種標(biāo)記引物從而使得3′末端緊鄰目標(biāo)多態(tài)性位點。將標(biāo)記引物雜交到所述位點，并以染料終端測序的方式用熒光標(biāo)記的二脫氧核糖核苷酸(ddNTPs)進(jìn)行標(biāo)記引物的單堿基延伸，除了沒有脫氧核糖核苷酸存在。添加的ddNTP響應(yīng)在標(biāo)記引物波長上激發(fā)的熒光增強(qiáng)被用來推斷添加核苷酸的同一性。
通過本領(lǐng)域公知的多種間接或直接方法可以確定個體中單倍型標(biāo)記X的存在，所述方法用來對于一個或兩個拷貝的個體基因組中一組多態(tài)性位點測定單倍型或單倍型對，其包括下列討論的那些。個體中多態(tài)性位點的基因型可以通過本領(lǐng)域已知的或如下所述的方法進(jìn)行測定。
一種用于確定零或至少一個拷貝的單倍型是否存在于個體中的間接方法是通過基于在包含所述單倍型的一個或多個多態(tài)性位點(PS)上測定的個體基因型的預(yù)測，并利用每個位點上測定的基因型確定存在于個體中的單倍型來進(jìn)行的。零，一或兩個拷貝的目標(biāo)單倍型的存在可以通過肉眼觀察在包含所述單倍型的PS上的等位基因進(jìn)行測定。通過將個體基因型與相同組PS上的基因型相比較，并確定哪一種單倍型對最可能存在于所述個體中來指定單倍型對，其對應(yīng)于已知存在于一般群體或特定群體組中的單倍型對或?qū)?yīng)于基于在每個PS上可能的選擇性等位基因而在理論上可能的單倍型對。
在相關(guān)的間接單倍型分型方法中，在個體中零拷貝或至少一個拷貝的單倍型的存在是利用已經(jīng)存在于參照組中的單倍型對的信息，由一組包含選定單倍型的PS的個體基因型進(jìn)行預(yù)測的。在一個實施方案中，這種單倍型對預(yù)測方法包括在包含選定單倍型的那組多態(tài)性位點上鑒定個體的基因型，存取包含在參照群體中對于一組包含選定單倍型的那組多態(tài)性位點的多態(tài)性位點鑒定的單倍型對的數(shù)據(jù)，并對個體指定與個體基因型相一致的單倍型對。隨后可以基于指定的單倍型對確定個體是否具有單倍型標(biāo)記X。單倍型對可以通過將個體基因型與對應(yīng)于已知存在于一般群體或特定群體組中的單倍型相比較，并測定哪種單倍型對與個體基因型相一致來指定單倍型對。在一些實施方案中，所述比較步驟可以通過肉眼觀察進(jìn)行。當(dāng)個體的基因型與一種以上的單倍型對相一致時，可以使用頻率數(shù)據(jù)來測定這些單倍型對中的哪一種最有可能存在于個體中。如果一種與個體單倍型相一致的特定單倍型對在參照群體中比和所述基因型一致的其它單倍型對更加頻繁，那么具有最高頻率的單倍型對就最有可能存在于個體中。
這種測定在一些實施方案中也可以通過肉眼觀察進(jìn)行。在其它實施方案中，所述比較可以通過計算機(jī)執(zhí)行的算法用個體基因型和以計算機(jī)可讀儲存的參照單倍型數(shù)據(jù)進(jìn)行。例如，如在WO01/80156中所述，進(jìn)行這種比較的計算機(jī)執(zhí)行算法承擔(dān)了列舉所有可能的與基因型一致的單倍型對，存取包含在參照群體中測定的單倍型對頻率的數(shù)據(jù)以測定所述人體具有可能的單倍型對的可能性，和分析測定的可能性以對所述個體指定單倍型對。
一般，參照群體由隨機(jī)選擇的個體組成，所述個體代表世界上主要的人種組。在本發(fā)明的方法中優(yōu)選使用的參照群體由高加索人個體組成，其數(shù)目是基于一個人被確?？吹降膯伪缎偷南∮谐潭冗M(jìn)行選擇的。例如，如果想有q％的機(jī)率不丟失以p％發(fā)生頻率存在于參照群體中的單倍型，那么必須取樣的個體數(shù)目通過2n＝log(1-q)/log(1-p)給出，其中p和q表示為分?jǐn)?shù)。特別優(yōu)選的參照群體包括3代高加索家族以充當(dāng)對照對于檢查單倍型分型方法的質(zhì)量。
如果所述參照群體包含一個以上的人種組，對每組的頻率數(shù)據(jù)進(jìn)行檢查以確定它是否符合Hardy-Weinberg平衡。Hardy-Weinberg平衡(D.LHartl等，Principles of Population Genomics，Sinauer Associates(Sunderland，MA)，3rd Ed.，1997)假定發(fā)現(xiàn)單倍型對H1/H2的頻率等于pH-W(H1/H2)＝2p(H1)p(H2)，如果H1≠H2，和PH-W(H1/H2)＝p(H1)p(H2)，如果H1＝H2。在觀察和預(yù)期單倍型頻率之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異可以歸因于一種或多種因素，包括群體組內(nèi)顯著的近親繁殖，對于基因的強(qiáng)選擇壓力，取樣偏倚，和/或基因型分型方法的誤差。如果在人種組中觀察到與Hardy-Weinberg平衡的大的偏差，可以提高該組中個體的數(shù)目來看該偏差是否是由于取樣偏倚造成的。如果更大的樣品規(guī)模并不減少觀察和預(yù)期單倍型頻率之間的差異，那么可以希望考慮利用直接的單倍型分型方法如，例如，CLASPER系統(tǒng)TM技術(shù)(美國專利號5,866,404)，單分子稀釋，或者等位基因特異性長程PCR (Michalotos-Beloin等，核酸Res.244841-4843，1996)對個體進(jìn)行單倍型分型。在這種對個體預(yù)測單倍型對的方法的一種實施方案中，所述指定步驟包括進(jìn)行下列分析。首先，將每種可能的單倍型對與參照群體中的單倍型對比較。一般，只有其中一種參照群體中的單倍型對匹配可能的單倍型對并且向個體指定該對。偶而地，只有一種參照單倍型對中給出的單倍型與個體的可能單倍型對相一致，在這些情況下對個體指定包含這種已知單倍型的單倍型對和通過將已知單倍型從可能的單倍型對中減去而得到的新單倍型?；蛘?，個體中的單倍型對可以利用報道的方法(例如，Clark等1990，Mol Bio Evol 7111-22或者WO 01/80156)或通過商業(yè)單倍型分型裝置如Genaissance Pharmaceuticals，Inc.(New Haven，CT)所提供的，由個體對于該基因的基因型進(jìn)行預(yù)測。在很少的情況下，在參照群體中沒有單倍型與可能的單倍型對相一致，或者，多個參照單倍型對與可能的單倍型對相一致。在這些情況下，優(yōu)選利用直接分子單倍型分型方法如，例如，CLASPER系統(tǒng)TM技術(shù)(美國專利號5,866,404)，SMD，或者等位基因特異性長程PCR(Michalotos-Beloin等，同上)來對個體進(jìn)行單倍型分型。
在此對于包含兩個多態(tài)性位點，PSA和PSB的單倍型說明由基因型測定存在于個體中的單倍型的數(shù)目。下表顯示可以在PSA和PSB上檢測到的9(3n，其中每個n＝2的雙等位基因多態(tài)性位點都可以具有存在的3種不同基因型的其中一種)種基因型，使用來自個體的兩個染色體拷貝。所述兩個位點的九種可能的基因型的其中八個允許明確測定存在于個體中的單倍型的拷貝數(shù)并且因此允許明確測定所述個體是否具有單倍型標(biāo)記X。不過，具有C/G A/C基因型的個體能夠具有任一種下列單倍型對CA/GC或者CC/GA，因而相應(yīng)于單倍型標(biāo)記X能夠具有1個拷貝的單倍型(CC/GA單倍型對)，或者相應(yīng)于單倍型標(biāo)記X具有0拷貝(CA/GC單倍型對)的單倍型。對于在確定的基因型C/G A/C之下的單倍型對中有不明確的情況，可以使用頻率信息來確定最可能的單倍型對并因此確定在個體中的單倍型的最可能的拷貝數(shù)。如果與個體的基因型一致的特定單倍型對在參照群體中比與所述基因型一致的其它單倍型對頻率更高，那么具有最高頻率的那個單倍型對就最有可能存在于個體中。隨后可以在所述PS上通過肉眼觀察測定在此單倍型對中的目標(biāo)單倍型的拷貝數(shù)，所述PS包含所述對中每種單倍型的反應(yīng)標(biāo)記。
或者，對于不明確的雙雜合子，可以進(jìn)行基因或染色體位點中一個或多個其它位點的基因型分型以消除在PSA和PSB上所述基因型之下去卷曲單倍型對的不明確性。熟練技術(shù)人員將會認(rèn)識到這些一個或多個其它位點將需要與所述對中的至少一種可能的單倍型中的等位基因具有足夠的連鎖性以便允許明確指定單倍型對。盡管本說明已經(jīng)指向測定存在于個體中的這種單倍型的數(shù)目的特定例子，但該方法對于任何包含單倍型標(biāo)記X的連鎖或取代單倍型都將是類似的。
基于PSA和PSB上基因型的假定單倍型(GA)的可能拷貝數(shù)
所需組的PS的個體基因型可以利用多種本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行測定。這些方法一般包括從個體中分離包含兩個拷貝的目標(biāo)基因或位點的基因組DNA樣品，由所述樣品中擴(kuò)增一種或多種包含待進(jìn)行基因型分型的多態(tài)性位點的靶區(qū)，和檢測存在于擴(kuò)增的靶區(qū)中每個目標(biāo)PS上的核苷酸對。不必對于每種目標(biāo)PS使用相同的方法來測定基因型。
此外，通過對另一種多態(tài)性位點的單倍型分型或基因型分型可以間接測定本文所述的任何多態(tài)性位點上存在的等位基因的同一性，所述另一種多態(tài)性位點與目標(biāo)多態(tài)性位點位于連鎖不平衡。與目前公開的多態(tài)性位點處于連鎖不平衡的多態(tài)性位點可以位于所述基因的區(qū)域中或位于本文未檢查的其它基因組區(qū)域中。存在于和新多態(tài)性位點連鎖不平衡的多態(tài)性位點上的等位基因的檢測可以通過，但不限于，任一種上述用于檢測多態(tài)性位點上等位基因同一性的方法進(jìn)行。
或者，通過利用本領(lǐng)域已知的方法，直接對個體基因組目標(biāo)區(qū)域或其合適片段的至少一個拷貝進(jìn)行單倍型分型，可以對一組包含單倍型標(biāo)記X的PS的單倍型或單倍型對在個體中的存在進(jìn)行測定。這些直接的單倍型分析方法一般包括以產(chǎn)生半合子DNA的方式處理分離自個體的基因組核酸樣品，所述半合子DNA樣品只具有兩個“拷貝”的個體基因組區(qū)域的其中之一，其如熟練技術(shù)人員容易理解的，可以是相同的等位基因或不同的等位基因，由樣品中擴(kuò)增一種或多種包含待進(jìn)行基因型分型的多態(tài)性位點的靶區(qū)，和檢測擴(kuò)增靶區(qū)中每個目標(biāo)PS上存在的核苷酸。所述核酸樣品可以利用多種本領(lǐng)域已知的用于制備半合子DNA樣品的方法獲得，所述方法包括如WO 98/01573，美國專利號5,866,404，和美國專利號5,972,614中所述的酵母中的靶向性體內(nèi)克隆(TIVC)；如美國專利號5,972,614中所述利用等位基因特異性寡核苷酸結(jié)合引物延伸和核酸外切酶生成半合子DNA靶；如在Ruano等，Proc.Natl.Acad.Sci.876296-6300，1990中所述的單分子稀釋(SMD)；和等位基因特異性PCR(Ruafio等，1989，supra；Ruano等，1991，同上；Michalatos-Beloin等，同上)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會容易地理解的是，任何個體克隆一般將只提供存在于個體中的兩種基因組拷貝的其中之一的單倍型信息。如果需要對于所述個體其它拷貝的單倍型信息，通常需要對其它克隆進(jìn)行檢測。一般，應(yīng)當(dāng)檢測至少五個克隆以便具有大于90％的可能性，來對所述個體中的兩個拷貝的基因組位點都進(jìn)行單倍型分型。不過，在一些情況下，一旦一種基因組等位基因的單倍型被直接測定，就可以推斷另一種等位基因的單倍型，如果所述個體對于目標(biāo)多態(tài)性位點具有已知的基因型，或者如果已知所述個體群體組的單倍型頻率或單倍型對頻率的話。
盡管在基因的兩種拷貝的直接單倍型分型中，優(yōu)選用置于分離的容器中的每種基因拷貝進(jìn)行分析，但也考慮如果兩種拷貝被標(biāo)記以不同的標(biāo)簽，或者是可以單獨區(qū)分開來的或可鑒定的，就有可能在一些情況下在同一容器中進(jìn)行單倍型分型。例如，如果基因的第一種或第二種拷貝分別被標(biāo)記以不同的第一種和第二種熒光染料，并且標(biāo)記以又一第三種不同熒光染料的等位基因特異性寡核苷酸被用來測定多態(tài)性位點，那么檢測第一和第三種染料的組合將鑒定第一種基因拷貝中的多態(tài)性，而檢測第二和第三種染料的組合將鑒定第二種基因拷貝中的多態(tài)性。
用于以上間接和直接單倍型分型方法中的核酸樣品一般從取自個體的生物學(xué)樣品中分離，如血液樣品或組織樣品。適合的組織樣品包括全血，唾液，淚液，尿液，皮膚和頭發(fā)。
B.藥物基因組學(xué)與對于特定治療方案的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的特定等位基因的知識，其本身或結(jié)合其它與特定疾病或病癥有關(guān)的遺傳缺陷的信息，允許根據(jù)受試者的遺傳模式定制預(yù)防或治療方案。本發(fā)明特別涉及藥物基因組學(xué)領(lǐng)域，即，涉及患者基因如何決定他或她對于藥物的反應(yīng)(例如，患者的“藥物反應(yīng)表型”，或“藥物反應(yīng)基因型”)的研究。因而，本發(fā)明的另一個方面提供了一種按照受試者的藥物反應(yīng)基因型量身定做受試者的預(yù)防或治療方案(如施用A1efacept)的方法。本發(fā)明的藥學(xué)基因組學(xué)方法允許臨床醫(yī)生或醫(yī)師對于患者靶向預(yù)防或治療性處理，所述患者將最大限度地從所述處理中受益并避免處理將會對處理無反應(yīng)和/或可能發(fā)生毒性藥物相關(guān)副作用的患者。
基于在來自受試者的樣品中的本文所述的一種或多種多態(tài)性的檢測，可以預(yù)測受試者對于治療方案的反應(yīng)。例如，如上所示，在來自受試者的樣品中以下各項的存在(a)至少一個拷貝的單倍型標(biāo)記1；(b)兩個拷貝的單倍型標(biāo)記2的存在；(c)至少一個拷貝的單倍型標(biāo)記4的存在；或者(d)單倍型標(biāo)記3的缺失將表示該受試者有可能對于Alefacept的治療無反應(yīng)。因而，這個受試者應(yīng)當(dāng)用另一種治療方案進(jìn)行治療。相反地，在來自(a)缺失單倍型標(biāo)記1；(b)缺失單倍型標(biāo)記2或者存在一個拷貝的單倍型標(biāo)記2；(c)存在至少一個拷貝的單倍型標(biāo)記3；或者(d)缺失單倍型標(biāo)記4的受試者的樣品中的檢測，將表明該受試者有可能對于Alefacept的治療有反應(yīng)。因而，治療這位受試者的醫(yī)師將選擇繼續(xù)治療。本發(fā)明還包括預(yù)測方法，其采用本文所鑒定的任一種多態(tài)性的組合的檢測。例如，本發(fā)明提供了一種方法，用于鑒定有可能對于Alefacept的治療無反應(yīng)的受試者，通過在來自受試者的樣品中測定(a)單倍型標(biāo)記1和單倍型標(biāo)記2的存在或者(b)單倍型標(biāo)記1和單倍型標(biāo)記3的存在。本發(fā)明還提供了一種方法，用于鑒定有可能對于Alefacept的治療有反應(yīng)的受試者，通過在來自受試者的樣品中測定(a)單倍型標(biāo)記1和單倍型標(biāo)記2的缺失或者(b)單倍型標(biāo)記1和單倍型標(biāo)記3的缺失。此外，通過讓患者群體層次化(stratification)，本發(fā)明的單倍型標(biāo)記關(guān)聯(lián)可以用于發(fā)展對于皮膚疾病，例如，牛皮癬，和其它疾病或者疾病的新治療的臨床試驗。
C.試劑盒本發(fā)明還包括試劑盒，用于檢測生物學(xué)樣品中本發(fā)明的單倍型標(biāo)記的存在，例如，適于診斷受試者對于治療方案的反應(yīng)的試劑盒。所述試劑盒包括用于檢測獲自患者的生物學(xué)樣品中本發(fā)明的單倍型標(biāo)記的存在或者缺失的裝置。任選地，所述試劑盒可以進(jìn)一步包括單倍型標(biāo)記與疾病，疾病易感性，或者治療反應(yīng)的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)組。在優(yōu)選的實施方案中，所述關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)組在計算機(jī)可讀的介質(zhì)上。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含可以用來檢測本發(fā)明的多態(tài)性或單倍型標(biāo)記的至少一種本發(fā)明的核酸，優(yōu)選寡核苷酸，更加優(yōu)選寡核苷酸引物或者探針的試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒可以包含一種或多種寡核苷酸，包括將5′和3′雜交到至少一種等位基因上的5′和3′寡核苷酸。PCR擴(kuò)增寡核苷酸應(yīng)當(dāng)在25和2500個堿基對之間的間隔，優(yōu)選在大約100和大約500個堿基對之間的間隔雜交，以便產(chǎn)生便利大小的PCR產(chǎn)物進(jìn)行隨后的分析。
通常，所述試劑盒包含一對或多對寡核苷酸引物，其雜交到靶核酸上以允許一種或多種靶區(qū)的擴(kuò)增，所述靶區(qū)包含或是本發(fā)明的一種或多種單倍型標(biāo)記的一部分。在優(yōu)選的實施方案中，可以對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析以測定包含在靶核酸中的多態(tài)性和/或單倍型標(biāo)記的基因型。在一些試劑盒中，提供固定在基質(zhì)上的寡核苷酸探針。在優(yōu)選的實施方案中，固定到基質(zhì)上的寡核苷酸探針雜交到本發(fā)明的給定多態(tài)性的特異性等位基因上。
為了試劑盒中的使用，寡核苷酸可以是許多天然和/或合成組合物的任一種，如合成性寡核苷酸，限制性片段，cDNAs，合成性核酸(PNAs)，等等。測定試劑盒和方法還可以采用標(biāo)記的寡核苷酸以便使得測定中的鑒定容易?？刹捎玫臉?biāo)記的例子包括放射性標(biāo)記，酶，熒光性化合物，鏈霉抗生物素，抗生物素蛋白，生物素，磁性部分，金屬結(jié)合部分，抗原或抗體部分，等等。
任選地，所述試劑盒還可以包括DNA取樣裝置。DNA取樣裝置是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且可以包括，但不限于，基質(zhì)如濾紙，(例如，theAmpliCardTM(University of Sheffield，Sheffield，England S10 2JF；Tarlow，JW，等，J.of Invest.Dennatol.103387-389(1994))等等；DNA純化試劑如theNucleonTM試劑盒，裂解緩沖液，蛋白酶溶液等等；PCR試劑，如10x反應(yīng)緩沖液，熱穩(wěn)定聚合酶，dNTPs，等等；和等位基因檢測工具如HinfI限制酶，等位基因特異性寡核苷酸，用于從干燥血液進(jìn)行巢式PCR的簡并性寡核苷酸引物。
通常，所述試劑盒還包含實施本發(fā)明的方法的說明書。這些試劑盒有助于鑒定有可能對治療方案陽性反應(yīng)或陰性反應(yīng)的受試者；有發(fā)展成炎性疾病，如牛皮癬的危險的受試者，對加劇牛皮癬疾病的藥物敏感的受試者，和具有與本發(fā)明的多態(tài)性和單倍型標(biāo)記連鎖不平衡的其它特征的受試者，并且還可以用于遺傳咨詢。
將整個本申請中所引用的所有參考文獻(xiàn)，專利和公開專利申請的內(nèi)容并入本文作為參考。
通過下列實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，所述實施例不應(yīng)被視為限制性的。
實施例將下列方法用于本文所述的實施例中。
A.研究受試者在第一種研究中，具有足夠DNA的患者(N＝205)選自4種研究，其中3種是安慰劑對照研究而其中1種是開放標(biāo)記研究。所有患者中，145位患者用Alefacept進(jìn)行治療而60位患者用安慰劑進(jìn)行治療。在145位活性患者中，有119位強(qiáng)反應(yīng)者和26位無反應(yīng)者。在60位安慰劑患者中，有30位強(qiáng)反應(yīng)者和30位無反應(yīng)者。
在第二種研究中，臨床組由68位強(qiáng)反應(yīng)者，其隨機(jī)選自一組在對Alefacept的反應(yīng)中達(dá)到PASI75的活性患者，和26位來自第一種研究的無反應(yīng)者組成。
B.樣品獲得和處理基于這里所述的臨床表型的定義，只有強(qiáng)反應(yīng)者和無反應(yīng)者被包括在分析群體中。具有低DNA量的受試者被排除在分析組之外。為了最小化臨床表型定義中的不利嗓音，將由于有限效力調(diào)查(efficacy visits)和/或抑制型伴隨藥物的使用而在治療期間任何時候都未達(dá)到PASI25的無反應(yīng)者排除在最后的分析組之外。
C.分析的表型牛皮癬面積和嚴(yán)重性指數(shù)(PASI)由基線的百分比減少是在第一和第二種研究中評估的表型。反應(yīng)級別如下進(jìn)行定義(a)強(qiáng)反應(yīng)者指反應(yīng)在任何時間都大于或等于由基線PASI的50％的減少的患者；(b)部分反應(yīng)者指在任何時間反應(yīng)都大于或等于由基線的PASI的25％但＜50％的減少的患者；或者(c)無反應(yīng)者指在任何時間反應(yīng)都小于由基線的PASI的25％的減少的患者。
D.候選基因在第一種研究中，選擇一組候選基因用于基因型分型，集中在涉及T細(xì)胞激活和抑制(T-細(xì)胞受體，輔助受體，整合素)，藥物靶向的受體(Fcγ受體)，和已知與牛皮癬有關(guān)的基因。在第二種研究中，選擇一組另外的39種候選基因用于基因型分型。
用于基因型分型的候選基因集中在與希望進(jìn)行治療的疾病，牛皮癬相關(guān)的基因上，并且集中在編碼與Amevive直接相互作用的蛋白質(zhì)的基因以及那些結(jié)合到其靶受體上被Amevive二級活化的基因。與牛皮癬相關(guān)的基因包括染色體6上的PSORS1位點基因，即，HCR，SPR1，STG，SEEK1，TCF 19和HLA-C?；贏mevive的作用模式選擇的基因包括CD2，Amevive的同類受體和CD58，編碼Amevive的膜結(jié)合形式的LFA3基因。此外，研究了編碼涉及T淋巴細(xì)胞激活和共刺激的細(xì)胞表面受體的基因，如CD3E，CD3G，CD3Z，CD4，CD8A，CD8B1，CTLA4，CCR6，ICAM和ICOS，和那些編碼下游信號蛋白的基因，如NFKB1，NFKB2，LCK，TNF，IL-20，CD2BP，IKBKAP，ZAP70，ITGAL，ITGAM?；贏mevive分子的C末端使Fcγ受體參與介導(dǎo)效應(yīng)劑功能(一種提議的臨床作用模式)的能力，研究了編碼Fcγ受體I(A，B)，II(A，B)和III(A，B)的基因以及編碼介導(dǎo)下游信號和Fc受體介導(dǎo)的效應(yīng)劑功能的蛋白質(zhì)的基因，如MAPK1，NFATC1，NFATC2，GNLY(granulolysin)，GZMB(粒酶B)。
E.SNP發(fā)現(xiàn)和單倍型標(biāo)記生成通過對來自組中受試者的基因組DNA進(jìn)行測序來實施SNP發(fā)現(xiàn)和臨床組的基因型分型。從基因組DNA中擴(kuò)增用于測序的區(qū)域(ATP上游500bp；每個外顯子加外顯子每端100bp的側(cè)翼序列；和終止密碼子下游100bp)。利用每種候選基因的序列設(shè)計加尾的PCR引物。利用AppliedBiosystems Big Dye Terminator chemistry對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并在ABIPrism 3700 DNA分析儀上進(jìn)行分析。利用PolyPhred程序?qū)Λ@得的序列檢查多態(tài)性的存在。隨后，對序列數(shù)據(jù)手工掃描樣品制備和測序異常并棄去在PolyPhred輸出文件中錯誤鑒定的SNPs。一旦SNP被接受，就對臨床組中每個個體的基因型進(jìn)行手工確證并保存。
利用在WO01/80156中所述的方法從臨床組的SNP單倍型中得到單倍型。對于向受試者每次指定單倍型對，置信分值量化指定精確性的可能性。在構(gòu)建單倍型中不使用低頻率的SNPs。
F.統(tǒng)計分析對于每個基因，選擇減少組的多態(tài)性位點，其產(chǎn)生上面利用全部多態(tài)性位點對于該基因座得到的單倍型的至少95％的遺傳多樣性(Judson，R.等Pharmacogenomics，3(3)379-91(2002))，用于以臨床終端進(jìn)行統(tǒng)計分析。列舉來自減弱少組的每種基因的所有可能單倍型，其包含最大高達(dá)四種多態(tài)性。使用這種對于多態(tài)性位點數(shù)目的上限，因為對于給定的基因來說，包括4或5個以上多態(tài)性位點的單倍型很少是最強(qiáng)的單倍型，并且因為較不重要的多態(tài)性通常加入到已經(jīng)很強(qiáng)的單倍型中，稀釋它們的作用。將分析組中的每個個體分類為具有0，1，或者2個拷貝的單倍型。隨后對具有＞5％頻率的每種單倍型關(guān)聯(lián)測試與臨床終端的關(guān)聯(lián)。
一種主要的結(jié)果變量是PASI分值的二元化版本(見C部分，分析的表型)，包括無反應(yīng)者和強(qiáng)反應(yīng)者。其反應(yīng)落入這兩種范圍之間的患者不包括在分析中。使用邏輯回歸來評估單倍型與強(qiáng)烈反應(yīng)或非反應(yīng)的二元結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)。用在邏輯分析中分析單倍型和臨床表型之間的關(guān)聯(lián)的模式是一般性關(guān)聯(lián)模型(0拷貝對1拷貝對2拷貝)，顯性關(guān)聯(lián)模型(0拷貝對1或2拷貝)，和隱性關(guān)聯(lián)模型(0或1拷貝對2拷貝).。對于所有模型來說，包括了對于單倍型拷貝數(shù)的遺傳標(biāo)記術(shù)語。性別和基線PASI被用作共變量。由于進(jìn)行了許多統(tǒng)計試驗，進(jìn)行了置換試驗(Good，P，2000.Permutation TestsA Practical Guide to Resampling Methods for TestingHypotheses，2nd edition.Springer′Series in Statistics，New York)以便對多種比較進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時適當(dāng)?shù)卣f明在該基因中單倍型的非獨立性。在這種方法中，將結(jié)果和共變量保持恒定，并將生成的單倍型組隨機(jī)改變序列1,000次。對于每個1,000次置換記錄來自許多單倍型中的最小p值。隨后將在這種分布中觀察到的p值分位數(shù)用作調(diào)節(jié)p值。例如，如果來自置換的4.5％的最小p值小于單倍型的粗p值，那么該單倍型的置換調(diào)節(jié)p值將為0.045。
在此基于分布性SNPs在每種基因中的定位對發(fā)現(xiàn)與臨床表型具有關(guān)聯(lián)的單倍型進(jìn)行標(biāo)記，利用該基因的參照mRNA的起始密碼子(ATG)作為+1位置的參照。所用的符號給出SNPs的ATG偏移(5′-3′)，后接每個位置上的等位基因。例如，在CD8B1基因的單倍型標(biāo)記1(-255，25，28589/CTG)，本文也稱作單倍型標(biāo)記1中，C是在-255上的啟動子SNP上的等位基因，而T和G分別是在所述基因中位置25和28589上的外顯子SNPs上的等位基因。
下列實施例提供包含在CD8B1，HCR，SPR1，和TCF19基因中鑒定的多態(tài)性位點的總結(jié)的表。特別地，對于每個基因來說，提供了一個表，有多態(tài)性位點號(″多態(tài)性位點號″)，SNP第一個位置的ATG偏移(″ATG偏移″)，序列內(nèi)SNP的第一個位置的核苷酸位置(″核苷酸位置″)，存在于ATG偏移和核苷酸位置上的等位基因(″參照等位基因″)，和取代替換參照等位基因的等位基因(″變異型等位基因″)。
在本分析中，發(fā)現(xiàn)CDSB1，HCR和SPR1和TCF19基因展現(xiàn)與PASI分值的統(tǒng)計學(xué)上顯著的關(guān)聯(lián)。
實施例I在CD8B1基因中單倍型標(biāo)記1的鑒定和分析本實施例描述了關(guān)于CD8B1基因中單倍型與對Alefacept的反應(yīng)的關(guān)聯(lián)的分析，以及鑒定這些單倍型的拷貝數(shù)能夠區(qū)分對Alefacept的強(qiáng)反應(yīng)者與無反應(yīng)者。最詳細(xì)地分析了表1的單倍型標(biāo)記1，一種三SNP單倍型。
A.在CD8B1基因中鑒定的多態(tài)性位點表2描述了在CD8B1基因中鑒定的多態(tài)性位點。如上所示，表2提供了一種多態(tài)性位點號(″多態(tài)性位點號″)，SNP第一個位置的ATG偏移(″ATG偏移″)，SEQ ID NO1內(nèi)SNP的第一個位置的核苷酸位置(″核苷酸位置″)，存在于ATG偏移和核苷酸位置上的等位基因(″參照等位基因″)，和取代替換參照等位基因的等位基因(″變異型等位基因″)。
表2.在CD8B1基因中鑒定的多態(tài)性位點
表3A和3B分別提供了CD8B1單倍型，利用顯性和隱性拷貝數(shù)模型，其顯示與PASI最顯著的關(guān)聯(lián)。特別是，表3A和3B的列中所給出的″CD8B1基因的多態(tài)性位點″對應(yīng)于表2中鑒定的CD8B1基因的多態(tài)性位點。表3A和3B的每一行代表單倍型標(biāo)記。此外，對于CD8B1基因內(nèi)的每個單倍型標(biāo)記來說，″未調(diào)節(jié)的P值″和″O.R.″分別對應(yīng)于粗p值和優(yōu)勢率。表3A和3B中的星號表示在這些位點上的等位基因are not determining并且可以是等位基因，即，如表2中所鑒定的參照等位基因或變異型等位基因。″較低CI的O.R.″和″較高CI的O.R.″代表95％的優(yōu)勢率置信限度。
表3A利用顯性遺傳拷貝數(shù)模型顯示與PASI關(guān)聯(lián)的CD8B1單倍型的表格
表3B利用隱性遺傳拷貝數(shù)模型顯示與PASI關(guān)聯(lián)的CD8B1單倍型的表格
B.CD8B1基因中的單倍型標(biāo)記1CD8B1基因中的三SNP單倍型(-255，25，28589/CTG)，本文稱作″單倍型標(biāo)記1，″將對于Alefacept的強(qiáng)反應(yīng)者與具有5.2的OR的無反應(yīng)者區(qū)別開來。
在單倍型標(biāo)記1和Alefacept反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)具有顯性遺傳模式，因為具有1或2個拷貝的受試者更有可能成為無反應(yīng)者而具有0拷貝的受試者更有可能成為強(qiáng)反應(yīng)者。在表4中提供了單倍型標(biāo)記1關(guān)聯(lián)的總結(jié)。
表4.單倍型標(biāo)記1的關(guān)聯(lián)結(jié)果的總結(jié)
C.單倍型標(biāo)記1與藥物反應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析圖1將單倍型標(biāo)記1與藥物反應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果描繪為一般性模型的OR曲線(比較0，1，和2個拷貝的標(biāo)記)。
圖2顯示了利用遺傳顯性模型的單倍型標(biāo)記1的關(guān)聯(lián)的OR曲線。當(dāng)在Alefacept處理的患者組中關(guān)于反應(yīng)對0，1，和2個拷貝的單倍型(一般性模型)進(jìn)行測試時，這種關(guān)聯(lián)具有0.0021的粗p值。單倍型標(biāo)記的拷貝數(shù)對于安慰劑反應(yīng)沒有影響并且對于安慰劑反應(yīng)的p值是非顯著性的(p＝0.523)(下版，圖1)。
在對于多種比較校正粗p值后，所述關(guān)聯(lián)保持統(tǒng)計學(xué)上的顯著性(置換調(diào)節(jié)的p＝0.021)。當(dāng)以顯性模型分析時，具有零拷貝標(biāo)記的人相對于具有1或2個拷貝標(biāo)記的人，有5.2倍更有可能對Alefacept反應(yīng)。性別不平衡顯現(xiàn)在患者組中，因此對較大的性別群男性進(jìn)行了亞組分析，并且標(biāo)記主要效應(yīng)保持顯著性(p＝0.0044)，對于具有零拷貝對1或2個拷貝的單倍型標(biāo)記的受試者有6.1的OR。
對Alefacept強(qiáng)反應(yīng)者和無反應(yīng)者之間的標(biāo)記分布總結(jié)于表5中。CD8B1標(biāo)記(1或2個拷貝的CTG)鑒定了62％的無反應(yīng)者和28％的強(qiáng)反應(yīng)者具有5.2的OR。通過將這些測試特征應(yīng)用到反應(yīng)試驗的分布上(23％的無反應(yīng)者和55％的強(qiáng)反應(yīng)者)，預(yù)測CD8B1單倍型標(biāo)記1具有81.6％的陽性預(yù)測值(PPV)(即，反應(yīng)強(qiáng)烈的可能性，假定一個人具有強(qiáng)烈反應(yīng)拷貝數(shù))和48.3％的陰性預(yù)測值(NPV)(即，不反應(yīng)的可能性，假定一個人具有非反應(yīng)拷貝數(shù))，對于Alefacept無反應(yīng)。
表5.單倍型標(biāo)記1的分布
實施例II在HCR基因中單倍型標(biāo)記2和單倍型標(biāo)記5的鑒定和分析本實施例描述了在HCR中單倍型的鑒定和分析，其與對Alefacept治療的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。對單倍型標(biāo)記2和5，三SNP單倍型，進(jìn)行最詳細(xì)地分析。
A.在HCR基因中鑒定的多態(tài)性位點表6描繪了HCR基因中鑒定的多態(tài)性位點。如以上所示，表6提供了多態(tài)性位點號，SNP的第一個位置的ATG偏移，在SEQ ID NO2內(nèi)SNP的第一個位置的核苷酸位置，存在于ATG偏移和核苷酸位置上的等位基因，和取代替換參照等位基因的等位基因。
表6.在HCR基因中鑒定的多態(tài)性位點
表7A和7B分別利用顯性和隱性遺傳拷貝數(shù)模型提供顯示對于PASI最顯著關(guān)聯(lián)的HCR單倍型。如上所述，在表7A和7B的列中給出的“HCR基因的多態(tài)性位點”對應(yīng)于表6中鑒定的HCR基因的多態(tài)性位點。表7A和7B的每一行代表單倍型標(biāo)記。此外，對于HCR基因內(nèi)的每個單倍型標(biāo)記來說，″未調(diào)節(jié)的P值″和″O.R.″分別對應(yīng)于粗p值和優(yōu)勢率。表7A和7B中的星號表示在這些位點上的等位基因不是確定的并且可以是等位基因，即，如表6中所鑒定的參照等位基因或變異型等位基因?！遢^低CI的O.R.″和″較高CI的O.R.″代表95％的優(yōu)勢率置信限度。
表7A利用顯性遺傳拷貝數(shù)模型顯示與PASI關(guān)聯(lián)的HCR單倍型的表格
表7B利用隱性遺傳拷貝數(shù)模型顯示與PASI關(guān)聯(lián)的HCR單倍型的表格
B.HCR基因中的單倍型標(biāo)記2在表8中提供了標(biāo)記的總結(jié)(255，25，28589/CTG)，本文稱作“單倍型標(biāo)記2”。單倍型標(biāo)記2具有隱性模式，因為具有2個拷貝的受試者更有可能成為無反應(yīng)者。在表9中也總結(jié)了第二種(5782，11565，14287/GGC)，本文也稱作″單倍型標(biāo)記5，″與標(biāo)記(2175，5787，11565/CTG)具有類似的分布和對反應(yīng)的作用。
表8.單倍型標(biāo)記2的關(guān)聯(lián)結(jié)果的總結(jié)
表9.單倍型標(biāo)記5的關(guān)聯(lián)結(jié)果的總結(jié)
C.單倍型標(biāo)記2與藥物反應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析圖3將單倍型標(biāo)記2與藥物反應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果描繪為OR曲線。與具有0或1拷貝的患者相比，具有2拷貝標(biāo)記的患者群體對于Alefacept反應(yīng)的OR為5.5。當(dāng)在Alefacept處理的患者組中針對反應(yīng)對0，1，或2個拷貝的單倍型標(biāo)記進(jìn)行測試時，選定的單倍型具有0.0016的粗p值。單倍型標(biāo)記的拷貝數(shù)對于安慰劑反應(yīng)沒有影響并且對于安慰劑反應(yīng)的p值是非顯著性的(p＝0.371)(下版，圖3)。在對于多種比較校正粗p值后，所述關(guān)聯(lián)保持統(tǒng)計學(xué)上的顯著性(置換調(diào)節(jié)的p＝0.031)。
由于相似的反應(yīng)可能性，具有0或1個拷貝的單倍型標(biāo)記的受試者可以分入1組，如圖3中所見。這暗示一種隱性遺傳模型，其中具有0或1拷貝單倍型標(biāo)記的受試者與具有2個拷貝單倍型標(biāo)記的受試者相比，有5.7倍更有可能對Alefacept反應(yīng)(圖4)。對Alefacept強(qiáng)反應(yīng)者和無反應(yīng)者之間的標(biāo)記分布總結(jié)于表10中。這種HCR標(biāo)記(2個拷貝的CTG)鑒定了58％的無反應(yīng)者和21％的強(qiáng)反應(yīng)者具有5.7的OR。如果將這些測試特征應(yīng)用到Alefacept試驗的反應(yīng)分布上(23％的無反應(yīng)者和55％的強(qiáng)反應(yīng)者)，預(yù)測HCR單倍型標(biāo)記2將具有81.1％的PPV和52％的NPV，對于Alefacept無反應(yīng)。
表10.單倍型標(biāo)記2的分布
實施例III在SPR1基因中單倍型標(biāo)記3的鑒定和分析本實施例描述了在SPR1中單倍型的鑒定和分析，其與對Alefacept治療的反應(yīng)強(qiáng)烈相關(guān)聯(lián)。對單倍型標(biāo)記3，三SNP單倍型，進(jìn)行最詳細(xì)地分析。
A.在SPR1基因中鑒定的多態(tài)性位點表11描繪了SPR1基因中鑒定的多態(tài)性位點。如以上所示，表11提供了多態(tài)性位點號，SNP的第一個位置的ATG偏移，在SEQ ID NO3內(nèi)SNP的第一個位置的核苷酸位置，存在于ATG偏移和核苷酸位置上的等位基因，和取代替換參照等位基因的等位基因。
表11.在SPR1基因中鑒定的多態(tài)性位點
表12利用顯性遺傳拷貝數(shù)模型提供顯示對于PASI最顯著關(guān)聯(lián)的SPR1單倍型。特別地，在表1 2的列中給出的“SPR1基因的多態(tài)性位點”對應(yīng)于表11中鑒定的SPR1基因的多態(tài)性位點。表12的每一行代表單倍型標(biāo)記。此外，對于SPR1基因內(nèi)的每個單倍型標(biāo)記來說，″未調(diào)節(jié)的P值″和″O.R.″分別對應(yīng)于粗p值和優(yōu)勢率。表12中的星號表示在這些位點上的等位基因不是確定的并且可以是等位基因，即，如表11中所鑒定的參照等位基因或變異型等位基因。″較低CI的O.R.″和″較高CI的O.R.″代表95％的優(yōu)勢率置信限度。
表12利用顯性遺傳拷貝數(shù)模型顯示與PASI關(guān)聯(lián)的SPR1單倍型的表格
B.SPR1基因中的單倍型標(biāo)記3選擇三SNP單倍型標(biāo)記(-845，-455，1171/GGA)，本文稱為“單倍型標(biāo)記3”，用于進(jìn)行詳細(xì)分析。
單倍型標(biāo)記3具有顯性模式，因為具有0拷貝的受試者更有可能成為無反應(yīng)者。在表13中提供了單倍型標(biāo)記3的總結(jié)。
表13.單倍型標(biāo)記3的關(guān)聯(lián)結(jié)果的總結(jié)
C.單倍型標(biāo)記3與藥物反應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析圖5將單倍型標(biāo)記3與藥物反應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果描繪為OR曲線。當(dāng)在Alefacept處理的患者組中針對反應(yīng)對0，1，或2個拷貝的標(biāo)記進(jìn)行測試時，選定的單倍型具有0.0009的粗p值。標(biāo)記的拷貝數(shù)對于安慰劑反應(yīng)沒有影響并且對于安慰劑反應(yīng)的p值是非顯著性的(p＝0.2839)(圖5，下版)。在利用置換試驗對于多種比較校正粗p值后，所述關(guān)聯(lián)保持統(tǒng)計學(xué)上的顯著性(置換調(diào)節(jié)的p＝0.028)。
由于相似的反應(yīng)可能性，將具有1或2個拷貝的單倍型標(biāo)記的受試者分入一組，如圖5中所見。這代表一種顯性遺傳模型，其中具有1或2拷貝的受試者與具有0拷貝單倍型標(biāo)記的受試者相比，有7倍更有可能對Alefacept反應(yīng)(圖6)。
對Alefacept強(qiáng)反應(yīng)者和無反應(yīng)者之間的標(biāo)記分布總結(jié)于表14中。這種SPR1標(biāo)記(0拷貝的CTG)鑒定了46％的無反應(yīng)者和13％的強(qiáng)反應(yīng)者具有7.1的OR。如果將這些測試特征應(yīng)用到Alefacept試驗中所見的反應(yīng)分布上(23％的無反應(yīng)者和55％的強(qiáng)反應(yīng)者)，預(yù)測SPR1單倍型標(biāo)記3將具有80％的PPV和61％的NPV，對于Alefacept無反應(yīng)。
表14.單倍型標(biāo)記3的分布
實施例IV在TCF19基因中單倍型標(biāo)記4的鑒定和分析本實施例描述了在TCF19中單倍型的鑒定和分析，其與對Alefacept治療的反應(yīng)強(qiáng)烈相關(guān)聯(lián)。對單倍型標(biāo)記4進(jìn)行最詳細(xì)地分析。
A.在TCF19基因中鑒定的多態(tài)性位點表15描繪了TCF19基因中鑒定的多態(tài)性位點。特別地，表15提供了多態(tài)性位點號，SNP的第一個位置的ATG偏移，在SEQ ID NO4內(nèi)SNP的第一個位置的核苷酸位置，存在于ATG偏移和核苷酸位置上的等位基因，和取代替換參照等位基因的等位基因。
表15.在TCF19基因中鑒定的多態(tài)性位點
表16A和16B分別利用顯性和隱性遺傳拷貝數(shù)模型提供顯示對于PASI最顯著關(guān)聯(lián)的TCF19單倍型。特別地，在表16A和16B的列中給出的“TCF19基因的多態(tài)性位點”對應(yīng)于表15中鑒定的TCF19基因的多態(tài)性位點。表16A和16B的每一行代表單倍型標(biāo)記。此外，對于TCF19基因內(nèi)的每個單倍型標(biāo)記來說，″未調(diào)節(jié)的P值″和″O.R.″分別對應(yīng)于粗p值和優(yōu)勢率。表16中的星號表示在這些位點上的等位基因沒有確定并且可以是等位基因，即，如表15中所鑒定的參照等位基因或變異型等位基因?！遢^低CI的O.R.″和″較高CI的O.R.″代表95％的優(yōu)勢率置信限度。
表16A利用顯性遺傳拷貝數(shù)模型顯示與PASI關(guān)聯(lián)的TCF19單倍型的表格
表16B利用隱性遺傳拷貝數(shù)模型顯示與PASI關(guān)聯(lián)的TCF19單倍型的表格
B.TCF19基因中的單倍型標(biāo)記4TCF19基因標(biāo)記和PASI分值的關(guān)聯(lián)分析鑒定了TCF19的單倍型標(biāo)記(2365，3340/GG)，本文稱為“單倍型標(biāo)記4”，與對于A1efacept的反應(yīng)具有統(tǒng)計學(xué)上顯著的關(guān)聯(lián)。在表17中提供了單倍型標(biāo)記4的總結(jié)。
表17.單倍型標(biāo)記4的關(guān)聯(lián)結(jié)果的總結(jié)
C.單倍型標(biāo)記4與藥物反應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析在圖7中也將單倍型標(biāo)記4對Alefacept反應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果以O(shè)R曲線描繪。它表明具有0拷貝這種標(biāo)記的人與具有1或2拷貝所述標(biāo)記的人相比，有6.3倍更高的對Alefacept反應(yīng)的幾率。單倍型標(biāo)記4具有0.0015的粗p值和0.01的置換調(diào)節(jié)的p值。在表18中提供了單倍型標(biāo)記4分布的總結(jié)。
表18.單倍型標(biāo)記4的分布
71％的時間，單倍型標(biāo)記4正確地鑒定了無反應(yīng)者。如果將測試特征應(yīng)用到Alefacept試驗中所見的反應(yīng)分布上(23％的無反應(yīng)者和55％的強(qiáng)反應(yīng)者)，預(yù)測這種單倍型標(biāo)記將具有86％的PPV和53％的NPV，對于Alefacept無反應(yīng)。
實施例V多基因分析本實施例描述了具有與對Alefacept反應(yīng)顯著關(guān)聯(lián)的HCR，SPR1，CD8B1和TCF19基因的單倍型標(biāo)記的多基因分析。在HCR，SPR1，CD8B1和TCF19基因中與對Alefacept反應(yīng)顯著關(guān)聯(lián)的單倍型標(biāo)記總結(jié)于表19中，并考慮包括在二基因模型中。
表19.包括在多基因分析中的單基因單倍型標(biāo)記
由于HCR和SPR1在PSORS1座位上高度連鎖，來自每個基因的標(biāo)記趨于在相同患者中發(fā)現(xiàn)。因此，這對基因未在2基因模型中進(jìn)行分析。
在二基因模型中，評估每個基因的拷貝數(shù)和單倍型標(biāo)記的組合(已經(jīng)分解來反映隱性或顯性模型，其提供最佳單基因統(tǒng)計結(jié)果)。進(jìn)行邏輯回歸，一開始考慮單倍型標(biāo)記對的拷貝數(shù)的所有四個可能組合。隨后將所述四種拷貝數(shù)組分成兩個(最差組對其它三組或最佳組對其它三組)。在實施的模型中，沒有一種具有顯著性的相互作用p值。不過，在所有模型中，對于第二種標(biāo)記的主要效應(yīng)的添加的自由試驗的2-級(2-degree of freedomtest)和與第一種標(biāo)記的相互作用效應(yīng)為顯著性的，而不論標(biāo)記加入的順序如何。表20給出了主要效應(yīng)的p值，相互作用，以及自由試驗的2-級。
表20.來自多基因分析的相互作用模型的總結(jié)
在強(qiáng)反應(yīng)者和無反應(yīng)者之間的標(biāo)記分布總結(jié)于下面的表中。
如在表21中所示，由1或2個拷貝的單倍型標(biāo)記1和2個拷貝的單倍型標(biāo)記2組成的CDSB1/HCR-CTG多基因標(biāo)記，正確地鑒定了38％的無反應(yīng)者并且只錯誤地指定5％的強(qiáng)反應(yīng)者為無反應(yīng)者，OR為12。因而，對于這種多基因標(biāo)記測試為陰性的受試者比測試為陽性的受試者12倍更有可能對于Alefacept治療產(chǎn)生反應(yīng)。如果將這些測試特征應(yīng)用到Alefacept試驗中所見的反應(yīng)分布上(23％的無反應(yīng)者和55％的強(qiáng)反應(yīng)者)，預(yù)測這種標(biāo)記將具有78.8％的陽性預(yù)測值(PPV)和75％的陰性預(yù)測值(NPV)，對于Alefacept無反應(yīng)。
表21.CD8B1/HCR-CTG多基因標(biāo)記的分布
如表22中所示，由1或2個拷貝的單倍型標(biāo)記1和0拷貝的單倍型標(biāo)記3組成的CD8B1/SPR1多基因標(biāo)記，正確地鑒定了31％的無反應(yīng)者并且只錯誤地指定3％的強(qiáng)反應(yīng)者為無反應(yīng)者，OR為11。因而，對于這種多基因標(biāo)記測試為陰性的受試者比測試為陽性的受試者11倍更有可能對于Alefacept治療產(chǎn)生反應(yīng)。如果將這些測試特征應(yīng)用到Alefacept試驗中所見的反應(yīng)分布上(23％的無反應(yīng)者和55％的強(qiáng)反應(yīng)者)，預(yù)測這種標(biāo)記將具有76.8％的PPV和77.8％的NPV，對于Alefacept無反應(yīng)。
表22.CD8B1/SPR1多基因標(biāo)記的分布
如表23中所示，由1或2個拷貝的單倍型標(biāo)記4和2個拷貝的單倍型標(biāo)記1組成的TCF19/CD8B1多基因標(biāo)記，正確地鑒定了91％的反應(yīng)者并且錯誤地指定50％的無反應(yīng)者為強(qiáng)反應(yīng)者，OR為13.1。因而，對于這種多基因標(biāo)記測試為陽性的受試者比測試為陰性的受試者13倍更有可能對于Alefacept治療產(chǎn)生反應(yīng)。如果將這些測試特征應(yīng)用到Alefacept試驗中所見的反應(yīng)分布上(23％的無反應(yīng)者和55％的強(qiáng)反應(yīng)者)，預(yù)測這種標(biāo)記將具有80.6％的PPV和70.6％的NPV，對于Alefacept無反應(yīng)。
表23.TCF19/CD8B1多基因標(biāo)記的分布
如表24中所示，由1或2個拷貝的單倍型標(biāo)記4和2個拷貝的單倍型標(biāo)記2組成的TCF19/HCR多基因標(biāo)記，正確地鑒定了90％的反應(yīng)者并且錯誤地指定58％的無反應(yīng)者為強(qiáng)反應(yīng)者，OR為6.9。因而，對于這種多基因標(biāo)記測試為陽性的受試者比測試為陰性的受試者7倍更有可能對于Alefacept治療產(chǎn)生反應(yīng)。如果將這些測試特征應(yīng)用到Alefacept試驗中所見的反應(yīng)分布上(23％的無反應(yīng)者和55％的強(qiáng)反應(yīng)者)，預(yù)測這種標(biāo)記將具有79.4％的PPV和62.5％的NPV，對于Alefacept無反應(yīng)。
表23.TCF19/HCR多基因標(biāo)記的分布
如表25中所示，由1或2個拷貝的單倍型標(biāo)記4和0拷貝的單倍型標(biāo)記3組成的TCF19/SPR1多基因標(biāo)記，正確地鑒定了91％的反應(yīng)者并且錯誤地指定65％的無反應(yīng)者為強(qiáng)反應(yīng)者，OR為7.5。因而，對于這種多基因標(biāo)記測試為陽性的受試者比測試為陰性的受試者八倍更有可能對于Alefacept治療產(chǎn)生反應(yīng)。如果將這些測試特征應(yīng)用到Alefacept試驗中所見的反應(yīng)分布上(23％的無反應(yīng)者和55％的強(qiáng)反應(yīng)者)，預(yù)測這種標(biāo)記將具有76.9％的PPV和61.5％的NPV，對于Alefacept無反應(yīng)。
表25.TCF19/SPR1多基因標(biāo)記的分布
表26展示了利用這些遺傳標(biāo)記作為Alefacept療法篩選試驗的效果的模擬。在100個患者的樣品中(反映Alefacept試驗中所見的反應(yīng)率)，將有23位無反應(yīng)者，22位部分反應(yīng)者，和55位強(qiáng)反應(yīng)者。對于每個單或多基因標(biāo)記來說，“In”組由將基于試驗結(jié)果進(jìn)行治療的患者組成?！癘ut”組由將不進(jìn)行治療的那些患者組成。盡管部分反應(yīng)者未被包括在統(tǒng)計分析中，但它們的單倍型是已知的，因此可以包括在此表中。例如，利用CD8B1/SPR1標(biāo)記，將對91患者進(jìn)行治療，對于他們來說反應(yīng)的分布將分別為17.6％，24.2％和58.2％無反應(yīng)者，部分反應(yīng)者和強(qiáng)反應(yīng)者；9位患者將被拒絕治療，其77.8％，0％和22.2％將為無反應(yīng)者，部分反應(yīng)者和強(qiáng)反應(yīng)者。
表26.單倍型標(biāo)記對于Alefacept治療篩選的模擬使用
*在分析中排除了部分反應(yīng)者。
序列表<110>B.科希B.J達(dá)因M.K.阿南特詹萍<120>單倍型標(biāo)記和利用其確定對于治療的反應(yīng)的方法<130>A212 WO 001<141>04-05-2004<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>26419<212>DNA<213>智人<220>
<221>等位基因<222>(1272)..(1272)<223>PS2多態(tài)堿基腺嘌呤或者鳥嘌呤<220>
<221>等位基因<222>(1702)..(1702)<223>PS6多態(tài)堿基胞嘧啶或者胸腺嘧啶<220>
<221>等位基因<222>(1981)..(1981)<223>PS11多態(tài)堿基胞嘧啶或者胸腺嘧啶<220>
<221>不確定<222>(3055)..(3155)<223>N′s代表未知核苷酸<220>
<221>等位基因<222>(9682)..(9682)<223>PS13多態(tài)堿基鳥嘌呤或者腺嘌呤<220>
<221>不確定<222>(10786)..(10886)<223>N′s代表未知核苷酸
<221>等位基因<222>(12027)..(12027)<223>PS15多態(tài)堿基鳥嘌呤或者腺嘌呤<220>
<221>等位基因<222>(16448)..(16448)<223>PS21多態(tài)堿基鳥嘌呤或者腺嘌呤<220>
<221>不確定<222>(17114)..(17214)<223>N′s代表未知核苷酸<220>
<221>等位基因<222>(25065)..(25065)<223>PS26多態(tài)堿基腺嘌呤或者鳥嘌呤<220>
<221>等位基因<222>(25139)..(25139)<223>PS27多態(tài)堿基胞嘧啶或者胸腺嘧啶<220>
<221>等位基因<222>(25215)..(25215)<223>PS28多態(tài)堿基胞嘧啶或者胸腺嘧啶<400>1cactaatatt tagaggttaa tttatcacag acgcaagagt ttccataact aatgcatcca60ggggttccct gtctatgatt ttagacaata cctgacaaag cagtgagtaa cttttaatca 120tttactgaga aagttgttcc ttttgcaatg ctgtggcgcc catgagagag tggatagaaa 180gaggtagctt gtgttttcta aacaacaaat actttgaata cacatacaaa gaagaaatac 240aaatggccaa caagcacatg aattgatgct taacatcatt tctcattcag gaagtacaaa 300tccaaaccac aatgagatat cacttcacac ccactaggat ggaacaaaac aaaaacagaa 360aataacaagt gttggcgatg atgtggggaa attggaaccc tttcattgtt ggcagaaatg 420taaatggtca cagctgctat ggaaatcagt tggttagtcc ctcaaaaagt taaacataga 480attattgtat gacccagcaa ttgcactgcc tgagtacata cctgaaagaa ttgaaaacag 540gcacccaaac atatatttgt acaagaatgt tcacagtagc attactcaca aaagtcaaaa 600agtagatata gtagcccact caaatgtcca tcattagatg aacagataaa gaaaatgtgg 660tatatacagg tacatacaca aaatattact caacaataag aagaaatggt gctataatgg 720ggatgaacct gaaaaacatt gcgctgagtc aaagaagcca ttcgctaaag accacacatt 780gtatgggagc caaggcagta tccagcgaga ctctggcctc tggctgggct gagtgacttc 840ttttccccca gtgcctttga actctctgca cccaactcag ccatgagcaa tgctgtcacc 900agcaatgggc agaggggctg gggcaagagt gggatggaaa gaatactgga tgtggagacc 960aaatgtgaca gtgtccttgc ccggctgcct gctttagatc tcaggggaca cgccatttcc 1020tctccgataa actctaagct cttagggtaa cccatggacc tgcctggctg ggtctttgtt 1080
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<220>
<221>等位基因<222>(13914)..(13914)<223>PS47多態(tài)堿基腺嘌呤或者胸腺嘧啶<220>
<221>等位基因<222>(14309)..(14309)<223>PS50多態(tài)堿基胞嘧啶或者鳥嘌呤<400>2cgccctttca actctgccaa gaatggctcc cacctggctc tcagacattc ccctggtcca 60acccccaggc catcaagatg tctcagagag gcggctagac acccagagac ctcaagtgac120catgtgggaa cgggatgttt ccagtgacag gcaggagcca gggcggagag gcaggtaggg180atccatccac gccgttttct caggcttgct tgctagtgac ccttcctcac tggaataaac240tccttaccct atttcggccc tagtttccag aacgtactca tttttatgta agcaattagt300tcctacagtg cataaataat aaagcagtgt gctaagtgct agggatgagg ataacaatag360tgaataagac aaatcctgac ttaaatttgt aattaataag gaatctaaaa tcctaagagg420ggagatagat tgaccaccag ctgatggtaa agcatggtat gaggcaagat gaagaagtgc480aaactagagg tagagaccca gcactgtggc agtgtgggtt cattctgatg gaagaaagcc540tttacagagg acatgctgtg ggagctggcc atgctgtcgt attatctgta aacattctta600ttcttgtttc atgtgtcttt tcccagatgt actgggatat cattctgcca ttttgctcca660gaataggatt acattagaag aagcagcatg atgaagaagg aatactagac tgggtgtcag720gagacagaga ctctatttct agtttggcta ccagctagag gacatttggc aagtcactta780atttccctag cctacagatc gctgctacta aagaaaagaa agaaagagcg agccagatat840ggcggctcac acctataatc ctagcacttt gggagctgag gcaggaggat cacttgagcc900caggagttca tgaccagcgt gggcaacaaa gcgagactcc gtctccacag aaaataatta960gctggctgtg gtggcatgca tttgtagtcc tagctactca ggaggctaag gtggtaggac1020cccttgagct cagaagttga agactgcagt gacctatgat ccagccactg cattgaggcc1080tgggtgacac agtgataccc tgtctctaaa aacgacaaca acaacaatct cttatagtcc1140tgggtctcag agagctgcct caggagccat gttccaagct ggattaaact tcacgtgaca1200ttggtagacg atttctctaa aggctggcac tgtgttattt atgtactgtt ctctcagact1260cctcataaag tatacctaac actcaataaa tgcctttttt tttttttttt ttttttgaga 1320tggagtctca ctctgtcgcc caggctggag tgcactgggg agatcttggc tcactgcaag1380ctccgcctcc caggttgacg ccattctcct gcctcagcct cccaagcagc tgggactaca1440ggcacctgcc accacgccca gctagttttt tatattttta gtagagatgg ggtttcaccg1500tgttaaccag gatgatctcg atctcctgac ctcgtgatcc gcccgcctcg gcctcccaaa1560gtgctgggat tacaggcatg agccaccgcg cccagccaat aaatgccttt taactagcac1620ctggcctcac catattgata ctggaagctt acgacctctc tatgcccatt cctccctcaa1680acttcttgcc cttaaattag aattgagaag tccctgtgtg ttcttccaac ctttccactt1740aaaatgtgtg gcctaaaaat aaaaaaataa ataagacaaa aaaaccacca aaaaacaaaa1800agaatgtgtg gcctaatgat atacacattt gatgttgaat cctcctgtat gtagctctct1860ctagggagat catgttccac gatctcagcc agactttagg tcctgtgagt ccaggcactg1920gactcaacat gctcaatagg gctttgatga atgatgatga tgtcaatgca gacatcccca1980taccccagct tcagcacccc cttcacctcc ccacacggaa gcagaggggt cctcttttcc2040ttctcctggc tatgtttatg ccctcaacta tccttccagc actggagaca agtctcacct2100gcactaacct gtctttgaag gtcctggggg ctggaggggt cacaggccct gagccagcag2160gctgaggtga tcgttcggca gctgcaagag ctgcrgyggc tggaggagga ggtccggctc2220ctgcgggaga cctcgctgca gcagaagatg aggctagagg cccaggccat ggagctagag2280gctctggcac gggcggagaa ggccggccga gctgaggctg agggcctgcg tgctgctttg2340gctggggctg aggttgtccg gaagaacttg gaagagggga gscagcggga gctggaagag2400gttcagaggc tgcaccaaga gcaggtgaat gcaggggtag aaaggattca aattcataac2460ggagagctgg gcagtagctt ccaagcaaag aacaggtatt gcagaaaaga ccctccatga2520gtagtgagta gtagagtgat gagacctttg gtgaaaataa acacacatgg gctagaaaga2580
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<221>等位基因<222>(1128)..(1128)<223>PS2多態(tài)堿基鳥嘌呤或者腺嘌呤<220>
<221>等位基因<222>(1402)..(1402)<223>PS6多態(tài)堿基鳥嘌呤或者腺嘌呤<220>
<221>等位基因<222>(1792)..(1792)<223>PS7多態(tài)堿基鳥嘌呤或者腺嘌呤<220>
<221>等位基因
<222>(1863)..(1863)<223>PS12多態(tài)堿基胸腺嘧啶或者胞嘧啶<220>
<221>等位基因<222>(2019)..(2019)<223>PS16多態(tài)堿基腺嘌呤或者鳥嘌呤<220>
<221>等位基因<222>(2407)..(2407)<223>PS20多態(tài)堿基胞嘧啶或者胸腺嘧啶<220>
<221>等位基因<222>(2873)..(2873)<223>PS21多態(tài)堿基鳥嘌呤或者腺嘌呤<220>
<221>等位基因<222>(2985)..(2985)<223>PS22多態(tài)堿基鳥嘌呤或者腺嘌呤<220>
<221>等位基因<222>(3159)..(3159)<223>PS24多態(tài)堿基胞嘧啶或者胸腺嘧啶<220>
<221>等位基因<222>(3417)..(3417)<223>PS27多態(tài)堿基腺嘌呤或者鳥嘌呤<400>3gtttgagacc agccaacata gggagactcc atctatataa aaaataaaaa taaaaaacat60tggagggcat ggtggcgtgc acccatggtc ctagttactc cagaggctga gttgggagga 120ttgtttgagc ccaagaggtt gaggctgcaa tgagctgtga tcgcaccact gcaccccagc 180ctaagagagc gagaacctgt cctcactccc caaacaaagg gaagacgcaa catgatttgg 240tgtacatttt ttttcctgag ggacttactg gatggtccct tccagagtga ggtacacata 300tccacgcact gtggtcagcg attgctcccg gcacccagcg cagcagatgg gtgggtctaa 360ccaggtcact tccccaggag ggcataattg agcagtttcc gcatcaggtc cacgtgggcc 420agcagcatgc ggcaggcagc ggctgtggtg cttcaggccc agggcgtccc catcagcgta 480cttggactgc agcagcccca ggtaggcctc ccacgtgttg cccacagtct tgctgcaggt 540gaagcagcgc acacaactcc tgagctcaag tggtcctcct gtgtcagctt cccaaagtgc 600tggcatgagc cactacgcct ggcctgatat atatatatat gttttttttt tttttgagac 660ggaatttcac tcgttgccca ggctggagtg caatggtgtg atctcagctc accacaacct 720ctgcctcctg ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctct tgagtagctg ggattacagg 780catgtgccac catgtccggc taatattttt gtatttttag tagagacggg gtttctccat 840gttggtcagg ctggtcttga actcccgacc tcaggtgatc tgcccgcttc ggcctcccaa 900
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<221>等位基因<222>(1568)..(1568)<223>PS3多態(tài)堿基胸腺嘧啶或者胞嘧啶<220>
<221>等位基因<222>(1661)..(1661)<223>PS5多態(tài)堿基胞嘧啶或者胸腺嘧啶<220>
<221>等位基因<222>(2186)..(2186)<223>PS6多態(tài)堿基胸腺嘧啶或者胞嘧啶<220>
<221>等位基因<222>(3929)..(3929)<223>PS7多態(tài)堿基胞嘧啶或者胸腺嘧啶<220>
<221>等位基因<222>(4235)..(4235)<223>PS9多態(tài)堿基鳥嘌呤或者腺嘌呤<220>
<221>等位基因<222>(4326)..(4326)<223>PS11多態(tài)堿基胞嘧啶或者胸腺嘧啶<220>
<221>等位基因<222>(5210)..(5210)<223>PS13多態(tài)堿基腺嘌呤或者鳥嘌呤<400>4tgcagggcta gaccctcccc aagaccttgg gaatccaggc cgcctagatc cccaggcaga 60aaagccagcg tcctgacatc ttattcaaat ctttcctgcg gctgttctct cagcttctct120
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權(quán)利要求
1.一種確定受試者對于用T細(xì)胞損耗劑進(jìn)行治療的反應(yīng)的方法，包括在來自所述受試者的樣品中確定T細(xì)胞激活或抑制單倍型內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上存在的核苷酸，由此基于在所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型中一個或多個多態(tài)性位點上存在于所述受試者內(nèi)的核苷酸來確定受試者對于用T細(xì)胞損耗劑進(jìn)行治療的反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞損耗劑是Alefacept。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在選自由CD8B1，HCR，SPR1，和TCF19組成的組的基因中的單倍型。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在CD8B1基因中的單倍型并且其中在單倍型和對治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)p值小于或等于大約0.005。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在SPR1基因中的單倍型，其中在單倍型和對治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)p值小于或等于大約0.005。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在TCF19基因中的單倍型，其中在單倍型和對治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)p值小于或等于大約0.010。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在HCR基因中的單倍型并且其中在單倍型和對治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)p值小于或等于大約0.007。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是單倍型標(biāo)記1，并且該方法進(jìn)一步包括在來自所述受試者的樣品中，確定在T細(xì)胞激活或抑制單倍型內(nèi)一個或多個多態(tài)性位點上存在的核苷酸，所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型選自單倍型標(biāo)記2，單倍型標(biāo)記3，單倍型標(biāo)記4，或單倍型標(biāo)記5。
9.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括利用在T細(xì)胞激活或抑制單倍型中一個或多個多態(tài)性位點上存在于所述受試者內(nèi)核苷酸確定T細(xì)胞激活或抑制單倍型的拷貝數(shù)。
10.一種試劑盒，其包含選自由一種或多種寡核苷酸組成的組的寡核苷酸，所述寡核苷酸適于對在CD8B1，HCR，SPR1，和TCF19基因中的T細(xì)胞激活或抑制單倍型中的SNP進(jìn)行基因型分型，由此T細(xì)胞激活或抑制單倍型的拷貝數(shù)對于一組患有T細(xì)胞關(guān)聯(lián)疾病的受試者是否會對一種T細(xì)胞耗損劑產(chǎn)生反應(yīng)提供統(tǒng)計學(xué)上顯著的關(guān)聯(lián)。
11.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在CD8B1基因中的單倍型并且其中在單倍型和對治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)p值小于或等于大約0.005。
12.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在HCR基因中的單倍型并且其中在單倍型和對治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)p值小于或等于大約0.007。
13.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在SPR1基因中的單倍型，其中在單倍型和對治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)p值小于或等于大約0.005。
14.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在TCF19基因中的單倍型，其中在單倍型和對治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)p值小于或等于大約0.010。
15.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述T細(xì)胞耗損劑是Alefacept。
16.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述T細(xì)胞關(guān)聯(lián)疾病是牛皮癬。
17.一種試劑盒，用于檢測與對于T細(xì)胞耗損劑的反應(yīng)或無反應(yīng)有關(guān)的T細(xì)胞激活或抑制單倍型的存在，所述試劑盒包含一組設(shè)計來對T細(xì)胞激活或抑制單倍型內(nèi)的多態(tài)性位點進(jìn)行基因型分型的寡核苷酸，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在選自由CD8B1，HCR，SPR1，和TCF19組成的組的基因中的單倍型。
18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述單倍型選自由下列各項組成的組(a)表3A和3B中所示的CD8B1單倍型；(b)表7A和7B中所示的HCR單倍型；(c)表12中所示的SPR1單倍型；(d)表16A和B中所示的TCF19單倍型；(e)與下列任一種連鎖的單倍型(i)表3A和3B中所示的CD8B1單倍型，(ii)表7A和7B中所示的HCR單倍型，(iii)表12中所示的SPR1單倍型，或者(iv)表16A和B中所示的TCF19單倍型；和(f)取代下列任一種的單倍型(i)表3A和3B中所示的CD8B1單倍型，(ii)表7A和7B中所示的HCR單倍型，(iii)表12中所示的SPR1單倍型，或者(iv)表16A和B中所示的TCF19單倍型。
19.權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述單倍型是(a)選自由單倍型標(biāo)記1，單倍型標(biāo)記2，單倍型標(biāo)記3，和單倍型標(biāo)記4，和單倍型標(biāo)記5組成的組的單倍型標(biāo)記；(b)與單倍型標(biāo)記1，單倍型標(biāo)記2，單倍型標(biāo)記3，單倍型標(biāo)記4，和單倍型標(biāo)記5連鎖的單倍型；(c)對于單倍型標(biāo)記1，單倍型標(biāo)記2，單倍型標(biāo)記3，單倍型標(biāo)記4，和單倍型標(biāo)記5的取代單倍型。
20.權(quán)利要求19中所給出的試劑盒，其中在連鎖的單倍型標(biāo)記和單倍型標(biāo)記之間的連鎖不平衡具有選自由至少0.75，至少0.80，至少0.85，至少0.90，至少0.95，和1.0組成的組的Δ2。
21.權(quán)利要求的試劑盒，其中Δ2為至少0.95。
22.權(quán)利要求17中所給出的試劑盒，其中所述T細(xì)胞損耗劑為Alefacept。
23.一種試劑盒，其包含選自由一種或多種適于對在CD8B1，HCR，SPR1，和TCF19基因中的SNP進(jìn)行基因型分型的寡核苷酸組成的組的寡核苷酸，用于診斷患病受試者對治療方案的反應(yīng)。
24.權(quán)利要求23的試劑盒，其中所述SNP選自以下位置上的多態(tài)性CD8B1基因中的位置-685，-255，25，8632，15080，19501，28589，28663和28739，HCR基因中的位置2173，2175，2360，5782，5787，6174，6666，8277，8440，8476，11565，11941，12152，13553，13892，14287，SPR1基因中的位置-119，-845，-455，-384，-228，161，627，739，913和1171，和TCF19基因中的-303，-210，316，2059，2365，2456和3340。
25.權(quán)利要求23的試劑盒，進(jìn)一步包含使用說明書。
26.權(quán)利要求23的試劑盒，其中所述寡核苷酸能夠可檢測地與SNP雜交。
27.一種適于對在CD8B1，HCR，SPR1，或者TCF19基因中的T細(xì)胞激活或抑制單倍型中的SNP進(jìn)行基因型分型的單鏈寡核苷酸。
28.權(quán)利要求27的單鏈寡核苷酸，其中所述SNP選自以下位置上的多態(tài)性CD8B1基因中的位置-685，-255，25，8632，15080，19501，28589，28663和28739，HCR基因中的位置2173，2175，2360，5782，5787，6174，6666，8277，8440，8476，11565，11941，12152，13553，13892，14287，SPR1基因中的位置-119，-845，-455，-384，-228，161，627，739，913和1171，和TCF19基因中的-303，-210，316，2059，2365，2456和3340。
29.一種確定受試者對于T細(xì)胞耗損劑治療的反應(yīng)的方法，包括分析來自所述受試者的樣品以確定受試者的T細(xì)胞激活或抑制單倍型的拷貝數(shù)。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述T細(xì)胞耗損劑是Alefacept。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述T細(xì)胞激活或抑制單倍型是在選自由CD8B1，HCR，SPR1，和TCF19組成的組的基因中的單倍型。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述單倍型選自由下列各項組成的組(a)表3A和3B中所示的CD8B1單倍型；(b)表7A和7B中所示的HCR單倍型；(c)表12中所示的SPR1單倍型；(d)表16A和B中所示的TCF19單倍型；(e)與下列任一種連鎖的單倍型(i)表3A和3B中所示的CD8B1單倍型，(ii)表7A和7B中所示的HCR單倍型，(iii)表12中所示的SPR1單倍型，或者(iv)表16A和B中所示的TCF19單倍型；和(f)取代下列任一種的單倍型；(i)表3A和3B中所示的CD8B1單倍型，(ii)表7A和7B中所示的HCR單倍型，(iii)表12中所示的SPR1單倍型，或者(iv)表16A和B中所示的TCF19單倍型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過測定在單倍型標(biāo)記內(nèi)的一種或多種多態(tài)性位點上核苷酸的存在來診斷或預(yù)測對于治療的反應(yīng)的方法，所述治療如Alefacept。本發(fā)明鑒定了與對于Alefacept的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的多種單倍型。本發(fā)明鑒定的單倍型標(biāo)記和本發(fā)明的方法能夠?qū)τ谠\斷或預(yù)測對皮膚疾病，如牛皮癬的易感性特別有用。
文檔編號C07K14/705GK1997756SQ200580021392
公開日2007年7月11日 申請日期2005年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月4日
發(fā)明者B·科希, B·J·達(dá)因, M·K·阿南特, 詹萍 申請人:杰耐薩斯藥品公司