專利名稱：Il－1基因簇和相關(guān)的炎性多態(tài)性和單倍型的制作方法
1.發(fā)明背景IL-1是一種主要的炎性細(xì)胞因子，并已經(jīng)涉及介導(dǎo)急性和慢性病理性炎性疾病。兩個(gè)功能類似的分子，IL-1α和IL-1β，由單獨(dú)的基因編碼(分別地，IL1A和IL1B)。家族的第三個(gè)基因(IL1RN)編碼IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)，一種抗炎非信號(hào)分子，其與受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IL-1α和IL-1β。IL-1α，IL-1β和IL-1ra的成對(duì)比較在每種情形中產(chǎn)生＜25％的同一性，而IL-1β和IL-1ra的X-射線晶體分析法顯示緊密類似的折疊(Priestle等(1989)PNASUSA 869667-967)；Vigers等(1994)Biol Chem 26912874-12879)。在結(jié)構(gòu)上，蛋白質(zhì)由稱為β-三葉(trefoil)的12個(gè)裝配的β-折疊的單個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。因?yàn)榇蠖鄶?shù)裝配相互作用的特征在于主鏈原子，已經(jīng)爭(zhēng)論少數(shù)不變的氨基酸是產(chǎn)生IL-1折疊必需的殘基，因此基因編碼序列的廣泛多樣化已經(jīng)可能。在大豆胰蛋白酶抑制劑中獲得非常類似的折疊，而無(wú)任何可檢測(cè)的序列相似性。所有三種蛋白質(zhì)僅結(jié)合IL-1的功能信號(hào)受體，I型IL-1受體(IL-1R1)(參見(jiàn)Sims等(1993)PNAS USA 906155-6159)。
已經(jīng)表征IL-1主要作為受激的單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)物，但對(duì)于從平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞釋放的IL-1已經(jīng)提示重要作用(綜述于Ross(1993)Nature 362801-9)。通過(guò)IL-1R1的信號(hào)涉及受體的胞質(zhì)類似Toll的結(jié)構(gòu)域(Heguy等，(1992).J Biol Chem 2672605-2609)。功能性IL-1受體廣泛分布于組織中。當(dāng)前認(rèn)為IL-1ra不同于IL-1，其不能激活I(lǐng)L-1R1和第二受體元件，IL-1受體輔助蛋白，IL-1RacP之間的相互作用。這是一種跨膜蛋白，其為IL-1R1的遠(yuǎn)親，具有類似的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，但對(duì)IL-1不具有內(nèi)在的親和力(Greenfeder等，(1995)J Biol Chem 27013757-13756；Wesche等，(1997)J Biol Chem 2727727-7731)。
IL-1基因簇在染色體2的長(zhǎng)臂上(2q13)，在430Kb的區(qū)域內(nèi)包含至少關(guān)于IL-1α(IL-1A)，IL-1β(IL-1B)，和IL-1受體拮抗劑(IL-1RN)的基因(Nicklin，等(1994)Genomics，19382-4)。通過(guò)人基因組DNA限制酶切消化物的脈沖場(chǎng)凝膠電泳已經(jīng)估計(jì)遠(yuǎn)端基因IL1A和IL1RN的最大間隔為430kb(Nicklin，等(1994)Genomics，19382-4)，通過(guò)物理克隆的序列分析已經(jīng)確定三個(gè)基因的定向(Nothwang等(1997)Genomics 41370-378)。IL-18似乎是IL-1結(jié)構(gòu)家族的第四個(gè)成員(Bazan等(1996)Nature379591)。它也是一種促炎細(xì)胞因子，但其活性類似于IL-1。IL-18與相關(guān)受體(IL-18R1)而不與IL-1R1結(jié)合(Torigoe等(1997)J Biol Chem 27225737-25742)，其涉及有關(guān)輔助蛋白，IL-18RacP，而不是IL-1RacP(Bom等(1998)。IL-18基因，IL18，位于染色體11上(Nolan等，(1998)Genomics51161-3)。
從商業(yè)和公共cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)鑒定某些其它包含類似IL-1的元件的蛋白質(zhì)(Mulero等(1999)Biochem Biophys Res Commun 5702-6；Smith等(2000)J Biol Chem 2751169-1175)；Kumar等，(2000)J Biol Chem 27510308-10314；Busfield等(2000)Genomics 66213-216；Lin等(2001)J BiolChem 27620597-20602)。在cDNA選擇后通過(guò)與結(jié)合IL-1簇的YAC克隆雜交也鑒定了一個(gè)類IL-1基因(Barton等，(2000)Eur J Immunol 303299-3308)。該IL-1基因及其產(chǎn)物(即類白細(xì)胞介素-1的蛋白質(zhì)1基因/產(chǎn)物)在我們待審批的申請(qǐng)U.S.S.N.09/617720中詳述，該申請(qǐng)的內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。對(duì)于這6個(gè)新基因的統(tǒng)一命名系統(tǒng)最近已經(jīng)為涉及基因發(fā)現(xiàn)的研究者所認(rèn)可(參見(jiàn)Sims等(2001)Trends Immunol 22536-537)，并將用于本文。識(shí)別4個(gè)先前已知的IL-1家族成員，新的人基因已經(jīng)命名為IL1F5，IL1F6，IL1F7，IL1F8(即IL-IL1)，IL1F9和IL1F10。蛋白質(zhì)產(chǎn)物以該方式命名，IL-1F7b(其將意指IL1F7基因的第二個(gè)所述推定的蛋白產(chǎn)物)。基因通常似乎在人和小鼠之間保守。
由此其內(nèi)容全部結(jié)合美國(guó)專利No.6,268,142中作為參考，我們先前已經(jīng)描述了與IL-1炎性單倍型有關(guān)的某些多態(tài)性，包括SNP，及它們?cè)谘仔约膊≡\斷和治療中的應(yīng)用。在U.S.S.N.09/617720和U.S.S.N.09/969,215[公開(kāi)號(hào)US 2002/0182612]中，由此其內(nèi)容全部結(jié)合，我們先前已經(jīng)描述基于IL-1B等位基因2(+6912)的多態(tài)性的治療和診斷。另外，在U.S.S.N.010/300011(也為PCT US 02/37222)中，其內(nèi)容也由此完整地結(jié)合，我們描述和表征功能多態(tài)性，包括IL-1B基因上游區(qū)域影響轉(zhuǎn)錄和對(duì)炎性疾病和傳染病的易感性的那些。另外，在U.S.S.N.09/617720中，其內(nèi)容由此完整地結(jié)合，我們先前描述類IL-1基因及其產(chǎn)物(即類白細(xì)胞介素-1蛋白1基因/產(chǎn)物，即IL-1F8)。認(rèn)識(shí)到整個(gè)IL-1基因的基因座主要涉及炎性疾病，我們于此提供另外的詳細(xì)的IL-1基因座多態(tài)性，連鎖，疾病相關(guān)和功能分析，其支持組合物用于檢測(cè)人IL-1基因座的遺傳同一性以及它們?cè)陬A(yù)測(cè)、診斷和治療炎性疾病中的應(yīng)用。
2.發(fā)明概述通常本發(fā)明提供用于檢測(cè)IL-1單倍型(例如與發(fā)展炎性疾病或癥狀增加的風(fēng)險(xiǎn)或降低的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的IL-1單倍型)的組合物和方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，IL-1單倍型與發(fā)展疾病或癥狀的增加的風(fēng)險(xiǎn)或降低的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，然而本發(fā)明必定包括用于檢測(cè)與發(fā)展炎性疾病或癥狀增加的風(fēng)險(xiǎn)及降低的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)的IL-1單倍型的材料和方法(例如“正?！被颉耙吧汀被蛐?。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于通過(guò)檢測(cè)與炎性疾病或癥狀有關(guān)的IL-1等位基因或與該等位基因連鎖不平衡的任何IL-1等位基因，例如一個(gè)或多個(gè)如

圖1，2A，2B，7A或7B中任何一個(gè)所示的連鎖的IL-1等位基因來(lái)確定受試者是否患有或傾向于發(fā)展與IL-1炎性單倍型有關(guān)的疾病或癥狀的組合物和方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，連鎖的等位基因與炎性相關(guān)等位基因具有至少0.5和優(yōu)選至少0.6，0.7，0.8或0.9的連鎖不平衡值(D’)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于通過(guò)檢測(cè)與炎性疾病或癥狀降低的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的IL-1等位基因或與該“保護(hù)性的”等位基因連鎖不平衡的任何IL-1等位基因，例如一個(gè)或多個(gè)如圖1，2A，2B，7A或7B中任何一個(gè)所示的連鎖的IL-1等位基因來(lái)確定受試者是否具有降低的發(fā)展疾病或癥狀的風(fēng)險(xiǎn)的組合物和方法，所述疾病或癥狀與IL-1炎性單倍型有關(guān)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，連鎖的等位基因與“保護(hù)性的”等位基因具有至少0.5和優(yōu)選至少0.6，0.7，0.8或0.9的連鎖不平衡值(D’)。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，基于新鑒定的SNP，本發(fā)明包括4種新的IL-1單倍型(hap1-4)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供hap1(IL-1單倍型型式1)和IL-1促炎(與前述單倍型3322146121一致)，其包括IL-1A(+4845)等位基因2(與IL-IA(-889)等位基因2100％LD)；IL-1B(+3954)等位基因2；和IL-1B(-511)等位基因1。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供hap1單倍型，其包含如圖3A和3B所示的多種兩個(gè)或多個(gè)等位基因的hap1單倍型型式。在優(yōu)選實(shí)施方案中，hap1單倍型包括圖3A和B所示的IL-1TTC/2-2-1型式。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與前述單倍型4411233212一致的IL-1單倍型，hap2，其包括IL-1A(+4845)等位基因1(與IL-1A(-889)等位基因1100％LD)；IL-1B(+3954)等位基因1IL-1B(-511)等位基因2。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供hap2單倍型，其包含如圖4A和4B所示的多種兩個(gè)或多個(gè)等位基因的hap2單倍型型式。在優(yōu)選實(shí)施方案中，hap2單倍型包括圖4A和4B所示的IL-1 GCT/1-1-2型式。
在還有另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與前述(“野生型”)等位基因型**111***一致的IL-1單倍型，hap3，其包括IL-1A(+4845)等位基因1(與IL-1A(-889)等位基因1 100％LD)；IL-1B(+3954)等位基因1；和IL-1B(-511)等位基因1。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供hap3單倍型，其包含如圖5A和5B所示的多種兩個(gè)或多個(gè)等位基因的hap3單倍型型式。在優(yōu)選實(shí)施方案中，hap3單倍型包括如圖5A和5B所示的IL-1hap3GCC/1-1-1型式。
在還有另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與新IL-1單倍型型式(hap4)一致的新鑒定的SNP，其包含IL-1B(+3954)等位基因；IL-1B(-511)等位基因1；和IL-1B(-3737)等位基因1。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供hap4單倍型，其包含如圖6A和6B所示的多種兩個(gè)或多個(gè)等位基因的hap4單倍型型式。在優(yōu)選實(shí)施方案中，hap3單倍型包括如圖6A和6B所示的IL-1hap4CCC/1-1-1型式。
本發(fā)明另一目的是提供涉及來(lái)自IL-1基因簇和特別是來(lái)自IL-1簇的新的類IL-1基因的序列信息的應(yīng)用的方法和組合物。另一目的是將該序列信息與遺傳數(shù)據(jù)結(jié)合。因此，本發(fā)明提供IL-1簇的圖譜，其提供關(guān)于基因的結(jié)構(gòu)和組構(gòu)和相關(guān)多態(tài)性的詳細(xì)信息。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供預(yù)測(cè)和診斷與IL-1基因簇有關(guān)的疾病或癥狀的方法。另一個(gè)目的是提供多種人IL-1基因簇序列標(biāo)識(shí)符(identifier)，其包含一個(gè)或多個(gè)用于鑒定IL-1多態(tài)性的核酸，如圖4所示。
3.附圖簡(jiǎn)述圖1用示意圖表示在整個(gè)IL-1基因簇的基因座中代表性的SNP的連鎖不平衡。
圖2(A和B)顯示在整個(gè)IL-1基因簇中代表性的SNP的連鎖不平衡定量值(D’值在對(duì)角線下出現(xiàn))和它們的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(1-p值在對(duì)角線上出現(xiàn))。
圖3(A和B)顯示IL-1單倍型型式1(hap1)的SNP組構(gòu)(T-T-C＝2_2_1)。
圖4(A和B)顯示IL-1單倍型型式2(hap2)的SNP組構(gòu)(G-C-T＝1_1_2)。
圖5(A和B)顯示IL-1單倍型型式3(hap3)的SNP組構(gòu)(G-C-C＝1_1_1)。
圖6(A和B)顯示IL-1單倍型型式4(hap4)的SNP組構(gòu)(C-C-C＝1_1_1)。
圖7(A和B)顯示強(qiáng)烈連鎖不平衡和未特別地包括在LD表中的SNP。
圖8顯示IL-1A基因多態(tài)性的同一性和位置。
圖9顯示IL-1B基因多態(tài)性的同一性和位置。
圖10(A和B)顯示IL-1RNic基因多態(tài)性的同一性和位置。
圖11顯示IL-1RNsec基因多態(tài)性的同一性和位置。
圖12顯示對(duì)應(yīng)于IL-1A+4845等位基因1和2的IL-1α變體在通過(guò)鈣蛋白酶蛋白酶裂解中的差異。
圖13顯示用表達(dá)IL-1+4845等位基因1和2變體的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞增殖的速率。
圖14(A和B)顯示IL-1A SNP構(gòu)建體的基因型(A)和在成纖維細(xì)胞系中所選報(bào)告基因的活性(B)。
圖15(A，B，C，和D)顯示IL-1B SNP構(gòu)建體的基因型(A)和在成纖維細(xì)胞系中所選報(bào)告基因的活性(B)；以及另外一組IL-1B構(gòu)建體的基因型，其中等位基因2出現(xiàn)在位置14和15(C)和在成纖維細(xì)胞系中所選報(bào)告基因的活性(D)。
圖16(A和B)顯示IL-1RN SNP構(gòu)建體的基因型(A)和在成纖維細(xì)胞系中所選報(bào)告基因的活性(B)。
圖17顯示IL-1基因簇的圖譜。在數(shù)據(jù)之上和之下提供刻度線(kb)以幫助對(duì)比。
圖18(A-G)顯示10個(gè)已知的IL-1家族成員的3個(gè)共有外顯子編碼序列的對(duì)比。
圖19顯示在IL-1基因簇內(nèi)選擇多態(tài)性標(biāo)記的圖譜位置。
4.發(fā)明詳述4.1.概述幾種細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1基因的同系物對(duì)先前鑒定的IL-1基因簇作圖，但該區(qū)域的公共測(cè)序相對(duì)較慢。我們因此構(gòu)建整個(gè)簇的重疊群并注釋它。另外，已經(jīng)定位在該基因簇(包括IL-1A，IL-1B和IL-RN中的SNP)中的新的人多態(tài)性基因座和相關(guān)的IL-1單倍型，并如圖1-11所概述鑒定。在后附的本發(fā)明和實(shí)施例的詳細(xì)描述中進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明的特征。
4.2.定義為了方便起見(jiàn)，下面提供在本說(shuō)明書，實(shí)施例，和后附權(quán)利要求中使用的某些術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)的含義。
術(shù)語(yǔ)“等位基因”是指在不同多態(tài)區(qū)域發(fā)現(xiàn)的不同序列變體。例如IL-1RN(VNTR)具有至少5個(gè)不同的等位基因。序列變體可以是單個(gè)或多個(gè)堿基變化，無(wú)限制地包括插入，缺失，或替代，或可以是可變數(shù)量的序列重復(fù)。
術(shù)語(yǔ)“等位基因型”是指一個(gè)等位基因或多個(gè)等位基因在一個(gè)或多個(gè)多態(tài)區(qū)域的同一性。例如，等位基因型可以由在一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的單個(gè)等位基因組成，關(guān)于IL-1RN(VNTR)等位基因1，其是在IL-1RN基因座的VNTR處具有至少一個(gè)拷貝的IL-1RN等位基因1的等位基因型。備選地，等位基因型可以由單個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的純合或雜合狀態(tài)組成。例如，IL1-RN(VNTR)等位基因2，2是這樣的等位基因型，其中存在兩拷貝的對(duì)應(yīng)于純合IL-RN(VNTR)等位基因2狀態(tài)的IL-1RN的VNTR標(biāo)記的第二個(gè)等位基因。備選地，等位基因型可以由在多于一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的等位基因的同一性組成。
術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中意欲是指與IL-1多態(tài)特異性反應(yīng)的結(jié)合劑，其包括整個(gè)抗體或其結(jié)合片段。使用常規(guī)技術(shù)可以將抗體片段化，以與上述對(duì)于完整抗體的相同方式篩選片段的效用。例如，通過(guò)用胃蛋白酶處理抗體可以產(chǎn)生F(ab)2片段?？梢蕴幚淼玫降腇(ab)2片段以還原二硫鍵產(chǎn)生Fab片段。本發(fā)明的抗體另外意欲包括雙特異性的，單鏈的，和嵌合和人源化的分子，其具有由抗體的至少一個(gè)CDR區(qū)域賦予的對(duì)IL-1B多肽的親和力。
可以交換使用的“生物學(xué)活性”或“生物活性”或“活性”或“生物學(xué)功能”在此是意指通過(guò)IL-1多肽(無(wú)論是它的天然或變性構(gòu)象)或通過(guò)其任何子序列直接或間接實(shí)施的效應(yīng)物或抗原功能。生物學(xué)活性包括與靶肽，例如IL-1受體結(jié)合。可以通過(guò)直接影響IL-1多肽來(lái)調(diào)節(jié)IL-1生物活性。備選地，通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1多肽的水平，如通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1基因的表達(dá)，可以調(diào)節(jié)IL-1生物活性。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“IL-1多肽的生物活性片段”是指全長(zhǎng)IL-1多肽的片段，其中該片段特異性地模擬或拮抗野生型IL-1多肽的活性。生物活性片段優(yōu)選是能夠與白細(xì)胞介素受體相互作用的片段。
術(shù)語(yǔ)“異?；钚浴?，如應(yīng)用于多肽如IL-1的活性，是指這樣的活性，其不同于野生型或天然多肽的活性或不同于健康受試者中多肽的活性。因?yàn)樗鼜?qiáng)于它的天然對(duì)應(yīng)物的活性，所以多肽活性可以是異常的。備選地，因?yàn)樗鄬?duì)于它的天然對(duì)應(yīng)物的活性較弱或缺乏，活性可以是異常的。異?；钚赃€可以是活性的變化。例如異常多肽可以與不同靶肽相互作用。由于編碼IL-1基因座多肽的IL-1基因座基因的過(guò)表達(dá)或表達(dá)不足(underexpression)，細(xì)胞可以具有異常的IL-1活性。
“細(xì)胞”，“宿主細(xì)胞”或“重組宿主細(xì)胞”在本文中是可以交換使用的術(shù)語(yǔ)，不僅是指特定的受試者細(xì)胞，而且指該細(xì)胞的后代或潛在的后代。因?yàn)橛捎谕蛔兓颦h(huán)境影響導(dǎo)致某些改變可以在后代中發(fā)生，該后代事實(shí)上可以與母細(xì)胞不相同，但仍被包括在本文所用術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。
“異源嵌合體”，“同源嵌合體”，“嵌合的哺乳動(dòng)物”等是指轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其在至少一些它的含有基因組的細(xì)胞中具有剔除或敲入(knock-in)構(gòu)建體。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)照”或“對(duì)照樣品”是指對(duì)于所用檢測(cè)技術(shù)適合的任何樣品。對(duì)照樣品可以包含所用等位基因檢測(cè)技術(shù)的產(chǎn)物或待檢測(cè)的材料。另外，對(duì)照可以是陽(yáng)性或陰性對(duì)照。通過(guò)實(shí)施例的方式，其中等位基因檢測(cè)技術(shù)是PCR擴(kuò)增，接著大小分級(jí)，對(duì)照樣品可以包含適當(dāng)大小的DNA片段。同樣，當(dāng)?shù)任换驒z測(cè)技術(shù)涉及檢測(cè)突變蛋白質(zhì)時(shí)，對(duì)照樣品可以包含突變蛋白質(zhì)的樣品。然而，優(yōu)選對(duì)照樣品包含待檢測(cè)的物質(zhì)。例如，對(duì)照可以是基因組DNA樣品或IL-1基因簇的克隆部分。然而，當(dāng)待檢測(cè)的樣品是基因組DNA時(shí)，優(yōu)選對(duì)照樣品是高度純化的基因組DNA樣品。
短語(yǔ)“與IL-1多態(tài)性有關(guān)的疾病和癥狀”是指多種疾病或癥狀，基于IL-1復(fù)合體內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)等位基因的鑒定可以顯示在受試者中對(duì)其的易感性。實(shí)例包括炎性或退行性疾病，包括系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)(SIRS)；阿爾茨海默氏病(和相關(guān)的病癥和癥狀包括慢性神經(jīng)炎癥，神經(jīng)膠質(zhì)激活；增加的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)炎斑塊形成；和對(duì)治療的應(yīng)答)；肌萎縮性側(cè)索硬化癥(Amylotropic Lateral Sclerosis)(ALS)，關(guān)節(jié)炎(和相關(guān)的病癥和癥狀，包括急性關(guān)節(jié)炎，抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，與慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎有關(guān)的關(guān)節(jié)炎，膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，幼年性慢性關(guān)節(jié)炎；幼年性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，預(yù)后(prognosis)和鏈球菌誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎)，哮喘(和相關(guān)病癥和癥狀，包括支氣管哮喘；慢性阻塞性氣道疾病，慢性阻塞性肺疾病，幼年性哮喘和職業(yè)性哮喘)；心血管疾病(和相關(guān)病癥和癥狀，包括動(dòng)脈粥樣硬化；自身免疫性心肌炎，慢性心臟缺氧，充血性心力衰竭，冠狀動(dòng)脈病，心肌病和心細(xì)胞功能障礙，包括主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞激活；心細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡；和心細(xì)胞功能的免疫調(diào)節(jié)；糖尿病和相關(guān)病癥和癥狀，包括自身免疫性糖尿病，胰島素依賴性(1型)糖尿病，糖尿病牙周炎，糖尿病視網(wǎng)膜病，和糖尿病腎病)；腸胃炎癥(和相關(guān)病癥和癥狀，包括乳糜瀉(celiac disease)，相關(guān)的骨質(zhì)稀少，慢性結(jié)腸炎，局限性回腸炎，炎性腸病和潰瘍性結(jié)腸炎)；胃潰瘍；肝炎癥，膽固醇膽石和肝纖維化，HIV感染(和相關(guān)病癥和癥狀，包括退行性應(yīng)答，神經(jīng)變性應(yīng)答，和HIV有關(guān)的霍奇森病)，川崎綜合征(和相關(guān)病癥和癥狀，包括粘膜皮膚淋巴結(jié)綜合征，子宮頸淋巴結(jié)病，冠狀動(dòng)脈損傷，浮腫，發(fā)熱，增加的白細(xì)胞，輕度貧血，脫皮，皮疹，結(jié)膜發(fā)紅，血小板增多；多發(fā)性硬化，腎病(和相關(guān)疾病和病癥，包括糖尿病腎病，晚期腎病，腎小球性腎炎，古德帕斯徹綜合癥，血液透析存活和腎局部缺血再灌注損傷)，神經(jīng)變性病(和相關(guān)疾病和癥狀，包括急性神經(jīng)變性，衰老和神經(jīng)變性病中IL-1的誘導(dǎo)，IL-1誘導(dǎo)的下丘腦神經(jīng)元的可塑性和慢性應(yīng)激過(guò)度反應(yīng)性)，眼病(Qphthalmopathies)(和相關(guān)疾病和病癥，包括糖尿病視網(wǎng)膜病，格雷夫斯眼病，和葡萄膜炎，骨質(zhì)疏松癥(和相關(guān)疾病和病癥，包括牙糟，股骨，橈骨，椎骨或腕骨損失或骨折發(fā)生，經(jīng)絕后的骨損失，物質(zhì)(mass)，骨折發(fā)生或骨損失速率)，中耳炎(成人或兒科)，胰腺炎或胰腺泡炎，牙周病(和相關(guān)疾病和病癥，包括成人，早發(fā)性和糖尿病性)；肺病，包括慢性肺病，慢性竇炎，透明膜病，缺氧和SIDS中的肺病；再狹窄；風(fēng)濕病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕病阿孝夫小體，風(fēng)濕病和風(fēng)濕性心肌炎；甲狀腺炎，包括慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎；尿道感染，包括慢性前列腺炎，慢性骨盆疼痛綜合癥和尿石病。免疫疾病，包括自身免疫病，如斑禿，自身免疫性心肌炎，格雷夫斯病，格雷夫斯眼病，苔蘚硬化癥，多發(fā)性硬化，牛皮癬，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，系統(tǒng)性硬化，甲狀腺病(例如甲狀腺腫和基質(zhì)淋巴瘤性(橋本甲狀腺炎，淋巴結(jié)樣甲狀腺腫)，睡眠障礙和慢性疲勞綜合癥和肥胖癥(非糖尿病性或與糖尿病有關(guān))。對(duì)傳染病的抗性，所述傳染病如利什曼病，麻風(fēng)病，萊姆病，萊姆心炎，瘧疾，腦型瘧，腦膜炎，與瘧疾有關(guān)的管狀腸腎炎)，其是由細(xì)菌，病毒(例如巨細(xì)胞病毒，腦炎，EB病毒，人免疫缺陷病毒，流感病毒)或原生動(dòng)物(例如惡性瘧原蟲，錐蟲)導(dǎo)致的。對(duì)包括腦外傷的外傷的應(yīng)答，(包括中風(fēng)和局部缺血，腦炎，腦病，癲癇，圍生期腦損傷，持續(xù)熱性癲癇發(fā)作，SIDS和蛛網(wǎng)膜下出血)，低出生體重(例如大腦性麻痹)，肺損傷(急性出血性肺損傷，古德帕斯徹綜合癥，急性局部缺血再灌注)，心肌功能障礙，其是由職業(yè)和環(huán)境污染物導(dǎo)致(例如對(duì)毒油綜合癥硅病的易感性)，輻射創(chuàng)傷，和傷口愈合反應(yīng)的效率(例如燒傷或燙傷，慢性傷口，外科手術(shù)傷口和脊髓損傷)。對(duì)瘤形成的易感性，包括乳腺癌相關(guān)的溶骨轉(zhuǎn)移瘤，惡病質(zhì)，結(jié)直腸癌，過(guò)度增殖性疾病，霍奇森病，白血病，淋巴瘤，代謝病和腫瘤，轉(zhuǎn)移瘤，骨髓瘤(myeolomas)，和各種癌癥(包括乳房，前列腺，卵巢，結(jié)腸，肺等)，厭食癥和惡病質(zhì)。激素調(diào)節(jié)，包括生育力/生殖力，妊娠的可能性，早產(chǎn)發(fā)生率，產(chǎn)前和新生期并發(fā)癥，包括早產(chǎn)低出生體重，大腦性麻痹，敗血病，低甲狀腺素癥(hypothyroxinernia)，氧依賴，顱畸形，絕經(jīng)提前。受試者對(duì)移植物的反應(yīng)(排斥或接受)，急性期反應(yīng)(例如發(fā)熱反應(yīng))，普通炎癥發(fā)應(yīng)，急性呼吸窘迫反應(yīng)，急性系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，傷口愈合，粘連，免疫炎癥反應(yīng)，神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，發(fā)熱發(fā)展和抵抗，急性期反應(yīng)，應(yīng)激反應(yīng)，疾病易感性，重復(fù)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激，網(wǎng)球肘，和疼痛管理和反應(yīng)。
術(shù)語(yǔ)“基因破壞”和“定向破壞”或任何類似的短語(yǔ)是指位點(diǎn)特異性的破壞天然DNA序列以便與野生型拷貝的該基因相比防止在細(xì)胞中該基因的表達(dá)。間斷可以由對(duì)基因的缺失，插入或修飾或其任何組合所導(dǎo)致。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“單倍型”意欲是指一組等位基因，其在統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義的水平上(pcorr＜0.05)作為一組(連鎖不平衡)一起遺傳。如本文所用，短語(yǔ)“IL-1單倍型”是指IL-1基因座中的單倍型。IL-1炎性或促炎單倍型是指表示增加的激動(dòng)劑和/或降低的拮抗物活性的單倍型。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“IL-1基因簇”和“IL-1基因座”包括位于或接近染色體2的2q13區(qū)域的所有核酸，包括至少IL-1A，IL-1B和IL-1RN基因和其它任何連鎖序列。(Nicklin等，Genomics 19382-84，1994)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“IL-1A”，“IL-1B”，和“IL-1RN”分別是指編碼IL-1，IL-1和IL-1受體拮抗物的基因。IL-1A，IL-1B，和IL-1RN的基因登記號(hào)分別為X03833，X04500，和X64532。
“IL-1功能突變”是指lL-1基因簇內(nèi)導(dǎo)致改變的表型的突變(即影響IL-1基因或蛋白質(zhì)的功能)。實(shí)例包括IL-1A(+4845)等位基因2，IL-1B(+3954)等位基因2，IL-1B(+6912)等位基因2和IL-1RN(+2018)等位基因2。
“IL-1X(Z)等位基因Y”是指特定的等位基因型，稱為Y，其出現(xiàn)在基因X的IL-1基因座多態(tài)位點(diǎn)，其中X是IL-1A，B或RN并且位于或接近核苷酸Z，其中核苷酸Z是相對(duì)于主要轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)編號(hào)，其是特定IL-1基因X的核苷酸+1。如本文另外所用，4179X術(shù)語(yǔ)“IL-1X等位基因(Z)”是指位于或接近核苷酸Z的基因X中IL-1多態(tài)位點(diǎn)的所有等位基因。例如，術(shù)語(yǔ)“IL-1RN(+2018)等位基因”是指在標(biāo)記+2018處IL-1RN基因的備選型?！癐L-1RN(+2018)等位基因1”是指IL-1RN基因型，其在有義鏈的位置+2018包含半胱氨酸(C)。Clay等，Hum.Genet.97723-26，1996。“IL-1RN(+2018)等位基因2”是指IL-1RN基因形式，其在正鏈的位置+2018含有胸腺嘧啶(T)。當(dāng)受試者具有兩個(gè)相同的IL-1RN等位基因時(shí)，受試者被稱為純合的，或具有純合狀態(tài)。當(dāng)受試者具有兩個(gè)不同IL-1RN等位基因時(shí)，受試者被稱為雜合的，或具有雜合狀態(tài)。術(shù)語(yǔ)“IL-1RN(+2018)等位基因2，2”是指純合IL-1RN(+2018)等位基因2狀態(tài)。相反，術(shù)語(yǔ)“IL-1RN(+2018)等位基因1，1”是指純合IL-1RN(+2018)等位基因1狀態(tài)。術(shù)語(yǔ)“IL-1RN(+2018)等位基因1，2”是指雜合等位基因1和2狀態(tài)。
術(shù)語(yǔ)“IL-1表型”含義是指由IL-1基因座位的遺傳同一性導(dǎo)致的任何表型-即包括對(duì)炎性疾病或癥狀的增加或降低的傾向以及“正常的”(例如平均或“野生型”)相關(guān)的炎性疾病或病癥的可能性。
本文所用的“IL-1相關(guān)”意欲包括在人染色體2(2q 12-14)上所有與人IL-1基因座基因有關(guān)的基因。這些包括位于染色體2(2q 13-14)的人IL-1基因簇的IL-1基因，包括編碼白細(xì)胞介素-1α的IL-1A基因，編碼白細(xì)胞介素-1β的IL-1B基因，和編碼白細(xì)胞介素-1受體拮抗物的IL-1RN(或IL-1ra)基因。另外這些IL-1相關(guān)基因包括位于人染色體2(2q12)的I型和II型人IL-1受體基因和位于小鼠染色體1位置19.5cM的它們的小鼠同系物。白細(xì)胞介素-1α，白細(xì)胞介素-1β，和白細(xì)胞介素-1RN如此相關(guān)以致它們都與IL-1I型受體結(jié)合，然而僅白細(xì)胞介素-1α和白細(xì)胞介素-1β是激活I(lǐng)L-1I型受體的激動(dòng)劑配體，而白細(xì)胞介素-1RN是天然存在的拮抗物配體。當(dāng)將術(shù)語(yǔ)“IL-1”用于參考基因產(chǎn)物或多肽時(shí)，意欲是指由人染色體2(2q 12-14)上的白細(xì)胞介素-1基因座所編碼的所有基因產(chǎn)物和來(lái)自其它物種的它們對(duì)應(yīng)的同系物或其功能變體。術(shù)語(yǔ)IL-1因此包括促進(jìn)炎癥應(yīng)答的分泌的多肽，如IL-1α和IL-1β，以及拮抗炎癥應(yīng)答的分泌的多肽，如IL-1受體拮抗物和IL-1II型(引誘)受體。
“IL-1受體”或“IL-1R”是指結(jié)合各種細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)受體，其能夠結(jié)合和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)自IL-1基因座編碼的配體的信號(hào)。術(shù)語(yǔ)適用于任何能夠結(jié)合白細(xì)胞介素-1(IL-1)分子的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)為它們的天然構(gòu)型作為哺乳動(dòng)物質(zhì)膜蛋白，可能在將IL-1提供的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)給細(xì)胞中起作用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)包括具有IL-1結(jié)合或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的天然蛋白質(zhì)的類似物。實(shí)例包括在美國(guó)專利4,968,607中描述的人和鼠IL-1受體。術(shù)語(yǔ)“IL-1核酸”是指編碼IL-1蛋白質(zhì)的核酸。
“IL-1多肽”和“IL-1蛋白質(zhì)”意欲包括包含由圖1，2，和3中顯示的IL-1基因組DNA序列編碼的氨基酸序列的多肽，或其片段和其同系物，并且包括激動(dòng)劑和拮抗物多肽。
“增加的風(fēng)險(xiǎn)”是指與未攜帶特定多態(tài)等位基因的群體成員中疾病或病癥發(fā)生頻率相比，在攜帶特定多態(tài)等位基因的個(gè)體中統(tǒng)計(jì)學(xué)上更高的疾病或病癥發(fā)生頻率。
“降低的風(fēng)險(xiǎn)”是指與未攜帶特定多態(tài)等位基因的群體成員中或在整個(gè)群體中疾病或病癥發(fā)生頻率相比，在攜帶特定多態(tài)等位基因的個(gè)體中統(tǒng)計(jì)學(xué)上更低的疾病或病癥發(fā)生頻率。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“相互作用”意欲包括分子間可檢測(cè)的關(guān)系或關(guān)聯(lián)(例如生化相互作用)，如本質(zhì)上蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-核酸，核酸-核酸和蛋白質(zhì)-小分子或核酸-小分子之間的相互作用。
本文關(guān)于核酸如DNA或RNA所用的術(shù)語(yǔ)“分離的”是指分別從在大分子天然來(lái)源中存在的其它DNA，或RNA分離的分子。例如，編碼受試者IL-1多肽之一的分離的核酸優(yōu)選包括不超過(guò)10千堿基(kb)的天然緊鄰基因組DNA中IL-1基因的核酸序列，更優(yōu)選不超過(guò)5kb這種天然存在的側(cè)翼序列，最優(yōu)選小于1.5kb的這種天然存在的側(cè)翼序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)分離還指基本上不含細(xì)胞物質(zhì)，病毒物質(zhì)，或當(dāng)通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí)培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)的化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)的核酸或肽。此外，“分離的核酸”意欲包括天然不是作為片段存在和在自然狀態(tài)未發(fā)現(xiàn)的核酸片段。術(shù)語(yǔ)“分離的”在本文中還用于指從其它細(xì)胞蛋白質(zhì)分離的多肽，并且意欲包括純化和重組的多肽。
“敲入(knock-in)”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指已經(jīng)將修飾基因?qū)肫浠蚪M的動(dòng)物，并且修飾基因可以是外源或內(nèi)源性的。
“剔除”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指其中存在對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)的部分或完全抑制的動(dòng)物(例如基于缺失至少基因的一部分，用第二種序列替換至少基因的一部分，引入終止密碼子，編碼關(guān)鍵氨基酸的堿基的突變，或內(nèi)含子接點(diǎn)的去除等)。
“剔除構(gòu)建體”是指可以用于降低或抑制細(xì)胞中由內(nèi)源DNA序列編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)的核酸序列。在簡(jiǎn)單實(shí)施例中，剔除構(gòu)建體由基因，如IL-1RN基因組成，基因的關(guān)鍵部分有缺失，以便活性蛋白不能從中表達(dá)。備選地，可以將許多終止密碼子加至天然基因以導(dǎo)致蛋白質(zhì)的提前終止或可以使內(nèi)含子接點(diǎn)失活。在典型的剔除構(gòu)建體中，用可選擇的標(biāo)記(如neo基因)替換基因的某些部分因此基因可以如下表示IL-1RN 5’/neo/IL-1RN3’，其中IL-1RN 5’和IL-1RN 3’是指基因組或cDNA序列，其分別在相對(duì)于部分IL-1RN基因的上游和下游，并且其中neo是指新霉素抗性基因。在另一剔除構(gòu)建體中，將第二種可選擇的標(biāo)記加入側(cè)翼位置因此基因可以表示為IL-1RN/neo/IL-1RN/TK，其中TK是胸苷激酶基因，其可以加至前述構(gòu)建體的IL-1RN5’或IL-1RN3’序列并且可以另外相對(duì)在適當(dāng)培養(yǎng)基中選擇(即是陰性可選擇標(biāo)記)。該雙標(biāo)記構(gòu)建體允許從典型地保留TK序列的非同源重組事件中選擇去除側(cè)翼TK標(biāo)記的同源重組事件?；蛉笔Ш?或替換可以從外顯子，內(nèi)含子，特別是內(nèi)含子接點(diǎn)，和/或調(diào)節(jié)區(qū)域如啟動(dòng)子進(jìn)行。
“連鎖不平衡”是指兩個(gè)等位基因以大于從給定對(duì)照群體中每個(gè)等位基因發(fā)生的分開(kāi)頻率所期望的頻率的共遺傳。獨(dú)立遺傳的兩個(gè)等位基因發(fā)生的期望頻率是第一個(gè)等位基因的頻率乘以第二個(gè)等位基因的頻率。以期望頻率共發(fā)生的等位基因稱為“連鎖不平衡”。連鎖不平衡的原因經(jīng)常是不清楚的。它可以是由于對(duì)特定等位基因組合的選擇或遺傳異種群體的最近混合。另外，在標(biāo)記與疾病基因非常緊密連鎖的情形中，如果疾病突變?cè)谧罱^(guò)去發(fā)生以致還未經(jīng)過(guò)足夠的時(shí)間以通過(guò)特定染色體區(qū)域的重組事件達(dá)到平衡，期望等位基因(或一組連鎖等位基因)與疾病基因的關(guān)聯(lián)。當(dāng)提及由多于一個(gè)等位基因組成的等位基因型時(shí)，如果所有包含第一個(gè)等位基因型的等位基因與第二個(gè)等位基因型的至少一個(gè)等位基因連鎖不平衡，則第一個(gè)等位基因型與第二個(gè)等位基因型連鎖不平衡。連鎖不平衡的實(shí)例是在IL-1RN(+2018)和IL-1RN(VNTR)多態(tài)位點(diǎn)的等位基因之間發(fā)生。IL-1RN(+2018)的兩個(gè)等位基因與IL-1RN(VNTR)的兩個(gè)最頻繁的等位基因，等位基因1和等位基因2是100％連鎖不平衡。
術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”是指已知在個(gè)體之間變化的基因組序列。例如，IL-1RN基因具有由可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)組成的標(biāo)記。
“突變基因”或“突變”或“功能突變”是指基因的等位基因型，相對(duì)于不具有突變基因的受試者，其能夠改變具有突變基因的受試者的表型。通過(guò)某些試劑可以校正或補(bǔ)償由突變導(dǎo)致的改變的表型。如果對(duì)于該突變受試者必須是純合的以具有改變的表型，則突變稱為隱性的。如果一個(gè)拷貝的突變基因足以改變受試者的表型，則突變稱為顯性的。如果受試者具有一個(gè)拷貝的突變基因和具有純合和雜合受試者之間的表型(對(duì)于該基因)，突變稱為共顯性的。
本發(fā)明的“非人類動(dòng)物”包括哺乳動(dòng)物如嚙齒類，非人靈長(zhǎng)類，羊，狗，牛，山羊，等，兩棲類，如非洲爪蟾屬成員，和轉(zhuǎn)基因鳥(niǎo)類(例如雞，鳥(niǎo)等)。術(shù)語(yǔ)“嵌合動(dòng)物”在本文中用來(lái)指其中發(fā)現(xiàn)重組基因，或者其中重組基因在動(dòng)物的一些但不是全部細(xì)胞中表達(dá)的動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“組織特異性嵌合動(dòng)物”表示重組IL-1基因之一在一些組織但不在其它組織中存在和/或表達(dá)或破壞。術(shù)語(yǔ)“非人類哺乳動(dòng)物”是指哺乳動(dòng)物綱除了人類以外的任何成員。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸”是指多核苷酸或寡核苷酸如脫氧核糖核酸(DNA)，并且當(dāng)適當(dāng)時(shí)，指核糖核酸(RNA)。術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)也被理解為包括，作為等價(jià)物，由核苷酸類似物制成的RNA或DNA的類似物(例如肽核酸)和如適用于描述的實(shí)施方案，單(有義或反義)和雙鏈多核苷酸。
術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)物(nutraceutical)”如本文所用包括食品和飲食添加劑的FDA定義，其可以在治療疾病或癥狀-特別是與炎性疾病有關(guān)的疾病或癥狀中有價(jià)值。因此，“營(yíng)養(yǎng)物”包括可以用于獲得健康益處的營(yíng)養(yǎng)成分。這些成分可以是在“食品”-即“功能食品”中或在飲食添加劑中。在1994年10月，飲食添加劑健康和教育法案(Dietary Supplement Health andEducation Act)(“DSHEA”)被簽署為法律。DSHEA認(rèn)為數(shù)百萬(wàn)的消費(fèi)者認(rèn)為飲食添加劑可以提供健康益處。議會(huì)通過(guò)它的意圖在于在消費(fèi)者獲得飲食添加劑和FDA當(dāng)局反對(duì)存在安全問(wèn)題或攜帶假的或誤導(dǎo)標(biāo)簽的添加劑之間權(quán)衡輕重。DSHEA為飲食添加劑的安全性和標(biāo)簽建立了新的規(guī)章制度。FDA有義務(wù)以實(shí)現(xiàn)DSHEA的方式執(zhí)行DSHEA。因此，本文所用的“營(yíng)養(yǎng)物”包括本領(lǐng)域已知的飲食添加劑(例如微生素，礦物質(zhì)，藥草和其它添加劑)，其被消化和意欲補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，包括“營(yíng)養(yǎng)成分”。營(yíng)養(yǎng)成分可以包括維生素，礦物質(zhì)，藥草或其它藥材，氨基酸，和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如酶。營(yíng)養(yǎng)成分還可以是代謝物，組分，提取物，濃縮物，或這些成分的組合。營(yíng)養(yǎng)物添加劑以包括片，膠囊，液體和棒的形式提供。
術(shù)語(yǔ)“多態(tài)性”是指基因或其部分(例如等位基因變體)多于一種形式的共存。存在至少兩種不同形式，即兩種不同核苷酸序列的基因的一部分被稱為“基因的多態(tài)區(qū)域”?；蚨鄳B(tài)區(qū)域的特異基因序列是等位基因。多態(tài)區(qū)域可以是單核苷酸，其同一性在不同等位基因中不同。多態(tài)區(qū)域也可以是幾個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)疾病的傾向”，和對(duì)疾病的“傾向”或“易感性”或任何相似的短語(yǔ)含義是某些等位基因因此被發(fā)現(xiàn)有關(guān)于或預(yù)示受試者發(fā)展特定疾病(例如血管病)的發(fā)生率。與健康個(gè)體相比，等位基因因此在患病個(gè)體中經(jīng)常過(guò)度表達(dá)。因此，這些等位基因可以用來(lái)預(yù)測(cè)疾病，甚至在癥狀前或患病前的個(gè)體中預(yù)測(cè)疾病。
本文所用的“小分子”含義是指組合物，其具有小于約5kD和最優(yōu)選小于約4kD的分子量。小分子可以是核酸，肽，肽模擬物，碳水化合物，脂質(zhì)或其它有機(jī)或無(wú)機(jī)分子。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“特異性雜交”或“特異性檢測(cè)”是指核酸分子與樣品核酸的至少約6個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的能力。
“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”是貫穿本說(shuō)明書使用的通稱，是指DNA序列，如起始信號(hào)，增強(qiáng)子，和啟動(dòng)子，其誘導(dǎo)或控制它們可操作連接的蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指已經(jīng)導(dǎo)入細(xì)胞的核酸序列(編碼例如一種IL-1多肽，或向其的反義轉(zhuǎn)錄物)。轉(zhuǎn)基因可以對(duì)于導(dǎo)入其的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞部分或完全異源，即外源，或?qū)τ趯?dǎo)入其的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞的內(nèi)源基因同源，但其被設(shè)計(jì)來(lái)以改變插入其的細(xì)胞基因組的方式被插入，或插入到動(dòng)物基因組中(例如將它在不同于天然基因的位點(diǎn)插入或者它的插入導(dǎo)致剔除)。轉(zhuǎn)基因還可以以附加體的形式存在于細(xì)胞中。轉(zhuǎn)基因可以包括一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和其它任何核酸，如內(nèi)含子，其可能對(duì)于所選核酸的最佳表達(dá)是所需的。
“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”是指任何動(dòng)物，優(yōu)選非人類哺乳動(dòng)物，鳥(niǎo)或兩棲動(dòng)物，其中一個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞包含通過(guò)人干預(yù)的方式如本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入的異源核酸。經(jīng)過(guò)計(jì)劃的遺傳操作，如通過(guò)用重組病毒顯微注射或通過(guò)注射，通過(guò)導(dǎo)入細(xì)胞前體將核酸直接或間接導(dǎo)入細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)遺傳操作不包括常規(guī)的雜交育種，或體外受精，而涉及重組DNA分子的引入。該分子可以整合到基因組中，或可以是染色體外復(fù)制的DNA。在本文所述的典型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，轉(zhuǎn)基因?qū)е录?xì)胞表達(dá)IL-1多肽之一的重組形式，例如激動(dòng)劑或拮抗物形式。然而，還考慮其中重組基因是沉默的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如以下描述的FLP或CRE重組酶依賴性構(gòu)建體。此外，“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”還包括其中一個(gè)或多個(gè)基因的基因破壞是由人干預(yù)導(dǎo)致的那些重組動(dòng)物，所述人干預(yù)包括重組和反義技術(shù)。術(shù)語(yǔ)意欲包括所有后代。因此，包括起始動(dòng)物及其所有的F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3等后代。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”意欲包括治愈以及改善病癥或疾病的至少一種癥狀。
術(shù)語(yǔ)“載體”是指核酸分子，其能夠運(yùn)輸已經(jīng)與它連接的另一核酸。一類優(yōu)選載體是附加體，即能夠在染色體外復(fù)制的核酸。優(yōu)選載體是能夠自主復(fù)制和/或表達(dá)與它們連接的核酸的那些。能夠指導(dǎo)與它們可操作連接的基因表達(dá)的載體在此處被稱為“表達(dá)載體”。通常，用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)載體經(jīng)常是“質(zhì)?！毙问?，其通常是指環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，它們的載體形式與染色體不結(jié)合。在本說(shuō)明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以交換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明隨后于此意欲包括這種其它形式的表達(dá)載體，其起相當(dāng)?shù)淖饔貌楸绢I(lǐng)域所知。
術(shù)語(yǔ)“野生型等位基因”是指基因的等位基因，當(dāng)以兩個(gè)拷貝存在受試者中時(shí)其導(dǎo)致野生型表型。因?yàn)榛蛑械哪承┖塑账嶙兓赡懿挥绊懢哂袃蓚€(gè)拷貝具有核苷酸變化的基因的受試者的表型，可以存在特定基因的多個(gè)不同野生型等位基因。
4.3等位基因的檢測(cè)許多方法可供檢測(cè)人多態(tài)基因座的特定等位基因。用于檢測(cè)特定多態(tài)等位基因的優(yōu)選方法將部分依賴于多態(tài)性的分子性質(zhì)。例如，多態(tài)基因座的不同等位基因形式可以通過(guò)DNA單堿基對(duì)區(qū)別。這種單核苷酸多態(tài)性(或SNP)是遺傳變異的主要貢獻(xiàn)者，包含約80％的所有已知多態(tài)性，它們?cè)谌祟惢蚪M中的密度估計(jì)為平均每1,000個(gè)堿基對(duì)1個(gè)。SNP是最頻繁的二等位基因-僅以兩種不同形式存在(盡管高達(dá)四種不同形式的SNP，對(duì)應(yīng)于在DNA中出現(xiàn)的四種不同核苷酸堿基，在理論上是可能的)。然而，SNP在突變上比其它多態(tài)性更穩(wěn)定，使它們適合于關(guān)聯(lián)研究，其中將標(biāo)記和未知變體之間的連鎖不平衡用于將致病突變作圖。另外，因?yàn)镾NP典型地僅具有兩種等位基因，它們可以通過(guò)簡(jiǎn)單的正/負(fù)測(cè)定而不是長(zhǎng)度測(cè)量來(lái)基因分型，使它們更易于自動(dòng)化。
多種方法可供檢測(cè)個(gè)體中特定單核苷酸多態(tài)等位基因的存在。該領(lǐng)域的進(jìn)展已經(jīng)提供準(zhǔn)確，容易和便宜的大規(guī)模SNP基因分型。最近，例如已經(jīng)描述幾種新技術(shù)，包括動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)，微板陣列對(duì)角凝膠電泳(MADGE)，焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)，寡核苷酸特異性連接，TaqMan系統(tǒng)以及各種DNA“芯片”技術(shù)如Affymetrix SNP芯片。這些方法要求靶基因區(qū)域典型地通過(guò)PCR的擴(kuò)增。還有其它新開(kāi)發(fā)的方法，其基于通過(guò)侵入裂解產(chǎn)生小信號(hào)分子，接著質(zhì)譜分析或固定化鎖定探針和滾環(huán)擴(kuò)增，最終可能消除PCR的需要。如下總結(jié)本領(lǐng)域已知的用于檢測(cè)特定單核苷酸多態(tài)性的幾種方法。本發(fā)明的方法應(yīng)當(dāng)理解為包括所有可利用的方法。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)幾種方法以促進(jìn)單核苷酸多態(tài)性的分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用專門的抗外切核酸酶的核苷酸可以檢測(cè)單堿基多態(tài)性，如例如Mundy，C.R.(美國(guó)專利4,656,127)所公開(kāi)。根據(jù)該方法，與緊接多態(tài)位點(diǎn)3’的等位基因序列互補(bǔ)的引物允許與從特定動(dòng)物或人獲得的靶分子雜交。如果在靶分子上的多態(tài)位點(diǎn)包含與存在的特定抗外切核酸酶的核苷酸衍生物互補(bǔ)的核苷酸，那么該衍生物將被摻入到雜交引物的末端。該摻入導(dǎo)致引物抗外切核酸酶，由此允許它的檢測(cè)。因?yàn)闃悠房雇馇泻怂崦傅难苌锏纳矸菔且阎?，引物已?jīng)變得抗外切核酸酶的發(fā)現(xiàn)顯示存在靶分子的多態(tài)位點(diǎn)中的核苷酸與用于反應(yīng)中的核苷酸衍生物互補(bǔ)。該方法具有優(yōu)勢(shì)即它不要求測(cè)定大量的外來(lái)序列數(shù)據(jù)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，基于溶液的方法被用于測(cè)定多態(tài)位點(diǎn)核苷酸的同一性。Cohen，D.等(法國(guó)專利2,650,840；PCT申請(qǐng)No.WO91/02087)。如在美國(guó)專利4,656,127的Mundy方法中，使用與緊接多態(tài)位點(diǎn)3’的等位基因序列互補(bǔ)的引物。使用標(biāo)記的雙脫氧核苷酸衍生物，該方法確定那個(gè)位點(diǎn)的核苷酸的同一性，所述雙脫氧核苷酸衍生物如果與多態(tài)位點(diǎn)的核苷酸互補(bǔ)將變得摻入引物的末端。
Goelet，P.等(PCT申請(qǐng)92/15712)描述一種備選方法，稱為遺傳位分析法(Genetic BitAnalysis)或GBA.TM。Goelet，P.等的方法使用標(biāo)記的終止子和引物的混合物，所述引物與多態(tài)位點(diǎn)3’的序列互補(bǔ)。摻入的標(biāo)記的終止子因此通過(guò)存在于被評(píng)估的靶分子的多態(tài)位點(diǎn)中的核苷酸而測(cè)定并與其互補(bǔ)。與Cohen等的方法(法國(guó)專利2,650,840；PCT申請(qǐng)No.WO91/02087)形成對(duì)比，Goelet，P.等的方法優(yōu)選是不均勻相測(cè)定，其中將引物或靶分子固定于固相。
近來(lái)，已經(jīng)描述幾種用于測(cè)定DNA中多態(tài)位點(diǎn)的引物引導(dǎo)的核苷酸摻入方法(Komher，J.S.等，Nucl.Acids.Res.177779-7784(1989)；Sokolov，B.P.，Nucl.Acids Res.183671(1990)；Syvanen，A.-C.，等，Genomics 8684-692(1990)；Kuppuswamy，M.N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)881143-1147(1991)；Prezant，T.R.等，Hum.Mutat.1159-164(1992)；Ugozzoli，L.等，GATA 9107-112(1992)；Nyren，P.等，Anal.Biochem.208171-175(1993))。這些方法區(qū)別于GBA.TM，在于它們?nèi)恳蕾囉跇?biāo)記的脫氧核苷酸的摻入以在多態(tài)位點(diǎn)處的堿基之間區(qū)別。在該形式中，因?yàn)樾盘?hào)與摻入的脫氧核苷酸的數(shù)量成比例，在相同核苷酸的運(yùn)行中出現(xiàn)的多態(tài)性可以產(chǎn)生與運(yùn)行長(zhǎng)度成比例的信號(hào)(Syvanen，A.-C.，等，Amer.J.Hum.Genet.5246-59(1993))。
對(duì)于導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯的過(guò)早終止的突變，蛋白質(zhì)截短試驗(yàn)(PTT)提供有效的診斷方法(Roest，等，(1993)Hum.Mol. Genet.21719-21；van derLuijt，等，(1994)Genomics 201-4)。對(duì)于PTT，RNA最初從可利用的組織中分離并被逆轉(zhuǎn)錄，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的區(qū)段。然后將逆轉(zhuǎn)錄PCR的產(chǎn)物用作嵌套PCR擴(kuò)增的模板，引物包含RNA聚合酶啟動(dòng)子和用于起始真核生物翻譯的序列。在擴(kuò)增目的區(qū)域以后，摻入到引物的獨(dú)特基序允許PCR產(chǎn)物的連續(xù)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。經(jīng)過(guò)翻譯產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳以后，截短多肽的出現(xiàn)指示導(dǎo)致翻譯過(guò)早終止的突變的存在。在該技術(shù)的變體中，當(dāng)目的靶區(qū)域來(lái)源于單個(gè)外顯子時(shí)，將DNA(與RNA相反)用作PCR模板。
可以利用任何細(xì)胞類型或組織以獲得用于本文所述診斷的核酸樣品。在優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA樣品獲自體液，例如通過(guò)已知技術(shù)(例如靜脈穿刺)獲得的血液或唾液。備選地，可以在干燥樣品(例如頭發(fā)或皮膚)上進(jìn)行核酸檢驗(yàn)。當(dāng)使用RNA或蛋白質(zhì)時(shí)，可以使用的細(xì)胞或組織必須表達(dá)IL-1基因。
還可以直接在獲自活組織檢查或切除術(shù)的受試者組織的組織切片(固定和/或冷凍)上原位進(jìn)行診斷步驟，因此不需要核酸純化?？梢詫⒑怂嵩噭┯米髟撛环椒ǖ奶结樅?或引物(參見(jiàn)例如，Nuovo，G.J.，1992，PCR insitu hybridizationprotocols and applications，Raven Press，NY)。
除了主要集中在檢測(cè)一個(gè)核酸序列的方法以外，在該檢測(cè)方案中還可以評(píng)估圖譜。例如通過(guò)使用差異顯示方法，Northern分析和/或RT-PCR可以產(chǎn)生指紋圖譜。
優(yōu)選的檢測(cè)方法是使用探針的等位基因特異性雜交，所述探針重疊IL-1促炎單倍型的至少一個(gè)等位基因區(qū)域和具有突變或多態(tài)區(qū)域周圍約5，10，20，25，或30個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將能夠與其它涉及再狹窄的等位基因變體特異性雜交的幾個(gè)探針附著在固相載體，例如“芯片”(其可以容納高達(dá)約250,000個(gè)寡核苷酸)。寡核苷酸可以通過(guò)包括平版印刷術(shù)的多種方法與固相載體結(jié)合。例如在Cronin等(1996)Human Mutation 7244中描述使用這些包含寡核苷酸的芯片，也稱為“DNA探針陣列”的突變檢測(cè)分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，芯片包含基因的至少一個(gè)多態(tài)區(qū)域的所有等位基因變體。然后將固相載體與檢驗(yàn)核酸接觸并檢測(cè)與特異性探針的雜交。因此，在簡(jiǎn)單的雜交實(shí)驗(yàn)中可以鑒定一個(gè)或多個(gè)基因的許多等位基因變體的同一性。
這些技術(shù)可以還包含在分析前擴(kuò)增核酸的步驟。擴(kuò)增技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并包括但不限于克隆，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，特異性等位基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ASA)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)，嵌套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(Guatelli，J.C.等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)，轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(Kwoh，D.Y.等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)，和Q-Beta復(fù)制酶(Lizardi，P.M.等，1988，Bio/Technology 61197)。
擴(kuò)增產(chǎn)物可以以多種方式測(cè)定，包括大小分析，限制消化接著大小分析，在反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)特異性標(biāo)記的寡核苷酸引物，等位基因特異性寡核苷酸(ASO)雜交，等位基因特異性5’外切核酸酶檢測(cè)，測(cè)序，雜交等。
基于PCR的檢測(cè)方法可以同時(shí)包括多重?cái)U(kuò)增多個(gè)標(biāo)記。例如，在本領(lǐng)域中公知選擇PCR引物以產(chǎn)生大小不重疊并且可以同時(shí)分析的PCR產(chǎn)物。備選地，可以用區(qū)別標(biāo)記和因此每個(gè)可以區(qū)別檢測(cè)的引物擴(kuò)增不同標(biāo)記。當(dāng)然，基于雜交的檢測(cè)方法允許樣品中多個(gè)PCR產(chǎn)物的差異檢測(cè)。本領(lǐng)域已知其它技術(shù)允許多個(gè)標(biāo)記的多重分析。
在僅僅說(shuō)明性的實(shí)施方案中，方法包括以下步驟(i)從患者收集細(xì)胞樣品，(ii)從樣品細(xì)胞中分離核酸(例如，基因組，mRNA或兩者)，(iii)在各種條件下將核酸樣品與一個(gè)或多個(gè)引物接觸以便發(fā)生等位基因的雜交和擴(kuò)增，所述引物與IL-1促炎單倍型的至少一個(gè)等位基因5’和3’特異性雜交，和(iv)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。如果這些分子以極低數(shù)量存在，這些檢測(cè)方案對(duì)于檢測(cè)核酸分子特別有用。
在受試者測(cè)定的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)限制酶切割圖譜的改變鑒定IL-1促炎單倍型的等位基因。例如，分離樣品和對(duì)照DNA，擴(kuò)增(任選地)，用一種或多種限制內(nèi)切核酸酶消化，通過(guò)凝膠電泳確定片段長(zhǎng)度大小。
在還有另一實(shí)施方案中，本領(lǐng)域已知的多種測(cè)序反應(yīng)中的任何一種可以用于直接將等位基因測(cè)序。示例性的測(cè)序反應(yīng)包括基于由Maxim和Gilbert((1977)Proc.Natl Acad Sci USA 74560)或Sanger(Sanger等(1977)Proc.Nat.Acad.Sci USA 745463)開(kāi)發(fā)的技術(shù)的那些。還考慮當(dāng)進(jìn)行受試者測(cè)定時(shí)可以使用多種自動(dòng)測(cè)序方法中的任何一種(參見(jiàn)例如Biotechniques(1995)19448)，包括通過(guò)質(zhì)譜測(cè)序(參見(jiàn)例如PCT公開(kāi)WO94/16101；Cohen等(1996)Adv Chromatogr 36127-162；和Griffin等(1993)Appl Biochem Biotechnol 38147-159)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將明顯的是，對(duì)于某些實(shí)施方案，僅僅需要在測(cè)序反應(yīng)中確定一個(gè)，兩個(gè)或三個(gè)核酸堿基的出現(xiàn)。例如，可以進(jìn)行A-跟蹤(track)等，如其中僅檢測(cè)一個(gè)核酸。
在另一實(shí)施方案中，可以使用防止切割劑(如核酸酶，羥胺或四氧化鋨和哌啶)的保護(hù)來(lái)檢測(cè)RNA/RNA或RNA/DNA或DNA/DNA異源雙鏈中的錯(cuò)配堿基(Myers，等(1985)Science 2301242)。通常，“錯(cuò)配切割”的現(xiàn)有技術(shù)通過(guò)提供通過(guò)將含有野生型等位基因的(標(biāo)記的)RNA或DNA與樣品雜交形成的異源雙鏈起始。用試劑處理雙鏈體，該試劑切割雙鏈體的單鏈區(qū)域，如由于對(duì)照和樣品鏈之間的堿基對(duì)錯(cuò)配導(dǎo)致其將存在。例如，可以用RNA酶處理RNA/DNA雙鏈體，用S1核酸酶處理DNA/DNA雜交物(hybrid)以酶促消化錯(cuò)配區(qū)域。在其它實(shí)施方案中，可以用羥胺或四氧化鋨和哌啶處理DNA/DNA或RNA/DNA雙鏈體以便消化錯(cuò)配區(qū)域。在消化錯(cuò)配區(qū)域以后，然后通過(guò)在變性聚丙烯酰胺凝膠上通過(guò)大小分離得到的物質(zhì)以確定突變位點(diǎn)。參見(jiàn)例如Cotton等(1988)Proc.NatlAcad Sci USA854397；和Saleeba等(1992)Methods Enzymol.217286-295。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以將對(duì)照DNA或RNA標(biāo)記以用于檢測(cè)。
在還有另一實(shí)施方案中，錯(cuò)配切割反應(yīng)使用一種或多種識(shí)別雙鏈DNA中的錯(cuò)配堿基對(duì)的蛋白質(zhì)(所謂“DNA錯(cuò)配修復(fù)”酶)。例如大腸桿菌mutY酶在G/A錯(cuò)配處切割A(yù)，來(lái)自HeLa細(xì)胞的胸苷DNA糖基化酶在G/T錯(cuò)配處切割T(Hsu等(1994)Carcinogenesis 151657-1662)。按照例舉的實(shí)施方案，基于IL-1基因座單倍型的等位基因的探針與來(lái)自檢驗(yàn)細(xì)胞的cDNA或其它DNA產(chǎn)物雜交。用DNA錯(cuò)配修復(fù)酶處理雙鏈體，從電泳方案等可以檢測(cè)切割產(chǎn)物，如果有的話。參見(jiàn)例如美國(guó)專利5,459,039。
在其它實(shí)施方案中，電泳遷移率的改變將可以用來(lái)鑒定IL-1基因座等位基因。例如，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)可以用于檢測(cè)突變型和野生型核酸之間的電泳遷移率的差異(Orita等(1989)Proc Natl.Acad.Sci USA 862766，還參見(jiàn)Cotton(1993)Mutat Res 285125-144；和Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 973-79)。將樣品和對(duì)照IL-1基因座等位基因的單鏈DNA片段變性并允許復(fù)性。單鏈核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)根據(jù)序列而變化，導(dǎo)致的電泳遷移率的改變使能夠檢測(cè)甚至單一的堿基變化?？梢詫NA片段標(biāo)記或用標(biāo)記探針檢測(cè)。通過(guò)使用RNA(而不是DNA)可以增強(qiáng)測(cè)定的靈敏性，在RNA中二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)序列變化更敏感。在優(yōu)選實(shí)施方案中，基于電泳遷移率的變化，主題方法使用異源雙鏈體分析來(lái)分離雙鏈異源雙鏈分子(Keen等(1991)Trends Genet 75)。
在還有另一實(shí)施方案中，使用變性梯度凝膠電泳(DGGE)測(cè)定在含有梯度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中等位基因的運(yùn)動(dòng)(Myers等(1985)Nature313495)。當(dāng)將DGGE用作分析方法時(shí)，例如通過(guò)PCR加入約40bp高-熔解富含GC的DNA的GC夾(clamp)修飾DNA以確保它不完全變性。在另一實(shí)施方案中，使用溫度梯度替代變性劑梯度來(lái)鑒定對(duì)照和樣品DNA的遷移率差異(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys Chem 26512753)。
其它用于檢測(cè)等位基因的技術(shù)的實(shí)例包括但不限于，選擇性寡核苷酸雜交，選擇性擴(kuò)增，或選擇性引物延伸。例如，可以制備其中已知突變或核苷酸差異(例如在等位基因變體中)被放置在中央的寡核苷酸引物，然后在只有當(dāng)發(fā)現(xiàn)完全匹配時(shí)允許雜交的條件下與靶DNA雜交(Saiki等(1986)Nature 324163)；Saiki等(1989)Proc.Natl Acad.Sci USA 866230)。當(dāng)寡核苷酸與PCR擴(kuò)增的靶DNA雜交時(shí)該等位基因特異性寡核苷酸雜交技術(shù)可以用于檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)一個(gè)突變或多態(tài)區(qū)域，當(dāng)寡核苷酸附著在雜交膜和與標(biāo)記的靶DNA雜交時(shí)該技術(shù)可以用于檢測(cè)許多不同突變或多態(tài)區(qū)域。
備選地，依賴于選擇性PCR擴(kuò)增的等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)可以與本發(fā)明結(jié)合使用。用作特異性擴(kuò)增的引物的寡核苷酸可以在分子中央攜帶所關(guān)心的突變或多態(tài)區(qū)域(因此擴(kuò)增取決于示差雜交)(Gibbs等(1989)Nucleic Acids Res.172437-2448)，或者在一條引物的最3’末端，其中在適當(dāng)條件下可以防止錯(cuò)配，或減少聚合酶延伸(Prossner(1993)Tibtech 11238)。另外，可以期望在突變區(qū)域引入新的限制位點(diǎn)以產(chǎn)生基于切割的檢測(cè)(Gasparini等(1992)Mol.Cell Probes 61)。預(yù)期在某些實(shí)施方案還可以使用用于擴(kuò)增的Taq連接酶來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88189)。在這些情形中，只有當(dāng)5’序列的3’末端存在完全匹配時(shí)發(fā)生連接，使可以通過(guò)檢查擴(kuò)增的存在或缺乏來(lái)檢測(cè)在特定位點(diǎn)已知突變的存在。
在另一實(shí)施方案中，如例如U.S.專利4,998,617和在Landegren，U.等((1988)Science 2411077-1080)所述，使用寡核苷酸連接測(cè)定(OLA)進(jìn)行等位基因變體的鑒定。OLA方案使用兩條寡核苷酸，其設(shè)計(jì)來(lái)能夠與靶單鏈的鄰接序列雜交。寡核苷酸之一與分離標(biāo)記連接，例如生物素化，另一條可檢測(cè)地標(biāo)記。如果在靶分子中發(fā)現(xiàn)精確的互補(bǔ)序列，寡核苷酸將雜交以致它們的末端鄰接，并產(chǎn)生連接底物。然后連接允許使用抗生物素蛋白或另外的生物素配體回收標(biāo)記的寡核苷酸。Nickerson，D.A.等已經(jīng)描述結(jié)合PCR和OLA屬性的核酸檢測(cè)分析(Nickerson，D.A.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878923-27)。在該方法中，將PCR用于實(shí)現(xiàn)靶DNA的指數(shù)擴(kuò)增，然后使用OLA檢測(cè)。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)幾種基于該OLA方法的技術(shù)并可以用于檢測(cè)IL-1基因座單倍型的等位基因。例如，美國(guó)專利5,593,826公開(kāi)OLA，其使用具有3’-氨基的寡核苷酸和5’-磷酸化寡核苷酸以形成具有氨基磷酸酯連接的偶聯(lián)物。在Tobe等((1996)Nucleic Acids Res 243728)描述的另一種OLA變體中，與PCR結(jié)合的OLA允許在單個(gè)微量滴定孔中將兩個(gè)等位基因分型。通過(guò)用獨(dú)特的半抗原，即羊地黃毒苷和熒光素標(biāo)記每種等位基因特異性引物，通過(guò)使用半抗原特異性抗體可以檢測(cè)每種OLA反應(yīng)，所述半抗原特異性抗體用不同酶報(bào)告基因(reporter)，堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記。該系統(tǒng)允許使用導(dǎo)致兩種不同顏色產(chǎn)生的高通量形式檢測(cè)兩個(gè)等位基因。
本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及用于檢測(cè)發(fā)展再狹窄的傾向的試劑盒。該試劑盒可包含一種或多種寡核苷酸，包括與IL-1基因座單倍型的至少一個(gè)等位基因5’和3’雜交的5’和3’寡核苷酸。PCR擴(kuò)增寡核苷酸應(yīng)當(dāng)在相隔25和2500個(gè)堿基對(duì)之間，優(yōu)選相隔約100和約500個(gè)堿基之間雜交，以便產(chǎn)生大小便于隨后分析的PCR產(chǎn)物。
特別優(yōu)選的引物包括在圖8-11中描述的核苷酸序列。來(lái)自包含人IL-1基因座的人染色體2q13-的最新序列信息和最新的關(guān)于該基因座可獲得的人多態(tài)性信息的可用性促進(jìn)用于通過(guò)本發(fā)明方法擴(kuò)增和檢測(cè)IL-1多態(tài)等位基因的另外的寡核苷酸的設(shè)計(jì)。例如，分別在圖1(GenBank登記號(hào)X03833)，2(GenBank登記號(hào)X04500)和3(GenBank登記號(hào)X64532)中顯示關(guān)于IL-1A，IL-1B和IL-1RN的DNA序列。使用該序列信息和本領(lǐng)域已知用于設(shè)計(jì)和優(yōu)化引物序列的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以容易地設(shè)計(jì)用于檢測(cè)這些基因中人類多態(tài)性的適當(dāng)引物。例如通過(guò)使用可商購(gòu)的引物選擇程序如Primer 2.1，Primer 3或GeneFisher可以完成這些引物序列的最優(yōu)設(shè)計(jì)(還參見(jiàn)Nicklin M.H.J.，Weith A.Duff G.W.，“A Physical Map of theRegion Encompassing the Human Interleukin-1α，Interleukin-1β，andInterleukin-1Receptor Antagonist Genes”Genomics 19382(1995)；Nothwang H.G，等“Molecular Cloning of the Interleukin-1 gene ClusterConstruction of an Integrated YAC/PAC Contig and a partial transcriptionalMap in the Region of Chromosome 2ql 3”Genomics 41370(1997)；Clark，等(1986)Nucl.Acids.Res.，147897-7914[出版錯(cuò)誤在Nucleic Acids Res.，15868(1987)和URL http//www.gdb.org的Genome Database(GDB)計(jì)劃中出現(xiàn)]。
關(guān)于試劑盒中的使用，寡核苷酸可以是多種天然和/或合成組合物中的任何一種，如合成寡核苷酸，限制片段，cDNA，合成肽核酸(PNA)，等。分析試劑盒和方法還可以使用標(biāo)記的寡核苷酸以允許在測(cè)定中易于鑒定。可以使用的標(biāo)記的實(shí)例包括放射標(biāo)記，酶，熒光化合物，鏈霉抗生物素，抗生物素蛋白，生物素，磁性部分，金屬結(jié)合部分，抗原或抗體部分等。
試劑盒可以任選地還包括DNA取樣裝置。DNA取樣裝置對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的并且可以包括但不限于基質(zhì)，如濾紙，AmpliCard.TM(University of Sheffield，Sheffield，England S10 2JF；Tarlow，JW，等，J.ofInvest.Dermatol.103387-389(1994))等；DNA純化試劑如Nucleo.TM試劑盒，裂解緩沖液，蛋白酶溶液等；PCR試劑，如10x反應(yīng)緩沖液，熱穩(wěn)定性聚合酶，dNTP等；和等位基因檢測(cè)裝置如HinfI限制酶，等位基因特異性寡核苷酸，用于從干血的嵌套PCR的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物。
4.4藥物基因組學(xué)(pharmacogenomics)單獨(dú)或結(jié)合關(guān)于其它有助于特定疾病或病癥的遺傳缺陷的信息，了解與發(fā)展特定疾病或病癥的敏感性相關(guān)的特定等位基因允許按照個(gè)體的遺傳圖譜定制化預(yù)防或治療，這是“藥物基因組學(xué)”的目標(biāo)。因此，個(gè)體IL-1圖譜與種群圖譜關(guān)于血管疾病的比較，允許選擇或設(shè)計(jì)藥物或其它治療方案，其期望對(duì)于特定患者或患者群體(即一組具有相同遺傳改變的患者)是安全和有效的。
另外，基于遺傳圖譜靶向期望顯示最高臨床益處的群體的能力使可以1)重新定位已經(jīng)上市的藥物；2)拯救由于安全性或功效限制導(dǎo)致中斷臨床開(kāi)發(fā)的患者亞群特異性的候選藥物；和3)加速和更便宜地開(kāi)發(fā)候選療法和更優(yōu)化的藥物標(biāo)簽(例如因?yàn)闇y(cè)量各種劑量的藥劑對(duì)致病突變的效果對(duì)于優(yōu)化有效劑量是有用的)。
通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)(例如IL-1α，IL-1β，或IL-1Ra)，mRNA和/或轉(zhuǎn)錄水平可以監(jiān)測(cè)特定療法的個(gè)體治療。根據(jù)檢測(cè)水平，然后可以維持或調(diào)整(增加或減少劑量)治療方案。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用藥劑治療受試者的效力包含以下步驟(i)在給藥藥劑之前從受試者中獲得給藥前樣品；(ii)檢測(cè)給藥前樣品中的蛋白質(zhì)，mRNA或基因組DNA的水平或數(shù)量；(iii)從受試者中獲得一個(gè)或多個(gè)給藥后的樣品；(iv)在給藥后的樣品中檢測(cè)蛋白質(zhì)，mRNA或基因組DNA的表達(dá)水平或活性；(v)將在給藥前的樣品中蛋白質(zhì)，mRNA或基因組DNA的表達(dá)水平或活性分別與在給藥后的樣品中對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)，mRNA或基因組DNA比較；和(vi)相應(yīng)地改變對(duì)受試者的藥劑給藥。
還可以在治療劑給藥之前和之后獲得受試者的細(xì)胞以檢測(cè)除了IL-1基因以外的基因的表達(dá)水平，以證實(shí)治療劑未增加或減少可能有害的基因的表達(dá)。這可以例如通過(guò)使用轉(zhuǎn)錄作圖(profiling)的方法完成。因此，可以將來(lái)自體內(nèi)暴露于治療劑的細(xì)胞的mRNA和來(lái)自未暴露于治療劑的相同類型細(xì)胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄和與含有來(lái)自多個(gè)基因的DNA的芯片雜交，由此比較在用治療劑處理或未處理的細(xì)胞中基因的表達(dá)。
4.5.用于與IL-1多態(tài)性有關(guān)的疾病和病癥的治療劑用于與IL-1多態(tài)性或單倍型有關(guān)的疾病和病癥的治療劑是指防止或延遲受試者中特定疾病或癥狀的發(fā)展或緩解其癥狀的任何試劑或治療方案(包括藥物，營(yíng)養(yǎng)物和外科方法)。治療劑可以是多肽，肽模擬物，核酸或其它無(wú)機(jī)或有機(jī)分子，優(yōu)選包括維生素，礦物質(zhì)和其它養(yǎng)分的“小分子”。通過(guò)模仿或加強(qiáng)(激動(dòng))或抑制(拮抗)天然存在的多肽作用，優(yōu)選治療劑可以調(diào)節(jié)IL-1多肽的至少一種活性，例如與受體的相互作用。激動(dòng)劑可以是野生型蛋白質(zhì)或其具有至少一種野生型生物活性例如受體結(jié)合活性的衍生物。激動(dòng)劑還可以是上調(diào)基因表達(dá)或者增加蛋白質(zhì)的至少一種生物活性的化合物。激動(dòng)劑還可以是增加多肽與另一分子例如受體相互作用的化合物。拮抗物可以是抑制或減少蛋白質(zhì)和另一分子例如受體之間的相互作用的化合物，或者是阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或翻譯后加工的試劑(例如IL-1轉(zhuǎn)化酶(ICE)抑制劑)。因此，優(yōu)選的拮抗物是抑制或減少與受體結(jié)合和由此阻斷隨后受體激活的化合物。拮抗物還可以是下調(diào)基因表達(dá)或減少存在的蛋白質(zhì)的量的化合物。拮抗物可以是顯性失活形式(negative form)的多肽，例如能夠與靶肽例如受體相互作用但是不促進(jìn)受體激活的形式的多肽。拮抗物還可以是編碼顯性失活形式的多肽的核酸，反義核酸，或能夠與RNA特異性相互作用的核酶。還有的其它拮抗物是與多肽結(jié)合和抑制其作用的分子。這些分子包括肽，例如不具有生物活性和抑制與受體結(jié)合的各種形式的靶肽。因此，這些肽將與蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)結(jié)合和防止它與靶肽相互作用。還有的其它拮抗物包括與分子表位特異性相互作用，以致結(jié)合干涉多肽的生物學(xué)功能的抗體。在還有另一優(yōu)選實(shí)施方案中，拮抗物是小分子，如能夠抑制多肽和靶受體之間相互作用的分子。備選地，通過(guò)與除了受體結(jié)合位點(diǎn)以外的位點(diǎn)相互作用，小分子可以用作拮抗物。
IL-1(例如IL-1α，IL-1β或IL-1受體拮抗物)或由與IL-1基因連鎖不平衡的基因編碼的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)物可以包含任何類型的化合物，包括蛋白質(zhì)，肽，肽模擬物(peptidomimetic)，小分子，或核酸。優(yōu)選的拮抗物包括核酸(例如編碼IL-1蛋白或被IL-1蛋白上調(diào)或下調(diào)的基因)，蛋白質(zhì)(例如IL-蛋白質(zhì)或由此上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì))或小分子(例如調(diào)節(jié)IL-1蛋白表達(dá)或結(jié)合)。例如使用本文所述的測(cè)定可以鑒定的優(yōu)選拮抗物，包括核酸(例如單(反義)或雙鏈(三鏈體)DNA或PNA和核酶)，蛋白質(zhì)(例如抗體)和用于制止或抑制IL-1轉(zhuǎn)錄和/或蛋白質(zhì)活性的小分子。
4.6.有效劑量和制劑和應(yīng)用通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中例如用于測(cè)定LD50(50％群體致死的劑量)和Ed50(50％群體治療有效的劑量)的標(biāo)準(zhǔn)藥物程序，可以測(cè)定這些化合物的毒性和治療功效。有毒和治療作用之間的劑量比率是治療指數(shù)，它可以表達(dá)為比率LD50/ED50。優(yōu)選顯示大的治療指數(shù)的化合物。盡管可以使用顯示毒性副作用的化合物，應(yīng)當(dāng)小心設(shè)計(jì)傳遞系統(tǒng)，其將這些化合物靶向受影響組織的部位，以便最小化對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損傷和由此減小副作用。
從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制各種用于人類的劑量。這些化合物的劑量?jī)?yōu)選位于包括ED50具有很小或無(wú)毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。根據(jù)所用劑型和所用給藥途徑，劑量可以在該范圍內(nèi)變化。對(duì)于本發(fā)明方法中所用的任何化合物，最初從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中可以評(píng)估治療有效劑量。在動(dòng)物模型中可以配制劑量以獲得包括如細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定的IC50(即獲得癥狀最大抑制一半的檢測(cè)化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。該信息可以用于更準(zhǔn)確地測(cè)定人類中的有效劑量。例如通過(guò)高效液相色譜可以測(cè)量血漿中的水平。
可以使用一種或多種生理上可接受的載體或賦形劑以常規(guī)方法配制按照本發(fā)明使用的組合物。因此，可以配制化合物和它們生理上可接受的鹽和溶劑化物，用于通過(guò)例如注射，吸入或吹入(通過(guò)嘴或鼻)給藥或口服，頰含(buccal)，腸胃外或直腸給藥。
對(duì)于該治療，可以將本發(fā)明化合物配制用于各種負(fù)荷的給藥，包括系統(tǒng)和局部(topical)或定位(localized)給藥。技術(shù)和配制通常可以在Remmington′s Pharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.，Easton，Pa中發(fā)現(xiàn)。對(duì)于全身給藥，優(yōu)選注射，包括肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)和皮下。對(duì)于注射，可以將本發(fā)明化合物配制在液體溶液中，優(yōu)選在生理相容的緩沖液如Hank’s溶液或Ringer’s溶液。另外，化合物可以以固體形式配制和在即將使用前再溶解或懸浮。還包括凍干形式。
對(duì)于口服給藥，組合物可以采用例如片劑或膠囊的形式，其是通過(guò)常規(guī)方法用以下各項(xiàng)制備藥用賦形劑如粘合劑(例如預(yù)先糊化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂，滑石或硅石)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)；或濕潤(rùn)劑(例如十二烷基硫酸鈉)。可以用本領(lǐng)域公知的方法包衣片劑。用于口服給藥的液體制劑可以采取例如溶液，糖漿或混懸劑的形式，或者它們可以作為在使用前與水或其它適當(dāng)載體組構(gòu)的干產(chǎn)品存在。通過(guò)常規(guī)方法用藥用添加劑可以制備這些液體制劑，所述藥用添加劑如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿，纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載體(例如ationd油，油性酯，乙醇或分級(jí)的植物油)；和防腐劑(例如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯或山梨酸)。如果適當(dāng)制劑還可以包含緩沖鹽，調(diào)味劑，著色劑和甜味劑。
可以將用于口服給藥的制劑適當(dāng)?shù)嘏渲埔援a(chǎn)生活性化合物的控釋。對(duì)于頰含給藥組合物可以采取以常規(guī)方法配制的片劑或錠劑的形式。對(duì)于通過(guò)吸入給藥，按照本發(fā)明使用的化合物便利地以來(lái)自加壓包裝或噴霧器的氣溶膠噴霧呈遞的形式使用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑傳遞，所述推進(jìn)劑例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它適當(dāng)?shù)臍怏w。在加壓氣溶膠的情形中，通過(guò)提供閥門以傳遞計(jì)量的量可以測(cè)定劑量單位?？梢耘渲朴糜谖肫骰虼等肫鞯睦缑髂z的膠囊和藥筒，其包含化合物和適當(dāng)粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可以配制化合物用于腸胃外給藥，其通過(guò)注射例如通過(guò)大丸劑注射或連續(xù)輸注。用于注射的制劑可以與加入的防腐劑以單位劑量形式，例如在安剖中或在多劑量容器中存在。組合物可以采取諸如在油性或水性載體中的混懸液，溶液或乳劑的形式，并且可以包含配制試劑如混懸劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑。備選地，活性成分可以是在使用前與適當(dāng)載體例如無(wú)菌不含熱原的水組構(gòu)的粉末形式。
化合物還可以配制成直腸組合物如栓劑或保留灌腸劑，例如包含常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可油或其它甘油酯。
除了前述制劑，化合物還可以配制成貯存制劑。這些長(zhǎng)效制劑可以通過(guò)移植(例如皮下或肌內(nèi))或通過(guò)肌內(nèi)注射施用。因此，例如化合物可以用適當(dāng)?shù)木酆匣蚴杷晕镔|(zhì)(例如作為可接受油中的乳劑)或離子交換樹(shù)脂配制，或配制成微溶衍生物，例如微溶鹽。其它適當(dāng)?shù)膫鬟f系統(tǒng)包括微球體，其提供在延長(zhǎng)時(shí)期的時(shí)間內(nèi)局部非侵害傳遞藥物的可能性。該技術(shù)利用前毛細(xì)血管大小的微球體，其可以經(jīng)由冠狀動(dòng)脈導(dǎo)管注射到例如心臟或其它器官的任何選擇的部分而不導(dǎo)致炎癥或局部缺血。施用的治療劑從這些微球體緩慢地釋放并被周圍組織細(xì)胞(例如內(nèi)皮細(xì)胞)吸收。
還可以通過(guò)經(jīng)粘膜或經(jīng)皮的方法全身給藥。對(duì)于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥，在制劑中使用適于被滲透的屏障的滲透劑。該滲透劑在本領(lǐng)域公知，并且包括例如用于經(jīng)粘膜給藥膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。另外，可以使用洗滌劑以促進(jìn)滲透。經(jīng)粘膜給藥可以通過(guò)鼻噴霧或使用栓劑。對(duì)于局部給藥，本發(fā)明的寡聚體可以配制成本領(lǐng)域公知的軟膏，藥膏，凝膠，或乳膏?？梢跃植渴褂孟匆阂蕴幚?yè)p傷或炎癥以加速愈合。
如果需要，組合物可以存在于包裝或分配器裝置之中，其可以含有一種或多種含有活性成分的單位劑量形式。包裝例如可以包含金屬或塑料箔，如泡罩包裝。包裝或分配器裝置可以附有給藥使用說(shuō)明。
4.7.鑒定治療劑的測(cè)定基于導(dǎo)致或有助于與IL-1多態(tài)性或單倍型有關(guān)的疾病或紊亂發(fā)展的突變的鑒定，本發(fā)明另外特征在于用于鑒定治療劑的基于細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞的測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，在測(cè)試化合物單獨(dú)存在下或在測(cè)試化合物和另外的蛋白質(zhì)的存在下，溫育在其細(xì)胞膜外表面上表達(dá)IL-1受體或由與IL-1基因連鎖不平衡的基因編碼的蛋白質(zhì)的受體的細(xì)胞，并例如通過(guò)使用微生理儀(microphysiometer)(McConnell等(1992)Science 2571906)檢測(cè)測(cè)試化合物和受體之間或蛋白質(zhì)(優(yōu)選標(biāo)記蛋白質(zhì))和受體之間的相互作用。通過(guò)微生理儀檢測(cè)作為培養(yǎng)基酸化變化的受體和測(cè)試化合物或蛋白質(zhì)之間的相互作用。該測(cè)定系統(tǒng)因此提供鑒定例如通過(guò)干涉蛋白質(zhì)-受體相互作用起作用的分子拮抗物以及例如通過(guò)激活受體起作用的分子激動(dòng)劑的方法。
細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞測(cè)定還可以用于鑒定調(diào)節(jié)IL-1基因或與其連鎖不平衡的基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)mRNA翻譯或調(diào)節(jié)mRNA或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的化合物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，將能夠產(chǎn)生IL-1或其它蛋白質(zhì)的細(xì)胞，與測(cè)試化合物溫育，測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)基中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的量，并與從未與測(cè)試化合物接觸的細(xì)胞中生產(chǎn)的量比較。通過(guò)各種對(duì)照分析，例如測(cè)量一個(gè)或多個(gè)對(duì)照基因的表達(dá)，可以證實(shí)化合物相對(duì)于蛋白質(zhì)的特異性。特別是，該分析可以用于測(cè)定反義，核酶和三聚體化合物的功效。
無(wú)細(xì)胞測(cè)定還可以用于鑒定能夠與蛋白質(zhì)相互作用，由此改變蛋白質(zhì)活性的化合物。該化合物可以例如修飾蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)由此影響它與受體結(jié)合的能力。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于鑒定這些化合物的無(wú)細(xì)胞測(cè)定基本上由反應(yīng)混合物組成，所述反應(yīng)混合物包含在結(jié)合配體的存在或不存在條件下蛋白質(zhì)和測(cè)試化合物或測(cè)試化合物庫(kù)。測(cè)試化合物可以是例如結(jié)合配體的衍生物，例如無(wú)生物活性的靶肽或小分子。
因此，本發(fā)明的一個(gè)示例性篩選測(cè)定包括將蛋白質(zhì)或其功能片段與測(cè)試化合物或測(cè)試化合物庫(kù)接觸和檢測(cè)復(fù)合體的形成的步驟。為了檢測(cè)目的，分子可以用特異的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記，測(cè)試化合物或測(cè)試化合物庫(kù)用不同的標(biāo)記標(biāo)記。于是在溫育步驟和洗滌步驟以后通過(guò)測(cè)定兩種標(biāo)記的水平可以檢測(cè)測(cè)試化合物與蛋白質(zhì)或其片段的相互作用。在洗滌步驟以后兩種標(biāo)記的存在表示相互作用。
通過(guò)使用檢測(cè)表面等離子共振(SPR)，一種光學(xué)現(xiàn)象的實(shí)時(shí)BIA(生物分子相互作用分析，Pharmacia Biosensor AB)也可以鑒定分子間的相互作用。檢測(cè)依賴于在生物特異性界面大分子質(zhì)量濃度的變化，不需要標(biāo)記任何反應(yīng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將測(cè)試化合物庫(kù)固定在傳感器表面，例如，其形成微流量池的一個(gè)池壁。然后含有蛋白質(zhì)或其功能片段的溶液連續(xù)流過(guò)傳感器表面。如信號(hào)記錄所示的共振角的變化顯示相互作用已經(jīng)發(fā)生。該技術(shù)例如在Pharmacia的BIA技術(shù)手冊(cè)中進(jìn)一步描述。
本發(fā)明另一示例性的篩選測(cè)定包括以下步驟(a)形成反應(yīng)混合物，其包括(i)IL-1或其它蛋白質(zhì)，(ii)適當(dāng)?shù)氖荏w，和(iii)測(cè)試化合物；和(b)檢測(cè)蛋白質(zhì)和受體的相互作用。與缺乏測(cè)試化合物的相互作用相比，在測(cè)試化合物存在條件下蛋白質(zhì)和受體的相互作用的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化(加強(qiáng)或抑制)顯示可能的拮抗物(抑制劑)。該測(cè)試的化合物可以同時(shí)接觸。備選地，蛋白質(zhì)可以首先與測(cè)試化合物接觸適當(dāng)量的時(shí)間，接著將受體加入反應(yīng)混合物。通過(guò)使用各種濃度的測(cè)試化合物獲得的數(shù)據(jù)產(chǎn)生劑量反應(yīng)曲線可以評(píng)估化合物的功效。此外，還可以進(jìn)行對(duì)照測(cè)定以提供比較的基線。
通過(guò)各種技術(shù)可以檢測(cè)在蛋白質(zhì)和受體之間的復(fù)合體形成。通過(guò)免疫測(cè)定，或通過(guò)色譜檢測(cè)，使用例如可檢測(cè)的標(biāo)記蛋白質(zhì)，如放射性標(biāo)記，熒光標(biāo)記，或酶促標(biāo)記的蛋白質(zhì)或受體，可以定量復(fù)合體形成的調(diào)節(jié)。
典型地，期望固定化蛋白質(zhì)或受體以促進(jìn)從非復(fù)合形式的一種或兩種蛋白質(zhì)中分離復(fù)合體以及適應(yīng)測(cè)定的自動(dòng)化。在任何適于包含反應(yīng)物的容器中可以完成蛋白質(zhì)和受體的結(jié)合。實(shí)例包括微量滴定板，試管，和微型離心管。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以提供融合蛋白質(zhì)，其增加允許蛋白質(zhì)與基質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白質(zhì)可以吸附到谷胱甘肽瓊脂糖珠粒(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生化的微量滴定板上，其然后與受體例如35S-標(biāo)記的受體，和測(cè)試化合物結(jié)合，盡管稍微更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件可能更理想，在有助于復(fù)合體形成的條件下，例如在鹽和pH的生理?xiàng)l件下，溫育混合物。在溫育后，洗滌珠粒以去除任何未結(jié)合的標(biāo)記，將基質(zhì)固定和直接測(cè)定放射性標(biāo)記(例如將珠粒放于閃爍體中)，或在隨后將復(fù)合體解離后在上清液中測(cè)定。備選地，復(fù)合體可以從基質(zhì)上解離，通過(guò)SDS-PAGE分離，使用如在后附實(shí)施例中所述的標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)從凝膠中定量在珠級(jí)分中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)或受體的水平。其它用于固定蛋白質(zhì)于基質(zhì)上的技術(shù)也可以供主題測(cè)定使用。例如，利用生物素和鏈霉抗生物素的偶聯(lián)可以固定化蛋白質(zhì)或受體。也可以制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以鑒定激動(dòng)劑和拮抗物或證實(shí)候選治療劑的安全性和功效。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以包括非人類動(dòng)物，其包含在適當(dāng)內(nèi)源啟動(dòng)子的控制下或在異源啟動(dòng)子的控制下的再狹窄致病突變。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還可以是含有在適當(dāng)啟動(dòng)子的控制下轉(zhuǎn)基因如報(bào)告基因或其片段的動(dòng)物。這些動(dòng)物用于例如鑒定如通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)IL-1蛋白質(zhì)的生產(chǎn)的藥物。獲得轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物的方法在本領(lǐng)域公知。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用例如以期望模式控制表達(dá)的順式作用序列，將再狹窄致病突變的表達(dá)限制在特定的細(xì)胞亞群，組織或發(fā)育階段。在本發(fā)明中，這種蛋白質(zhì)的嵌合表達(dá)可能對(duì)于許多連鎖分析類型是關(guān)鍵性的，并且可以另外提供評(píng)估例如表達(dá)水平效果的方法，所述表達(dá)水平可能完全改變另外正常胚胎內(nèi)小塊組織的發(fā)育。為此，可以使用組織特異性調(diào)節(jié)序列和條件調(diào)節(jié)序列來(lái)控制在特定空間分布模式中突變的表達(dá)。此外，通過(guò)例如條件重組系統(tǒng)或原核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可以提供表達(dá)的時(shí)間分布模式。遺傳技術(shù)，其允許通過(guò)體內(nèi)位點(diǎn)特異性遺傳操作可以調(diào)節(jié)突變表達(dá)，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在多個(gè)它們的細(xì)胞內(nèi)都包括本發(fā)明的致病突變轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因改變“宿主細(xì)胞”的表型。在說(shuō)明性的實(shí)施方案中，可以使用噬菌體P1的cre/loxP重組酶系統(tǒng)(Lakso等(1992)PNAS 896232-6236；Orban等(1992)PNAS 896861-6865)或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP重組酶系統(tǒng)(O’Gorman等(1991)Science 2511351-1355；PCT公開(kāi)WO 92/15694)來(lái)產(chǎn)生體內(nèi)位點(diǎn)特異性遺傳重組系統(tǒng)。Cre重組酶催化位于loxP序列之間的插入靶序列的位點(diǎn)特異性重組。loxP序列是Cre重組酶結(jié)合的34個(gè)堿基對(duì)的核苷酸重復(fù)序列并且為Cre重組酶介導(dǎo)的遺傳重組所需。當(dāng)Cre重組酶存在時(shí)，loxP序列的定向決定插入靶序列被切除或倒置(Abremski等(1984)J. Biol.Chem.2591509-1514)；當(dāng)loxP序列定向?yàn)檎蛑貜?fù)時(shí)催化靶序列的切除，當(dāng)loxP序列定向?yàn)榉聪蛑貜?fù)時(shí)催化靶序列的倒置。
因此，靶序列的遺傳重組取決于Cre重組酶的表達(dá)。重組酶的表達(dá)可以通過(guò)啟動(dòng)子元件調(diào)節(jié)，所述啟動(dòng)子受調(diào)節(jié)控制，例如組織特異性，發(fā)育階段特異性，通過(guò)外加試劑可誘導(dǎo)的或可抑制的。這種調(diào)節(jié)的控制將僅在重組酶表達(dá)受啟動(dòng)子元件介導(dǎo)的細(xì)胞中導(dǎo)致靶序列的遺傳重組。因此，通過(guò)控制重組酶表達(dá)可以調(diào)節(jié)致病突變轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的激活。
將cre/loxP重組酶系統(tǒng)用于調(diào)節(jié)致病突變轉(zhuǎn)基因的表達(dá)要求構(gòu)建含有編碼Cre重組酶和主題蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過(guò)構(gòu)建“二重”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以提供含有Cre重組酶和再狹窄致病突變轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。提供這些動(dòng)物的便利方法是使兩種各自含有一種轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物交配。
使用原核啟動(dòng)子序列可以提供類似的條件轉(zhuǎn)基因，為了促進(jìn)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)所述原核啟動(dòng)子序列要求原核蛋白質(zhì)同時(shí)表達(dá)。示例的啟動(dòng)子和相應(yīng)的反式激活原核蛋白質(zhì)在美國(guó)專利4,833,080中提供。
此外，通過(guò)類似基因治療的方法可以誘導(dǎo)條件轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，其中將編碼反式激活蛋白，例如重組酶或原核蛋白質(zhì)的基因傳遞到組織并使如以細(xì)胞類型特異性的方式表達(dá)。通過(guò)該方法，轉(zhuǎn)基因可以保持沉默至成年期直至通過(guò)引入反式激活物“開(kāi)啟”。
在例舉的實(shí)施方案中，通過(guò)將轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨祟悇?dòng)物的種系中生產(chǎn)本發(fā)明的“轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物”。在不同發(fā)育階段的胚胎靶細(xì)胞可以用來(lái)導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因。根據(jù)胚胎靶細(xì)胞的發(fā)育階段使用不同方法。以普遍良好的健康，好的胚胎產(chǎn)率，在胚胎中良好的原核能見(jiàn)度，和良好的生殖適度選擇用來(lái)實(shí)施本發(fā)明的任何動(dòng)物的特定品系。另外，單倍型是一個(gè)重要因素。例如，當(dāng)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)，經(jīng)常使用品系如C57BUJ6或FVB品系(JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME)。優(yōu)選的品系是具有H-2b，H-2d或H-2q單倍型的那些如C57BL/6或DBA/1。用于實(shí)施本發(fā)明的品系它們本身可以是轉(zhuǎn)基因的，和/或者可以是剔除物(knockouts)(即從一個(gè)或多個(gè)基因部分或完全被抑制的動(dòng)物獲得)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入單一階段的胚胎。合子是顯微注射的最好目標(biāo)。在小鼠中，雄性原核達(dá)到直徑約20微米的大小，其允許1-2pl DNA溶液的可重復(fù)注射。將合子用作基因轉(zhuǎn)移的目標(biāo)具有一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)，即在大多數(shù)情形中注射的DNA將在第一次卵裂之前整合到宿主基因中(Brinster等(1985)PNAS 824438-4442)。結(jié)果，所有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞將攜帶整合的轉(zhuǎn)基因。這通常也將反映在轉(zhuǎn)基因有效的傳遞給建立者(founder)的后代，因?yàn)?0％生殖細(xì)胞將含有轉(zhuǎn)基因。
通常，將受精的胚胎在適當(dāng)培養(yǎng)基中溫育直至原核出現(xiàn)。約在此時(shí)，如下所述將包含轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列導(dǎo)入雌性或雄性原核。在一些物種如小鼠中，優(yōu)選雄性原核。最優(yōu)選在它被卵核或合子的雌性原核加工以前將外源遺傳物質(zhì)加至合子的雄性DNA互補(bǔ)體(complement)。認(rèn)為卵核或雌性原核釋放影響雄性DNA互補(bǔ)體的分子，其可能通過(guò)用組蛋白替換雄性DNA的魚精蛋白，由此促進(jìn)雌性和雄性DNA互補(bǔ)體的結(jié)合以形成二倍體合子。因此，優(yōu)選在它受雌性原核的影響之前將外源遺傳物質(zhì)加入雄性DNA互補(bǔ)體或任何其它DNA互補(bǔ)體。例如，在形成雄性原核之后盡可能快地將外源遺傳物質(zhì)加入早期雄性原核，這時(shí)雄性原核和雌性原核很好地分離并且都位于近細(xì)胞膜。備選地，在它已經(jīng)被誘導(dǎo)進(jìn)行解凝聚以后可以將外源遺傳物質(zhì)加入精核。含有外源遺傳物質(zhì)的精子然后可以加入卵子或者可以將解凝聚的精子加入卵子，其后盡可能快地加入轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。
通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法如例如顯微注射，電穿孔或脂轉(zhuǎn)染，可以完成將轉(zhuǎn)基因核苷酸序列導(dǎo)入胚胎。在將轉(zhuǎn)基因核苷酸序列導(dǎo)入胚胎以后，胚胎可以體外溫育不同數(shù)量的時(shí)間，或重移植到替代宿主中，或兩者都進(jìn)行。體外溫育至成熟在本發(fā)明的范圍內(nèi)。取決于物種，一種常規(guī)方法是將胚胎體外溫育約1-7天，然后將它們重移植到替代宿主中。
為了本發(fā)明的目的，合子基本上是二倍體細(xì)胞的形成，其能夠發(fā)育成完整的生物。通常合子將由含有通過(guò)融合來(lái)自一個(gè)配子或多個(gè)配子的兩個(gè)單倍體核，天然或人工形成的核的卵子組成。因此，配子核必須是天然相容的配子核，即產(chǎn)生能生存的能夠進(jìn)行分化和發(fā)育成功能生物的合子的配子核。通常，優(yōu)選整倍體合子。如果獲得整倍體合子，那么相對(duì)于任何一個(gè)配子起源的生物的整倍體數(shù)量，染色體的數(shù)量改變應(yīng)當(dāng)不超過(guò)一個(gè)。
除了類似的生物學(xué)考慮，物理考慮也決定外源遺傳物質(zhì)的數(shù)量(例如體積)，所述外源遺傳物質(zhì)可以加入合子的核或者可以形成合子核的一部分的遺傳物質(zhì)。如果未去除遺傳物質(zhì)，那么可以加入的外源遺傳物質(zhì)的量受將被吸收而不物理破壞性的量的限制。通常，插入的外源遺傳物質(zhì)的體積將不超過(guò)約10皮升。加入的物理影響不應(yīng)該如此大以致物理上破壞合子的生存力。因?yàn)榈玫降暮献拥倪z傳物質(zhì)，包括外源遺傳物質(zhì)必須在生物學(xué)上能夠起始和保持合子的分化和發(fā)育成功能生物，DNA序列的數(shù)量和種類的生物學(xué)限制將根據(jù)具體合子和外源遺傳物質(zhì)的功能而變化，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易明顯的。
加入合子的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的拷貝數(shù)目取決于加入的外源遺傳物質(zhì)的總量，并且將是能夠使遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)生的量。理論上僅需要一個(gè)拷貝；然而通常使用許多拷貝，例如1,000-20,000個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，以便確保一個(gè)拷貝有功能。關(guān)于本發(fā)明，通常將是有利的是具有多于一個(gè)功能拷貝的每個(gè)插入外源DNA序列以增強(qiáng)外源DNA序列的表型表達(dá)。
只要它不對(duì)細(xì)胞，核膜或其它存在的細(xì)胞或遺傳結(jié)構(gòu)是破壞性的，可以使用允許加入外源遺傳物質(zhì)于核遺傳物質(zhì)中的任何技術(shù)。將外源遺傳物質(zhì)優(yōu)選通過(guò)微量注射插入核遺傳物質(zhì)。細(xì)胞和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的微量注射是已知的并在本領(lǐng)域中使用。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法完成重移植。通常，將替代宿主麻醉，將胚胎插入輸卵管。移植到具體宿主中的胚胎的數(shù)量將隨物種變化，但是將通常比得上物種天然生產(chǎn)的后代數(shù)量。
通過(guò)任何適當(dāng)方法可以篩選替代宿主的轉(zhuǎn)基因后代轉(zhuǎn)基因的存在和/或表達(dá)。經(jīng)常使用與轉(zhuǎn)基因的至少一部分互補(bǔ)的探針，通過(guò)DNA印跡或RNA印跡分析完成篩選?？梢允褂美冕槍?duì)由轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體的蛋白質(zhì)印跡分析作為備選或另外的篩選轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物存在的方法。典型地，從尾組織中制備DNA并通過(guò)DNA印跡分析或PCR分析轉(zhuǎn)基因。備選地，盡管任何組織或細(xì)胞類型可以用于該分析，但使用DNA印跡分析或PCR檢驗(yàn)認(rèn)為以最高水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因的組織或細(xì)胞轉(zhuǎn)基因的存在和表達(dá)。
用于評(píng)估轉(zhuǎn)基因存在的備選或另外的方法無(wú)限制地包括適當(dāng)?shù)纳锘瘜W(xué)測(cè)定如酶和/或免疫學(xué)測(cè)定，針對(duì)特定標(biāo)記或酶活性的組織學(xué)染色，流式細(xì)胞儀分析等。血液的分析也可以用于檢測(cè)血液中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的存在，以及評(píng)估轉(zhuǎn)基因?qū)Ω鞣N類型的血細(xì)胞和其它血液成分的水平的影響。
通過(guò)將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與適當(dāng)?shù)呐渑冀慌?，或通過(guò)獲自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的卵和/或精子的體外受精，可以獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的后代。當(dāng)進(jìn)行與配偶交配時(shí)，配偶可以是或不是轉(zhuǎn)基因的和/或剔除物；當(dāng)它是轉(zhuǎn)基因的時(shí)，它可以包含相同或不同的轉(zhuǎn)基因，或都含有。備選地，配偶可以是母本品系。當(dāng)使用體外受精時(shí)，可以將受精胚胎移植到替代宿主中或體外溫育，或兩者都進(jìn)行。使用任一方法，使用上述方法或其它適當(dāng)?shù)姆椒梢栽u(píng)估后代轉(zhuǎn)基因的存在。
按照本發(fā)明生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將包括外源遺傳物質(zhì)。另外，在該實(shí)施方案中，序列將附著在轉(zhuǎn)錄控制元件例如啟動(dòng)子上，所述啟動(dòng)子優(yōu)選允許在特定類型的細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。
逆轉(zhuǎn)錄病毒感染也可以用來(lái)將轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨祟悇?dòng)物。發(fā)育的非人類胚胎可以體外培養(yǎng)至胚泡期。在該期間，可以以卵裂球?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄感染的目標(biāo)(Jaenich，R.(1976)PNAS 731260-1264)。通過(guò)酶處理去除透明帶可以獲得卵裂球的有效感染(Manipulating the Mouse Embryo，Hogan eds.(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986)。用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的病毒載體系統(tǒng)典型地是攜帶轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒(Jahner等(1985)PNAS 826927-6931；Van der Putten等(1985)PNAS 826148-6152)。通過(guò)在生產(chǎn)病毒的細(xì)胞單層上培養(yǎng)卵裂球容易或有效地獲得轉(zhuǎn)染(Van derPutten，上文；Stewart等(1987)EMBO J. 6383-388)。備選地，在后期可以進(jìn)行感染?？梢詫⒉《净虍a(chǎn)生病毒的細(xì)胞注射到囊胚腔中(Jahner等(1982)Nature 298623-628)。因?yàn)檎蟽H在形成轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物的細(xì)胞亞群中發(fā)生，大多數(shù)建立者將是轉(zhuǎn)基因的嵌合體。另外，建立者可以在基因組的不同位置包含轉(zhuǎn)基因的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒插入，其通常將在后代中分離。另外，還可以通過(guò)子宮內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染懷孕間期胚胎將轉(zhuǎn)基因?qū)敕N系(Jahner等(1982)上文)。
第三類用于轉(zhuǎn)基因?qū)氲陌屑?xì)胞是胚胎干細(xì)胞(ES)。ES細(xì)胞獲自體外培養(yǎng)和與胚胎融合的移植前的胚胎(Evans等(1981)Nature 292154-156；Bradley等(1984)Nature 309255-258；Gossler等(1986)PNAS 839065-9069；和Robertson等(1986)Nature 322445-448)。通過(guò)DNA轉(zhuǎn)染或通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以將轉(zhuǎn)基因有效地導(dǎo)入ES細(xì)胞。該轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞此后可以與來(lái)自非人類動(dòng)物的胚泡結(jié)合。ES細(xì)胞此后移植(colonize)胚胎，并有助于得到的嵌合動(dòng)物的種系。關(guān)于綜述參見(jiàn)Jaenisch，R.(1988)Science 2401468-1474。
進(jìn)一步通過(guò)下列實(shí)施例來(lái)舉例說(shuō)明本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是以任何方式限制性的。所有引用的參考文獻(xiàn)(包括貫穿本申請(qǐng)引用的文獻(xiàn)參考，授權(quán)的專利，公開(kāi)的專利申請(qǐng))的內(nèi)容特別結(jié)合于此作為參考。除非另外說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施將使用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中充分解釋。參見(jiàn)例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，(第二版，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，編輯.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress1989)；DNA Cloning，卷I和II(D.N.Glover編輯.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編輯.，1984)；U.S.專利號(hào)4,683,195；U.S.專利號(hào)4,683,202；和Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins編輯.，1984)。
5.實(shí)施例下面的實(shí)施例進(jìn)一步支持但不排他性地表示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
實(shí)施例1IL-1基因座位的作圖和表征已經(jīng)鑒定編碼具有IL-1折疊的蛋白質(zhì)的6個(gè)新基因。分類家族涉及炎癥信號(hào)?；诳寺『头派潆s交作圖已經(jīng)將所有6個(gè)新基因以染色體2上的～400kb間隔放置在接近于或在與3個(gè)原有基因家族成員(IL1A，IL1B，IL1RN)相同的簇內(nèi)。我們已經(jīng)將不完全的公共數(shù)據(jù)庫(kù)序列與我們自己的序列結(jié)合產(chǎn)生參考序列和包含所有新基因的圖譜，允許確定基因結(jié)構(gòu)，外顯子的精確定位和常規(guī)SNP與微衛(wèi)星標(biāo)記之間距離的測(cè)定。從著絲粒至端粒的基因順序是IL1A-IL1B-IL1F7-IL1F9-IL1F6-IL1F8-IL1F5-IL1F10-IL1RN，其中IL1A，IL1B和IL1F8僅向著絲粒轉(zhuǎn)錄?；蝽樞蚺c基因之間的進(jìn)化關(guān)系有關(guān)。外顯子邊界的關(guān)鍵特征是保守的。沒(méi)有其它IL-1家族成員在簇內(nèi)的證據(jù)。
最近，顯示與IL-1R1最緊密相關(guān)的受體，稱為IL-1受體相關(guān)蛋白2(IL-1Rrp2，基因IL1RL2)賦予轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)IL-1F9的應(yīng)答性，該應(yīng)答極有效地被最緊密類似IL-1ra的IL-1F5抑制。與IL-1F5的相互作用似乎是高親和力的。IL-1F5和IL-1F9在上皮細(xì)胞中較豐富，已經(jīng)提示它們?cè)谡{(diào)節(jié)該特定區(qū)室的炎癥中具有作用。其它基因的功能是未知的，但在IL-1F7和IL-18R1之間(Pan等，2001)，和在IL-1F10和IL-1R1之間(Lin等，2001)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)低親和力的相互作用。新IL-1家族成員的生物學(xué)作用正在研究中，但mRNA表達(dá)似乎與IL-1α，IL-1β，IL-1ra和IL-18所看到的相比遠(yuǎn)更有限。因此可能涉及新IL-1家族成員功能的細(xì)胞類型比IL-1情形的更特化。
材料和方法測(cè)序和序列拼接(sequence assembly)按照公共結(jié)構(gòu)域中的部分序列(Lander等，2001)鑒定包含IL1A，IL1B，IL1RN和IL1F5的BAC，其先前已經(jīng)作圖為基因簇(Nicklin等，1994；Notwang等，1996；Barton等，2000)。9個(gè)選擇的BAC為RP11-1I24，RP11-477F18，RP11-554I7，RP11-368A17，RP11-434I13，RP11-67L14，RP11-725J3，RP11-339F22，RP11-97J14和RP11-65I12。很多公共數(shù)據(jù)是未完成的，不包含序列或定向信息。將單個(gè)BAC的公共序列彼此對(duì)比提供最小重疊的信息。為了在區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生最小平鋪支架(scaffold)，選擇7個(gè)BAC(RP11-477F18，RP11-554I7，RP11-434I13，RP11-67L14，RP11-725J3，RP11-339F22，RP11-97J14)并測(cè)序至3X覆蓋度。在正向和方向上將小的插入質(zhì)粒克隆(～3500bp)測(cè)序，提供跨越克隆的成對(duì)閱讀。將PHRED和PHRAP(Ewing等，1998；Ewing和Green，1998)用于7個(gè)BAC的堿基調(diào)用和拼接。使用內(nèi)部重疊群觀察工具來(lái)分析得到的拼接。我們通過(guò)匹配其成對(duì)閱讀落到其它重疊群末端的測(cè)序的重疊群末端來(lái)將重疊群排序。在該低覆蓋率下，BAC拼接成大量重疊群，但確定了順序和定向。從Genebank輸入7個(gè)內(nèi)部測(cè)序的BAC以及2個(gè)外部完成的BAC(RP11-1I24和RP11-65I12)的公共數(shù)據(jù)。使用各種軟件工具比較和排列內(nèi)部的，公共的和重疊順序，提供跨越所有可用數(shù)據(jù)的順序和定位信息。然后從這些排列中選擇重疊群以在區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生盡可能多的連續(xù)序列，并使用Sequencher(4.0.5版)拼接。
序列對(duì)比和外顯子定位用在NCBI服務(wù)器上運(yùn)行的2-序列BLAST程序(Altschul等，1997)將引物和cDNA序列最初與基因組序列匹配。用在HGMP服務(wù)器(Cambridge，UK)上運(yùn)行的est2基因組程序(Mott，1997)進(jìn)行外顯子對(duì)比。設(shè)置程序以鑒定共有的外顯子邊界。將由于它們較短不能鑒定的5’外顯子手工定位在最近的在共有剪接供體二核苷酸(GT)處終止的對(duì)應(yīng)序列。未嘗試將非編碼區(qū)的3’末端作圖，因?yàn)閙RNA大小數(shù)據(jù)大多不可獲得。
結(jié)果IL-1簇的序列將900kb區(qū)域拼接成14個(gè)有序的結(jié)合內(nèi)部和公共序列的連續(xù)序列。該序列的端粒部分包含基因PAX8。隨后，從該區(qū)域中提取由7個(gè)重疊群組成的較短區(qū)域，總共496kb。公共數(shù)據(jù)庫(kù)的近來(lái)更新已經(jīng)使我們將序列中6個(gè)缺口中的5個(gè)補(bǔ)平。(參見(jiàn)圖17)。我們已經(jīng)向公共數(shù)據(jù)庫(kù)提交495475個(gè)核苷酸的注解的序列，如本報(bào)告所述(登記號(hào)***)。剩余的單個(gè)缺口(在圖17上標(biāo)記“缺口”)是IL-1簇的著絲粒。序列不是完成質(zhì)量但為完成序列提供框架和允許我們檢查基因在IL-1簇內(nèi)的結(jié)構(gòu)。新圖譜與先前公開(kāi)的圖譜(Nicklin等，1994；Nothwang等，1996)一致，但基本上不同于不完全的公共基因組拼接計(jì)劃(Lander等，2001)。
向著絲粒最近的鑒定的側(cè)翼基因與IL-1無(wú)關(guān)。它是質(zhì)膜磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC20A1(以前鑒定為長(zhǎng)臂猿白血病病毒受體，GLVR1的人同系物，登記號(hào)XM_002217)，其定位(map)于圖1中在原點(diǎn)左邊63kb-45kb之間。向該簇的端粒方向存在TIC(登記號(hào)NM_012455)，其最有可能是ARF6-選擇性的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子(MN和Tomas Klenka，準(zhǔn)備手稿)，其在端粒側(cè)翼。它的圖譜位置在圖17中顯示。
基因結(jié)構(gòu)我們已經(jīng)將所有IL-1家族的cDNA序列作圖在基因組序列上(圖17)，其中基因的范圍用黑長(zhǎng)方形表示。圖17顯示IL-1基因簇的圖譜。在數(shù)據(jù)之上和之下提供刻度線(kb)以幫助對(duì)比。所述數(shù)據(jù)的來(lái)源通過(guò)上部三條線表示。在基因組治療學(xué)上完全測(cè)定“新序列”?！肮睤B”顯示取自Genbank的序列。從兩個(gè)來(lái)源的組合拼接“組合序列”。在表示重疊群的短線上面，用標(biāo)記的箭頭表示先前描述的多態(tài)性標(biāo)記的位置(Cox等概述，1996和di Giovine等，2000)。還顯示單個(gè)未填滿的缺口。如本文定義的富含CpG的區(qū)域表示為“CpGr”。還將用于先前作圖的稀有切割限制酶位點(diǎn)簇的可能位點(diǎn)標(biāo)記為“Xrec”，“Yrec？”，和“Zrec”。圖18的cDNA序列作圖在重疊群上的范圍通過(guò)重疊群線之下的實(shí)心黑長(zhǎng)方形表示，除了非細(xì)胞因子基因TIC以外，其標(biāo)記為灰色。CE1，CE2和CE3的編碼序列位置通過(guò)垂直線表示?；蚍?hào)之前或之后有V形標(biāo)記以表示轉(zhuǎn)錄方向。圖17進(jìn)一步顯示IL-1簇的詳細(xì)結(jié)構(gòu)。從著絲粒至端粒順序列出每個(gè)基因?！盎颉被虻某Ｒ?guī)基因座名稱。“定向”或者為“正向”，其中存放的序列是有義鏈，或“反向”，其中它是反義的?！拔恢谩笔窃诖娣诺男蛄猩蠈?duì)應(yīng)于每個(gè)外顯子的核苷酸數(shù)目。
當(dāng)已知cDNA序列為不完全時(shí)，類似的外顯子延伸用“＜”和“＞”符號(hào)標(biāo)記?！巴怙@子”是我們基于它在對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄物之一的cDNA中的存在賦予每個(gè)外顯子的名稱；因此IL1RN-a4/b5/c6是cDNA a(X52015)的第4個(gè)外顯子，cDNA b(M55646)的第5個(gè)外顯子和cDNA c的第6個(gè)外顯子。已經(jīng)認(rèn)可對(duì)應(yīng)的mRNA的身份(**)。針對(duì)相鄰條目的星號(hào)(*)表示兩個(gè)外顯子共有剪接供體位點(diǎn)，其為使用備選啟動(dòng)子的結(jié)果?！巴怙@子邊界”是外顯子內(nèi)部側(cè)鄰內(nèi)含子的15個(gè)核苷酸序列。兩個(gè)末端的省略號(hào)(…)表示外顯子可能因?yàn)閏DNA序列已經(jīng)被截短而不完全?！巴怙@子類型”表示外顯子的編碼潛力5’N，5’-非翻譯區(qū)域；5’SO，可能翻譯的5，短可讀框；Ps，肽前序列(表示這已經(jīng)被提出)；cs，不保守的編碼序列；CE，保守外顯子；3’N，3’-非翻譯區(qū)域。省略號(hào)表示外顯子分配可能是不完全的，一些或所有非編碼序列已經(jīng)省略?！熬幋a”表示由每個(gè)外顯子編碼的氨基酸序列。通過(guò)cDNA名稱和它們組成的登記號(hào)(在盒頂部表示)來(lái)鑒定外顯子。每個(gè)外顯子的編碼能力以小寫體表示。斜體殘基部分在下一個(gè)外顯子上編碼。數(shù)字上標(biāo)表示在包含在密碼子內(nèi)所述外顯子中的堿基數(shù)。殘基從下一個(gè)外顯子中省略。在橋連(bridging)密碼子中的核苷酸通過(guò)“外顯子邊界”盒中的斜體表示。在隨后的外顯子是交錯(cuò)的時(shí)候，橋連殘基可以改變。這在括號(hào)中表示。加下劃線的殘基來(lái)自外顯子的末端完整密碼子，它們的密碼子在“外顯子邊界”盒中加下劃線。星號(hào)表示翻譯終止。ILA大部分是著絲?；颍⑾蛑z粒轉(zhuǎn)錄，如相鄰的基因，IL1B。剩余的基因，以IL1RN結(jié)束，簇的大部分端粒成員，向端粒轉(zhuǎn)錄，除了IL1F8以外。每個(gè)基因的最后3個(gè)外顯子，我們稱為共有外顯子(CE)1，2和3，編碼IL-1-同源區(qū)域(如圖18所示和在別處定義)，并且落入序列的緊密區(qū)域。CE1，CE2和CE3在圖1中通過(guò)垂直線表示，但在圖17的分辨率下，一些不能區(qū)分。具有很少或無(wú)編碼內(nèi)容的另外的外顯子大大地?cái)U(kuò)展了大部分基因的范圍。最大的跨度是IL1RN和IL1F8。在后者情形中，第一個(gè)非編碼外顯子是基因剩余部分的20kb端粒。與每個(gè)外顯子的編碼肽序列一起給出基因作圖的細(xì)節(jié)。當(dāng)剪接變體存在時(shí)，該信息使閱讀者能夠拼接不同的可能的蛋白質(zhì)形式。當(dāng)前不確定所有這些形式是否可能是生物學(xué)相關(guān)(參見(jiàn)討論)。
圖18(1-7張)顯示10個(gè)已知IL-1家族成員的3個(gè)共有外顯子的編碼序列的對(duì)比。在每個(gè)情形中共有外顯子是最后3個(gè)轉(zhuǎn)錄物；例如IL-1α的7個(gè)外顯子中的外顯子5，6和7。通過(guò)尋找氨基酸同一性和類似殘基組用眼睛完成對(duì)比。然后將缺口最小化。結(jié)合IL-1β和IL-1ra的晶體學(xué)數(shù)據(jù)并進(jìn)一步用于改進(jìn)對(duì)比。順序表示3個(gè)共有外顯子部分的翻譯。數(shù)字表示由每個(gè)外顯子編碼的成熟產(chǎn)物的第一個(gè)和最后一個(gè)密碼子。根據(jù)它們可能的系統(tǒng)發(fā)育列出基因產(chǎn)物。(！)表示在蛋白水解位點(diǎn)加工產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)，但前序列中的一些也在第一個(gè)共有外顯子內(nèi)編碼。加框的殘基對(duì)于至少3個(gè)序列共有。為了簡(jiǎn)單，不顯示相似性。對(duì)于IL-1β和IL-1ra，在編碼序列以下的第一行上，(標(biāo)記的“結(jié)晶學(xué)”)β-折疊末端的近似位置通過(guò)垂直線表示，折疊的跨度劃灰色陰影線并用折疊數(shù)標(biāo)記。在下一條線(標(biāo)記的“接觸點(diǎn)”)中，數(shù)字表示IL-1R與每個(gè)殘基側(cè)鏈相互作用的結(jié)構(gòu)域。編號(hào)的殘基包含至少1個(gè)重原子(C，N，O，S)，其位于I型IL-1受體重原子的4內(nèi)部(PDB數(shù)據(jù))，如程序RasMol(Sayle和Milner-White)所顯現(xiàn)。在IL-1F5下面的行(標(biāo)記的NMR)中，(^)表示在它們的α-13CNMR信號(hào)中顯示強(qiáng)烈的高磁場(chǎng)位移(＞0.7)的IL-1F5的殘基，這被認(rèn)為顯示在β-折疊內(nèi)它存在的高概率。框圖的最后一條線(標(biāo)記的“共有”)表示以小寫體，在該位點(diǎn)出現(xiàn)至少7/10次的殘基。當(dāng)大寫時(shí)，殘基存在于所有情形中。省略號(hào)表示特定序列的折疊1可能在前面的外顯子上開(kāi)始。(*)表示翻譯終止。
富含CpG區(qū)域使用程序CpGplot(Larsen等，1992)鑒定5個(gè)可能的CpG島，其具有60％C+G含量，60％的CpG二核苷酸的期望頻率和長(zhǎng)度300個(gè)核苷酸。除了第一個(gè)和最后兩個(gè)富含CpG序列，這些區(qū)域較短和可能不構(gòu)成“CpG島”。因此在IL-1簇中不存在CpG島。我們已經(jīng)嘗試定位先前用于物理作圖的限制位點(diǎn)簇(Nicklin等，1994)。富含CpG的序列在圖1中標(biāo)記CpGr。兩個(gè)另外標(biāo)記為Xrec和Zrec。這兩個(gè)區(qū)域包含先前鑒定的稀有的特異切割位點(diǎn)，因此可能對(duì)應(yīng)于簇的側(cè)翼，如先前指定。與先前估計(jì)從基因組DNA的限制消化的Southern雜交430kb相比，序列數(shù)據(jù)提供392kb的長(zhǎng)度。先前用于將IL1B作圖的Nae I和Eag I位點(diǎn)的緊密配對(duì)在標(biāo)記Yrec？的位點(diǎn)周圍發(fā)現(xiàn)，但即使用較不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膮?shù)也不被程序CpGplot所選擇。僅Xrec和Zrec標(biāo)記大量的CpG島。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和公共基因組注解努力還未顯示與這些基因座任何一個(gè)有關(guān)的基因。一個(gè)可能是Zrec標(biāo)記TIC未被識(shí)別的上游外顯子，其為一個(gè)在所有檢驗(yàn)組織中大量表達(dá)的非細(xì)胞因子基因(Tomas Klenka和MN，未公開(kāi)數(shù)據(jù))。
IL-1簇中的多態(tài)性標(biāo)記我們已經(jīng)將多態(tài)性定位在先前已經(jīng)描述的該區(qū)域中(通過(guò)圖17中的箭頭表示和在圖19中列出)。這允許我們重新評(píng)估前述不平衡數(shù)據(jù)(Cox等，1998)。我們的分析給出稍微更好的在圖譜距離和不平衡衰減之間的相關(guān)系數(shù)(數(shù)據(jù)未顯示)。
掃描IL-1簇另外的類IL-1基因我們研究在IL-1簇內(nèi)部是否存在另外的類IL-1序列。因?yàn)樗鼈冚^小的尺寸，該簇的基因組序列可經(jīng)受用BLAST算法(Altschul等，1997)的極低嚴(yán)謹(jǐn)性的搜索。以其缺省設(shè)置使用NCBI服務(wù)器的兩個(gè)序列的BLAST比較，除了將靈敏度升高至期望每個(gè)基因組5000次碰擊(hit)(其缺省值為10)。將單個(gè)外顯子的翻譯提交用于IL-1簇基因組序列的TBLASTN分析。該算法針對(duì)來(lái)自基因組序列片段的6個(gè)可能的閱讀框進(jìn)行編碼序列的搜索。我們假設(shè)外顯子結(jié)構(gòu)將是保守的，如果它們被終止密碼子中斷，匹配隨后折扣。
因?yàn)樗歉h(yuǎn)的相關(guān)序列之一，我們首先用IL1A的CE3搜索。這僅與其自身匹配。IL1B的CE3重現(xiàn)(return)除了IL1A外在IL-1簇上所有已知家族成員的CE3。發(fā)現(xiàn)一個(gè)連續(xù)碰擊，但它僅共有6個(gè)相同的推定殘基，長(zhǎng)于典型的CE3，并實(shí)際上位于IL1B的反方向。序列是折扣的(discounted)，因?yàn)闆](méi)有對(duì)應(yīng)的可能的上游CE2的證據(jù)。我們接下來(lái)用IL1F5的CE3搜索，其也重現(xiàn)除了IL1A以外的所有CE3。一條長(zhǎng)的可能的富含CpG的外顯子缺乏CE3的保守核心殘基。作為另外的異常值，我們使用IL18(登記號(hào)XM_041373)的CE3。這從IL-1簇重現(xiàn)IL1F5和無(wú)新序列。我們接下來(lái)檢驗(yàn)來(lái)自IL1A和IL1B的CE2(外顯子6)。前者僅重現(xiàn)自身，后者重現(xiàn)IL1F6，IL1F8，IL1F9和IL-10和無(wú)其它序列。IL1F5的CE2重現(xiàn)IL1RN，IL1F6，IL1F9和IL1F10，但無(wú)新的連續(xù)的外顯子。IL18的CE2無(wú)重現(xiàn)。最后測(cè)試IL1F9的CE2。它重現(xiàn)IL1F6，IL1F8，ILIRN，ILF10的CE2和無(wú)其它序列。我們得出結(jié)論在IL-1簇內(nèi)不存在另外的IL-1家族基因，除非它們具有高度發(fā)散的序列或者在具有更多分段的外顯子結(jié)構(gòu)方面不同于所有其它家族成員。
進(jìn)化考慮為了研究IL-1家族的種系發(fā)生，我們運(yùn)行程序Tree-Puzzle(Strimmer和yon Haesler，1996)對(duì)比圖2a所示的CE3。將IL-18設(shè)置為家族的外組(outgroup)成員。結(jié)果在圖3所示的輻射狀的系統(tǒng)樹(shù)(Page，1996)中顯現(xiàn)。
實(shí)施例2炎性基因和冠心病的病例-群組研究(社區(qū)動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)(Atherosclerosis Risk in Communities)(ARIC)計(jì)劃的子研究)ARIC是預(yù)期的群組研究，其設(shè)計(jì)來(lái)研究動(dòng)脈粥樣硬化的病因?qū)W和自然歷史，臨床動(dòng)脈粥樣硬化疾病的病因?qū)W，和隨種族，性別，地點(diǎn)和時(shí)間的心血管風(fēng)險(xiǎn)因子，醫(yī)療，疾病的變化。
ARIC群組由來(lái)自四個(gè)美國(guó)社區(qū)年齡基準(zhǔn)為45-64歲的15,792個(gè)個(gè)體的概率樣本組成。批準(zhǔn)ILGN對(duì)所有ARIC計(jì)劃參與者基因分型以適當(dāng)?shù)貪M足兩個(gè)合作的子研究的目的。在我們正在進(jìn)行的意外心血管事件的研究中，我們現(xiàn)在具有來(lái)自955個(gè)ARIC參與者的DNA樣品，所述參與者與隨機(jī)抽樣的群組對(duì)照組一起經(jīng)歷急性臨床事件。這些樣品代表在縱向監(jiān)控的開(kāi)始11年期間所有的意外心血管情形。最近完成所有樣品的基因分型，可獲得部分結(jié)果。這些結(jié)果證明對(duì)于總膽甾醇(TC)＜200mg/dl的受試者，臨床事件的風(fēng)險(xiǎn)與IL-1(+4845)等位基因2之間顯著相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵方面包括●+4845基因型顯著與臨床事件相關(guān)(存活率分析相對(duì)危險(xiǎn)性～4.0，p＜.01)●分析包括所有年齡●在多變量模型中，IL-1基因型發(fā)現(xiàn)與年齡，性別，吸煙，種族，糖尿病，高血壓，BMI，LDL，HDL無(wú)關(guān)
●TC＜200包括的受試者的數(shù)量為955基因座IL1A(+4845)，總膽甾醇＜200mg/dl層第一次急性冠狀動(dòng)脈病事件的時(shí)間在每個(gè)表中存在三個(gè)模型。第一個(gè)是僅具有基因型變量的原型。這通過(guò)調(diào)整欄中的“原型”識(shí)別。在調(diào)整欄中“組1”的模型對(duì)年齡，性別和種族/根源(center)調(diào)整。在調(diào)整欄中“組2”的那些對(duì)年齡，性別，種族/根源，現(xiàn)在吸煙者(是/否)，糖尿病(是/否)，高血壓(是/否)，LDL膽甾醇，和HDL膽甾醇。針對(duì)‘1.1’基線比較‘1.2’和‘2.2’。
針對(duì)‘1.1’和‘1.2’一起的基線比較‘2.2’
排除具有‘1.2’的受試者針對(duì)‘1.1’的基線比較‘2.2’
實(shí)施例3舊金山骨質(zhì)疏松癥骨折研究(SOF)在舊金山加州大學(xué)Steven Cummings博士指導(dǎo)下的多根源(multi-center)骨質(zhì)疏松癥骨折研究，由大群組的來(lái)自4個(gè)不同臨床中心的歐洲/白種人血統(tǒng)的婦女組成。自1986年始已經(jīng)檢查這些婦女各種醫(yī)學(xué)和生活方式發(fā)現(xiàn)，包括臀部，腕和脊柱骨折和腰椎和股頸中的骨礦物密度變化。在基線訪問(wèn)時(shí)(1986/1987)所有參與者(n＝9,704)65歲或更年長(zhǎng)，能走動(dòng)和未住院(not institionalized)。從約4,000名受試者收集血樣并保存在-70℃用于DNA分析。
最近的SOF群組死因分析確定IL-1A(4845)等位基因2與心血管病早期死亡顯著相關(guān)。
實(shí)施例4+4845IL-1SNP的功能分析+4845IL-1SNP是非同義的SNP(即天然存在的多態(tài)性，其改變氨基酸并導(dǎo)致IL-1a細(xì)胞因子中的氨基酸變化)。使用桿狀病毒載體(bacculoviral vector)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)變體蛋白質(zhì)，并分析結(jié)構(gòu)和功能差異。通過(guò)序列分析證實(shí)用于昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)的變體cDNA僅包含一個(gè)導(dǎo)致氨基酸變化的SNP。這里有2個(gè)與該SNP有關(guān)的數(shù)據(jù)。
在蛋白質(zhì)印跡分析中(參見(jiàn)圖12)，我們提供數(shù)據(jù)顯示IL-1a細(xì)胞因子的2個(gè)變體被鈣蛋白酶消化而不同地加工。鈣蛋白酶是已知切割全長(zhǎng)IL-1a細(xì)胞因子(31kDa)以形成成熟蛋白質(zhì)(17kDa)的酶。等位基因-1(Ala)IL-1a細(xì)胞因子產(chǎn)生單個(gè)17kDa的分子，而等位基因-2(Ser)IL-1a細(xì)胞因子產(chǎn)生2條帶，一條大小與等位基因-1發(fā)現(xiàn)的條帶相同，但另外它還產(chǎn)生分子量稍微更大的另一條帶。該結(jié)果顯示在2個(gè)變體中存在結(jié)構(gòu)差異。我們還假定Ala至Ser的突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不同的翻譯后修飾，例如，磷酸化或肉豆蔻酸化(myristolation)的差異。該氨基酸變化可以導(dǎo)致翻譯后修飾的識(shí)別信號(hào)改變(增加或去除)。
發(fā)現(xiàn)用表達(dá)載體中的ala和ser變體cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞具有不同的增殖速率。等位基因-2變體具有比等位基因-1變體更快的生長(zhǎng)速率，這支持我們的主張即等位基因-2預(yù)示促炎特性(profile)。(參見(jiàn)圖13)。因此，在等位基因-2變體中改變的氨基酸顯示比等位基因-1變體更有效的促炎細(xì)胞因子的證據(jù)。
實(shí)施例5IL-1A，IL-1B和IL-1RN SNP的系統(tǒng)功能分析在本實(shí)施例中，在非“野生型”IL-1序列的背景中構(gòu)建所選IL-1A，IL-1B，和IL-1RN多態(tài)性，在成纖維細(xì)胞系中測(cè)量效果。
通過(guò)報(bào)告基因-啟動(dòng)子構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄分析IL-1A，IL-1B，IL-1RN基因啟動(dòng)子SNP。每個(gè)基因的數(shù)據(jù)在分開(kāi)的圖中(即分別為圖14，15和16)。圖14，15，和16圖片A(和圖15D)顯示SNP和不同的等位基因-2突變，其在分開(kāi)的熒光素酶構(gòu)建體和還有不同長(zhǎng)度的用轉(zhuǎn)染分析中研究的SNP注釋的啟動(dòng)子-熒光素酶構(gòu)建體中產(chǎn)生。另外，我們還提供僅關(guān)于功能SNP的熒光素測(cè)定結(jié)果，其顯示相對(duì)于野生型(在所有基因座的等位基因-1)改變的基因轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)于B基因，我們也提供關(guān)于骨架中功能SNP的數(shù)據(jù)，其中SNP#14(-511)和SNP#2(-31)也為等位基因-2。
注意這些構(gòu)建體在成纖維細(xì)胞系(即WI38-其模擬IL-1在炎性應(yīng)答中的特殊作用)中測(cè)試。因此，將特別地檢測(cè)其它模擬IL-1-介導(dǎo)的炎性疾病和病癥其它機(jī)制方面的細(xì)胞系。例如人細(xì)胞單核細(xì)胞系(例如U937)和人karatinocyte細(xì)胞系(例如A143)和在人成骨細(xì)胞系中(例如以研究對(duì)骨質(zhì)疏松癥IL-1炎性過(guò)程的影響。
實(shí)施例6IL-1基因簇SNP的注釋我們已經(jīng)進(jìn)一步在整個(gè)IL-1基因簇中注釋多態(tài)性(參見(jiàn)圖8-11)。因?yàn)檫@些多態(tài)性在如本文支持的確定的IL-1單倍型內(nèi)存在(參見(jiàn)圖1-7)，它們提供在本申請(qǐng)中支持的組合物和方法。
等價(jià)物和通過(guò)參考結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或者能夠使用僅僅常規(guī)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，本文所述的具體多肽，核酸，方法，測(cè)定和試劑的許多等價(jià)物。這些等價(jià)物被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)并為下面的權(quán)利要求所覆蓋。
本申請(qǐng)包括許多已知文本的引用，公開(kāi)文章和專利申請(qǐng)以及授權(quán)的美國(guó)和外國(guó)專利。所有這些引用的完整內(nèi)容由此結(jié)合于此作為參考。
權(quán)利要求
1.一種用于確定受試者是否患有或傾向于發(fā)展與IL-1炎性單倍型有關(guān)的疾病或癥狀的方法，其包含檢測(cè)如圖1，2A，2B，7A或7B中任何一個(gè)所示的IL-1等位基因。
2.權(quán)利要求1的方法，其中檢測(cè)至少兩個(gè)包含在圖1，2A，2B，7A或7B中任何一個(gè)的等位基因。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述兩個(gè)等位基因具有至少0.5的連鎖不平衡值(D’)。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述兩個(gè)等位基因具有至少0.6的連鎖不平衡值(D’)。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述兩個(gè)等位基因具有至少0.6的連鎖不平衡值(D’)。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述兩個(gè)等位基因具有至少0.7的連鎖不平衡值(D’)。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所述兩個(gè)等位基因具有至少0.8的連鎖不平衡值(D’)。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述兩個(gè)等位基因具有至少0.9的連鎖不平衡值(D’)。
9.一種用于確定受試者是否患有或傾向于發(fā)展與IL-1炎性單倍型表型有關(guān)的疾病或癥狀的方法，其包含檢測(cè)如圖3A，3B，4A，4B，5A，5B，6A，或6B中任何一個(gè)所示的IL-1單倍型的特征型式。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述IL-1單倍型包含如圖3A和3B所示的hap1型式。
11.權(quán)利要求9的方法，其包含檢測(cè)hap1型式T_T_C/2_2_1的三個(gè)等位基因。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述IL-1單倍型包含如圖4A和4B所示的hap2型式。
13.權(quán)利要求9的方法，其包含檢測(cè)hap2型式G_C_T/1_1_2的三個(gè)等位基因。
14.權(quán)利要求9的方法，其中所述IL-1單倍型包含如圖5A和5B所示的hap3型式。
15.權(quán)利要求9的方法，其包含檢測(cè)hap3型式G_C_C/1_1_1的三個(gè)等位基因。
16.權(quán)利要求9的方法，其中所述IL-1單倍型包含如圖6A和6B所示的hap4型式。
17.權(quán)利要求9的方法，其包含檢測(cè)hap4型式C_C_C/1_1_1的三個(gè)等位基因。
18.用于檢測(cè)IL-1多態(tài)性的IL-1多核苷酸序列，其包含如圖8，9，10A，10B或11中任何一個(gè)所示SNP序列的至少12個(gè)連續(xù)核苷酸的新核酸，或其互補(bǔ)序列。
19.權(quán)利要求18的IL-1多核苷酸序列，其中所述新核酸序列包含如圖8，9，10A，10B或11中任何一個(gè)所示SNP序列的至少14個(gè)連續(xù)核苷酸，或其互補(bǔ)序列。
20.權(quán)利要求18的IL-1多核苷酸序列，其中所述新核酸序列包含如圖8，9，10A，10B或11中任何一個(gè)所示SNP序列的至少17個(gè)連續(xù)核苷酸，或其互補(bǔ)序列。
21.權(quán)利要求18，19或20中任何一項(xiàng)的IL-1多核苷酸序列，其中所述SNP序列是IL-1A SNP，其選自由以下各項(xiàng)組成的組IL-1A SNP #1；IL-1A SNP #2；IL-1A SNP #3；IL-1A SNP #4；IL-1A SNP #9；IL-1A SNP #10；IL-1A SNP #11；IL-1A SNP #14；IL-1A SNP #15；IL-1A SNP #16；IL-1A SNP#19；IL-1A SNP #24；IL-1A SNP #25IL-1A SNP#；IL-1A SNP #30；IL-1ASNP #31；IL-1A SNP #33；和IL-1A SNP #34。
22.權(quán)利要求18，19或20中任何一項(xiàng)的IL-1多核苷酸序列，其中所述SNP序列是IL-1B SNP，其選自由以下各項(xiàng)組成的組IL-1B SNP #1；IL-1B SNP #2；IL-1B SNP #3；IL-1B SNP #4；IL-1B SNP #5；IL-1B SNP #6；IL-1B SNP #7；IL-1B SNP #8；IL-1B SNP #9；IL-1B SNP #17；IL-1B SNP #19；IL-1B SNP #35；和IL-1B SNP #38。
23.權(quán)利要求18，19或20中任何一項(xiàng)的IL-1多核苷酸序列，其中所述SNP序列是IL-1RNic SNP，其選自由以下各項(xiàng)組成的組IL-1RNic SNP#14；IL-1RNic SNP #14；IL-1RNic SNP #18；IL-1RNic SNP #21；IL-1RNicSNP #22；IL-1RNic SNP #26；IL-1RNic SNP #29；IL-1RNic SNP #30；IL-1RNic SNP #31；IL-1RNic SNP #32；IL-1RNic SNP #33；IL-1RNic SNP#34；IL-1RNic SNP #35；IL-1RNic SNP #36；IL-1RNic SNP #37；IL-1RNicSNP #38；IL-1RNic SNP #40；IL-1RNic SNP #42；43；IL-1RNic SNP #65；IL-1RNic SNP #67；IL-1RNic SNP#；68；和IL-1RNic SNP #82。
24.權(quán)利要求18，19或20中任何一項(xiàng)的IL-1多核苷酸序列，其中所述SNP序列是IL-1RNsec SNP，其選自由以下各項(xiàng)組成的組IL-1RNsecSNP #67；IL-1RNsec SNP #68；IL-1RNsec SNP #82；和IL-1RNsec SNP #93。
25.一種用于IL-1基因分型的試劑盒，其包含至少兩個(gè)權(quán)利要求18，19或20中任何一項(xiàng)的多核苷酸。
26.一種用于IL-1基因分型的試劑盒，其包含至少兩個(gè)多核苷酸，該多核苷酸是至少12個(gè)連續(xù)的選自由以下各項(xiàng)組成的組的核苷酸IL-1ASNP #1；IL-1A SNP #2；IL-1A SNP #3；IL-1A SNP #4；IL-1A SNP #9；IL-1ASNP #10；IL-1A SNP #11；IL-1A SNP #14；IL-1A SNP #15；IL-1A SNP #16；IL-1A SNP #19；IL-1A SNP #24；IL-1A SNP #25IL-1A SNP#；IL-1A SNP #30；IL-1A SNP #31；IL-1A SNP #33；和IL-1A SNP #34；IL-1B SNP #1；IL-1BSNP #2；IL-1B SNP #3；IL-1B SNP #4；IL-1B SNP #5；IL-1B SNP #6；IL-1BSNP #7；IL-1B SNP #8；IL-1B SNP #9；IL-1B SNP #17；IL-1B SNP #19；IL-1B SNP #35；和IL-1B SNP #38；IL-1RNic SNP #14；IL-1RNic SNP #14；IL-1RNic SNP #18；IL-1RNic SNP #21；IL-1RNic SNP #22；IL-1RNic SNP#26；IL-1RNic SNP #29；IL-1RNic SNP #30；IL-1RNic SNP #31；IL-1RNicSNP #32；IL-1RNic SNP #33；IL-1RNic SNP #34；IL-1RNic SNP #35；IL-1RNic SNP #36；IL-1RNic SNP #37；IL-1RNic SNP #38；IL-1RNic SNP#40；IL-1RNic SNP #42；43；IL-1RNic SNP #65；IL-1RNic SNP #67；IL-1RNic SNP#；68；IL-1RNic SNP #82；IL-1RNsec SNP #67；IL-1RNsecSNP #68；IL-1RNsec SNP #82；和IL-1RNsec SNP #93。
27.一種為個(gè)體選擇適當(dāng)治療劑的方法，所述個(gè)體患有或傾向于發(fā)展與IL-1多態(tài)性有關(guān)的疾病或癥狀，該方法包含以下步驟通過(guò)檢測(cè)如圖1，2A，2B，7A或7B中任何一個(gè)所示的IL-1等位基因檢測(cè)IL-1炎性單倍型；和選擇補(bǔ)償所檢測(cè)的IL-1炎性單倍型的治療劑。
28.權(quán)利要求27的方法，其中檢測(cè)檢測(cè)至少兩個(gè)包含在圖1，2A，2B，7A或7B中任何一個(gè)的等位基因。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述兩個(gè)等位基因具有至少0.5的連鎖不平衡值(D’)。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述兩個(gè)等位基因具有至少0.6的連鎖不平衡值(D’)。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述兩個(gè)等位基因具有至少0.6的連鎖不平衡值(D’)。
32.權(quán)利要求28的方法，其中所述兩個(gè)等位基因具有至少0.7的連鎖不平衡值(D’)。
33.權(quán)利要求28的方法，其中所述兩個(gè)等位基因具有至少0.8的連鎖不平衡值(D’)。
34.權(quán)利要求28的方法，其中所述兩個(gè)等位基因具有至少0.9的連鎖不平衡值(D’)。
35.權(quán)利要求27的方法，其包含檢測(cè)hap1 IL-1單倍型。
36.一種確定特定治療劑在治療具有炎性疾病表型的個(gè)體中是否有效的方法，其包含通過(guò)檢測(cè)如圖1，2A，2B，7A或7B中任何一個(gè)所示的IL-1等位基因檢測(cè)IL-1單倍型；檢測(cè)個(gè)體中的炎性表型；用所述治療劑治療該個(gè)體；和確定該個(gè)體中的炎性表型是否被所述治療劑消除或減輕，其中，如果該個(gè)體的炎性表型被所述治療劑消除或減輕，那么所述治療劑在治療具有所檢測(cè)的IL-1單倍型的個(gè)體中有效。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述治療劑是營(yíng)養(yǎng)物。
38.權(quán)利要求36或37的方法，其中所述IL-1單倍型選自由hap1，hap2，hap3和hap4組成的組。
39.權(quán)利要求38的方法，其中檢測(cè)至少一個(gè)選自由以下各項(xiàng)組成的組的IL-1等位基因IL-1A SNP #1；IL-1A SNP #2；IL-1A SNP #3；IL-1A SNP#4；IL-1A SNP #9；IL-1A SNP #10；IL-1A SNP #11；IL-1A SNP #14；IL-1ASNP #15；IL-1A SNP #16；IL-1A SNP #19；IL-1A SNP #24；IL-1A SNP #25IL-1A SNP #；IL-1A SNP #30；IL-1A SNP #31；IL-1A SNP #33；和IL-1ASNP #34；IL-1B SNP #1；IL-1B SNP #2；IL-1B SNP #3；IL-1B SNP #4；IL-1BSNP #5；IL-1B SNP #6；IL-1B SNP #7；IL-1B SNP #8；IL-1B SNP #9；IL-1BSNP #17；IL-1B SNP #19；IL-1B SNP #35；和IL-1B SNP #38；IL-1RNic SNP#14；IL-1RNic SNP #14；IL-1RNic SNP #18；IL-1RNic SNP #21；IL-1RNicSNP #22；IL-1RNic SNP #26；IL-1RNic SNP #29；IL-1RNic SNP #30；IL-1RNic SNP #31；IL-1RNic SNP #32；IL-1RNic SNP #33；IL-1RNic SNP#34；IL-1RNic SNP #35；IL-1RNic SNP #36；IL-1RNic SNP #37；IL-1RNicSNP #38；IL-1RNic SNP #40；IL-1RNic SNP #42；43；IL-1RNic SNP #65；IL-1RNic SNP #67；IL-1RNic SNP#；68；和IL-1RNic SNP #82；IL-1RNsecSNP #67；IL-1RNsec SNP #68；IL-1RNsec SNP #82；和IL-1RNsec SNP #93；IL-1A SNP #1；IL-1A SNP #2；IL-1A SNP #3；IL-1A SNP #4；IL-1A SNP #9；IL-1A SNP #10；IL-1A SNP #11；IL-1A SNP #14；IL-1A SNP #15；IL-1A SNP#16；IL-1A SNP #19；IL-1A SNP #24；IL-1A SNP #25 IL-1A SNP#；IL-1ASNP #30；IL-1A SNP #31；IL-1A SNP #33；IL-1A SNP #34；IL-1B SNP #1；IL-1B SNP #2；IL-1B SNP #3；IL-1B SNP #4；IL-1B SNP #5；IL-1B SNP #6；IL-1B SNP #7；IL-1B SNP #8；IL-1B SNP #9；IL-1B SNP #17；IL-1B SNP #19；IL-1B SNP #35；IL-1B SNP #38；IL-1RNic SNP #14；IL-1RNic SNP #14；IL-1RNic SNP #18；IL-1RNic SNP #21；IL-1RNic SNP #22；IL-1RNic SNP#26；IL-1RNic SNP #；29；IL-1RNic SNP #30；IL-1RNic SNP #；31；IL-1RNicSNP #32；IL-1RNic SNP #33；IL-1RNic SNP #34；IL-1RNic SNP #35；IL-1RNic SNP #36；IL-1RNic SNP #37；IL-1RNic SNP #38；IL-1RNic SNP#40；IL-1RNic SNP #42；43；IL-1RNic SNP #65；IL-1RNic SNP #67；IL-1RNic SNP#；68；IL-1RNic SNP #82；IL-1RNsec SNP #67；IL-1RNsecSNP #68；IL-1RNsec SNP #82；和IL-1RNsec SNP #93。
全文摘要
本發(fā)明提供涉及鑒定和使用來(lái)自IL－1基因簇的遺傳信息的方法和組合物，所述遺傳信息包括在IL－1的基因座中發(fā)現(xiàn)的新的類IL－1基因的結(jié)構(gòu)和組構(gòu)以及這些基因內(nèi)部的多態(tài)性和相關(guān)的單倍型。本發(fā)明由此擴(kuò)展了從IL－1基因座可獲得的有用遺傳信息的所有組成部分，其包含先前鑒定的IL－1α，IL－1β和IL－1RN基因，用于預(yù)測(cè)IL－1相關(guān)表型(例如增加或減小的炎性疾病的風(fēng)險(xiǎn))和用于治療I1－1單倍型相關(guān)的炎性表型。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1751127SQ03806113
公開(kāi)日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2003年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月25日
發(fā)明者馬丁·尼克林, 戈登·達(dá)夫, 肯尼思·科恩曼, 馬里亞姆·拉菲·科爾平, 謝忠明, 拉朱·戈文達(dá)拉朱, 納茲尼恩·阿齊茲, 克里斯·坎寧 申請(qǐng)人:白介素遺傳公司