專利名稱：一種分級結(jié)構(gòu)微載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分析材料領(lǐng)域，特別是涉及一種分級結(jié)構(gòu)微載體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自Willhelm Roux于1885年從雞胚中分離細(xì)胞首次建立體外細(xì)胞培養(yǎng)，單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已有百余年的歷史。傳統(tǒng)的單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)指的是適用于大多數(shù)貼壁依賴性細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，這類細(xì)胞需要附著于帶適量正電荷的固體或者半固體表面上生長。其主要是通過一些傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶、多層平板進(jìn)行培養(yǎng)，但操作比較繁瑣，貼附面積有限，傳質(zhì)和傳氧差，在實(shí)際生產(chǎn)使用中受到極大的限制。近年來，體外三維細(xì)胞培養(yǎng)的研究已受到了人們廣泛的關(guān)注，三維細(xì)胞培養(yǎng)是指將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長，構(gòu)成三維的細(xì)胞-載體復(fù)合物。與傳統(tǒng)的二維-單層細(xì)胞培養(yǎng)相比，三維細(xì)胞培養(yǎng)中的藥物、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體擴(kuò)散屬性更接近于活體組織。目前細(xì)胞三維培養(yǎng)已廣泛用于基礎(chǔ)生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究，它的主要優(yōu)點(diǎn)是具有良好的結(jié)構(gòu)，能直接反映結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，細(xì)胞的形態(tài)和微環(huán)境更接近體內(nèi)的狀態(tài)，而且可以與相鄰的細(xì)胞建立更為緊密的聯(lián)系。

很多天然材料已被用來制成細(xì)胞微載體并已成功地商業(yè)化，現(xiàn)有技術(shù)中大多利用球形微載體培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞一般是生長在微載體的表面上，細(xì)胞在大規(guī)模攪拌懸浮培養(yǎng)時(shí)很容易受到巨大的剪切力而發(fā)生破損。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種分級結(jié)構(gòu)微載體，該載體為分級結(jié)構(gòu)，能夠能較好地維持細(xì)胞形態(tài)，降低成本，還能提高培養(yǎng)效率。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種分級結(jié)構(gòu)微載體，所述分級結(jié)構(gòu)微載體包括一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)，所述一級結(jié)構(gòu)為利用單乳液微流體制備出的小液滴，所述小液滴尺寸為5-10 μ m ;所述二級結(jié)構(gòu)為通過雙乳液微流體內(nèi)相生成的大液滴，所述大液滴尺寸為200-500 μ m。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述分級結(jié)構(gòu)微載體為油溶性微載體，生成所述油溶性微載體的一級結(jié)構(gòu)的單乳液微流控裝置為水包油(W/0)型，生成所述油溶性微載體的二級結(jié)構(gòu)的雙乳液微流 控裝置為水包油包水(W/0/W)型。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述分級結(jié)構(gòu)微載體為水溶性微載體，形成所述水溶性微載體的一級結(jié)構(gòu)的單乳液微流控裝置為油包水(0/W)型，形成所述水溶性微載體的二級結(jié)構(gòu)的雙乳液微流控裝置為油包水包油(0/W/0)。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述分級結(jié)構(gòu)微載體選自聚二甲基硅氧烷或乙氧基
化三羥甲基丙烷三丙烯酸酯。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述分級結(jié)構(gòu)微載體選自膠原、殼聚糖、海藻酸隹丐、瓊脂糖、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺中的一種或多種。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述分級結(jié)構(gòu)微載體的二級結(jié)構(gòu)為單囊或多囊。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的另一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種制備分級結(jié)構(gòu)微載體的方法，包括以下步驟:
首次，微載體一級結(jié)構(gòu)的制備:根據(jù)微載體性質(zhì)，對微流控裝置管道進(jìn)行親疏水性修飾，組裝合適的單乳液微流控裝置，配制互不相溶的分散相和連續(xù)相溶液，生成含有小尺寸液滴的乳液；
其次，微載體二級結(jié)構(gòu)的制備:組裝合適的雙乳液微流控裝置，以包含一級結(jié)構(gòu)的乳液作為中間相溶液，配制與之互不相溶的內(nèi)外相I溶液，通過調(diào)節(jié)各相溶液的流速，生成包裹若干大尺寸內(nèi)囊且同時(shí)含有一級結(jié)構(gòu)的液滴·；
再次，固化液滴，清洗后，即可獲得具有分級結(jié)構(gòu)的微載體。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述微流控裝置選自協(xié)流式或匯聚式微流控裝置，所述微流控裝置的管道材料選用二氧化硅、特氟龍、聚二甲基硅氧烷中的一種或多種。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述親疏水修飾為在表面修飾上羥基或氨基；所述疏水性修飾為在表面修飾上長鏈烷烴。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的另一個(gè)技術(shù)方案是:所述分級結(jié)構(gòu)微載體在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的另一個(gè)技術(shù)方案是:所述的分級結(jié)構(gòu)微載體在蛋白質(zhì)、核酸或細(xì)胞的多元檢測技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明將微載體制備成多孔結(jié)構(gòu)，細(xì)胞便可進(jìn)入微載體孔內(nèi)粘附生長，即可以保護(hù)細(xì)胞免受攪拌剪切力的傷害，又可以增加細(xì)胞粘附的表面積，能夠能較好地維持細(xì)胞形態(tài)，降低成本，還能提高培養(yǎng)效率。


圖1是本發(fā)明分級結(jié)構(gòu)微載體及制備方法的示意 圖2是本發(fā)明為制備分級結(jié)構(gòu)微載體二級結(jié)構(gòu)的乳液示意 圖3是本發(fā)明雙乳液微流體裝置示意 圖4是本發(fā)明分級結(jié)構(gòu)微載體示意 附圖中各部件的標(biāo)記如下:1、外相；2、內(nèi)相；3、中間相；5、一級結(jié)構(gòu)；6、二級結(jié)構(gòu)。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。請參閱圖1-4，本發(fā)明實(shí)施例提供如下技術(shù)方案
在一個(gè)實(shí)施例中，提供一種分級結(jié)構(gòu)微載體，所述分級結(jié)構(gòu)微載體包括一級結(jié)構(gòu)5和二級結(jié)構(gòu)6，所述一級結(jié)構(gòu)5為利用單乳液微流體制備出的小液滴，所述小液滴尺寸為5-10 μ m ;所述二級結(jié)構(gòu)6為通過雙乳液微流體內(nèi)相2生成的大液滴,所述大液滴尺寸為200-500 μ mD優(yōu)選的，所述分級結(jié)構(gòu)微載體為油溶性微載體，生成所述油溶性微載體的一級結(jié)構(gòu)5的單乳液微流控裝置為水包油(W/0)型，生成所述油溶性微載體的二級結(jié)構(gòu)6的雙乳液微流控裝置為水包油包水(W/0/W)型。優(yōu)選的，所述分級結(jié)構(gòu)微載體為水溶性微載體，形成所述水溶性微載體的一級結(jié)構(gòu)5的單乳液微流控裝置為油包水(0/W)型，形成所述水溶性微載體的二級結(jié)構(gòu)6的雙乳液微流控裝置為油包水包油(0/W/0)。優(yōu)選的，所述分級結(jié)構(gòu)微載體選自聚二甲基硅氧烷或乙氧基化三羥甲基丙烷三丙稀Ife酷。優(yōu)選的，所述分級結(jié)構(gòu)微載體選自膠原、殼聚糖、海藻酸鈣、瓊脂糖、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺中的一種或多種。優(yōu)選的，所述分級結(jié)構(gòu)微載體的二級結(jié)構(gòu)6為單囊或多囊。在另一個(gè)實(shí)施例中，提供一種制備分級結(jié)構(gòu)微載體的方法，包括以下步驟:
首先，微載體一級結(jié)構(gòu)5的制備:根據(jù)微載體性質(zhì)，對微流控裝置管道進(jìn)行親疏水性修飾，組裝合適的單乳液微流控裝置，配制互不相溶的分散相和連續(xù)相溶液，生成含有小尺寸液滴的乳液；
其次，微載體二級結(jié)構(gòu)6的制備:組裝合適的雙乳液微流控裝置，以包含一級結(jié)構(gòu)的乳液作為中間相3溶液，配制與之互不相溶的內(nèi)外相I溶液，通過調(diào)節(jié)各相溶液的流速，生成包裹若干大尺寸內(nèi)囊且同時(shí)含有一級結(jié)構(gòu)的液滴。再次，固化液滴，清洗后 ，即可獲得具有分級結(jié)構(gòu)的微載體。。優(yōu)選的，所述微流控裝置選自協(xié)流式或匯聚式微流控裝置，所述微流控裝置的管道材料選用二氧化硅、特氟龍、聚二甲基硅氧烷中的一種或多種。優(yōu)選的，所述親疏水修飾為在表面修飾上羥基或氨基；所述疏水性修飾為在表面修飾上長鏈烷烴。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，所述分級結(jié)構(gòu)微載體在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，所述的分級結(jié)構(gòu)微載體在蛋白質(zhì)、核酸或細(xì)胞的多元檢測技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。所述分級結(jié)構(gòu)微載體的各級結(jié)構(gòu)都是通過微流體的方法制備而成的；通過微流體制備所述具有分級結(jié)構(gòu)的微載體的方法如下:首先利用單乳液的三維微流控裝置生成含有小尺寸單分散液滴的乳液，一級結(jié)構(gòu)5即為小尺寸液滴,然后將含有小尺寸液滴的乳液作為雙乳液微流控裝置的中間相3溶液，二級結(jié)構(gòu)6即為雙乳液微流體內(nèi)相2生成的大尺寸液滴，由此固化后形成具有分級結(jié)構(gòu)的微載體。本發(fā)明首先通過單乳液微流體制備出含有許多單分散小尺寸液滴的乳液，然后將此乳液作為雙乳液微流體的中間相3溶液，通過雙乳液間的剪切作用以及各相溶液流速的控制，形成包裹了若干個(gè)大尺寸內(nèi)囊(二級結(jié)構(gòu)6)的微載體，這些微載體中同時(shí)還含有許多作為一級結(jié)構(gòu)5的小尺寸液滴。這樣具有分級結(jié)構(gòu)的微載體是一種能符合細(xì)胞培養(yǎng)，蛋白質(zhì)，核酸以及細(xì)胞多元檢測等要求的復(fù)合微載體。本發(fā)明設(shè)計(jì)組裝合適的單乳液微流控裝置，形成許多單分散的小尺寸液滴，然后此乳液作為雙乳液微流體的中間相3溶液，通過調(diào)節(jié)各相溶液的流速，生成包含若干個(gè)大尺寸內(nèi)囊的液滴，同時(shí)含有許多小尺寸內(nèi)囊。固化清洗后，即可形成符合細(xì)胞培養(yǎng)以及蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞檢測等要求的聚合物微載體。
本發(fā)明分級結(jié)構(gòu)微載體及其制備方法包括設(shè)計(jì)組裝合適的單乳液微流控裝置，生成包含許多單分散小尺寸液滴的乳液，以此作為雙乳液微流體的中間相3溶液，利用各相溶液之間的剪切作用和各相溶液流速的控制，生成包含若干個(gè)大尺寸內(nèi)囊的液滴，這些液滴內(nèi)同時(shí)含有小尺寸內(nèi)囊，固化液滴，清洗后即可得到具有分級結(jié)構(gòu)的微載體，該微載體能符合細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞等多元檢測的要求。分級結(jié)構(gòu)微載體及其制備方法，應(yīng)根據(jù)微載體的性質(zhì)，選擇相應(yīng)的微流體?？蔀橛腿苄晕⑤d體，選擇水包油(w/0)單乳液微流體生成一級結(jié)構(gòu)5，選擇水包油包水(W/0/W)雙乳液微流體形成二級結(jié)構(gòu)6。也可為水溶性微載體，應(yīng)選擇對應(yīng)相反的微流體。該具有分級結(jié)構(gòu)的微載體具有一定的生物學(xué)應(yīng)用。通過調(diào)節(jié)制備一級結(jié)構(gòu)5和二級結(jié)構(gòu)6微流體各相溶液的流速，可控制其在固化后形成大小不一的貫穿多孔分級結(jié)構(gòu)，這樣的分級微載體可用于細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞的多元檢測中。微載體大小不一的多孔結(jié)構(gòu)可以粘附細(xì)胞或固定生物分子，便于結(jié)合、反應(yīng)或進(jìn)一步的檢測。具有分級結(jié)構(gòu)的微載體在進(jìn)行生物學(xué)應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞可以通過其大小不一的孔洞進(jìn)入微載體內(nèi)部，大尺寸孔洞可以作為細(xì)胞粘附、生長和增殖的支架，小尺寸孔洞可以為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣，由此，該具有分級結(jié)構(gòu)的微載體可以成為一種優(yōu)良的細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。本發(fā)明分級結(jié)構(gòu)微載體及其制備方法，由于其可通過微流體準(zhǔn)確的調(diào)節(jié)各相流速，控制生成小尺寸及大尺寸內(nèi)囊的大小和數(shù)量，因此能制備出具有分級結(jié)構(gòu)的微載體，并在固化后形成具有大小不一的貫穿多孔微載體。在生物學(xué)應(yīng)用中，一般的球載體培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞通常是生長在微載體的表面，呈單層生長，細(xì)胞易受攪拌懸浮培養(yǎng)時(shí)巨大的剪切力而發(fā)生破損。而利用具有分級結(jié)構(gòu)的微載體培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞可以通過其大小不一的內(nèi)囊進(jìn)入微載體內(nèi)部，大尺寸內(nèi)囊可以作為細(xì)胞粘附、生長和增殖的支架，小尺寸內(nèi)囊可以為細(xì)胞提供氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)，如此可以實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞的懸浮化大規(guī)模培養(yǎng)，并且在大尺寸內(nèi)囊中細(xì)胞有生成團(tuán)聚體的機(jī)會(huì)，因此，這種具有分級結(jié)構(gòu)的微載體可成為一種優(yōu)良的細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。本發(fā)明分級結(jié)構(gòu)微載體是通過微流體技術(shù)制備而成的，其材料本身選擇范圍廣，可以選擇易獲得、生物相容性良好的天然材料，也可選擇易合成、可控性強(qiáng)的人工合成材料。由于微流體技術(shù)的高 度可控性，能夠制備出具有分級結(jié)構(gòu)的微載體，在固化后形成大小不一的貫穿多孔結(jié)構(gòu)，可作為一種優(yōu)良的細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。同時(shí)，這種微載體還能夠通過一些物理或化學(xué)方法對其表面進(jìn)行改性，不僅可更好的適用于生物分析，還適用于蛋白質(zhì)、核酸或細(xì)胞的多元檢測等領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。實(shí)施例1乙氧基化三羥甲基丙烷三丙烯酸酯(ETPTA)分級結(jié)構(gòu)微載體的制備:
1.ETPTA微載體一級結(jié)構(gòu)5的制備:選擇W/，單乳液玻璃毛細(xì)管微流控裝置，用十八
烷基三甲氧基硅烷的2%-10%丙酮溶液對外相I玻璃毛細(xì)管作疏水處理。利用玻璃毛細(xì)管、載玻片、蓋玻片、點(diǎn)樣針頭和速干膠組裝玻璃毛細(xì)管微流控芯片。內(nèi)相2為2wt%的F108溶液，外相I為含有1%光引發(fā)劑的ETPTA溶液。將裝有兩相溶液的注射器連接至微流控芯片上相應(yīng)的玻璃毛細(xì)管通道。調(diào)節(jié)好兩相流速，生成含有5-10 μ m小水滴的ETPTA乳液，收集保存。2.ETPTA微載體二級結(jié)構(gòu)6的制備:選擇W/0/W型的雙乳液玻璃微流控裝置，對中間相3毛細(xì)管作疏水處理，用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的2%-10%乙醇溶液進(jìn)行對外相I毛細(xì)管作親水處理。內(nèi)相2為2wt%的F108溶液，中間相3為含有許多5_10 μ m小水滴的ETPTA乳液，外相I為2wt%PVA和2%wt F108以1:1體積比的混合溶液。微流控裝置用黑膠帶或錫紙將芯片和所有通中間相3ETPTA的管道和注射器包裹起來，防止紫外固化時(shí)，堵塞裝置。將裝有各相溶液的注射器連接至微流控芯片上相應(yīng)的玻璃毛細(xì)管通道。調(diào)節(jié)三相流速，至微流體能穩(wěn)定生成包裹若干個(gè)大尺寸內(nèi)囊，且同時(shí)含有許多小水滴的ETPTA液滴。3.ETPTA分級結(jié)構(gòu)微載體的制備:在收集管末端放置收集容器，其中預(yù)先放入外相I溶液，并使收集管末端浸入液面以下，在實(shí)驗(yàn)人員穿戴好紫外光防護(hù)用品后，打開紫外光點(diǎn)固化系統(tǒng)光源，照射收集管?？梢愿鶕?jù)需要調(diào)整紫外光的強(qiáng)度與照射距離，以使收集的載體完全固化。收集到的ETPTA分級結(jié)構(gòu)微載體利用純水、乙醇多次清洗后保存。實(shí)施例2聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)分級結(jié)構(gòu)微載體的制備:
1.PEGDA微載體一級結(jié)構(gòu)5的制備:選擇0/W單乳液玻璃毛細(xì)管微流控裝置，利用玻璃毛細(xì)管、載玻片、蓋玻片、點(diǎn)樣針頭和速干膠組裝玻璃毛細(xì)管微流控芯片。內(nèi)相2為粘度較低的KF-96 (0.65CST)與表面活性劑KF6015的混合溶液，外相I為含有1%光引發(fā)劑的PEGDA水凝膠聚合前體溶液。將裝有兩相溶液的注射器連接至微流控芯片上相應(yīng)的玻璃毛細(xì)管通道。調(diào)節(jié)好兩相流 速，生成含有5-10 μ m小油滴的PEGDA乳液，收集保存。2.PEGDA微載體二級結(jié)構(gòu)的制備:選擇0/W/0型的雙乳液玻璃微流控裝置，用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的2%-10%乙醇溶液進(jìn)行對中間相3毛細(xì)管作親水處理，十八烷基三甲氧基硅烷的2%-10%丙酮溶液對外相I毛細(xì)管進(jìn)行疏水處理。內(nèi)相2為粘度較低的KF-96 (0.65CST)與表面活性劑KF6015的混合溶液；中間相3為含有5_10 μ m小油滴的PEGDA水凝膠聚合前體溶液；外相I為粘度較高的KF-96 (50CST)和表面活性劑KF6011的混合溶液。微流控裝置用黑膠帶或錫紙將芯片和所有通中間相3PEGDA的管道和注射器包裹起來，防止紫外固化時(shí)，堵塞裝置。將裝有各相溶液的注射器連接至微流控芯片上相應(yīng)的玻璃毛細(xì)管通道。調(diào)節(jié)三相流速，至微流體能穩(wěn)定生成包裹若干個(gè)大尺寸內(nèi)囊，且同時(shí)含有許多小油滴的PEGDA液滴。3.PEGDA分級結(jié)構(gòu)微載體的制備:在收集管末端放置收集容器，其中預(yù)先放入外相I溶液，并使收集管末端浸入液面以下，在實(shí)驗(yàn)人員穿戴好紫外光防護(hù)用品后，打開紫外光點(diǎn)固化系統(tǒng)光源，照射收集管?？梢愿鶕?jù)需要調(diào)整紫外光的強(qiáng)度與照射距離，以使收集的載體完全固化。收集到的PEGDA分級結(jié)構(gòu)微載體利用純水、乙醇多次清洗后保存。實(shí)施例3 ETPTA分級結(jié)構(gòu)微載體用于三維細(xì)胞培養(yǎng)
1.ETPTA分級結(jié)構(gòu)微載體的制備:利用0/W型單乳液微流體制備包含許多小水滴的ETPTA乳液，并以此作為W/0/W型雙乳液微流體的中間相3溶液，制備包裹若干個(gè)大水滴，同時(shí)含有許多小水滴的ETPTA分級結(jié)構(gòu)微載體，固化后微載體成為大小不一的貫穿多孔分級結(jié)構(gòu)。
2.ETPTA分級結(jié)構(gòu)微載體的消毒滅菌:利用氧等離子體處理儀使微載體表面羥基化，然后將其浸泡于75%酒精溶液中過夜，再用無菌的PBS (PH=7.4)反復(fù)清洗，并浸泡在PBS中紫外照射3h。3.細(xì)胞接種:將無菌的ETPTA分級結(jié)構(gòu)微載體置于六孔板中，將消化好的細(xì)胞接種至六孔板內(nèi)，輕微搖晃六孔板:T4h，使細(xì)胞與微載體充分接觸，將其置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 0C，5%C02)，培養(yǎng)24-48h。也可直接放入微載體培養(yǎng)瓶中進(jìn)行大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。4.細(xì)胞觀察:經(jīng)過培養(yǎng)之后，利用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞是否已粘附于ETPTA分級結(jié)構(gòu)微載體孔內(nèi)生長。5.細(xì)胞表征和生物學(xué)功能的檢測:對細(xì)胞進(jìn)行染色，利用熒光顯微鏡判斷細(xì)胞的存活率；或利用掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞生長的形態(tài)和趨勢。利用試劑盒對細(xì)胞的各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測定，以評價(jià)這種分級結(jié)構(gòu)微載體培養(yǎng)細(xì)胞對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。本發(fā)明通過分級結(jié)構(gòu)微載體，能夠能較好地維持細(xì)胞形態(tài)，降低成本，還能提高培
養(yǎng)效率。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范 圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種分級結(jié)構(gòu)微載體，其特征在于，所述分級結(jié)構(gòu)微載體包括一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)，所述一級結(jié)構(gòu)為利用單乳液微流體制備出的小液滴，所述小液滴尺寸為5-10 μ m ;所述二級結(jié)構(gòu)為通過雙乳液微流體內(nèi)相生成的大液滴，所述大液滴尺寸為200-500 μ m。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分級結(jié)構(gòu)微載體，其特征在于，所述分級結(jié)構(gòu)微載體為油溶性微載體，生成所述油溶性微載體的一級結(jié)構(gòu)的單乳液微流控裝置為水包油(W/0)型，生成所述油溶性微載體的二級結(jié)構(gòu)的雙乳液微流控裝置為水包油包水(W/0/W)型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分級結(jié)構(gòu)微載體，其特征在于，所述分級結(jié)構(gòu)微載體為水溶性微載體，形成所述水溶性微載體的一級結(jié)構(gòu)的單乳液微流控裝置為油包水(0/W)型，形成所述水溶性微載體的二級結(jié)構(gòu)的雙乳液微流控裝置為油包水包油(0/W/0)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分級結(jié)構(gòu)微載體，其特征在于，所述分級結(jié)構(gòu)微載體選自聚二甲基硅氧烷或乙氧基化三羥甲基丙烷三丙烯酸酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分級結(jié)構(gòu)微載體，其特征在于，所述分級結(jié)構(gòu)微載體選自膠原、殼聚糖、海藻酸鈣、瓊脂糖、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分級結(jié)構(gòu)微載體，其特征在于，所述分級結(jié)構(gòu)微載體的二級結(jié)構(gòu)為單囊或多囊。
7.一種制備權(quán)利要求1-6任一所述的分級結(jié)構(gòu)微載體的方法,其特征在于,包括以下步驟: 首先，微載體一級結(jié)構(gòu)的制備:根據(jù)微載體性質(zhì)，對微流控裝置管道進(jìn)行親疏水性修飾，組裝合適的單乳液微流控裝置，配制互不相溶的分散相和連續(xù)相溶液，生成含有小尺寸液滴的乳液； 其次，微載體二級結(jié) 構(gòu)的制備:組裝合適的雙乳液微流控裝置，以包含一級結(jié)構(gòu)的乳液作為中間相溶液，配制與之互不相溶的內(nèi)外相I溶液，通過調(diào)節(jié)各相溶液的流速，生成包裹若干大尺寸內(nèi)囊且同時(shí)含有一級結(jié)構(gòu)的液滴； 再次，固化液滴，清洗后，即可獲得具有分級結(jié)構(gòu)的微載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備權(quán)利要求1所述的分級結(jié)構(gòu)微載體的方法，其特征在于，所述微流控裝置選自協(xié)流式或匯聚式微流控裝置，所述微流控裝置的管道材料選用二氧化硅、特氟龍、聚二甲基硅氧烷中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備權(quán)利要求1所述的分級結(jié)構(gòu)微載體的方法，其特征在于，所述親疏水修飾為在表面修飾上羥基或氨基；所述疏水性修飾為在表面修飾上長鏈烷烴。
10.如權(quán)利要求1-6任一所述的分級結(jié)構(gòu)微載體在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求1-6任一所述的分級結(jié)構(gòu)微載體在蛋白質(zhì)、核酸或細(xì)胞的多元檢測技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分級結(jié)構(gòu)微載體及其制備方法和應(yīng)用，所述分級結(jié)構(gòu)微載體包括一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)，所述一級結(jié)構(gòu)為利用單乳液微流體制備出的小液滴，所述小液滴尺寸為5-10μm；所述二級結(jié)構(gòu)為通過雙乳液微流體內(nèi)相生成的大液滴，所述大液滴尺寸為200-500μm；制備方法包括首先，微載體一級結(jié)構(gòu)的制備；其次，微載體二級結(jié)構(gòu)的制備；再次，固化液滴；所述微載體在細(xì)胞培養(yǎng)中及蛋白質(zhì)、核酸或細(xì)胞的多元檢測技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/02GK103146636SQ20131005838
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月25日
發(fā)明者趙遠(yuǎn)錦, 劉瑋, 商珞然, 程瑤, 顧忠澤 申請人:東南大學(xué)