專利名稱：一種轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb₁生成Rd的酵母菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的酵母菌，同時還涉及該酵母菌的應(yīng)用，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人參(Panax ginseng G.A.Meyer)是我國珍貴的傳統(tǒng)中藥,應(yīng)用于中醫(yī)臨床已有兩千多年的歷史。人參的主要活性成分是人參皂苷(ginsenoside)，其中，原人參二醇類皂苷屬于達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷，主要包括Rbp Re、Rd、Rg3以及Rh2等。以上單體的結(jié)構(gòu)差異僅在于C3和C20位上的糖基側(cè)鏈不同，但顯示出的藥理活性卻有不同。如Rb1表現(xiàn)出良好的抗心律失常和抗衰老作用(人參皂苷Rb1的藥理活性研究進展，中國中藥雜志，2008,33(12):1371-1377) ;Rc可減弱由辣椒堿和P物質(zhì)誘導(dǎo)的疼痛(Effects ofginsenosides on vanilloid receptor (VRl) channels expressed in Xenopus oocytes,Mol Cells,2001,12:342-346 ；Antinociceptive effects ginsenosides injectedintracerebroventricularly or intrathecally in substance P—induced pain model，Planta Med，2003，6 9:1001-1004)及延長溶血發(fā)生的滯后時間(Can ginsenosidesprotect human erythrocytes against free-radical-1nduced hemolysis, BiochimBiophys Acta, 2002，1572 (I):58-66) ;Rd 具有促進神經(jīng)干細胞分 ^(Ginsenoside-Rdfrom Panax notoginseng enhances astrocyte differentiation from neural stemcells，Life Sci，2005，76 (9):983_995)、選擇性拮抗卡因酸引起的致死性興奮性中毒(Effects of ginsenoside Rd and decursinol on the neurotoxic responses inducedby kainic acid in mice，Planta Med，2003，69 (3):230_234)、減弱由辣椒減和 P 物質(zhì)誘導(dǎo)的疼痛(Effects of ginsenosides on vanilloid receptor (VRl) channelsexpressed in Xenopus oocytes,Mol Cells，2001，12:342-346 ;Antinociceptive effectsginsenosides injected intracerebroventricularly or intrathecally in substanceP-1nduced pain model，Planta Med，2003，69:1001-1004)以及抗衰老(Ginsenoside-Rdattenuates oxidative damage related to aging in senescence-accelerated mice，J Pharm Pharmacol，2004，56 (I):107-113)等作用；Rg3在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移及增強機體免疫力等方面具有顯著的效果(人參皂苷Rg3抗腫瘤作用機制研究進展，現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2008，16 (4):648-652) ;Rh2對多種腫瘤均有一定的抑制作用，具有較強的抗腫瘤增效作用(Rh2synergistically enhances paclitaxelor mitoxantrone in prostate cancer models，J Urol,2006,175 (5):1926-1931),此夕卜，還具有降血糖的作用(Mediation of β -endorphin by ginsenoside Rh2to lowerplasma glucose in streptozotoein-1nduced diabetic rats， Planta Med，2006，72(I):9-13)。上述皂苷中，Rb1.Re和其它三種皂苷單體Rb2、Re和Rg1在人參根中的含量超過80%，而Rd、Rg3和Rh2含量卻極低，但它們有著更強的藥理活性(Microbial conversion ofmajor ginsenoside Rt^to pharmaceutically active minor ginsenoside Rd，Journal ofMicrobiology, 2005,43 (5):456_462)。此外，天然高含量苷類成分在腸道難以吸收，分子結(jié)構(gòu)不是最佳活性狀態(tài)，難以直接發(fā)揮藥效，因此，稀有皂苷成為國內(nèi)外主要研究開發(fā)對象。
人參皂苷在人參代謝過程中的機理還不明確，無法在生長過程中予以控制以定向積累稀有人參皂苷。研究者常通過將含量較高的多糖基人參皂苷如Rb1及Re水解以獲得低糖基的Rd、Rg3或Rh2等稀有皂苷。人參皂苷糖基改造的方法有化學(xué)法、酶法和微生物轉(zhuǎn)化法，其中酶法和微生物轉(zhuǎn)化法操作簡單，能最大限度保護中藥化學(xué)成分免遭破壞，同時有利于環(huán)境保護，降低生產(chǎn)成本，是以人參總皂苷為原料轉(zhuǎn)化生產(chǎn)稀有皂苷的理想生產(chǎn)方式。目前，已有利用微生物或動植物代謝過程中所產(chǎn)能水解人參皂苷糖苷鍵的糖基水解酶為催化劑，定向轉(zhuǎn)化生成稀有皂苷的技術(shù)方法。研究中涉及的微生物類型主要是細菌和霉菌(高產(chǎn)人參皂苷β -葡萄糖苷酶菌種的篩選，大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2000，19 (3) =195-198 ;從一種新篩選的菌中找出人參皂苷酶，大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2003，22(3):164-166 ；Microbial conversion of major ginsenoside Rb1 to pharmaceuticallyactive minor ginsenoside Rd, Journal of Microbiology,2005,43 (5):456-462;把人參二醇類皂苷轉(zhuǎn)化為Rg3的特種人參皂苷糖苷酶生成的細菌篩選，大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，27 (2):97-101 )，也有從人參中分離出人參皂苷水解酶以及使用動物消化酶進行研究的 艮道(Purification and characterization of ginsenoside-β -glucosidase fromginseng, Chem.Pharm.Bull,2001,49(7):795-798 !Purification and characterizationof ginsenoside-a -arabinofuranase hydrolyzing ginsenoside Re into Rd from thefresh root of Panax ginseng, Process Biochemistry, 2002, 37:793-798 ;蝸牛酶中一種人參皂苷Rb1酶的分離純化，生物 工程學(xué)報，2005，11:929-933)，此外，還有使用真菌(真菌對人參皂昔Rb1及人參二醇系皂苷的代謝作用，藥學(xué)學(xué)報，2001，3 (18) =603-605)或大型藥用真菌采用固體發(fā)酵進行微生物轉(zhuǎn)化的研究報道(人參皂苷微生物轉(zhuǎn)化的研究，吉林:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004)。研究中獲得較多的酶為人參皂苷Rb1水解酶，其水解產(chǎn)物主要為Rd，此外還有可將Rg3水解生成Rh2的人參皂苷糖苷酶，以及從人參根中分離純化出能將Re水解生成Rd的人參皂苷-α -阿拉伯糖苷酶。
這些轉(zhuǎn)化方法中，大都采用到斜面種子活化，制備液體種子進行微生物轉(zhuǎn)化，在進行生物轉(zhuǎn)化時，除人參皂苷原料外，同時還添加其它輔料如葡萄糖，無機鹽等，且轉(zhuǎn)化效率低，大多約為15% 20%。也有利用活性干酵母轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的報道，轉(zhuǎn)化率僅為30% 36%。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的酵母菌。
為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的酵母菌，所述酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GWYS01,保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏號=CCTCC NO:M2013038，保藏日期:2013年I月22日。
酵母菌是一種單細胞 真菌，具有多種活性強大的酶系，如淀粉酶、糖化酶、糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶等，特別是糖苷酶活性強，而人參皂苷由苷元和糖鏈組成，利用酵母菌所產(chǎn)糖苷酶，降解人參皂苷分子上的糖基，使其轉(zhuǎn)化為皂苷苷元，可提高人參皂苷的生物利用度。本發(fā)明酵母菌代謝產(chǎn)物中含有能強烈水解人參皂苷Rb1的人參皂苷糖苷酶，24小時Rb1的轉(zhuǎn)化率達到97.5%，轉(zhuǎn)化形成Rd的比率為62%。本發(fā)明的目的還在于提供一種酵母菌在轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd方面的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種酵母菌在轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd方面的應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供一種酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的方法。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的方法，包括以下步驟:I)酶液的制備:將酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)，然后將發(fā)酵液過濾，第一次離心，去除菌體沉淀，收集上清液；在20-30°C條件下，加入硫酸銨至60-80%飽和度，4-6°C靜置過夜；然后第二次離心，棄上清液，收集蛋白質(zhì)沉淀；將蛋白質(zhì)沉淀用0.02mol/L、pH4.5-5.5的醋酸鈉緩沖液6-lOmL溶解后裝入透析袋，用相同的醋酸鈉緩沖液透析22-26h ;透析后，第三次離心，上清液即為酶液；2)酶液的轉(zhuǎn)化反應(yīng):稱取人參皂苷Rb1，將人參皂苷Rb1與0.02mol/L、pH4.5_5.5的醋酸鈉緩沖液混合，配制成人參皂苷Rb1濃度為1.70mg/mL的底物反應(yīng)液，然后將底物反應(yīng)液與酶液按照體積比1:5-9混合，在35-45°C條件下反應(yīng)，得到人參皂苷Rd。所述酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)的具體方法為:將酵母菌接種到PDA培養(yǎng)基上，在28_32°C條件下培養(yǎng)35-45h，然后將酵母菌接種于YPD培養(yǎng)基中，在34-38°C條件下，振蕩培養(yǎng)45_51h，得到酵母菌發(fā)酵液。所述PDA培養(yǎng)基包括以下組分:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15_20g，水定容至IOOOmL,自然 pH。所述YH)培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分:1%酵母浸膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖。所述第一次離心的條件為:離心溫度15-17°C、轉(zhuǎn)速10000-12000r/min、離心時間15_20mino所述第二次離心的條件為:離心溫度4-6°C、轉(zhuǎn)速WOOO-HOOOiVmin、離心時間15_20mino所述第三次離心的條件為:離心溫度15-17°C、轉(zhuǎn)速WOOO-HOOOiVmin、離心時間8-12min。本發(fā)明利用酵母菌代謝產(chǎn)物糖苷酶將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為Rd，提高了人參中有效成分的生物利用率。本發(fā)明的成本較低，操作簡單，轉(zhuǎn)化周期短，促進了中藥人參皂苷現(xiàn)代化和產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。
具體實施例方式培養(yǎng)基的配制:PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15-20g，水定容至IOOOmL,自然pH，115°C,0.1MPa 高壓滅菌 20min。
YTO培養(yǎng)基:1%酵母浸膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖，115°C，0.1MPa高壓滅菌20min。YPD瓊脂培養(yǎng)基即在YPD培養(yǎng)基中2%的瓊脂。麥芽汁液體培養(yǎng)基:將干麥芽粉碎，一份麥芽加四份水，在65°C水浴鍋中糖化3_4h，將糖化液煮沸后用紗布過濾至澄清，稀釋至5-6波美度，pH6.4，12rC，0.1MPa，高壓滅菌20min。葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基:黃豆芽125g，酵母膏6g，葡萄糖20g，水lOOOmL，115°C滅菌，20mino氮源同化培養(yǎng)基:葡萄糖20g，KH2PO4Ig, MgSO4.7H200.5g，酵母膏0.2g，瓊脂20g，水IOOOmL,過濾后分裝試管，115°C滅菌20min。實施例1、1、酵母菌的篩選將酒廠窖泥接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中進行增菌培養(yǎng)，然后采用YPD培養(yǎng)基，以平板稀釋法分離菌株，分別于25°C和37°C兩個溫度條件下培養(yǎng)2d，以菌落外觀形態(tài)為主，配合鏡檢觀察菌體形態(tài)，獲得符合酵母菌菌落特征的菌株若干，然后進行多次純化得到5個菌株，分別接入YPD瓊脂培養(yǎng)基斜面，置于冰箱4°C保存?zhèn)溆谩７蛛x純化得到的5個菌株分別命名為 GWYS01、GWYS02、GWYS03、GWYS04、GWYS05。2、酶液的制備分別制備實施例1篩選的5個菌株相應(yīng)的酶液，具體步驟如下:I)菌株的培養(yǎng)與發(fā)酵`將實施例1分離純化的菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)40h后，再按照體積分?jǐn)?shù)5%的比例轉(zhuǎn)入YPD培養(yǎng)基發(fā)酵，在36°C、160r/min條件下，振蕩培養(yǎng)48h，得到發(fā)酵液；2)酶液的制備:將發(fā)酵液過濾,在15°C、10000r/min條件下,離心20min,去除菌體沉淀,收集上清液；在25°C條件下，加入硫酸銨至70%飽和度，4°C靜置過夜；然后在4°C、13000r/min條件下,離心20min,棄上清液,收集蛋白質(zhì)沉淀；將蛋白質(zhì)沉淀用0.02mol/L、pH5.0的醋酸鈉緩沖液8mL溶解后裝入透析袋，用相同的醋酸鈉緩沖液透析24h ;透析后，在15°C，13000r/min條件下，離心lOmin，上清液即為酶液。3、轉(zhuǎn)化反應(yīng)將5個菌株相應(yīng)的酶液在相同條件下與人參皂苷Rb1反應(yīng)，篩選得到I個能夠有效轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的菌株，為GWYS01。將GWYS01劃線接種于YPD培養(yǎng)基中，于37°C下培養(yǎng)2d，肉眼觀察其菌落形態(tài)特征，鏡檢觀察細胞形態(tài)。選用葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后37°C培養(yǎng)，每隔12h觀察發(fā)酵情況，同時選用氮源同化培養(yǎng)基，接種后37°C培養(yǎng)2d觀察。觀察菌株GWYS01的菌落形態(tài)、細胞形態(tài)，以及生理生化培養(yǎng)特性，如表I所示。表I形態(tài)觀察及生理生化特性測試結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的酵母菌，其特征在于，所述酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GWYS01,保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏號:CCTCCN0:M2013038，保藏日期:2013年I月22日。
2.一種如權(quán)利要求1所述的酵母菌在轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd方面的應(yīng)用。
3.—種如權(quán)利要求1所述的酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)酶液的制備: 將酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)，然后將發(fā)酵液過濾，第一次離心，去除菌體沉淀，收集上清液；在20-30 °C條件下，加入硫酸銨至60-80%飽和度，4-6 °C靜置過夜；然后第二次離心，棄上清液，收集蛋白質(zhì)沉淀；將蛋白質(zhì)沉淀用0.02mol/L、pH4.5_5.5的醋酸鈉緩沖液6_10mL溶解后裝入透析袋，用相同的醋酸鈉緩沖液透析22-26h ;透析后，第三次離心，上清液即為酶液； 2)酶液的轉(zhuǎn)化反應(yīng): 稱取人參皂苷Rb1,將人參皂苷Rb1與0.02mol/L、pH4.5-5.5的醋酸鈉緩沖液混合，配制成人參皂苷Rb1濃度為1.70mg/mL的底物反應(yīng)液，然后將底物反應(yīng)液與酶液按照體積比1:5-9混合，在35-45°C條件下反應(yīng)，得到人參皂苷Rd。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，所述酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)的具體方法為:將酵母菌接種到PDA培養(yǎng)基上，在28-32°C條件下培養(yǎng)35-45h，然后將酵母菌接種于YPD培養(yǎng)基中，在34-38°C條件下，振蕩培養(yǎng)45_51h，得到酵母菌發(fā)酵液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，所述PDA培養(yǎng)基包括以下組分:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15-20g，水定容至IOOOmL,自然pH。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，所述Yro培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分:1%酵母浸膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，所述第一次離心的條件為:離心溫度15_17°C、轉(zhuǎn)速10000-12000r/min、離心時間15_20min。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，所述第二次離心的條件為:離心 溫度4_6°C、轉(zhuǎn)速12000-14000r/min、離心時間15_20min。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酵母菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl生成Rd的方法，其特征在于，所述第三次離心的條件為:離心溫度15_17°C、轉(zhuǎn)速12000-14000r/min、離心時間8_12min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd的酵母菌及其應(yīng)用。所述酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GWYS01，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏號CCTCC NOM2013038，保藏日期2013年1月22日。本發(fā)明同時公開了一種酵母菌在轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成Rd方面的應(yīng)用。本發(fā)明利用酵母菌代謝產(chǎn)物糖苷酶將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為Rd，提高了人參中有效成分的生物利用率，24小時Rb1的轉(zhuǎn)化率達到97.5%，轉(zhuǎn)化形成Rd的比率為62%。本發(fā)明的成本較低，操作簡單，轉(zhuǎn)化周期短，促進了中藥人參皂苷現(xiàn)代化和產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。
文檔編號C12R1/865GK103146592SQ201310038798
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月31日
發(fā)明者李東霄, 鄧小莉, 郭丹釗, 常景玲, 張勉 申請人:河南科技學(xué)院