專利名稱：鑒別中國與歐洲牛肝菌的分子特異性標(biāo)記引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒別中國牛肝菌Boletus roseoflavus與歐洲牛肝菌B.appendiculatus的分子特異性標(biāo)記引物，以及一種利用該引物對中國與歐洲牛肝菌標(biāo)本進行快速辨別的方法。
背景技術(shù)：
Boletus roseoflavus 和 B.appendiculatus 均隸屬于牛肝菌目 Boletales 下Boletus 屬的 Appendiculati Konrad & Maubl.ex Lannoy & EstadSs 類群。到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)B.roseoflavus分布于中國，B.appendiculatus分布于歐洲。中國B.roseoflavus的鑒別特征為菌蓋淡粉紅色、紫紅色、玫瑰紅色，菌肉暴露在空氣中不變藍(lán)，或緩慢變藍(lán)，菌孔受傷后立刻變藍(lán)，擔(dān)孢子的平均長寬比小于3。歐洲B.appendiculatus的鑒別特征為菌蓋淺色到深褐色，不帶有粉紅色彩；菌肉暴露在空氣中顯著變藍(lán)，菌孔受傷變藍(lán)；擔(dān)孢子的平均長寬比小于3。這二個種在菌蓋顏色上存在明顯差異，但子實體形態(tài)特征較為相似，菌肉、菌孔的變色反應(yīng)也很接近。自2005年以來，分布于浙江的B.roseoflavus標(biāo)本被我國的菌物學(xué)家錯誤地冠以了歐洲B.appendiculatus的種名，國內(nèi)一些文獻(xiàn)對此有過記載。事實上，B.roseoflavus與B.appendiculatus并非同種，迄今在中國尚未發(fā)現(xiàn)有真正的B.appendiculatus存在,這一結(jié)論后來也得到了分子數(shù)據(jù)的支持。對B.roseoflavus與B.appendiculatus這二個相似種辨別的主要特征是宏觀上的子實體顏色差異和變色 反應(yīng)以及生境。但由于顏色差異易受生境、氣候、土壤、子實體生長期、生理狀況等的影響而常常導(dǎo)致主觀判別上的偏差，而對于長期保藏的干標(biāo)本，特別是對古老標(biāo)本、模式標(biāo)本的重新鑒別研究，僅憑顏色差異更是難以準(zhǔn)確鑒定。因此，在大型真菌分類研究上，分子技術(shù)已成為了對標(biāo)本輔助鑒定的重要手段。真菌的核糖體基因rRNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)的保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異比較明顯，這一特點使得ITS區(qū)段不僅適合于屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，而且非常適合于真菌物種的分子鑒定。對B.roseoflavus和B.appendiculatus的ITS區(qū)測序結(jié)果顯示，B.roseoflavus 和 B.appendiculatus 的 ITS1-5.8S-1TS2 序列長度分別為 690_706bp 和600-690bp，很難利用通用引物對(如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4)的PCR擴增、普通電泳來進行準(zhǔn)確辨別。對這二個相似種的ITS序列比對顯示二者的局部序列存在較大差異，這為設(shè)計ITS特異引物，針對性地擴增ITS特異片段，以方便用于這二個相似種的分子輔助鑒定提供了可能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種可鑒別中國牛肝菌B.roseoflavus和歐洲牛肝菌B.appendiculatus的分子特異性標(biāo)記引物，以及一種利用該引物對中國和歐洲牛肝菌進行快速辨別的方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種鑒別中國牛肝菌B.roseoflavus和歐洲牛肝菌B.appendiculatus的分子特異性標(biāo)記引物，其核苷酸序列如下:上游引物:5'-CTTGCTCAGCCCAACTCAACG-3'下游引物:5'-ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG-3'該引物對是采用PCR技術(shù),經(jīng)過對中國牛肝菌標(biāo)本B.roseoflavus和歐洲牛肝菌標(biāo)本B.appendiculatus的核糖體基因ITS區(qū)序列的克隆測序，以得到的ITS序列進彳丁喊基差異比對，并以此設(shè)計ITS特異性引物對。以該引物對B.roseoflavus和B.appendiculatus標(biāo)本進行PCR擴增，可從B.roseoflavus中獲得625bp大小的特異性片段。本發(fā)明還涉 及所述的分子特異性標(biāo)記引物在鑒別中國牛肝菌B.roseoflavus和歐洲牛肝菌B.appendiculatus中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種利用所述分子特異性標(biāo)記引物鑒別中國牛肝菌B.roseoflavus和歐洲牛肝菌B.appendiculatus的方法，所述方法包括:提取待測牛肝菌標(biāo)本基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)625bp的DNA條帶,則待測牛肝菌為B.roseoflavus,若電泳結(jié)果未出現(xiàn)625bp的DNA條帶，則待測牛肝菌為B.appendiculatus ；所述分子特異性標(biāo)記引物序列為:上游引物:5'-CTTGCTCAGCCCAACTCAACG-3'下游引物:5'-ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG-3'所述方法關(guān)鍵在于擴增引物的選擇、DNA提取、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件確定，以及電泳檢測，均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進行。需要說明的是，本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物和檢測方法僅適用于中國牛肝菌B.roseoflavus和歐洲牛肝菌B.appendiculatus的鑒別，即待測標(biāo)本是限定為中國牛肝菌標(biāo)本B.roseoflavus和歐洲牛肝菌標(biāo)本B.appendiculatus的范圍內(nèi)的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)子實體形態(tài)特征和顏色先進行初步的判斷，再將判斷為B.roseoflavus或B.appendiculatus的牛肝菌標(biāo)本用本發(fā)明方法進行鑒別。在過去的很多年里，中國牛肝菌B.1Oseoflavus標(biāo)本被錯誤鑒定為歐洲牛肝菌B.appendiculatus種，對二者的正確辨別主要通過子實體顏色和變色反應(yīng)上的些許差異，但對顏色差異的判別具有很強的主觀性，常常出現(xiàn)偏差，而且對于干標(biāo)本，特別是古老標(biāo)本已很難僅僅通過顏色差異來準(zhǔn)確鑒定。采用本發(fā)明方法，可對相似種B.roseoflavus和B.appendiculatus進行快速的分子鑒定,方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，是形態(tài)特征辨別的有效輔助。所述PCR擴增反應(yīng)體系組成如下(總體積25 μ L):
權(quán)利要求
1.一種鑒別中國牛肝菌B.roseof Iavus和歐洲牛肝菌B.appendiculatus的分 子特異性標(biāo)記引物，其核苷酸序列如下: 上游引物:5' -CTTGCTCAGCCCAACTCAACG-3' 下游引物:5' -ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG-3'。
2.如權(quán)利要求1所述的分子特異性標(biāo)記引物在鑒別中國牛肝菌B.1Oseoflavus和歐洲牛肝菌B.appendiculatus中的應(yīng)用。
3.一種利用權(quán)利要求1所述分子特異性標(biāo)記引物鑒別中國牛肝菌B.roseoflavus和歐洲牛肝菌B.appendiculatus的方法，所述方法包括:提取待測牛肝菌標(biāo)本基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)625bp的DNA條帶,則待測牛肝菌為B.roseoflavus,若電泳結(jié)果未出現(xiàn)625bp的DNA條帶,則待測牛肝菌為B.appendiculatus ;所述分子特異性標(biāo)記引物序列為: 上游引物:5' -CTTGCTCAGCCCAACTCAACG-3' 下游引物:5' -ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG-3'。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR擴增條件如下:94°C預(yù)變性6min后；94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸2min，共30個循環(huán)；最后于72°C補平7min，終止溫度為4°C。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于方法如下: (1)取待測牛肝菌標(biāo)本子實體，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待測牛肝菌的基因組DNA ； (2)以步驟(I)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記 引物作為擴增引物，進行PCR擴增: PCR反應(yīng)體系每25 μ L組成如下:
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可鑒別中國牛肝菌B.roseoflavus和歐洲牛肝菌B.appendiculatus的分子特異性標(biāo)記引物，以及一種利用該引物對中國牛肝菌B.roseoflavus和歐洲牛肝菌B.appenidculatus進行快速辨別的方法。所述分子特異性標(biāo)記引物核苷酸序列如下上游引物5′-CTTGCTCAGCCCAACTCAACG-3′下游引物5′-ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG-3′本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物可對近緣種中國牛肝菌B.roseoflavus和歐洲牛肝菌B.apPendiculatus進行快速的分子鑒定，方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，是形態(tài)特征辨別二種牛肝菌的有效輔助。
文檔編號C12Q1/68GK103173541SQ20131003833
公開日2013年6月26日 申請日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者王麗玲, 李海波, 錢華, 魏海龍, 胡傳久 申請人:浙江省林業(yè)科學(xué)研究院