人類免疫缺陷病毒1型一步法熒光定量pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了人類免疫缺陷病毒1型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒，試劑盒包括RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶混合物、引物探針、陰性對照、強(qiáng)陽性對照、弱陽性對照、校準(zhǔn)品1號~5號。本發(fā)明可對提取好的HIV-1RNA直接進(jìn)行一步法熒光定量RT-PCR反應(yīng)，檢測樣本中HIV-1RNA的病毒載量，并依靠內(nèi)參基因作為內(nèi)對照、利用UNG酶預(yù)防污染。本發(fā)明的試劑盒一步法擴(kuò)增方法簡單、程序簡短、操作簡便、預(yù)防污染，檢測結(jié)果特異性強(qiáng)、敏感度高、結(jié)果明晰、可信度高，可用于血清中人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）RNA病毒載量檢測。
【專利說明】人類免疫缺陷病毒1型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種生物檢測技術(shù)，尤其涉及一種用于人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1) RNA熒光定量檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)是一種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒(Lentivirus),屬反轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)的一種。該病毒破壞人體的免疫功能，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的失去抵抗力，從而導(dǎo)致各種疾病病原體得以在人體內(nèi)生存，發(fā)展到最后，導(dǎo)致艾滋病(即獲得性免疫缺陷綜合征，Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)，為一種至今無有效療法的致命性傳染病。自1981年在美國首次發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)以來，艾滋病已奪取超過3000萬人的性命，使它成為史上最具破壞力的全球性流行病之一，截至2011年5月底世界上約有6400萬人感染艾滋病毒，每天平均有7000宗新病例。目前，南亞和東南亞成為繼撒哈拉以南非洲之后的第二重災(zāi)區(qū)。中國CDC估計(jì)，截止至2011年底，我國存活HIV攜帶者及艾滋病患者約78萬人，全年新發(fā)感染者4.8萬人，死亡2.8萬人。疫情已覆蓋全國所有省、自治區(qū)、直轄市，目前我國面臨艾滋病發(fā)病和死亡的高峰期，且已由吸毒、暗娼等高危人 群開始向一般人群擴(kuò)散，防艾、抗艾形勢嚴(yán)峻。
[0003]HIV感染后病毒載量的變化與疾病的進(jìn)程有密切的相關(guān)性，HIV病毒載量的檢測可以預(yù)測疾病發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后，因此，HIV病毒載量的檢測可以監(jiān)控疾病的發(fā)展過程，并為制定相應(yīng)的治療方案和策略提供依據(jù)；而且病毒載量較高的孕婦造成母嬰傳播的危險(xiǎn)性較大，可根據(jù)病毒載量確定孕婦是否需服用抗病毒藥物來減少HIV的母嬰傳播?？笻IV病毒藥物的作用主要是抑制病毒的復(fù)制，降低病毒載量。因此，病毒載量的檢測對疾病的監(jiān)控、預(yù)防母嬰傳播以及觀察抗病毒藥物的療效都具有重要的意義。
[0004]根據(jù)基因差異，可將HIV分為HIV-1型和HIV-2型。一般，HIV-1病毒是絕大多數(shù)HIV感染的病原體，HIV-2病毒主要出現(xiàn)在非洲，尤其是在西非地區(qū)。HIV-2的傳播方式與HIV-1相同，都會(huì)發(fā)生機(jī)會(huì)性感染和AIDS，但HIV-2所致的免疫缺陷發(fā)展得較為緩慢和溫和。不同地區(qū)流行的亞型不同，同一亞型在不同地區(qū)的流行態(tài)勢也存在一定差異。目前，世界范圍內(nèi)流行的主要為HIV-1型。在美國，因?yàn)镠IV-2較為少見，所以HIV-2未被列為常規(guī)檢測。中國境內(nèi)流行的HIV主要為M組HIV-1型(目前境內(nèi)尚未見HIV-1 N組和O組的報(bào)道，HIV-2型感染病例的報(bào)道極少)，其基因型主要為B/B’、BC重組型(包括CRF 07_BC重組型和CRF 08_BC重組型)以及AE重組型(CRF 01_AE重組型)。而且，HIV-1基因型具有一定的地域差異，不同的地區(qū)流行的HIV基因型也不盡相同，如CRF 07_BC重組型流行于四川、新疆等地，而CRF 08_BC重組型則流行于廣西等地。
[0005]目前，HIV的檢測方總體可分為抗體檢測和病毒檢測兩大類。病毒檢測包括細(xì)胞培養(yǎng)(病毒分離)、P24抗原檢測和病毒核酸檢測。早期對HIV的診斷主要是通過血清學(xué)試驗(yàn)檢測抗HIV的抗體，間接地診斷HIV感染。近幾年，分子生物學(xué)方法不斷被應(yīng)用到HIV的檢測中，HIV的實(shí)驗(yàn)室診斷方法取得了很大的進(jìn)展，核酸檢測已經(jīng)成為了 HIV實(shí)驗(yàn)室診斷的發(fā)展方向。
[0006]傳統(tǒng)的核酸檢測方法是采用核酸雜交技術(shù)對目的核酸進(jìn)行檢測，雖然采用放射性標(biāo)記的探針可以提高檢測的敏感性，但仍然偏低，不能滿足臨床需要。最近幾年核酸檢測技術(shù)發(fā)展迅速，主要是采用各種擴(kuò)增放大技術(shù)提高檢測的靈敏度。隨著擴(kuò)增技術(shù)的成熟，可以將低拷貝的靶序列成對數(shù)級放大擴(kuò)增，同時(shí)采用比放射性探針更靈敏的非放射性檢測系統(tǒng)(如電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)等)，明顯提高核酸檢測的靈敏度，并減少放射性物質(zhì)的污染。檢測HIV-1 RNA病毒載量的方法主要有分支DNA檢測(bDNA)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和核酸序列擴(kuò)增檢測(NASBA)等，其中，基于TaqMan探針技術(shù)的熒光定量RT-PCR方法已發(fā)展成為成熟、常用而有效的檢測手段。
[0007]TaqMan探針技術(shù)是高度特異的熒光定量PCR技術(shù)。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’ -末端，淬滅基團(tuán)在探針3’ -末端。當(dāng)探針完整或與靶序列配對時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’-端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅，無熒光信號產(chǎn)生。在進(jìn)行PCR反應(yīng)延伸過程時(shí)，DNA聚合酶的5’ 一3’外切核酸酶活性將探針降解，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，即產(chǎn)生熒光信號。每經(jīng)歷一個(gè)PCR反應(yīng)循環(huán)，就有一分子的擴(kuò)增產(chǎn)物生成，并伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)信號不斷積累，為一個(gè)指數(shù)同步增長的過程，熒光信號的強(qiáng)度就代表了擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)、有效解決了 PCR污染等問題。HIV-1熒光定量檢測正是基于這種原理設(shè)計(jì)，為HIV-1早期感染診斷、大規(guī)模篩查、療效動(dòng)態(tài)分析、新藥開發(fā)等提供良好的技術(shù)支持。目前，國際上HIV-1病毒載量試劑主要有以下幾種=COBASAmpliPrep / COBASTaqMan HIV-1 Test (Roche)、Abbott RealTime HIV-1 AmplificationKit (Abbott)>Versant HIV-1 RNA 3.0 (bDNA, Simens)、Roche Amplicor HIV-1 MonitorTest (Roche)、NucliSens HIV-1 QT (NASBA)和 NucliSens HIV-1 EasyQ (EasyQ)等。我國中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司和凱杰生物工程(深圳)有限公司也研制出了 HIV-1核酸熒光定量診斷試劑，已獲國家生產(chǎn)許可。
[0008]同時(shí)為避免反應(yīng)結(jié)果的假陰性，在反應(yīng)體系中加入內(nèi)參基因和內(nèi)參探針。內(nèi)參基因是含有與擴(kuò)增基因中的探針序列不同慢病毒RNA序列，它帶有與HIV-1擴(kuò)增基因序列引物特異結(jié)合的區(qū)域。內(nèi)參基因通過HIV-1擴(kuò)增基因上下游特異性引物結(jié)合并能產(chǎn)生相同長度(137 bp)的擴(kuò)增產(chǎn)物，其堿基組成與HIV-1擴(kuò)增基因序列一致。
[0009]同時(shí)利用UNG酶防污染的特性，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中用dUTP代替dTTP，這樣僅在擴(kuò)增片段中含有dUTP ;而dUTP使污染的擴(kuò)增子在擴(kuò)增靶DNA前易于被UNG酶降解:這種含有dUTP的PCR產(chǎn)物與UNG酶一起孵育，因UDG酶可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可從單鏈或雙鏈DNA中消除dUTP而阻止Taq DNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG酶在50°C以上即失去活性，這樣經(jīng)過熱循環(huán)不會(huì)破壞病人HIV-1 RNA。UNG酶對不含dUTP的模板無任何影響，因此，反應(yīng)體系中只有從HIV-1陽性病人樣本血清中提取的HIV-1 RNA因不被UNG酶降解而直接進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。
[0010]該技術(shù)通過對Hiv-1各基因型序列比對分析，獲得針對Hiv-1各基因型特異、通用引物及熒光探針，通過檢測各種HIV-1標(biāo)準(zhǔn)血清及臨床血清，確定該試劑盒的各種檢測指標(biāo)，確定該試劑盒檢測的特異性、敏感性及檢測的最低拷貝數(shù)，為HIV-1的確診、大規(guī)模篩選、病情程度判斷、療效評價(jià)、新藥開發(fā)等提供一個(gè)方便、廉價(jià)的檢測手段。其關(guān)鍵技術(shù)為獲得針對各種HIV-1亞型及分離株的特異、敏感的通用引物及通用探針，制備高特異性、搞敏感性、重復(fù)性好的HIV-1熒光定量PCR檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于:提供一種精確簡便的用于人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)RNA定量檢測的方法；另一目的在于提供一種用于該方法的試劑盒。
[0012]本發(fā)明的技術(shù)方案為:提供一種人類免疫缺陷病毒I型熒光定量檢測方法及試劑盒，采用一步法熒光定量PCR技術(shù)對人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)RNA進(jìn)行檢測。在使用上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司柱法純化試劑(硅膠膜吸附法)對HIV-1陽性血清樣本進(jìn)行核酸提取后，直接配制反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系配制方便，擴(kuò)增程序步驟簡便，擴(kuò)增時(shí)間短，無需多次重復(fù)循環(huán)、防止產(chǎn)物污染。本發(fā)明方法操作簡便、敏感度高、結(jié)果明晰、可靠性高。
[0013]本發(fā)明提供的試劑盒包括=RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶混合物、引物探針、陰性對照、強(qiáng)陽性對照、弱陽性對照、校準(zhǔn)品I號飛號。本發(fā)明提供的試劑盒所檢測的核酸需通過使用上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司柱法純化試劑(硅膠膜吸附法)對Hiv-1陽性血清樣本進(jìn)行核酸提取，對提取好的HIV-1 RNA直接進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，其中所述的RT-PCR反應(yīng)液為 Tris-HCl (ρΗ8.3) 20 mM、KCl 100 mM、明膠 0.2 mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.4 mM、MgCl2 6 mM的混合液；所述的酶混合物為逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶和UNG酶的混合物(逆轉(zhuǎn)錄酶3 U/ul, Taq DNA聚合酶2 U/ul，UNG酶I U/ul);所述的引物探針為一對HIV-1特異性引物、一條HIV-1特異性探針和一條內(nèi)參探針的混合液(引物各6.25 uM，HIV-1特異性探針2.5 uM，內(nèi)參探針2.5 uM);所述的陰性對照為無HIV-1 RNA的正常人血清；所述的強(qiáng)陽性對照為高濃度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清；所述弱陽性對照為低濃度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清；所述校準(zhǔn)品I號~5號為已知濃度梯度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清。檢測用的HIV-1基因特異性引物分上游引物和下游引物:
上游引物序列〈SEQ ID N0.3)為:5’ -GGCTGTTGGAAATGTGG-3’ ；
下游引物序列(SEQ ID N0.4)為:5，-GCTGTTGGCTCTGGTCTG-3，；
HIV-1 特異性探針序列〈SEQ ID N0.5〉為:5’ -FAM-AATTCCCCGGCCTTCCTTTG
TTG-TAMRA-3，；
內(nèi)參特異性探針序列〈SEQ ID N0.6)為:5’-JOE-CCACCAATTGGTTCCTCTCTGTG-TAMRA-3，。
[0014]本發(fā)明提供的試劑保存于_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0015]本發(fā)明試劑盒使用方法:
每次檢測均應(yīng)設(shè)立陰性對照、強(qiáng)陽性對照、弱陽性對照和校準(zhǔn)品I號飛號。擴(kuò)增檢測方法如下:
a、按反應(yīng)樣本數(shù)(反應(yīng)樣本數(shù)=待檢樣品數(shù)+對照品3個(gè)+校準(zhǔn)品5個(gè)+l)n配制反應(yīng)液:取RT-PCR反應(yīng)液η X 12.5 μL、引物探針ηΧ2 μ 1、RT_PCR酶混合物ηΧΟ.5 μL于一離心管中混勻；低速離心數(shù)秒，按15 μ I/管分裝到反應(yīng)管中；
b、取樣本提取物、對照品提取物、校準(zhǔn)品提取物各10μI分別加入反應(yīng)管中，低速離心數(shù)秒，取出置全自動(dòng)熒光PCR儀上；
C、反應(yīng)程序?yàn)?37°C反應(yīng)10 min，50°C反應(yīng)15 min，然后95°C保溫2 min，再按94°C10 s — 60°C 45 s，循環(huán)45次，并于60°C分別采集FAM、JOE熒光通道的信號；
d、儀器PCR程序運(yùn)行完成后按儀器及軟件要求進(jìn)行結(jié)果保存和數(shù)據(jù)分析。以取高于樣本噪聲線和陰性對照的熒光值作為檢測閾值；同時(shí)確定每個(gè)樣本反應(yīng)管中，內(nèi)參基因檢出Ct值在30-32范圍之內(nèi)，避免檢測結(jié)果的假陰性；分析軟件自動(dòng)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品提取物的HIV-1 RNA含量C (IU/ml)。
[0016]本發(fā)明方法原理是基于TaqMan水解探針熒光PCR原理，以病毒HIV-1 RNA為模板，采用病毒基因組特異性引物探針，輔以逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶和UNG酶，經(jīng)一步法熒光RT-PCR實(shí)驗(yàn)，可快速、準(zhǔn)確對人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1) RNA模板進(jìn)行分析；從逆轉(zhuǎn)錄到熒光PCR，一步即可完成，可有效的防止多重操作污染。所以，本發(fā)明的檢測方法及試劑盒特異性強(qiáng)、敏感度高、操作簡便、結(jié)果明晰、可靠性高，可用于血清中人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)RNA的定量檢測。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1 一種人類免疫缺陷病毒I型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒。
[0018]1.人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1) RNA的提取
使用上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司柱法純化試劑(硅膠膜吸附法)對HIV-1陽性血清樣本進(jìn)行核酸提取。
[0019]2.逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR擴(kuò)增(每人份25ul體系)
【權(quán)利要求】
1.一種人類免疫缺陷病毒I型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:本發(fā)明通過考察人類免疫缺陷病毒I型基因組全序列，并對檢索所得Hiv-1各個(gè)基因型一致性保守序列，根據(jù)該保守序列設(shè)計(jì)出一對HIV-1特異性引物、一條HIV-1特異性熒光探針和一條內(nèi)參探針，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法擴(kuò)增目的基因。
2.權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒I型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)RNA特異性PCR擴(kuò)增的基因序列和內(nèi)參基因序列分別為:
(SEQ ID N0.1)
5’ -GGCTGTTGGAAATGTGGCAAGGAAGGACACCAAATGAAAGAKTGTACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGAAAATCTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTTCTTCAGAACAGACCAGAGCCAACAGC-3’，
(SEQ ID N0.2)
5’ -GGCTGTTGGAAATGTGGCAAGGAAGGACACCAAATGAAAGAKTGTACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGAAAATCTGGCCTTCCACCAATTGGTTCCTCTCTGGTGTTCTTCAGAACAGACCAGAGCCAACAGC-3’， 人類免疫缺陷病毒I型熒光定量檢測試劑盒擴(kuò)增基因序列全長137 bp，屬HIV-1 gag結(jié)構(gòu)基因區(qū)，為單拷貝序列；內(nèi)參基因序列全長137 bp，僅與擴(kuò)增基因中的探針序列有所不同。
3.如權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒I型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒，一對HIV-1特異性引物序列中的一條序列與SEQ ID N0.1中所示的序列相同，另一條序列與SEQID N0.1中所示的序列互補(bǔ)；HIV-1特異性探針與SEQ ID N0.1中所示的序列互補(bǔ):其中，所述的一對HIV-1特異性引物，其序列可以選自SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4，
(SEQ ID N0.3〉為:5’ -GGCTGTTGGAAATGTGG-3’，
(SEQ ID N0.4)為:5，-GCTGTTGGCTCTGGTCTG-3，； 一對HIV-1特異性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10~20個(gè)核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的HIV-1特異性探針，可以選自SEQ ID N0.5的序列，(SEQ ID N0.5)為:5’ -FAM-AATTCCCCGGCCTTCCTTTGTTG-TAMRA-3’， 其中探針5’ -端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，探針3’ -端均標(biāo)記淬滅基團(tuán)；HIV-1基因片段特異性探針序列也可以是上述序列向前或向后延伸10~20個(gè)核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的內(nèi)參探針，可以選自SEQ ID N0.6的序列，〈SEQ ID N0.6)為:5’ -JOE-CCACCAATTGGTTCCTCTCTGTG-TAMRA-3’，其中探針 5’ -端標(biāo)記 JOE 熒光基團(tuán)，探針3’-端均標(biāo)記淬滅基團(tuán)；內(nèi)參基因序列也可以是上述序列向前或向后延伸10-20個(gè)核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上。
4.如權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒I型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:試劑盒包括以下成分=RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶混合物、引物探針、陰性對照、強(qiáng)陽性對照、弱陽性對照、校準(zhǔn)品I號飛號:其中，所述的RT-PCR反應(yīng)液為Tris-HCl (ρΗ8.3)20 mM、KCl 100 禮、明膠0.2 mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0.4 mM、MgC12 6 mM 的混合液；所述的酶混合物為逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶和UNG酶的混合物(逆轉(zhuǎn)錄酶3 U/ul，TaqDNA聚合酶2 U/ul，UNG酶I U/ul);所述的引物探針為一對HIV-1特異性引物、一條HIV-1特異性探針和一條內(nèi)參探針的混合液(引物各6.25 uM，HIV-1特異性探針2.5 uM，內(nèi)參探針2.5 uM);所述的陰性對照為無HIV-1 RNA的正常人血清；所述的強(qiáng)陽性對照為高濃度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清；所述弱陽性對照為低濃度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清；所述校準(zhǔn)品I號飛號為已知濃度梯度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清。
5.如權(quán)利要求1中所述的人類免疫缺陷病毒I型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述的RT-PCR反應(yīng)液的配制和擴(kuò)增程序如下: a、一步法熒光定量RT-PCR反應(yīng)液的配制: 將RT-PCR反應(yīng)液 、RT-PCR酶混合物、引物探針按照12.5: 0.5: 2的比例混合，反應(yīng)液體積為25 ul ； b、一步法熒光定量PCR反應(yīng)程序: [1]370C10 min [2]50 0C15 min [3]95 0C2 min [4]94 0C10 s [5]60 0C45 s
[6]Go to [4] ,45 cycles
在第五步采集FAM和JOE通道熒光信號， [7]End。
【文檔編號】C12Q1/70GK103966356SQ201310029521
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月25日
【發(fā)明者】遲大利, 吳大治, 夏懿 申請人:上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥（集團(tuán)）股份有限公司