來源于水稻的蛋白質(zhì)及其編碼基因的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了來源于水稻的蛋白質(zhì)及其編碼基因的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用是培育提前開花的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括降低受體植物中FRRP1表達(dá)得到開花時(shí)間早于所述受體植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述FRRP1是如下a）或b）的蛋白質(zhì)：a）氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示的蛋白質(zhì)；b）將SEQ?ID?No.2中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花相關(guān)的由a）衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明可用于水稻早熟新品種創(chuàng)制。
【專利說明】來源于水稻的蛋白質(zhì)及其編碼基因的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及來源于水稻的蛋白質(zhì)及其編碼基因的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物的生長發(fā)育分為營養(yǎng)生長和生殖生長兩個(gè)階段，其中生殖生長決定了絕大部分綠色植物的結(jié)實(shí)和繁殖。而開花又是生殖生長中最重要的一環(huán)。在長期的進(jìn)化過程中，各種植物都有自己的開花周期，在一年中的特定時(shí)間開花對(duì)其成功繁衍后代有重要的意義。
[0003]對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)而言，各種作物能夠適時(shí)開花、成功結(jié)實(shí)保證了糧食產(chǎn)量的穩(wěn)定。我國幅員遼闊，各種農(nóng)作物對(duì)各地氣候的適應(yīng)在一定程度上影響了各地優(yōu)良品種向其他地域的調(diào)種、引種等。對(duì)一些優(yōu)良品種的大面積推廣應(yīng)用產(chǎn)生障礙。
[0004]因此，許多科研工作者、農(nóng)業(yè)育種學(xué)家等等都希望能夠人為改造植物開花時(shí)間，打破地域限制，讓優(yōu)種良種更好的為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所應(yīng)用。通過分子育種手段來改變植物開花時(shí)間是一種更加直接更加 定向的方法，現(xiàn)在已成為研究的熱點(diǎn)與焦點(diǎn)。
[0005]水稻是人類重要的糧食作物之一，它的耕種與食用的歷史都非常悠久?，F(xiàn)在全球約有一半的人口食用稻。我國北方廣大地區(qū)水稻種植生育期較長，抽穗開花較晚，導(dǎo)致收獲時(shí)溫度過低而影響產(chǎn)量。因此研究水稻的生育周期，挖掘出與開花時(shí)間相關(guān)的基因?qū)τ谂嘤齼?yōu)質(zhì)早熟的新品種，具有重要的生物學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供來源于水稻的一個(gè)蛋白質(zhì)FRRPl及編碼核酸分子的新用途，所述FRRPl是如下a)或b)的蛋白質(zhì):
[0007]a)氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì)；
[0008]b)將SEQ ID N0.2中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0009]本發(fā)明所提供的一種新用途是利用FRRPl的編碼核酸分子培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0010]本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法是培育提前開花的轉(zhuǎn)基因植物的方法，它包括降低受體植物中FRRPl或FRRPl基因表達(dá)得到開花早于所述受體植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述FRRPl是如下a)或b)的蛋白質(zhì):
[0011]a)氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì)；
[0012]b)將SEQ ID N0.2中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0013]其中，SEQ ID N0.2由844個(gè)氨基酸殘基組成。
[0014]上述方法中，可通過RNA干擾、或基因沉默或反義核酸技術(shù)降低受體植物中FRRPl或FRRPl基因的表達(dá)。
[0015]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述降低受體植物中FRRPl表達(dá)通過將如下式I所示的DNA片段導(dǎo)入目的植物中實(shí)現(xiàn)的:
[0016]SEQ 正向-X-SEQ 反向
[0017](I)
[0018]所述SEQtt選自SEQ ID N0.1且包括SEQ ID N0.1的第1641-2140位核苷酸；
[0019]所述SEQg的序列與所述序列反向互補(bǔ)；
[0020]所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQIE向及所述SEQ反向均不互補(bǔ)。
[0021]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述SEQ^的核苷酸序列是SEQ ID N0.1的第1641-2140位核苷酸。
[0022]所述降低受體植物中FRRPl表達(dá)是通過將如下重組表達(dá)載體pTCK303_FRRPl導(dǎo)入所述受體植物中實(shí)現(xiàn)的:將SEQ ID N0.1的第1641-2140位核苷酸替換載體pTCK303的Spe I和Sac I位點(diǎn)間片段，得到的重組載體記作中間重組載體；將SEQ ID N0.1的第1641-2140位核苷酸的反向互補(bǔ)序列所示的DNA替換所述中間重組載體的KpnI和BamHI位點(diǎn)間片段，得到的重組載體PTCK303-FRRP1。
[0023]上述方法中，所述受體植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物可為水稻。
[0024]上述FRRPl在調(diào)控植物開花時(shí)間中的應(yīng)用，以及下述至少一種生物材料在調(diào)控植物開花時(shí)間中的應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:
[0025]I)編碼FRRPl的核酸分子，所述FRRPl是如下a)或b)的蛋白質(zhì):
[0026]a)氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì)；
[0027]b)將SEQ ID N0.2中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)；
[0028]2)含有I)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0029]3)含有I)所述核酸分子的載體；
[0030]4)序列與I)所述核酸分子反向互補(bǔ)的核酸分子；
[0031]5)含有序列與I)所述核酸分子反向互補(bǔ)的核酸分子的表達(dá)盒；
[0032]6)含有序列與I)所述核酸分子反向互補(bǔ)的核酸分子的載體；
[0033]7)核苷酸序列是SEQ ID N0.1的第1641-2140位核苷酸的DNA分子；
[0034]8)含有4)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0035]9)含有4)所述核酸分子的載體。
[0036]其中，所述核酸分子可以是DNAjB cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
[0037]上述I)編碼FRRPl的核酸分子具體可為如下I)或2)或3)或4)所示的基因:
[0038]I)編碼所述FRRPl的DNA分子；
[0039]2)其編碼序列是SEQ ID N0.1的DNA分子；
[0040]3)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼FRRPl的DNA分子；
[0041]4)與I)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼FRRPl的DNA分子。
[0042]上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。[0043]其中，SEQ ID N0.1由2535個(gè)核苷酸組成，其編碼序列是第1_2535位，編碼SEQID N0.2所不的蛋白質(zhì)。
[0044]上述生物材料中，含有I)所述核酸分子的表達(dá)盒，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)FRRPl的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)FRRPl基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止FRRPl轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。所述載體可為克隆載體也可為表達(dá)載體。
[0045]上述生物材料中，8)含有4)所述核酸分子的表達(dá)盒具體可為上述重組載體PTCK303-FRRP1的Ub1-1啟動(dòng)和NOS終止子之間的DNA片段(包括Ub1-1啟動(dòng)和NOS終止子)；9)含有4)所述核酸分子的載體具體可為上述重組載體PTCK303-FRRP1。
[0046]上述應(yīng)用中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體可為水稻。
[0047]所述載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach, 1998, Method for Plant MolecularBiology VIII, Academy Press, New York,pp.411-463;Geiserson and Corey, 1998, PlantMolecular Biology (2nd Edition)。
[0048]所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。
[0049]實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)RRPl基因表達(dá)降低的轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖毡厩缰仓晗啾容^，開花顯著提前，開花時(shí)間提前23-26天。本發(fā)明對(duì)水稻的早熟新品種創(chuàng)制，以及水稻生產(chǎn)具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0050]圖1是PCR擴(kuò)增到的水稻FRRPI基因的電泳圖。
[0051 ] 圖2是干擾載體pTCK303-FRRPl構(gòu)建流程圖。
[0052]圖3是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織再生植株的獲得。
[0053]A:繼代愈傷組織；B:抗性愈傷組織篩選；C:抗性愈傷組織預(yù)分化；D:抗性愈傷組織分化；E:抗性愈傷組織分化為幼苗；F:再生苗誘導(dǎo)生根；G:再生苗煉苗；H:轉(zhuǎn)基因苗種
植在溫室。
[0054]圖4是T1代轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR檢測。
[0055]16為Ikb DNA ladder ； I為質(zhì)粒pTCK303_FRRPl的PCR產(chǎn)物(陽性對(duì)照);2為未轉(zhuǎn)化的水稻PCR產(chǎn)物(陰性對(duì)照)；3-15為轉(zhuǎn)pTCK303-FRRPl水稻PCR產(chǎn)物。
[0056]圖5是T3代轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR檢測。
[0057]I為Ikb DNA ladder ;2:為未轉(zhuǎn)化的水稻PCR產(chǎn)物(陰性對(duì)照)；3:為質(zhì)粒PTCK303-FRRP1 的 PCR 產(chǎn)物(陽性對(duì)照)；4_9:為轉(zhuǎn) pTCK303_FRRPl 水稻 PCR 產(chǎn)物。
[0058]圖6是T3代轉(zhuǎn)基因水稻幼根的⑶S活性檢測。
[0059]a為未轉(zhuǎn)基因水稻幼根；b_c為轉(zhuǎn)pTCK303-FRRPl水稻幼根
[0060]圖1是水稻FRRPl基因在T3代轉(zhuǎn)pTCK303_FRRPl株系中的表達(dá)分析。[0061]圖8是轉(zhuǎn)基因水稻培育至105天的表型觀察結(jié)果。
[0062]a:試驗(yàn)田；b:單株。
【具體實(shí)施方式】
[0063] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0064]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0065]下述實(shí)施例中的pTCK303(ZHENWANG, et al.A Practical Vector for EfficientKnockdown of Gene Expression in Rice(Oryza sativa L.).Plant Molecular BiologyReporter22:409-417, December2004)和水稻日本晴(毛建軍等.水稻品種日本晴粳稻組培培養(yǎng)基的篩選及轉(zhuǎn)稻瘟菌蛋白激發(fā)子基因植株的獲得.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào).2008年第05期)公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以利重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
[0066]實(shí)施例1、降低日本晴中FRRPl基因的表達(dá)得到開花提前的轉(zhuǎn)基因水稻
[0067]1、水稻FRRPl蛋白及其編碼基因的獲得
[0068]用TRIzoI法提取日本晴水稻葉片總RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳證明其完整性且無DNA污染，以完整性好、無污染的RNA為模板，用M-MLV酶(購自TaKaRa生物工程公司)反轉(zhuǎn)錄 RNA 為 cDNA,由 Invitrogen 公司合成引物對(duì)(P1:FRRP1_F:5’ -ATGGATGCCGCAGCTCTTCA-3’ 和 FRRPl-R:5’ -TCAGATCTTC ACCTCCCGAA-3’ )，以水稻 cDNA 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，得到2535bp的目的條帶，回收目的條帶，連接回收產(chǎn)物于PMD18-T simple vector上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒并測序驗(yàn)證。測序結(jié)果表明，該P(yáng)CR產(chǎn)物的核苷酸序列是SEQ ID N0.1。SEQ ID N0.1即為FRRPl的編碼序列，編碼氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì) FRRPI。
[0069]2、pTCK303_FRRPl組成型干擾載體的構(gòu)建
[0070]pTCK303-FRRPl是降低受體水稻——日本晴水稻中的SEQ ID N0.2所示的FRRPl的編碼基因表達(dá)的干擾載體。PTCK303-FRRP1的構(gòu)建方法如下:
[0071]UFRRPl 基因片段-FRRPl-F 和 FRRPl-R 的克隆:
[0072]由 Invitrogen 公司合成擴(kuò)增 FRRPl-F 的引物對(duì) P2:RNAi_F11641-2140:-atGAGCTCAAAAGCAGCAAATGAAGCGG-3，和 RNALR1IedUHO:5’ -at ACTAGTCCTTCTCTGCATCTGATACC-3’ ；以及擴(kuò)增 FRRPl-R 的弓丨物對(duì) P3:RNAi_F21641_2140:5’ -at GGATCCAAAAGCAGCA AATGAAGCGG-3’ 和 RNAi_R2164卜2140:5’ -at GGTACC CCTTCTCTGCATCTGATACC-3’。其中下劃線標(biāo)示的GAGCTC為Sac I酶切位點(diǎn)，ACTAGT為Spe I酶切位點(diǎn)；GGATCC為BamH I酶切位點(diǎn)，GGTACC為Kpn I酶切位點(diǎn)。以日本晴水稻cDNA為模板，分別用P2和P3進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將得到的片段分別插入pMD18-T simple載體(購自TaKaRa生物工程公司)，得到載體PMD18-T simple-FRRPl-F和pMD18-T simple-FRRPl-R，經(jīng)過測序驗(yàn)證，得到的片段FRRPl-F和FRRPl-R均具有SEQ ID N0.1的第1641-2140位核苷酸序列。
[0073]2、干擾載體pTCK303-FRRPl的構(gòu)建:通過Spe I和Sac I雙酶切載體pMD18_Ts imp Ie-FRRP 1-F，Kpn I 和 BamH I 雙酶切載體 pMD18_T simple-FRRPl-R，分別回收目標(biāo)片段FRRPl-F和FRRP1-F，將片段FRRPl-F與經(jīng)Spe I和Sac I酶切過的載體pTCK303 (中國科學(xué)院植物研究所種康老師惠贈(zèng))連接，得到中間載體PTCK303-FRRP1-F，驗(yàn)證中間載體pTCK303-FRRPl-F正確后，再將片段FRRPl-R與經(jīng)Kpn I和BamH I酶切過的中間載體PTCK303-FRRP1-F連接，得到最終的干擾載pTCK303-FRRPl。表達(dá)載體詳細(xì)構(gòu)建如說明書附圖圖2。
[0074]3、pTCK303_FRRPl組成型干擾載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻
[0075]農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備:挑取根癌農(nóng)桿菌EHA105 (抗生素抑制農(nóng)桿菌的效果及對(duì)條斑紫菜生長發(fā)育的影響，王萍等水產(chǎn)科學(xué)，2009 28 (7)，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得)單菌落接種于100ml YEP液體培養(yǎng)基中，220rpm28°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl=0.5 ;轉(zhuǎn)入無菌離心管,5000rpm離心5min,去上清,加入IOml預(yù)冷的0.15M的CaCl2溶液,輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置20min ;4°C, 5000rpm離心5min,去上清,加入4mI預(yù)冷的含10%甘油的0.15M的CaCl2溶液，輕輕懸??；農(nóng)桿菌懸浮液分裝于無菌印pendorf管中，每管200 μ I于液氮中速凍lmin，凍存于-70°C。
[0076]表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105:取I μ g的表達(dá)載體pTCK303_FRRPl加入到200 μ IΕΗΑ105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，靜止5min ;液氮中速凍lmin，42°C水浴5min，加入1ml YEP液體培養(yǎng)基，28 °C 180rpm振蕩培養(yǎng)4h ；5000rpm離心5min,棄上清，加入0.1ml YEP液體培養(yǎng)基，重新懸浮細(xì)胞；涂布于含50μ g/ml Kan和50 μ g/ml利福平的YEP固體平板上，28 °C培養(yǎng)約48h。PCR鑒定陽性克隆，鑒定所用引物對(duì)P2: RNA^F11641-2140:5，-atGAGCTC AAAAGCAGCAAATGAAGCGG-3’ 和 RNALR1Ie^IHO:5’-at ACTAGT CCTTCTCTGCATCTGATACC-3’。結(jié)果顯示載體pTCK303_FRRPl已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。得到含有PTCK303-FRRP1的重組農(nóng)桿菌EHA105/pTCK303_FRRPl。同時(shí)按照上述方法制備含有PTCK303 的重組農(nóng)桿菌 EHA105/pTCK303。
[0077]轉(zhuǎn)化水稻:將EHA105/pTCK303-FRRPl 或 EHA105/pTCK303 接種于 IOml 含 100 μ g/mlKan和50 μ g/ml利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；轉(zhuǎn)化前一天以1:50比例濃度接種于200ml含相同抗生素的YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h，5000rpm, 5min離心集菌，菌體懸浮于加有AS (乙酰丁香酮)100μΜ的AAM液體培養(yǎng)基中，28°C、220r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)24h，調(diào)整濃度至OD6tltl=L 5~2.0，即為共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化水稻用的農(nóng)桿菌懸浮液，轉(zhuǎn)化水稻日本晴愈傷組織。具體方法是:將繼代培養(yǎng)5-7天，色澤淡黃的水稻日本晴愈傷組織放入100mL無菌三角瓶中，加入20ml農(nóng)桿菌懸浮液，略微搖動(dòng)后靜置30min，后將愈傷置于無菌濾紙上，在超凈工作臺(tái)中吹干30min，最后將愈傷組織置于添加100μΜ AS(乙酰丁香酮)的共培養(yǎng)培養(yǎng)(PH5.2基上，25°C暗培養(yǎng)3d。
[0078]抗性愈傷組織的篩選:挑取共培養(yǎng)后的愈傷組織于無菌三角瓶中，用無菌水清洗至水中沒有可見的絲狀菌體為止，然后轉(zhuǎn)入含250mg/L羧芐青霉素的無菌水中浸泡60min，于無菌濾紙上晾干。轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基(NB+300mg/L酪蛋白酶解物+500mg/L脯氨酸+30g/L 蔗糖 +12g/L 瓊脂 +2mg/L2，4-D+100uM AS+250mg/L 羧芐青霉素 +30mg/L 潮霉素；pH5.8-5.9)上篩選抗性愈傷組織。
[0079] 抗性愈傷組織繼代:每兩周將愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的選擇培養(yǎng)基上，第二次繼代再附加50mg/L Hyg的選擇培養(yǎng)基((NB+300mg/L酪蛋白酶解物+500mg/L脯氨酸+30g/L鹿糖+12g/L瓊脂+2mg/L2，4-D+100uM AS+250mg/L羧芐青霉素+50mg/L潮霉素；ΡΗ5.8-5.9))上，約需三周即可見瘤狀抗性愈傷組織從干癟的愈傷中長出。每兩周繼代于選擇培養(yǎng)基上(可不加羧芐青霉素)。
[0080]抗性愈傷組織分化:待愈傷長大后可挑選抗性愈傷的一部分轉(zhuǎn)移至倒入組培瓶中的分化培養(yǎng)基(NB+300mg/L酪蛋白酶解物+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+12g/L瓊脂+2mg/L2, 4-D+10mg/LKT+0.4mg/LNAA ；pH5.8-5.9)上，每瓶中可放置4-5塊的同一克隆的愈傷組織，兩周后愈傷組織開始轉(zhuǎn)綠，三周后即可長出幼芽，隨后根也長出。
[0081]生根:將幼苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(l/2MS+30g/L蔗糖+12g/L瓊脂+30g/L潮霉素B ；pH5.8-5.9)上，每管I克隆，待幼苗生根長成后，移出，洗凈根上的培養(yǎng)基后，移至溫室盆栽，如說明書附圖圖3。
[0082]4、轉(zhuǎn)化水稻后代的篩選
[0083]轉(zhuǎn)基因水稻后代的篩選技術(shù)(一)PCR檢測:以轉(zhuǎn)基因水稻Tl代植株基因組DNA為模板，質(zhì)粒PTCK303-FRRP1為陽性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化水稻的基因組DNA為陰性對(duì)照，由Invitrogen公司合成引物對(duì)P4 (RNAi_F11641-2140:-atGAGCTC AAAAGCAGCAAATGAAGCGG-3> ,和 RNAi_303F:5’ -at TGAAAATCTCGAAACAGCCGTGTCATAGTC-3’)，PCR 擴(kuò)增 978bp 的目的片段。引物對(duì) P4 中，引物 RNAi_FJ641-2140 在基因 FRRP1500bp 序列中，引物 RNAi_303F 在載體 pTCK303Intron 序列中。
[0084]反應(yīng)體系(總體積50 μ I):
[0085]
【權(quán)利要求】
1.培育提前開花的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括降低受體植物中FRRPl表達(dá)得到開花時(shí)間早于所述受體植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述FRRPl是如下a)或b)的蛋白質(zhì): a)氣基酸序列如SEQID N0.2所不的蛋白質(zhì)； b)將SEQID N0.2中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花相關(guān)的由a )衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述降低受體植物中FRRPl表達(dá)是通過將如下式I所示的DNA片段導(dǎo)入目的植物中實(shí)現(xiàn)的: SEQ正向-X-SEQ反向
(I) 所述SEQtt選自SEQ ID N0.1且包括SEQ ID N0.1的第1641-2140位核苷酸； 所述SEQ的序列與所述序列反向互補(bǔ)； 所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ1向及所述SEQfi^1均不互補(bǔ)。
3.如權(quán)利要求 2所述的方法，其特征在于:所述核苷酸序列是SEQID N0.1的第1641-2140位核苷酸。
4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述單子葉植物為水稻。
6.FRRPl在調(diào)控植物開花時(shí)間中的應(yīng)用；所述FRRPl是如下a)或b)的蛋白質(zhì): a)氣基酸序列如SEQID N0.2所不的蛋白質(zhì)； b)將SEQID N0.2中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花相關(guān)的由a )衍生的蛋白質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述單子葉植物為水稻。
9.下述至少一種生物材料在調(diào)控植物開花時(shí)間中的應(yīng)用: 1)編碼FRRPl的核酸分子，所述FRRPl是如下a)或b)的蛋白質(zhì): a)氣基酸序列如SEQID N0.2所不的蛋白質(zhì)； b)將SEQID N0.2中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)； 2)含有I)所述核酸分子的表達(dá)盒； 3)含有I)所述核酸分子的載體； 4)序列與I)所述核酸分子反向互補(bǔ)的核酸分子； 5)含有序列與I)所述核酸分子反向互補(bǔ)的核酸分子的表達(dá)盒； 6)含有序列與I)所述核酸分子反向互補(bǔ)的核酸分子的載體； 7)核苷酸序列是SEQID N0.1的第1641-2140位核苷酸的DNA分子； 8)含有4)所述核酸分子的表達(dá)盒； 9)含有4)所述核酸分子的載體。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體可為水稻。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK103966211SQ201310027608
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月24日
【發(fā)明者】王濤, 杜軼威, 董江麗 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)