專利名稱：利用克雷伯氏肺炎桿菌兩段發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-d-葡萄糖酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，特別是涉及一種利用克雷伯氏肺炎桿菌兩段發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。
背景技術(shù)：
2-酮基-D-葡萄糖酸是一種大規(guī)模生產(chǎn)的有機酸，其可以用作水泥增塑劑、洗滌齊U，其鈣鹽可以用作食品添加劑用于增強鈣，2-酮基-D-葡萄糖酸還可以作為前體用于合成殺蟲劑、阿拉伯糖核糖等。目前發(fā)酵生產(chǎn)的2-酮基-D-葡萄糖酸主要直接用于合成D-異抗壞血酸，D-異抗壞血酸與L-抗壞血酸(維生素C)抗氧化作用相似，廣泛用于食品添加劑替代 L-抗壞血酸Mei Chia, Thi Bich Van Nguyen, Won Jae Choi, DO-stat fed-batchproduction of2-keto_D-gluconic acid from cassava using immobilized Pseudomonasaeruginosa. Appl Microbiol Biotechnol(2008)78:759 - 765。利用熒光假單胞菌發(fā)酵法生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸主要采用流加批次發(fā)酵進行孫文敬，趙峰梅，楊慶文，郭金權(quán)，秦麗，劉敬澤，補料分批培養(yǎng)生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的研究，食品科學(xué)，2004，25(11)，115-117。也有采用固定化細胞進行發(fā)酵的Mei Chia, ThiBich Van Nguyen, Won Jae Choi, DO-stat fed-batch production of2-keto_D-gluconicacid from cassava using immobilized Pseudomonas aeruginosa. Appl MicrobiolBiotechnol (2008) 78:759 - 765。利用氧化葡萄糖酸桿菌生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸有利用靜息細胞催化的方法進行生產(chǎn)的陳鴻勝，李克非，舒行宙，劉瀏，林金萍，魏東芝，基于Gluconobacter oxydans膜結(jié)合脫氫酶的靜息細胞催化合成2_酮基_D_葡萄糖酸,食品工業(yè)科技，2012，33 (19)，177-180。在克雷伯氏肺 炎桿菌生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的方法中有利用連續(xù)培養(yǎng)進行發(fā)酵的Hommes R, Postma P, Tempest D, Neijssel O (1989) The influence of the culturepH value on the direct glucose oxidative pathway in Klebsiella pneumoniaeNCTC418. Archives of Microbiologyl51 (3) : 261-267。本發(fā)明人利用 2，3-丁二醇合成途徑缺失的克雷伯氏肺炎桿菌為生產(chǎn)菌株，利用葡萄糖為底物生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸，具有較高的底物轉(zhuǎn)化率(專利申請?zhí)?01210476925. 4)。但為了提高生產(chǎn)強度和產(chǎn)物終濃度，需要開發(fā)更為高效的生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用克雷伯氏肺炎桿菌兩段發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。該方法具有較高底物轉(zhuǎn)化率，并能獲得較高產(chǎn)物終濃度。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的利用克雷伯氏肺炎桿菌兩段發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，包括第一階段主要進行克雷伯氏肺炎桿菌的菌體生長，第二階段主要進行2-酮基-D-葡萄糖酸合成。
對于上述生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其步驟包括I)第一階段發(fā)酵培養(yǎng)配制培養(yǎng)基，滅菌后，在培養(yǎng)基中接入克雷伯氏肺炎桿菌進行好氧培養(yǎng)，并保持充足供氧以及在該培養(yǎng)過程中，利用堿控制發(fā)酵液PH處于中性或接近中性條件；其中，培養(yǎng)基包括底物葡萄糖、氮源和無機鹽；氮源包括酵母粉、酵母膏、蛋白胨、玉米漿、硫酸銨、尿素和硝酸銨；無機鹽包括鈉鹽、鎂鹽、鐵鹽、磷酸鹽和錳鹽；本步驟中，中性培養(yǎng)條件適宜菌體生長，能使菌體大量增加；2)第二階段發(fā)酵培養(yǎng)第一階段培養(yǎng)結(jié)束后，繼續(xù)進行菌體的發(fā)酵培養(yǎng)，并停止或減慢堿的加入，利用菌體生長產(chǎn)生的有機酸使得培養(yǎng)基的pH逐漸降低到酸性條件或用酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液處于酸性條件，然后用堿控制發(fā)酵液穩(wěn)定于酸性條件；本步驟中，酸性條件下菌體生長被抑制，菌體利用葡萄糖氧化生成2-酮基-D-葡萄糖酸；3)在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，當培養(yǎng)基中的底物葡萄糖消耗到O 50g/L時，補加葡萄糖。所述步驟I)中，好氧培養(yǎng)的溫度為20 45°C，優(yōu)選35 40°C ;步驟I)中，待菌生長到菌體濃度為0D_1 20時，結(jié)束第一階段培養(yǎng)，優(yōu)選為0D_5 15。所述步驟1)、2)中，堿包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、碳酸鈣、碳酸鈉和碳酸氫鈉。所述步驟I)中，發(fā)酵液pH處于中性或接近中性條件為發(fā)酵液pH處于6 8，優(yōu)選為 6. 5 7. 5。所述步驟2)中，第二階段發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20 45°C，優(yōu)選35 40°C，培養(yǎng)時間為5 50小時；酸性條件為發(fā)酵液pH處于4 6,優(yōu)選為4. 5 5. 5。所述步驟2)的用酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液處于酸性條件中，酸包括2_酮基-D-葡萄糖酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、鹽酸、硝酸、磷酸和硫酸。 所述步驟3)中，優(yōu)選當培養(yǎng)基中的底物葡萄糖消耗到20 40g/L時，補加葡萄糖。本發(fā)明所用的克雷伯氏肺炎桿菌，較優(yōu)的選用2，3-丁二醇合成途徑阻斷的克雷伯氏肺炎桿菌。其中，2，3- 丁二醇合成途徑阻斷的克雷伯氏肺炎桿菌的制備方法，可通過對克雷伯氏肺炎桿菌2，3- 丁二醇合成途徑中乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脫羧酶基因或雙乙酰氧化還原酶基因進行失活，實現(xiàn)克雷伯氏肺炎桿菌合成2，3- 丁二醇能力的阻斷。如對于乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脫羧 酶基因或雙乙酰氧化還原酶基因進行失活，可通過基因突變進行失活，該基因突變包括基因重組，優(yōu)選為通過基因同源重組進行失活。本發(fā)明所用克雷伯氏肺炎桿菌在中性pH條件下適宜菌體生長，可以獲得較多的菌體量，但是中性條件下產(chǎn)生2-酮基-D-葡萄糖酸能力很弱。酸性條件下有利于產(chǎn)物2-酮基-D-葡萄糖酸合成，但是菌體生長受到抑制。本發(fā)明分兩段進行發(fā)酵，先在中性條件下培養(yǎng)使得菌體大量繁殖，獲得較多的菌體量，然后將發(fā)酵液的PH控制在酸性條件，由于第一階段已經(jīng)獲得大量菌體，第二階段在酸性條件下培養(yǎng)時，菌體量已經(jīng)較高，可以獲得較快的產(chǎn)物2-酮基-D-葡萄糖酸合成速率，同時在葡萄糖消耗到低水平后補加葡萄糖，可以獲得較高的產(chǎn)物終濃度。本發(fā)明生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，具有較高底物轉(zhuǎn)化效率，又具有較快的生產(chǎn)強度并獲得較高2-酮基-D-葡萄糖酸產(chǎn)物終濃度。
具體實施例方式以下實施例中，所用試劑如未特別說明，均為商業(yè)化產(chǎn)品。另外，對于以下實施例所獲得的發(fā)酵液中組分(如葡萄糖和2-酮基-D-葡萄糖酸)的測定采用高效液相色譜儀，利用HPX-87H色譜柱，視差檢測器對發(fā)酵液組分進行檢測。以下實施例中涉及的構(gòu)建的2，3-丁二醇合成途徑阻斷的克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366-budA 其具體的構(gòu)建方法如下1、利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌乙酰乳酸脫羧酶基因(budA)。根據(jù)克雷伯氏肺炎桿菌MGH78578 (Genbank: CP000647)基因組信息，設(shè)計乙酰乳酸脫羧酶 PCR 引物，上游引物 budA-s :GAAGATCAGAACATCGCCAGA (SEQ ID NO.1 所示)，下游引物 budA-a :CTCTGATGGACCTGCTTCGCCTTAT (SEQ ID NO. 2 所示)。通過上述引物，以克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366 (CGMCC1. 6366菌株為中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，具有氨芐青霉素抗性)基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，獲得乙酰乳酸脫羧酶基因片段，通過TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)連接到pMD_18Tsimple質(zhì)粒上,命名為pMD18T_budA質(zhì)粒,序列測定結(jié)果如下budA基因相鄰上游部分序列為

GAAGATCAGAACATCGCCAGAAAGCGTTTCACCGTGCGCGAGCGCTCGAAGCGCCGCCAGGCGATGGCGATATCGG TCTTCAGCGGTGCCCCGCTGAGCGGGTGATAGCTGACGTTCGGCTGTTGAATGCAGGTCATCGACTGCGGGACCAGCGCG AAGCCGAACCCGGCATTGACCATGCTCAGCGATGACGAAATCTGCGACGACTGCCAGGCGCGCTCCATATCGATGCCGGC GCGCAGGCAGCTGTTGTACACCAGCTCATACAGCCCCGGGGCCACCTCCCGCGGGA (SEQID NO. 3 所示)。budA基因閱讀框為AGAGAGTCTGTGCGAAACCCTGCGGGCGTTTTCCGCGCAGCATCCCGAGAGCGTGCTCTATCAGACATCGCTCATG AGCGCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCGCGGACCTGCTGAAGCACGGCGATTTCGGTCTCGGCAC CTTTAATGAGCTGGACGGGGAGCTGATCGCCTTCAGCAGTCAGGTCTATCAGCTGCGGGCCGACGGCAGCGCGCGCAAAG CCCAGCCGGATCAGAAAACGCCGTTCGCGGTGATGACCTGGTTCCAGCCGCAGTACCGGAAAACCTTCGACCATCCGGTG AGCCGCCAGCAGCTGCACGAGGTGATCGACCAGCAAATCCCCTCTGACAACCTGTTCTGCGCCCTGCGCATCGACGGCCA TTTCCGCCATGCCCATACCCGCACCGTGCCGCGCCAGACGCCGCCGTACCGGGCGATGACCGACGTCCTCGACGATCAGC CGGTGTTCCGCTTTAACCAGCGCGAAGGGGTGCTGGTCGGCTTCCGTACCCCACAGCATATGCAGGGGATCAACGTCGCC GGGTATCACGAGCACTTTATAACCGATGACCGCAAAGGCGGCGGTCACCTGCTGGATTACCAGCTCGACCACGGGGTATT GACCTTCGGCGAAATTCACAAGCTGATGATCGACCTGCCCGCCGACAGCGCGTTCCTGCAGGCCAATCTGCATCCCGATA ATCTCGATGCCGCCATCCGTTCCGTAGAAAGTTAAGGGGGTCACATGGACAAACAGTATCCGGT (SEQ ID NO. 4 所示)。budA基因相鄰下游部分序列為ACGCCAGTGGGCGCACGGCGCCGATCTCGTCGTCAGCCAGCTGGAAGCCCAGGGGGTACGTCAGGTGTTCGGCATC CCTGGCGCCAAAATCGACAAGGTATTCGACTCACTGCTGGATTCCTCCATTCGCATTATTCCGGTACGCCACGAAGCTAA CGCCGCCTTTATGGCCGCCGCCGTCGGGCGCATTACCGGTAAAGCGGGCGTGGCGCTGGTCACCTCCGGTCCGGGCTGTT CCAACCTGATCACCGGTATGGCCACCGCCAACAGCGAAGGCGACCCGGTGGTGGCCCTGGGCGGCGCGGTGAAACGCGCC GATAAGGCCAAACAGGTCCACCAGAG (SEQ ID NO. 5 所示)。2、利用步驟I克隆到的基因序列，制備兩側(cè)連有同源臂中間連接抗性核的DNA片段。本步驟中的操作，采用在大腸桿中利用Red重組酶催化，具有同源臂連接抗性核的DNA片段與pMD18T-budA質(zhì)粒進行同源重組，獲得pMD18T_budA質(zhì)粒上失活的budA基因，利用該質(zhì)粒作為模板通過PCR擴增具有長的同源臂的DNA片段，該片段兩側(cè)連有與budA基因上下游序列同源的序列，中間連接抗性核。本步驟操作原理可參見(Weiet. al. Red recombinase assistedgene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal of IndustrialMicrobiology&Biotechnology2012),具體步驟如下a. pMD18T-budA質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化到含有pIJ790質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 a -pIJ790中， 命名為 DH5 a -pMD18T-budA。制備DH5a-pMD18-budA感受態(tài)細胞，在菌體培養(yǎng)I個小時后，添加10mmol/L的阿拉伯糖，誘導(dǎo)PIJ790質(zhì)粒中Red重組酶的表達。b.設(shè)計引物budA_s2和budA_a2，序列分別為GCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCATTCCGGGGATCCGTCGACC (SEQ IDNO. 6所示)和TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ IDNO. 7所示)。弓丨物budA-s2 的 “GCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATC” 序列與 budA 基因序列同源，引物 budA-a2 的“TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGA”序列與 budA基因相應(yīng)序列同源。利用引物budA_s2和budA_a2，以質(zhì)粒pIJ778為模板擴增出長約1491bp的DNA片段A。該片段兩段分別具有與budA序列同源的同源臂，中間包含了來源于pIJ778質(zhì)粒的鏈霉素抗性基因aadA。c.利用DNA片段A轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a-pMD18T-budA感受態(tài)細胞。利用電擊轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化電壓為2000V，選擇鏈霉素抗性的菌株，鏈霉素用量為50mg/L。DNA片段A兩側(cè)的同源序列與質(zhì)粒pMD18T_budA上的budA同源部分發(fā)生重組，獲得了 pMD18T-A 質(zhì)粒。d.利用引物 budA-s (SEQ ID NO.1 所示)和 budA-a (SEQ ID NO. 2 所示)，以PMD18T-A質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，獲得3114bp的DNA片段B。DNA片段B兩端分別具有1131bp和571bp的budA基因和相鄰序列，該序列作為同源臂。DNA片段B中間具有鏈霉素抗性基因aadA，DNA片段B用于進行CGMCC1. 6366染色體上budA基因重組的線性DNA片段。3、利用轉(zhuǎn)化或結(jié)合方法將制備的DNA片段B轉(zhuǎn)入到克雷伯氏肺炎桿菌中，利用同源重組與染色體上的乙酰乳酸脫羧酶基因進行重組，篩選獲得乙酰乳酸脫羧酶基因失活的菌株，具體步驟如下
a.將 pDK6-red 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 CGMCC1. 6366 中，獲得 CGMCC1. 6366-pDK6_red 菌株，線性DNA片段B電擊轉(zhuǎn)化CGMCC1. 6366-pDK6-red感受態(tài)細胞。利用鏈霉素篩選抗性菌株。b.重組菌的驗證，設(shè)計驗證引物 Yanzheng778z AGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAG(SEQID NO. 8所示)，其序列對應(yīng)鏈霉素抗性基因aadA中間的一段序列。利用引物budA-s (SEQ ID NO.1所示)和Yanzheng778z,以長出的菌株總DNA為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物DNA片段為1889bp，而以出發(fā)菌株CGMCC1. 6366總DNA為模板進行PCR無特異性條帶，表明獲得的重組菌正確，命名為CGMCC1. 6366-budA_。該菌株的乙酰乳酸脫羧酶基因通過同源重組而失活。另外，利用CGMCC1. 6366出發(fā)菌株和CGMCC1. 6366-budA-菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，利用氣相色譜和液相色譜對發(fā)酵液各組分進行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CGMCC1. 6366-budA-菌株中，未檢測出2，3- 丁二醇含量，說明CGMCC1. 6366-budA-菌株的2，3- 丁二醇合成途徑已經(jīng)阻斷。實施例1利用克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366菌株(CGMCC1. 6366菌株為中國普通微生物
菌種保藏管理中心保藏)發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸，其步驟如下I)將葡萄糖和其他組分配制成培養(yǎng)基葡萄糖50g/L,玉米衆(zhòng)4g/L,酵母粉5g/L,蛋白胨5g/L,氯化鈉7g/L自來水配置。2)種子培養(yǎng) 配制好的培養(yǎng)基，分裝到250ml錐形瓶中，裝液量50ml，并加入Ig碳酸鈣。滅菌后接入克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366菌株，37°C搖床好氧培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)每分鐘，培養(yǎng)12小時。3)第一階段發(fā)酵培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐中裝入3L配制好的培養(yǎng)基，滅菌后接入50ml種子培養(yǎng)物，37°C，通風(fēng)量4L/分鐘，攪拌槳轉(zhuǎn)速為500轉(zhuǎn)每分鐘，利用氫氧化鈉溶液控制發(fā)酵液pH保持7. 5，培養(yǎng)3小時，測定菌體濃度0D_為5。4)第二階段發(fā)酵培養(yǎng)將發(fā)酵罐中發(fā)酵液pH設(shè)定為pH4. 5，繼續(xù)培養(yǎng)3小時后，發(fā)酵液pH逐漸降低到4. 5后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使得發(fā)酵液PH保持在pH4. 5。繼續(xù)培養(yǎng)，及時取樣測定發(fā)酵液中底物葡萄糖的濃度，保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度大于10g/L。培養(yǎng)28小時后，測定發(fā)酵液中產(chǎn)物2-酮基-D-葡萄糖酸為153g/L。計算生產(chǎn)強度為5. 46克每升每小時，底物轉(zhuǎn)化率O. 95mol/mol。實施例2利用CGMCC1. 6366菌株(CGMCC1. 6366菌株為中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏)發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸，其步驟如下I)將葡萄糖和其他組分配制成培養(yǎng)基葡萄糖150g/L,玉米衆(zhòng)4g/L,酵母粉5g/L,蛋白胨5g/L,氯化鈉7g/L自來水配置。2)種子培養(yǎng)配制好的培養(yǎng)基，分裝到250ml錐形瓶中，裝液量50ml，并加入Ig碳酸鈣。滅菌后接入克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366菌株，37°C搖床好氧培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)每分鐘，培養(yǎng)12小時。3)第一階段發(fā)酵培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐中裝入3L配制好的培養(yǎng)基，滅菌后接入50ml種子培養(yǎng)物，37°C，通風(fēng)量4L/分鐘，攪拌槳轉(zhuǎn)速為600轉(zhuǎn)每分鐘，利用氫氧化鉀溶液控制發(fā)酵液pH保持6. 5，培養(yǎng)6小時，測定菌體濃度0D_為15。4)第二階段發(fā)酵培養(yǎng)將發(fā)酵罐中發(fā)酵液pH設(shè)定為pH5. 5，繼續(xù)培養(yǎng)2小時后，發(fā)酵液pH逐漸降低到5. 5后用氫氧化鉀調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使得發(fā)酵液PH保持在pH5. 5。繼續(xù)培養(yǎng)，及時取樣測定發(fā)酵液中底物葡萄糖的濃度，保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度大于等于50g/L。培養(yǎng)26小時后，測定發(fā)酵液中產(chǎn)物2-酮基-D-葡萄糖酸為141g/L。計算生產(chǎn)強度為5. 42克每升每小時，底物轉(zhuǎn)化率O. 92mol/mol。實施例3 利用上述構(gòu)建的2，3- 丁二醇合成途徑阻斷的克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366-budA_發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸，其步驟如下I)將葡萄糖和其他組分配制成培養(yǎng)基葡萄糖100g/L,玉米衆(zhòng)4g/L,酵母粉5g/L,蛋白胨5g/L,氯化鈉7g/L自來水配置。2)種子培養(yǎng)配制好的培養(yǎng)基，分裝到250ml錐形瓶中，裝液量50ml，并加入Ig碳酸鈣。滅菌后接入克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366-budA_菌株，37°C搖床好氧培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)每分鐘，培養(yǎng)12小時。3)第一階段發(fā)酵培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐中裝入3L配制好的培養(yǎng)基，滅菌后接入50ml種子培養(yǎng)物，37°C，通風(fēng)量4L/分鐘，攪拌槳轉(zhuǎn)速為600轉(zhuǎn)每分鐘，利用氫氧化鈉溶液控制發(fā)酵液pH保持7，培養(yǎng)4小時，測定菌體濃度0D_為8。4)第二階段發(fā)酵培養(yǎng)將發(fā)酵罐中發(fā)酵液pH設(shè)定為pH5，繼續(xù)培養(yǎng)I小時后，發(fā)酵液pH逐漸降低到5后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵液，使得發(fā)酵液PH保持在pH5。繼續(xù)培養(yǎng)，及時取樣測定發(fā)酵液中底物葡萄糖的濃度，保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度大于30g/L。培養(yǎng)34小時后，測定發(fā)酵液中產(chǎn)物2-酮基-D-葡萄糖酸為177g/L。計算生產(chǎn)強度為5. 20克每升每小時，底物轉(zhuǎn)化率O. 98mol/mol。
權(quán)利要求
1.一種利用克雷伯氏肺炎桿菌兩段發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于，包括第一階段主要進行克雷伯氏肺炎桿菌的菌體生長，第二階段主要進行2-酮基-D-葡萄糖酸合成。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法，其步驟包括 1)第一階段發(fā)酵培養(yǎng) 配制培養(yǎng)基，滅菌后，在培養(yǎng)基中，接入克雷伯氏肺炎桿菌進行好氧培養(yǎng)，并保持充足供氧以及在該培養(yǎng)過程中，利用堿控制發(fā)酵液PH處于中性或接近中性條件； 2)第二階段發(fā)酵培養(yǎng) 第一階段培養(yǎng)結(jié)束后，繼續(xù)進行菌體的發(fā)酵培養(yǎng)，并停止或減慢堿的加入，利用菌體生長產(chǎn)生的有機酸使得培養(yǎng)基的PH逐漸降低到酸性條件或用酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液處于酸性條件，然后用堿控制發(fā)酵液穩(wěn)定于酸性條件； 3)在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，當培養(yǎng)基中的底物葡萄糖消耗到O 50g/L時，補加葡萄糖。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，培養(yǎng)基包括底物葡萄糖、氮源和無機鹽；其中，氮源包括酵母粉、酵母膏、蛋白胨、玉米漿、硫酸銨、尿素和硝酸銨；無機鹽包括鈉鹽、鎂鹽、鐵鹽、磷酸鹽和錳鹽； 步驟I)的好氧培養(yǎng)的溫度為20 45°C，待菌生長到菌體濃度為OD_l 20時，結(jié)束第一階段培養(yǎng)； 步驟I)的發(fā)酵液PH處于中性或接近中性條件為發(fā)酵液pH處于6 8。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述好氧培養(yǎng)的溫度為35 40°C，待菌生長到菌體濃度為OD_5 15時，結(jié)束第一階段培養(yǎng)； 步驟I)的發(fā)酵液PH處于中性或接近中性條件為發(fā)酵液pH處于6. 5 7. 5。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟1)、2)中，堿包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、碳酸鈣、碳酸鈉和碳酸氫鈉。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，第二階段發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20 45°C，培養(yǎng)時間為5 50小時； 步驟2)的用酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液處于酸性條件中，酸包括2_酮基-D-葡萄糖酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、鹽酸、硝酸、磷酸和硫酸； 步驟2)的酸性條件為發(fā)酵液pH處于4 6。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述第二階段發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為35 40 0C ； 步驟2)的酸性條件為發(fā)酵液pH處于4. 5 5. 5。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，當培養(yǎng)基中的底物葡萄糖消耗到20 40g/L時，補加葡萄糖。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述克雷伯氏肺炎桿菌為2，3-丁二醇合成途徑阻斷的克雷伯氏肺炎桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用克雷伯氏肺炎桿菌兩段發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，包括第一階段主要進行克雷伯氏肺炎桿菌的菌體生長，第二階段主要進行2-酮基-D-葡萄糖酸合成。本發(fā)明生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，具有較高底物轉(zhuǎn)化效率，又具有較快的生產(chǎn)強度并獲得較高2-酮基-D-葡萄糖酸產(chǎn)物終濃度。
文檔編號C12R1/22GK103045661SQ20131001278
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者郝健, 魏東, 柳鵬福, 孫月紅, 史吉平, 姜標 申請人:上海中科高等研究院