克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2r,3r-丁二醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2R,3R-丁二醇的方法，在氧限制條件下，以甘油為碳源，通過丁二醇還原酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2R,3R-丁二醇。利用本發(fā)明的方法獲得的產(chǎn)物2R,3R-丁二醇，具有很高的光學純度。
【專利說明】克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2R, 3R- 丁二醇的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)2R，3R-丁二醇的方法，特別涉及到一種克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2R，3R-丁二醇的方法。
【背景技術】
[0002]克雷伯氏肺炎桿菌是一種重要的工業(yè)微生物，用于生產(chǎn)1，3-丙二醇、2，3- 丁二醇、乙偶姻和2-酮基-D-葡萄糖酸等工業(yè)產(chǎn)品。
[0003]2，3-丁二醇是一種大宗化學品，其可用于合成塑料和橡膠等行業(yè)，同時也被認為是一種潛在的生物燃料，2S，3S-丁二醇和2R，3R-丁二醇由于凝固點較低，可用于防凍劑(Celinska E,Grajek ff, Biotechnological production of 2,3-butanediol-Currentstate and prospects.Biotechnol Adv, 2009，27，715-725)。2，3_ 丁二醇有兩個手性碳，形成內消旋_2，3- 丁二醇，2S, 3S- 丁二醇和2R，3R- 丁二醇三種立體異構體。2S，3S- 丁二醇和2R，3R- 丁二醇是對映異構體，結晶點和沸點等性質相同。
[0004]有多種微生物可以合成2，3-丁二醇，其中多粘芽孢桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、克雷伯氏產(chǎn)酸桿菌和粘質沙雷氏菌具有較高的2，3-丁二醇生產(chǎn)性能，是具有工業(yè)應用前景的菌株。目前報道芽孢桿菌主要生成2R，3R 丁二醇，伴隨少量內消旋-2，3-丁二醇；而克雷伯氏菌屬細菌主要生成內消旋_2，3- 丁二醇并伴隨少量2S，3S- 丁二醇(Ui S，MasudaT，Masuda H，Muraki H，Mechanism for the formation of2，3—butanediol stereoisomersin Bacillus polymyxa.J Ferment Technol，1986，64，481-486)。
[0005] 在克雷伯氏菌屬中，2，3- 丁二醇合成途徑始于丙酮酸，兩分子丙酮酸脫羧形成一分子乙酰乳酸，乙酰乳酸在脫羧酶的催化下脫羧形成R-乙偶姻(3-羥基-2-丁酮)，乙偶姻在丁二醇還原酶的催化下消耗NADH形成內消旋-2，3- 丁二醇。乙酰乳酸可以通過非酶催化形成雙乙酰，雙乙酰在丁二醇脫氫酶的催化下還原形成S-乙偶姻，S-乙偶姻進一步在丁二醇脫氫酶的催化下還原形成2S, 3S-丁二醇(Xiao Z, Xu P, Acetoin metabolism inbacteria.Crit Rev microbial, 2007, 33, 127-140)。
[0006]微生物生產(chǎn)的2，3- 丁二醇是兩種異構體的混合物，目前有相關報道利用基因工程菌株來生產(chǎn)單一立體構型的2，3- 丁二醇。
[0007]在克雷伯氏菌屬中，丁二醇脫氫酶由budC基因編碼，該酶具有將乙偶姻還原成丁二醇的能力，也具有將雙乙酰還原成S-乙偶姻的能力，其對底物的酮基還原后形成S構型羥基；因此該酶還原R-乙偶姻形成內消旋-2，3- 丁二醇，還原S-乙偶姻形成2S，3S- 丁二醇。通過在大腸桿菌中表達來源于克雷伯氏肺炎桿菌的丁二醇脫氫酶基因，同時表達解糖短桿菌的丁二醇脫氫酶，獲得的工程菌株可以利用雙乙酰生產(chǎn)2S，3S- 丁二醇(Ui S.etal., Production of 1-2，3-butanediol by a new pathway constructed in Escherichiacoli Lett.App1.Microbiol., 2004, 39, 533 - 537)。
[0008]通過在大腸桿菌中表達枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合成酶和乙酰乳酸脫羧酶基因，再表達枯草桿菌等來源的丁二醇脫氫酶基因，獲得的基因工程菌株可以利用葡萄糖為碳源合成 2R, 3R-丁二醇(Yan Y, Lee C，Liao J, Enantioselective synthesis ofpure (R, R)_2，3-butanediol in Escherichia coli with stereospecific secondaryalcohol dehydrogenases.2009, Org Biomol Chem7, 3914)。
[0009]目前并無利用克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2R，3R-丁二醇的報道。

【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種生產(chǎn)2R，3R- 丁二醇的方法。通過該方法，能利用甘油為碳源發(fā)酵生產(chǎn)高光學純度的2R，3R- 丁二醇。
[0011]為解決上述技術問題，本發(fā)明中利用克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)生產(chǎn)2R，3R-丁二醇的方法，是在氧限制條件下，通過丁二醇脫氫酶酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎桿菌，以甘油為碳源，發(fā)酵生產(chǎn)2R，3R- 丁二醇。
[0012]本發(fā)明中，所述丁二醇脫氫酶，也稱為雙乙酰還原酶和乙偶姻還原酶，可以催化雙乙酰與乙偶姻之間的氧化還原反應，也能催化乙偶姻與2，3- 丁二醇之間轉化的氧化還原反應。在克雷伯氏肺炎桿菌中budC基因閱讀框由771個堿基構成，編碼256個氨基酸殘基。
[0013]本發(fā)明中，利用克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2R，3R- 丁二醇的方法，其具體步驟包括:
[0014](I)構建丁二醇脫氫酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎桿菌突變株；
[0015](2)將甘油、氮源、磷源、金屬離子及微量元素和水，配制成培養(yǎng)基；
[0016](3)在步驟(2)配制的培養(yǎng)基中，接入丁二醇脫氫酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎桿菌突變株，在氧限制條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，丁二醇脫氫酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎桿菌突變株將甘油轉化成2R，3R- 丁二醇和1，3-丙二醇等代謝產(chǎn)物，并積累于發(fā)酵液中。即在培養(yǎng)過程中克雷伯 氏肺炎桿菌突變株消耗甘油的同時在發(fā)酵液中積累2R，3R-丁二醇。
[0017]所述步驟(2)中，氮源選自:有機氮源和無機氮源。其中，有機氮源選自:玉米漿、酵母粉、蛋白胨和豆餅粉；無機氮源選自:銨鹽、硝酸及其鹽類、亞硝酸及其鹽類和尿素。
[0018]所述步驟(2)中，磷源是含有磷元素的物質，選自:磷酸和磷酸鹽。
[0019]所述步驟(2)中，金屬離子包括:鉀、鎂、鐵和錳；微量元素包括:鋅、鈣、鑰、鈷、銅、鎳和硼。
[0020]所述步驟(3)中，氧限制條件為:供氧量小于菌體最大需氧量，其中在菌體生長對數(shù)期和穩(wěn)定期溶解氧濃度控制在5%以下。所述氧限制條件也稱微氧條件。
[0021]所述步驟(3)中，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為28~42°C，培養(yǎng)pH為ρΗ5.5-7.5 ;發(fā)酵培養(yǎng)的時間為10~70小時。
[0022]所述的克雷伯氏肺炎桿菌是克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366。
[0023]本發(fā)明的有益效果如下:
[0024]1.所用的原料為可再生資源甘油。
[0025]2.產(chǎn)品2R，3R_丁二醇具有很高的光學純度，發(fā)酵產(chǎn)物中不含2S，3S_丁二醇(如實施例2、3、4)，同時2R，3R-丁二醇在總丁二醇中所占比例高(如實施例4中2R，3R-丁二醇在總丁二醇中所占比例為91%)。
[0026]3.在克雷伯氏肺炎桿菌利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的過程中，提高2，3-丁二醇產(chǎn)品的附加值，從而提高整個發(fā)酵過程中的總體經(jīng)濟效益?！揪唧w實施方式】
[0027]以下采用的試劑和生物材料如未特別說明，均為商業(yè)化產(chǎn)品。
[0028]實施例1
[0029]本實施例中的CGMCC1.6366菌株為中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，具有氨芐青霉素抗性。
[0030]I)配制種子培養(yǎng)基
[0031]蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化鈉5g/L,用自來水配制,分裝到250mL錐形瓶中，裝液量50mL，滅菌。
[0032]2)將甘油、氮源、磷源和其他組分配制成發(fā)酵培養(yǎng)基
[0033]甘油30g/L，硫酸銨4g/L，磷酸氫二鉀0.69g/L，磷酸二氫鉀0.25g/L，硫酸鎂0.2g/L，酵母粉1.5g/L，微量元素1.0ml/L，鐵溶液1.0ml/L。
[0034]其中，微量元素為:硫酸錳100mg/L，氯化鋅70mg/L，鑰酸鈉35mg/L，硼酸60mg/L，氯化鈷 200mg/L，硫酸銅 29.28mg/L，氯化鎳 25mg/L，濃鹽酸(37%) 0.9ml/L。
[0035]鐵溶液為:每升水中加入硫酸亞鐵5.0g , 37%的濃鹽酸4ml。
[0036]3)種子培養(yǎng)
[0037]在裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶中接入野生型克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366菌苔，37°C搖床好氧培養(yǎng)，轉速為180轉每分鐘，培養(yǎng)12小時。
[0038]4)發(fā)酵培養(yǎng)
[0039]將培養(yǎng)好的種子一瓶，接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，通風量IL每分鐘，攪拌轉速250轉每分鐘，溫度37°C，利用氫氧化鈉溶液控制發(fā)酵過程的pH為6.0，當甘油濃度降低到3g/L時，流加甘油，控制甘油濃度在3-40g/L范圍，發(fā)酵培養(yǎng)48小時。
[0040]利用氣相色譜對發(fā)酵液中的產(chǎn)物和底物檢測，采用日本島津公司GC2012氣相色譜儀，裝備RESTEK公司Rt?-bDEXse手性色譜柱，進樣口溫度設定225°C，檢測器采用FID(氫火焰)檢測器，檢測器溫度設定225°C，柱溫箱程序升溫，初始50°C，以5°C每分鐘速率升溫到75°C，保留8分鐘，以20°C每分鐘速率升溫到200°C，保留2分鐘。
[0041]檢測結果為:甘油21.7g/L，l，3-丙二醇 59.0g/L，2R，3R-丁二醇 5.5g/L，內消旋-2，3- 丁二醇 14.2g/L，2S, 3S- 丁二醇 1.0g/L。2R，3R- 丁二醇在總丁二醇中所占的比例為 26%ο
[0042]實施例2
[0043]一、克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366budC突變株的構建
[0044]步驟如下:
[0045]1、利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌丁二醇脫氫酶(budC)和上下游相鄰序列，通過TA克隆方法連接到克隆載體，并進行DNA序列測定。
[0046]根據(jù)克雷伯氏肺炎桿菌MGH78578 (Genbank: CP000647)基因組信息，設計丁二醇脫氫酶 PCR 引物，上游引物 budC-s:GCCATCCAGGAAGAGAAAAAATATCA (SEQ ID N0.1 所示)，下游引物 budC-a:AGACGTTTGTACGCCTGGGTAGAAG (SEQ ID N0.2 所示)。
[0047]通過上述引物，以克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，獲得丁二醇脫氫酶(budC)基因片段，通過TA克隆方法連接到pMD-18T simple質粒(商業(yè)產(chǎn)品)上，命名為pMD18T-budC質粒，序列測定結果如下:
[0048]budC基因相鄰上游部分序列為:
[0049]GCCATCCAGGAAGAGAAAAAATATCAGCGCCTGTCCGGCGTCGAGTTCGGGCCGATGGATTTTAAAGCCTATGCCGAGTCCTTCGGCGCCAAAGGGTTTGCCGTGGAAAGCGCTGAGGCGCTGGAGCCGACCCTGCGCGCGGCGATGGACGTCGACGGCCCGGCGGTAGTGGCCATCCCGGTGGATTATCGCGATAACCCGCTGCTGATGGGTCAGCTGCATCTGAGTCAGATTCTGTAAGTCATCACAATAAGGAAAGGAAA (SEQ ID N0.3 所示)。
[0050]budC基因閱讀框為:
[0051]ATGAAAAAAGTCGCACTTGTTACCGGCGCCGGCCAGGGGATTGGTAAAGCTATCGCCCTTCGTCTGGTGAAGGATGGATTTGCCGTGGCCATTGCCGATTATAACGACGCCACCGCCAAAGCGGTCGCCTCCGAAATCAACCAGGCCGGCGGCCGCGCCATGGCGGTGAAAGTGGATGTCTCCGACCGCGATCAGGTGTTTGCCGCCGTCGAACAGGCGCGCAAAACGCTGGGCGGCTTCGACGTCATCGTCAACAACGCCGGCGTGGCGCCGTCCACGCCGATCGAGTCCATTACCCCGGAGATTGTCGATAAAGTTTACAATATCAACGTTAAAGGGGTGATCTGGGGCATTCAGGCGGCGGTCGAGGCCTTTAAGAAAGAGGGGCACGGCGGGAAAATCATTAACGCCTGTTCCCAGGCCGGCCAOGTCGGCAACCCGGAGCTGGCGGTGTATAGCTCCAGTAAATTCGCCGTACGCGGCTTAACCCAGACCGCCGCTCGCGACCTCGCGCCGCTGGGCATCACGGTCAACGGCTACTGCCCGGGGATCGTCAAAACGCCGATGTGGGCCGAAATTGACCGCCAGGTGTCCGAAGCTGCCGGTAAACCGCTGGGTTACGGTACCGCCGAGTTCGCCAAACGCATCACCCTTGGTCGTCTGTCCGAACCGGAAGATGTCGCCGCCTGCGTCTCCTATCTTGCCAGCCCGGATTCTGATTACATGACCGGTCAGTCATTGCTGATCGACGGCGGGATGGTATTTAACTAA (SEQ ID N0.4 所示)。
[0052]budC基因相鄰下游部分序列為:
[0053]TAAATAATAAGCTCTGACAT GGCTTGCCCCTGCTGATATGCAGGGGCTTTTTTTGGTTTGGGTGTGAGCATCGTGCAAAACGCAGCAACGATATTTGAAGGTCTCTGGCACGACGTGGGCAATCTGACTGGGTTGAAGGCCTGCTTTGAGCGAGGAGCATGTATTTTTCTTCACCCTCTACTTCGTCCATTCTTTATGCAGTAACGCATAGATGTATGTGTCGTCATACCTTGCCTTACCATCGTCGTTTTCAAAGGAGACAAACTCTTTAAAACAACCTTCCTGTCGCATATGCAAACGTTCACAGAGTTTTTGAGAGGCCAGGTTGTAAACTTCTACCCAGGCGTACAAACGTCT (SEQ ID N0.5 所示)。
[0054]2、利用步驟I克隆到的基因序列，制備兩側連有同源臂中間連接抗性盒的DNA片段。
[0055]本步驟中，采用在大腸桿菌中利用Red重組酶催化，具有同源臂連接抗性盒的DNA片段與pMD18T-budC質粒進行同源重組，獲得pMD18T-budC質粒上重組失活的budC基因，利用該質粒作為模板通過PCR擴增具有長的同源臂的DNA片段，該片段兩側連有與budC基因上下游序列同源的序列，中間連接抗性盒。
[0056]本步驟操作原理和使用的質粒和菌株等材料可參見(Wei et.al.Redrecombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal ofIndustrial Microbiology&Biotechnology2012),具體步驟如下:
[0057]a.pMD18T_budC質粒熱擊轉化到含有pIJ790質粒的大腸桿菌DH5 a -pIJ790中，命名為 DH5 a -pMD18T-budC。
[0058]制備DH5 a -pMD18_budC感受態(tài)細胞，在菌體培養(yǎng)I個小時后，添加10mmol/L的阿拉伯糖，誘導PIJ790質粒中Red重組酶的表達。
[0059]b.設計引物budC_s2和budC_a2,序列分別為:
[0060]AGATAGGAGACGCAGGCGGCGACATCTTCCGGTTCGGACATTCCGGGGATCCGTCGACC (SEQ IDN0.6 所示)和 CAGGCGCGCAAAACGCTGGGCGGCTTCGACGTCATCGTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQID N0.7 所示)。
[0061]引物budC_s2 的
[0062]“AGATAGGAGACGCAGGCGGCGACATCTTCCGGTTCGGAC” 序列與 budC 基因相應序列同源，引物budC_a2的
[0063]“ CAGGCGCGCAAAACGCTGGGCGGCTTCGACGTCATCGTCA ” 序列與 budC 基因相應序列同源。
[0064]利用引物budC_s2和budC_a2，以質粒pIJ778為模板擴增出長約1491bp的DNA片段A。該片段的兩端分別具有與budC序列同源的同源臂，中間包含了來源于pIJ778質粒的鏈霉素抗性基因aadA。
[0065]c.利用DNA片段A轉化感受態(tài)DH5 a -pMD18T_budC感受態(tài)細胞。利用電擊轉化方法，轉化電壓為2000V，選擇鏈霉素抗性的菌株，鏈霉素用量為50mg/L。
[0066]DNA片段A兩側的同源序列與質粒pMD18T_budC上的budC同源部分發(fā)生重組，獲得質粒，并命名為PMD18T-C質粒。
[0067]d.利用引物 budC-s (SEQ ID N0.1 所示)和 budC-a (SEQ ID N0.2 所示)，以PMD18T-C質粒為模板進行PCR擴增，獲得2394bp的DNA片段B。[0068]DNA片段B兩端分別具有516bp和466bp的budC基因和相鄰序列，該序列作為同源臂。DNA片段B中間具有鏈霉素抗性基因aadA，DNA片段B用于進行CGMCC1.6366染色體上budC基因重組的線性DNA片段。
[0069]3、利用轉化或結合方法將制備的DNA片段B轉入到克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中，DNA片段B與染色體上的丁二醇脫氫酶基因進行同源重組，篩選獲得菌株染色體丁二醇脫氫酶基因重組失活的菌株，具體步驟如下:
[0070]a.將 pDK6-red 質粒轉化到 CGMCC1.6366 中，獲得 CGMCC1.6366-pDK6_red 菌株，線性DNA片段B電擊轉化CGMCC1.6366-pDK6-red感受態(tài)細胞。利用鏈霉素篩選抗性菌株。
[0071]b.重組菌的驗證,設計驗證引物Yanzheng778z:
[0072]AGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAG (SEQ ID N0.8 所示)，其序列對應鏈霉素抗性基因aadA中間的一段序列。
[0073]利用引物budC-s (SEQ ID N0.1所示)和Yanzheng778z,以長出的菌株總DNA為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物DNA片段為1274bp，而以出發(fā)菌株CGMCC1.6366總DNA為模板進行PCR無特異性條帶，表明獲得的重組菌正確，命名為CGMCC1.6366-budC-。該菌株的丁二醇脫氫酶基因通過同源重組而失活。
[0074]二、利用丁二醇脫氫酶失活的克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366-budC-發(fā)酵生產(chǎn)2R, 3R- 丁二醇
[0075]I)配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基
[0076]按照實施例1配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0077]2)種子培養(yǎng)
[0078]在裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶中接入制備的克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366-budC-菌苔，28°C搖床好氧培養(yǎng)，轉速為200轉每分鐘，培養(yǎng)12小時。
[0079]3)發(fā)酵培養(yǎng)[0080]將培養(yǎng)好的種子一瓶，接入裝有4L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，通風量2L每分鐘，攪拌轉速200轉每分鐘，溫度28 °C，利用30%氫氧化鈉溶液控制發(fā)酵過程pH5.5，發(fā)酵培養(yǎng)10小時。
[0081]按照實施例1中的氣相色譜條件檢測發(fā)酵液組分，結果為:甘油3.2g/L，I, 3-丙二醇 13.8g/L，2R, 3R- 丁二醇 1.lg/L，內消旋-2，3- 丁二醇 0.3g/L，2S, 3S- 丁二醇 0.0g/L。2R, 3R- 丁二醇在總丁二醇中所占的比例為78%。
[0082]實施例3
[0083]1)配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基
[0084]按照實施例1配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0085]2)種子培養(yǎng)
[0086]在裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶中接入實施例2制備的克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366-budC-菌苔，42°C搖床好氧培養(yǎng)，轉速為200轉每分鐘，培養(yǎng)12小時。
[0087]3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0088]將培養(yǎng)好的種子一瓶，接入裝有4L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，通風量IL每分鐘，攪拌轉速150轉每分鐘，溫度42°C，利用氫氧化鈉溶液控制發(fā)酵過程pH7.5，當甘油濃度降低到5g/L時，流加甘油，控制甘油濃度在5-40g/L范圍，發(fā)酵培養(yǎng)70小時。
[0089]按照實施例1中的氣相色譜條件檢測發(fā)酵液組分，結果為:甘油33.3g/L，I, 3_丙二醇 65.9g/L，2R，3R- 丁二醇 19.2g/L，內消旋-2，3- 丁二醇 3.9g/L，2S，3S- 丁二醇 0.0g/L0 2R, 3R- 丁二醇在總丁二醇中所占的比例為83%。
[0090]實施例4
[0091 ] I)配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基
[0092]按照實施例1配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0093]2)種子培養(yǎng)
[0094]在裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶中接入實施例2制備的克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366-budC-菌苔，37°C搖床好氧培養(yǎng)，轉速為180轉每分鐘，培養(yǎng)12小時。
[0095]3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0096]將培養(yǎng)好的種子一瓶，接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，通風量IL每分鐘，攪拌轉速250轉每分鐘，溫度37°C，利用氫氧化鈉溶液控制發(fā)酵過程pH6.0,當甘油濃度降低到3g/L時，流加甘油，控制甘油濃度在3-40g/L范圍，發(fā)酵培養(yǎng)48小時。
[0097]按照實施例1中的氣相色譜條件檢測發(fā)酵液組分，結果為:甘油18.3g/L，I, 3_丙二醇 55.3g/L，2R, 3R- 丁二醇 24.6g/L，內消旋-2，3- 丁二醇 2.3g/L，2S, 3S- 丁二醇 0.0g/L0 2R, 3R- 丁二醇在總丁二醇中所占的比例為91%。
[0098]實施例5
[0099]野生菌株利用葡萄糖為碳源的發(fā)酵。
[0100]1)配制種子培養(yǎng)基
[0101]按照實施例1配制種子培養(yǎng)基。
[0102]2)配制成發(fā)酵培養(yǎng)基
[0103]葡萄糖50g/L，硫酸銨4g/L，磷酸氫二鉀0.69g/L，磷酸二氫鉀0.25g/L，硫酸鎂
0.2g/L，酵母粉1.5g/L，微量元素1.0ml/L，鐵溶液1.0ml/L。[0104]其中，微量元素為:硫酸錳100mg/L，氯化鋅70mg/L，鑰酸鈉35mg/L，硼酸60mg/L，氯化鈷 200mg/L，硫酸銅 29.28mg/L，氯化鎳 25mg/L，濃鹽酸(37%) 0.9ml/L。
[0105]鐵溶液為:每升水中加入硫酸亞鐵5.0g, 37%的濃鹽酸4ml。
[0106]3)種子培養(yǎng)
[0107]在裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶中接入野生型克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366菌苔，37°C搖床好氧培養(yǎng)，轉速為180轉每分鐘，培養(yǎng)12小時。
[0108]4)發(fā)酵培養(yǎng)
[0109]將培養(yǎng)好的種子一瓶，接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，通風量IL每分鐘，攪拌轉速250轉每分鐘，溫度37°C，利用氫氧化鈉溶液控制發(fā)酵過程pH6.0,當葡萄糖濃度降低到10g/L時，流加葡萄糖，控制甘油濃度在3-40g/L范圍，發(fā)酵培養(yǎng)48小時。
[0110]按照實施例1中的氣相色譜條件檢測發(fā)酵液組分，結果為:2R，3R-丁二醇0.3g/L，內消旋-2，3- 丁二醇 41.lg/L, 2S, 3S- 丁二醇 2.2g/L。2R，3R- 丁二醇在總丁二醇中所占的比例為0.7%。
[0111]實施例6
[0112]丁二醇脫氫酶突變株利用葡萄糖為碳源的發(fā)酵。
[0113]I)配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基
[0114]按照實施例5配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0115]2)種子培養(yǎng)
[0116]在裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶中接入實施例2制備的克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366-budC-菌苔，37°C搖床好氧培養(yǎng)，轉速為180轉每分鐘，培養(yǎng)12小時。
[0117]3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0118]將培養(yǎng)好的種子一瓶，接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，通風量IL每分鐘，攪拌轉速250轉每分鐘，溫度37°C，利用氫氧化鈉溶液控制發(fā)酵過程pH6.0,當葡萄糖濃度降低到10g/L時，流加葡萄糖，控制甘油濃度在3-40g/L范圍，發(fā)酵培養(yǎng)48小時。
[0119]按照實施例1中的氣相色譜條件檢測發(fā)酵液組分，結果為:2R，3R-丁二醇0.8g/L，內消旋-2，3- 丁二醇3.9g/L，2S, 3S- 丁二醇0.2g/L。2R，3R- 丁二醇在總丁二醇中所占的比例為16%。
【權利要求】
1.一種克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2R，3R-丁二醇的方法，其特征在于:所述方法是在氧限制條件下，以甘油為碳源，利用丁二醇脫氫酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2R, 3R-丁二醇。
2.如權利要求1所述的克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2R，3R-丁二醇的方法，其特征在于:所述克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2R，3R- 丁二醇的步驟包括: (1)構建丁二醇脫氫酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎桿菌突變株； (2)將甘油、氮源、磷源、金屬離子及微量元素和水，配制成培養(yǎng)基； (3)在前述步驟配制的培養(yǎng)基中，接入丁二醇脫氫酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎桿菌突變株，在氧限制條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。
3.如權利要求2所述的克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2R，3R-丁二醇的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，所述氮源選自:有機氮源和無機氮源；所述磷源選自:磷酸和磷酸鹽；所述金屬離子包括:鉀、鎂、鐵和錳；所述微量元素包括:鋅、鈣、鑰、鈷、銅、鎳和硼。
4.如權利要3所述的克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2R，3R-丁二醇的方法，其特征在于:所述有機氮源選自:玉米漿、酵母粉、蛋白胨和豆餅粉；所述無機氮源選自:銨鹽、硝酸及其鹽類、亞硝酸及其鹽類和尿素。
5.如權利要2所述的克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2R，3R-丁二醇的方法，其特征在于:所述步驟(3)中的氧限制條件為:供氧量小于菌體最大需氧量，其中在菌體生長對數(shù)期和穩(wěn)定期溶解氧濃度控制在5%以下。
6.如權利要2所述的克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2R，3R-丁二醇的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為28~42°C，培養(yǎng)pH為5.5-7.5，發(fā)酵培養(yǎng)的時間為10~70小時。
7.如權利要求1所述的克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2R，3R-丁二醇的方法，其特征在于:所述克雷伯氏肺炎桿菌是克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366。
【文檔編號】C12P7/18GK103740771SQ201410046736
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年2月10日 優(yōu)先權日:2014年2月10日
【發(fā)明者】郝健, 魏東, 史吉平, 姜標, 陳川 申請人:中國科學院上海高等研究院