克雷伯氏菌劑生物降解果蔬與土壤表面殘留的毒死蜱農(nóng)藥的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明在毒死蜱農(nóng)藥殘留土壤中分離出一株能降解毒死蜱農(nóng)藥殘留的微生物。經(jīng)過鑒定為克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）dsp-B，Genbank登錄號為HQ836365。菌種保藏號為：CCTCC：NO：M2012477。利用其對毒死蜱農(nóng)藥降解的特性,研制出適用于果蔬與土壤表面的生物降解菌劑。本發(fā)明屬于微生物環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域，工藝流程：保藏純化菌種→搖瓶培養(yǎng)→種子罐擴大培養(yǎng)→發(fā)酵罐再擴大→分裝產(chǎn)品。該菌劑制備工藝簡單、生產(chǎn)成本低廉易于推廣應(yīng)用，施用特點為直接噴灑。本發(fā)明可快速、高效地降解土壤及果蔬表面的殘留毒死蜱農(nóng)藥，從而解決殘留超標問題；對無毒無公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)有直接的經(jīng)濟價值。
【專利說明】克雷伯氏菌劑生物降解果蔬與土壤表面殘留的毒死蜱農(nóng)藥
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物環(huán)境修復(fù)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到克雷伯氏dsp-B菌株及其對土壤和果蔬表面毒死蜱農(nóng)藥殘留的生物降解方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]農(nóng)藥是現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)必不可少的生產(chǎn)資料，其在減少農(nóng)作物病蟲害，增加農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量，升農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量等方面發(fā)揮了巨大的作用，從而提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥的生產(chǎn)量及使用量巨大。農(nóng)藥生產(chǎn)方面，近年來我國農(nóng)藥產(chǎn)量呈連續(xù)快速增長的態(tài)勢。國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示2011年全國農(nóng)藥產(chǎn)量已達264.8萬噸。農(nóng)藥使用方面，農(nóng)業(yè)部全國農(nóng)技推廣中心估計2012年全國農(nóng)藥商品需求總量達98.4萬噸。同時，我國是蔬菜生產(chǎn)大國。統(tǒng)計資料顯示，截至2009年我國蔬菜播種面積為0.273億公頃，總產(chǎn)量達6.02億噸，分別占世界的43%和49%，均居世界第一。由于蔬菜生長周期短，且病蟲害較多，因此每年需要消耗大量農(nóng)藥用于防治蔬菜的病蟲害。我國是農(nóng)藥生產(chǎn)使用大國和蔬菜生產(chǎn)大國的國情決定了由農(nóng)藥在蔬菜生產(chǎn)中的大量使用所帶來的農(nóng)藥殘留問題將持續(xù)存在。蔬菜農(nóng)藥殘留超標可造成社會經(jīng)濟損失。近年來我國出口的蔬菜因達不到進口國衛(wèi)生技術(shù)標準的要求而被拒絕進口的事件時有發(fā)生，不僅影響我國蔬菜的出口，而且直接制約了我國農(nóng)產(chǎn)品在國際市場上的競爭力。因此蔬菜農(nóng)藥殘留問題必須引起足夠重視。農(nóng)藥殘留的方法:物理方法處理果蔬農(nóng)藥殘留是一般常用的方法，但水洗或洗滌劑洗滌的效果和應(yīng)用范圍終究有限。近些年來發(fā)展起來的化學(xué)處理果蔬農(nóng)藥殘留的方法不失為一種較好的替代方法。有報道指出，次氯酸鹽處理農(nóng)藥殘留可能會導(dǎo)致生成一些粘在果蔬表面的有毒或致癌的有機氯化合物，因此使用受到一定的限制。農(nóng)藥殘留及其廢水的降解主要有微生物降解、化學(xué)降解和光降解等方式。微生物能夠通過各種生物化學(xué)作用將壞境中的有機污染物轉(zhuǎn)化為CO2和H2O等無毒或毒性較小的物質(zhì)。與物理、化學(xué)降解方式相比，微生物降解具有操作簡單、降解徹底、無二次污染等優(yōu)點。因此利用微生物技術(shù)處理農(nóng)藥殘留，并對受污染的土壤與水體進行生物修復(fù)是一種行之有效的方法。毒死蜱是甲胺磷和甲基對硫磷等高效農(nóng)藥的新型高效、低毒替代品種，作為一種廣譜型有機磷酸酯類殺蟲劑，被廣泛用于農(nóng)業(yè)和城市衛(wèi)生害蟲的防治。由于其大量頻繁使用和它的持久性，在水體、土壤、和植物等環(huán)境樣品中大量檢出毒死蜱殘留。毒死蜱屬中度毒性殺蟲劑，能抑制人體膽堿酯酶活性，蓄積于神經(jīng)系統(tǒng)后導(dǎo)致惡心、頭暈、甚至神志不清，高濃度暴露可造成呼吸麻痹和死亡。因此，尋找一種去除環(huán)境中毒死蜱農(nóng)藥殘留高效安全的方法成為關(guān)注的焦點，而利用毒死蜱高效降解菌劑應(yīng)用于其污染環(huán)境的治理具有重要的現(xiàn)實意義和應(yīng)用前
旦
o
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的目的是針對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中殘留于蔬菜及土壤表面的毒死蜱農(nóng)藥，采用生物降解法處理。以及該生物降解-油包水菌劑的制作工藝與使用方法，本菌劑產(chǎn)品可以使毒死蜱殘留量降低88%左右，且生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，具有廣闊的市場前景。[0005]技術(shù)方案
本發(fā)明分離純化了一種毒死蜱降解菌，該菌株為革蘭氏染色陰性的克雷伯氏菌屬{Klebsiella sp.),該菌株16SrDNA的Genbank登錄號為HQ836365。該菌株拉丁文名稱:Klebsiella sp.dsp_B保藏日期:2012年11月23日。保藏地址:湖北省武漢市武昌洛珈山武漢大學(xué)保藏中心即中國典型物保藏中心。菌種保藏編號:M2012477。該菌電鏡照片如附圖一所示:大小l_2um，橢圓形或長方形。該菌能利用毒死蜱為唯一碳源和能源進行生長，將其徹底礦化為二氧化碳和水及簡單的無機化合物。在實驗室條件搖瓶試驗中，菌劑對實地降解毒死蜱最高降解率達81.6%。該菌的最適生長pH為6.8-7.2，最適生長溫度為32°C。工藝流程:保藏純化菌種一搖瓶培養(yǎng)一種子罐擴大培養(yǎng)一發(fā)酵罐再擴大一分裝產(chǎn)品。本發(fā)明的詳細實施步驟為:
(1)將保藏的純化菌種-克雷伯氏菌接種于LB培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩8h培養(yǎng)至對數(shù)生長
期；
(2)將上述培養(yǎng)好的菌液按15%體積接種量轉(zhuǎn)入種子罐，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期；
(3)將達到對數(shù)生長期的種子液按15%的接種量接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)；
(4)發(fā)酵完成后將細菌培養(yǎng)液制成油包水劑型，并用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型產(chǎn)品。直接噴施于蔬菜與土壤表面對殘留毒死蜱農(nóng)藥進行降解。種子罐和發(fā)酵罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:1-1.5，培養(yǎng)溫度為28-35°C，攪拌速度150-200rpm，全程培養(yǎng)時間為48-72小時，結(jié)束后含克雷伯氏菌40億個/ml ；
步驟4所研制的油包水劑型中添加的油相為10號白油，助溶劑為吐溫80，乳化劑為spanSO。使用時直接噴灑到果蔬表面，由于油包水的保水特性可以使營養(yǎng)物的緩慢釋放從而維持菌的活性，提高果蔬表面農(nóng)殘的降解率，同時還可防止果蔬失水、褐變等現(xiàn)象的發(fā)生。
[0006]本發(fā)明的有益效果為:
本發(fā)明提供一種毒死蜱農(nóng)藥的降解菌，實驗實驗和田間實驗結(jié)果表明，對毒死蜱的實地生物降解率達到81.6%左右。2，使用該方法生產(chǎn)的毒死蜱降解菌劑具有生產(chǎn)成本低，使用方便，降解效果好的優(yōu)點，易于大規(guī)模推廣使用。該發(fā)明對于保護生態(tài)環(huán)境，保護人民的身體健康，增加農(nóng)產(chǎn)品的附加值有著重要的意義。
【具體實施方式】
[0007]實施例1
采集成都市龍泉驛區(qū)果蔬生產(chǎn)基地，多年噴施毒死蜱農(nóng)藥土壤，采用富集培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，最后分離純化得到一株菌，再通過高濃度100-1000mg/L的毒死蜱培養(yǎng)基作為唯一碳源馴化本細菌。通過經(jīng)16SrDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)菌株B與Klebsiella 200916的序列相似性為99%,與sp.MS6的序列相似性也為99% , GenBank登錄號HQ836365。將初篩得到的10株菌活化，接入100mg/l毒死蜱基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，37°C，180r/min培養(yǎng)10d，測其降解率。通過復(fù)篩，得到降解率最高的菌株DSP-5。主要生物學(xué)特性為G_，兼性厭氧菌，有莢膜，不形成芽孢。在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12h的菌落直徑為0.5mm,呈半球形，半透明，濕潤，表面光滑；能利用檸檬酸鹽和葡萄糖作為唯一碳源，氨作為氮源；發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甲基紅實驗呈陰性；VP反應(yīng)顯陽性；三塘鐵瓊脂試驗不產(chǎn)生硫化氫。實施例2取實施例1中革蘭氏染色陰性的克雷伯氏菌的菌種接種于50mlLB培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)8h至對數(shù)期，獲得菌液。將上述培養(yǎng)好的菌液按15%體積接種量轉(zhuǎn)入已經(jīng)121 °C高壓濕熱滅菌并冷卻至35°C左右的種子罐，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1: 1.5，攪拌速度為150-200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為35°C。將達到對數(shù)生長期的種子液按15%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng),發(fā)酵罐所用培養(yǎng)基與種子罐相同,接種后的發(fā)酵溫度控制在28-35°C，無菌空氣的通氣量為1:1-1.5，攪拌速度為150-200rpm，全程發(fā)酵培養(yǎng)時間為48-72小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達到40億個/ml。發(fā)酵完成后按照一定的油水比例在乳化劑的作用下將細菌培養(yǎng)液制成油包水劑型，然后用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型。應(yīng)用例I 土壤降解盆栽實驗共設(shè)4個處理，滅菌土 +毒死蜱、非滅菌土 +毒死蜱、滅菌土 +毒死蝶+dsp-B菌劑、非滅菌土 +毒死蝶+ dsp-B菌劑,毒死蝶濃度為100mg/kg,降解菌dsp-B的接種量為108cfu/Kg，每個處理重復(fù)2次。于修復(fù)后第1，3，5，7，9，11，13，15d取樣測其毒死蜱殘留濃度。經(jīng)過檢測，表明微生物在土壤毒死蜱的降解過程中起著重要的作用。滅菌土壤中加入降解菌dsp-B的降解率為67.1%，高于未滅菌土壤，說明菌株dsp-B降解毒死蜱的能力高于土壤中土生土長的微生物。降解率最高的出現(xiàn)在添加了菌株dsp-B的非滅菌土壤中，為76.2%，這種現(xiàn)象說明菌株dsp-B對土壤中的毒死蜱有著良好的降解能力，且與土壤中的土著微生物間有著相互協(xié)調(diào)的群落關(guān)系。應(yīng)用例2選取龍泉2畝桃樹地為實驗對象，其中一畝作為對照，另一畝為降解菌劑處理組，噴灑由實施例2中研制的油包水降解菌劑，濃度為3X 109cfu/ml，共20 L，均勻地噴灑于桃樹土壤中，降解IOd后采集土壤回測其毒死蜱的含量?？瞻捉M于IOd后采集土壤樣品。采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法測定毒死蜱農(nóng)藥殘留含量。然后處理組經(jīng)測量，降解前土壤中毒死蜱的含量為8.7mg/kg,降解菌劑處理組降解后毒死蜱的含量為1.6mg/kg，其降解率為81.6%，略高于土壤盆栽實驗降解率，分析可能與光降解等自然環(huán)境因素相關(guān)，而IOd后對照組毒死蜱的降解率為27.6%，可以看出降解菌劑對土壤中毒死蜱殘留的降解顯著。應(yīng)用例3考察實施例2中的降解菌劑對果蔬表面毒死蜱農(nóng)殘的去除效果。選取龍泉耕地里的大白菜為實驗對象，采用100mg/L濃度的毒死蜱對大白菜葉面進行噴灑，待葉片上農(nóng)藥液滴消失后，采樣測其毒死蜱含量。在噴藥后隔一天用OD6tltlnm=O (清水對照)，發(fā)酵液濃度OD=L 0制成的油包水降解菌液對噴藥過的區(qū)域進行噴霧，每個處理設(shè)3個重`復(fù)，Im2/區(qū)域，隨機排列。噴藥及噴菌量都為20mL/m2，噴施時間選在下午4-5時進行，保證噴后24小時無雨。經(jīng)過7天的降解，實驗組與對照組都按照“S”形方法采樣采收大白菜5g測其毒死蜱含量。降解前葉片上毒死蜱的含量為6.20mg/kg,噴灑油包水降解菌液的實驗組降解后毒死蜱的含量為1.21mg/kg,降解率為80.5%，而噴灑OD600nm=O菌液的對照組毒死蜱殘留量為5.02mg/kg,降解率僅19.3%。利用微生物降解及處理農(nóng)產(chǎn)品，是農(nóng)藥殘留控制處理的新領(lǐng)域、新途徑，許多發(fā)達國家和大公司企業(yè)投入巨資以從事農(nóng)藥殘留高效降解菌的研究開發(fā)。實驗室和實際應(yīng)用研究都表明利用微生物來降解果蔬中的農(nóng)藥殘留，可有效提聞農(nóng)廣品的品質(zhì)和經(jīng)濟價值。
【權(quán)利要求】
1.毒死蜱生物降解菌劑，該菌劑中微生物是革蘭氏染色陰性的克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)的 dsp-B 菌株；該菌株 16SrDNA 的 Genbank 登錄號為 HQ836365 ; 菌種保藏號為:CCTCC:N0:M2012477o
2.利用權(quán)利要求1所述的克雷伯氏降解菌株研制成毒死蜱殘留降解菌劑；針對的是土壤與果蔬表面殘留的毒死蜱。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的毒死蜱殘留高效降解菌劑的制備方法，發(fā)酵液制成油包水產(chǎn)品時，從而大大延長菌劑產(chǎn)品的保質(zhì)期，提高菌劑的實用性。
【文檔編號】C12R1/22GK103484393SQ201310218540
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月4日
【發(fā)明者】徐恒, 李創(chuàng), 唐敦義 申請人:四川大學(xué)