專利名稱：土壤枯草芽孢桿菌菌株s001及其菌劑的制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生防領(lǐng)域，具體涉及枯草芽孢桿菌SOOl和其應用及以其制備的微生物菌劑和制備方法。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高和環(huán)保意識的增強，在國際或國內(nèi)市場，對蔬菜產(chǎn)品實行準入制，要進入市場的蔬菜必須是 無公害蔬菜?；瘜W殺菌劑在環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中可以殘留，其嚴重影響著全民的身心健康，同時影響生態(tài)環(huán)境及農(nóng)業(yè)貿(mào)易，也對非目標生物如人、家畜、益蟲和野生動物等的毒害。蔬菜農(nóng)藥殘留量超標，則面臨“綠色貿(mào)易壁壘”，在WTO的大環(huán)境下無法進入國際市場。這就要求人們對農(nóng)藥品種和性能進行調(diào)整，向無公害農(nóng)藥方向發(fā)展。生物農(nóng)藥則是生產(chǎn)無公害農(nóng)產(chǎn)品過程中防治病害的優(yōu)良選項。微生物農(nóng)藥是公認的“無公害農(nóng)藥”，可以通過直接或間接的作用方式來防治病害，其防治效果較好，對人畜無毒，不污染環(huán)境，無殘留；具較強的選擇性，不傷害有益生物及天敵，不破壞生態(tài)平衡，不易產(chǎn)生抗藥性；生產(chǎn)原料和有效成分為天然產(chǎn)物，易降解，可回歸大自然，保證可持續(xù)發(fā)展；隨著環(huán)境保護法的貫徹執(zhí)行，以及參與國際市場競爭，微生物農(nóng)藥將作為一種高新技術(shù)，在保護環(huán)境、保證人類健康，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中，發(fā)揮愈來愈重要的作用。大量施入土壤的化學氮肥、磷肥和鉀肥會導致重金屬在土體中累積、資源與能源大量消耗、環(huán)境污染，且其利用率低，未被吸收利用的氮肥在農(nóng)田中流失或揮發(fā)，對地下水資源、土壤和空氣造成了嚴重污染，使農(nóng)畜產(chǎn)品的有毒物質(zhì)超標，給人類健康帶來了極大的危害，同時化肥的長期大量施用破壞土壤團粒結(jié)構(gòu)，造成土壤板結(jié)，肥力下降。微生物肥料作為一種新型肥料，施入土壤后，通過其特定菌株的快速繁殖，能固定大氣中的氮素、釋放土壤中固定態(tài)的磷、鉀元素，使得環(huán)境的養(yǎng)分潛力得以充分發(fā)揮，并為作物生長營造一個良好的土壤微生物環(huán)境，在減少化肥用量、降低環(huán)境污染、提高農(nóng)作物品質(zhì)等方面具有重要意義。尤其是集固氮、解磷、解鉀和作物生長素于一身的復合微生物肥料的研發(fā)，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中有舉足輕重的作用。目前，國內(nèi)外雖然對微生物農(nóng)藥和微生物肥料方面都投入了巨大的人力及物力，但就數(shù)量而言化學農(nóng)藥和肥料遠遠多于生物農(nóng)藥和肥料；另外，生物農(nóng)藥和肥料對環(huán)境的要求較高。因此，開發(fā)符合當?shù)丨h(huán)境條件的微生物農(nóng)藥和肥料尤為重要，可促進當?shù)鼐G色農(nóng)業(yè)的發(fā)展、參與國際農(nóng)產(chǎn)品市場的競爭、保護環(huán)境和保證人類健康就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了能夠具有廣譜殺菌活性和促生能力的枯草芽孢桿菌SOOl。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:枯草芽孢桿菌(Bacillus
,為芽孢桿菌屬CbA/ ),于2012年8月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，菌種保藏編號為 CGMCC N0.6425。本發(fā)明的第二個目的是提供了上述枯草芽孢桿菌SOOl在抑制病原菌中的應用，所述病原菌為番茄灰霉菌、茄子菌核菌、小麥全蝕菌、小麥根腐菌或小麥紋枯菌，抑菌率大于等于90%。上述枯草芽 孢桿菌SOOl在抑制病原菌中的應用，所述病原菌為尖鐮孢菌、辣椒立枯絲核菌、番茄葉霉菌或番茄早疫菌，抑菌率大于等于71.1%。上述枯草芽孢桿菌SOOl在抑制病原菌中的應用，所述枯草芽孢桿菌SOOl在含100 mg/L色氨酸或不含色氨酸的King培養(yǎng)液中分泌吲哚乙酸的濃度分別為33.50 mg/L和10.88mg/L。本發(fā)明的第三個目的是提供了枯草芽孢桿菌SOOl制備的微生物菌劑，所述微生物菌劑的組成按照重量百分比計為枯草芽孢桿菌SOOl 5-10%,枯草芽孢桿菌SOOl培養(yǎng)基90-95%。進一步的，上述微生物菌劑，所述枯草芽孢桿菌SOOl培養(yǎng)基包括以重量百分比計的以下組分:玉米粉1.5-2.5%，黃豆粉0.5-1.2%，牛肉浸膏0.25-0.75%，蒸餾水或去離子水IOOOml ;所述枯草芽孢桿菌SOOl培養(yǎng)基的pH值為7_8。進一步的，上述微生物菌劑，所述枯草芽孢桿菌SOOl培養(yǎng)基包括以重量百分比計的以下組分:玉米粉2%，黃豆粉0.85%，牛肉浸膏0.5%，蒸餾水或去離子水IOOOml ;所述枯草芽孢桿菌SOOl培養(yǎng)基的pH值為7.5。本發(fā)明的第四個目的是提供了枯草芽孢桿菌SOOl制備的微生物菌劑的制備方法，是將枯草芽孢桿菌SOOl在枯草芽孢桿菌SOOl培養(yǎng)基上液體發(fā)酵24-36h得到的；所述液體發(fā)酵條件為溫度26-30°C，轉(zhuǎn)速150-250r/min，通氣量800-1000L/h ;所述枯草芽孢桿菌 SOOl 的活菌數(shù)為 5.78X10ncfu/mL-8.13 X 1012cfu/mL。進一步的，上述枯草芽孢桿菌SOOl制備的微生物菌劑的制備方法，所述液體發(fā)酵條件為溫度28°C，轉(zhuǎn)速200r/min，通氣量900L/h，發(fā)酵時間為30小時。本發(fā)明的第五個目的是提供了枯草芽孢桿菌SOOl制備的微生物菌劑在制備微生物農(nóng)藥或微生物肥料中的應用。本發(fā)明的具體操作過程如下:
一、對土壤枯草芽抱桿菌subtil is SOOl (CGMCC N0.6425)的形態(tài)鑒定。將土壤枯草芽抱桿菌subtilisSOOl (CGMCC N0.6425)接種于在牛肉浸膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)3d的培養(yǎng)性狀為:土壤枯草芽孢桿菌subtilis SOOl (CGMCC N0.6425)革蘭氏陽性，桿狀、兩端鈍圓，少數(shù)呈不同程度鏈狀排列。大小(0.62 2.54) umX (1.59 4.30) um,培養(yǎng)48h后產(chǎn)生芽孢，芽孢橢圓形，大多數(shù)近末端生，少數(shù)中生，孢子囊膨大不明顯或不膨大。在牛肉浸膏蛋白胨平板上，菌落乳白色、無光澤、表面呈皺紋狀突起、邊緣不整齊，形狀不規(guī)則形。斜面上菌苔乳白色、邊緣波紋狀、不透明、表面暗色。二、對土壤枯草芽孢桿菌subtilis SOOl (CGMCC N0.6425)的 16S rDNA基因序列鑒定。將土壤枯草芽孢桿菌subtilisSOOl (CGMCC N0.6425)的 16S rDNA 基因序列在 Genebank 中與ifeci77w5.subtilis (AB017591.1)的 16S rDNA 基因序列進行同源性比較。比較結(jié)果表明，土壤枯草芽孢桿菌feci77心subtilis SOOl (CGMCC N0.6425)與Bacillus subtilis (AB017591.1)的同源性可以達到99%以上。通過16S rDNA基因序列結(jié)果，土壤枯草芽抱桿菌 AaciJJw1S subtilis SOOl (CGMCC N0.&A2J0)與 Bacillussubtilis (AB017591.1)的同源性可以證明土壤枯草芽孢桿菌subtilis SOOl(CGMCC N0.6425)的確屬于枯草芽抱桿菌subtilis。三、對土壤枯草芽孢桿菌subtilis SOOl (CGMCC N0.6425)的室內(nèi)抑菌活性進行測定。首次篩選出土壤枯草芽抱桿菌ifeciJJiAs subtilis SOOl (CGMCC N0.6425)措抗菌株，將該拮抗菌株接種于SOOl (CGMCC N0.6425)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；同時，將指示菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(即PDA)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。當拮抗菌株和指示菌株在各自的培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化后，分別用打孔器打成直徑為7_的菌餅。選取指示菌株的菌餅一塊，置于PDA培養(yǎng)基中；具體的，可以將該菌餅接種于盛裝PDA培養(yǎng)基的平皿的中央位置(平皿直徑9cm);再選取由拮抗菌株得到的菌餅四塊，根據(jù)對峙法，將該四塊菌餅等距接種于距該平皿中央位置為2.5cm的圓周上。將該培養(yǎng)皿在26°C的環(huán)境溫度下培養(yǎng)5天后，用十字法多次重復測定該PDA培養(yǎng)基中上述菌株的抑菌圈直徑，在本試驗中，重復測定3次。土壤枯草芽抱桿菌subtilis SOOl (CGMCC N0.6425)的無菌液對部分
病原菌抑菌能力的測定結(jié)果可以參見表I。
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌SOOl，菌株SOOl為芽孢桿菌屬Cohn),于2012年8月13日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏編號為CGMCC N0.6425。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌SOOl在抑制病原菌中的應用，其特征在于，所述病原菌為番茄灰霉菌、茄子菌核菌、小麥全蝕菌、小麥根腐菌或小麥紋枯菌，抑菌率大于等于90%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌SOOl在抑制病原菌中的應用，其特征在于，所述病原菌為尖鐮孢菌、辣椒立枯絲核菌、番茄葉霉菌或番茄早疫菌，抑菌率大于等于71.1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌SOOl在抑制病原菌中的應用，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌SOOl在含100 mg/L色氨酸或不含色氨酸的King培養(yǎng)液中分泌吲哚乙酸的濃度分別為33.50 mg/L和10.88mg/L。
5.枯草芽孢桿菌SOOl制備的微生物菌劑，其特征在于，所述微生物菌劑的組成按照重量百分比計為枯草芽孢桿菌SOOl 5-10%，枯草芽孢桿菌SOOl培養(yǎng)基90-95%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物菌劑，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌SOOl培養(yǎng)基包括以重量百分比計的以下組分:玉米粉1.5-2.5%，黃豆粉0.5-1.2%，牛肉浸膏0.25-0.75%，蒸餾水或去離子水1000ml ;所述枯草芽孢桿菌SOOl培養(yǎng)基的pH值為7_8。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物菌劑，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌SOOl培養(yǎng)基包括以重量百分比計的以下組分:玉米粉2%，黃豆粉0.85%，牛肉浸膏0.5%，蒸餾水或去離子水1000ml ;所述枯草芽孢桿菌SOOl培養(yǎng)基的pH值為7.5。
8.枯草芽孢桿菌SOOl制備的微生物菌劑的制備方法，其特征在于，是將枯草芽孢桿菌SOOl在枯草芽孢桿菌SOOl培養(yǎng)基上液體發(fā)酵24-36h得到的；所述液體發(fā)酵條件為溫度26-30°C，轉(zhuǎn)速150-250r/min，通氣量800-1000L/h ;所述枯草芽孢桿菌SOOl的活菌數(shù)為5.78X10ncfu/mL-8.13 X 1012cfu/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的枯草芽孢桿菌SOOl制備的微生物菌劑的制備方法，其特征在于，所述液體發(fā)酵條件為溫度28°C，轉(zhuǎn)速200r/min，通氣量900L/h，發(fā)酵時間為30小時。
10.枯草芽孢桿菌SOOl制備的微生物菌劑在制備微生物農(nóng)藥或微生物肥料中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能夠抑制多種病原菌的土壤枯草芽孢桿菌S001，并公開了以其制備的微生物菌劑及其制備方法。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供的保藏編號為S001(CGMCCNo.6425)的土壤枯草芽孢桿菌BacillussubtilisS001具有抑菌和促生能力，對尖鐮孢菌、辣椒立枯絲核菌、番茄葉霉菌、番茄早疫菌、番茄灰霉菌、茄子菌核菌、小麥全蝕菌、小麥根腐菌、小麥紋枯菌等病原菌有抑制作用；以其制備的微生物農(nóng)藥和微生物肥料環(huán)保性好，不易產(chǎn)生抗藥性，安全性良好。
文檔編號C12R1/125GK103103149SQ20131001041
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月11日
發(fā)明者陳秀蓉, 楊成德, 劉曉妹, 王艷, 盛紅梅, 潘龍其, 姚玉玲, 韋寶貴, 何贏 申請人:陳秀蓉, 楊成德