Gabr-a2診斷的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了選擇作為用NMDA拮抗劑藥物，諸如(S)-1-苯基-2-(吡啶-2-基)乙胺或氯胺酮治療的候選者的患者的方法，由此預(yù)測升高或降低的響應(yīng)NMDA拮抗劑的可能性。本發(fā)明提供了用于在稱為rs3756007，rs11503016，rs17537359或rs1372472的4個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點之任一處測定GABR-A2序列的方法。該方法還提供了為了測定這些GABR-A2?SNP處的序列而優(yōu)化的ARMS引物和包含適合于測定特定SNP的引物或探針的診斷試劑盒。
【專利說明】GABR-A2 診斷
[0001] 本發(fā)明涉及選擇作為用NMDA拮抗劑藥物，諸如[(S)-l-苯基-2-(吡啶-2-基）乙 胺]治療的候選者的患者的方法，由此預(yù)測升高或降低的響應(yīng)NMDA拮抗劑藥物的可能性， 并且涉及治療此類患者的方法。本發(fā)明的部分牽涉測定GABR-A2 (GABA受體的alpha-2亞 基）的核酸序列內(nèi)的多個位點處存在的特定多態(tài)性。能夠檢測這些SNP的引物、探針和試 劑盒用于預(yù)測對用NMDA拮抗劑藥物治療的可能響應(yīng)的用途也是本發(fā)明的一部分。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 重度抑郁病癥（MDD)是一種以存在一種或多種抑郁發(fā)作而沒有躁狂、混合或輕躁 狂發(fā)作史為特征的精神病狀況。盡管尚未闡明清楚的傳播方式，但是MDD的形成中存在有 遺傳成分的證據(jù)。
[0004] 目前，美國批準(zhǔn)用于治療MDD的藥劑有超過25種。盡管一大批抗抑郁藥物的 可用性，臨床試驗指示30 %至40 %的重度抑郁患者不能響應(yīng)一線抗抑郁治療，不管適 當(dāng)?shù)膭┝?、持續(xù)時間和順從性。此外，目前治療的抗抑郁發(fā)作的開始有相當(dāng)長的延遲時 間。明顯地，需要開發(fā)新穎且改善的用于MDD的治療劑。比現(xiàn)有療法具有更快的作用起 始和相等或更好的耐受性概況的抑郁療法會提供更好的治療備選，即可以潛在降低患 者遭受癥狀的時間和與自殺行為有關(guān)的風(fēng)險兩者的療法（Thase，Journal of Clinical Psychiatry, 63:95-103, 2002) 〇
[0005] 研究已經(jīng)證明了 NMDA受體拮抗劑氯胺酮在MDD患者中具有快速的抗抑郁效 果（Berman 等 Biological Psychiatry, 47(4) :351-354, 2000 及 Zarate 等 Archives of General Psychiatry, 63(8):856-864, 2006)〇
[0006] (S)-1-苯基-2-(批陡-2-基）乙胺（"化合物A"）是一種低未和力谷氨酸拮抗 劑（在NMDA受體的NR1A/2A亞型時，IC 5(I為350nM)，其已經(jīng)顯示在超過500名人志愿者和 患者中是非常良好耐受的，具有較小的引起擬精神病效果的傾向，其與在氯胺酮暴露情況 下的那些發(fā)現(xiàn)相當(dāng)（Torvaldsson 等 Sleep Research. 14:149-155, 2005 ;Lees 等 Stroke 322:466-472, 2001;及 Diener 等 Journal of Neurology 249:561-568, 2002)?；衔?A 披 露于W0 93/20052,并且其在治療抑郁中的用途披露于W0 00/00540。
[0007] 個人化的藥物的目的是預(yù)測哪種治療為個體提供最佳的結(jié)果。目前，不可能測量 抗抑郁藥對個體患者的可能性益處。
[0008] 在本文中描述的發(fā)明中，已經(jīng)鑒定出GABR-A2基因中的某些單核苷酸多態(tài)性 (SNP)，其影響抑郁或焦慮（諸如MDD)患者如何響應(yīng)NMDA拮抗劑藥物化合物A。發(fā)現(xiàn)SNP 『837560074813724724811503016和1817537359中每個的次要等位基因與用匪04拮抗劑 藥物化合物A治療的患者中的結(jié)果改善有關(guān)。發(fā)現(xiàn)SNP rs3756007擁有特別強的關(guān)聯(lián)。實 際上，此遺傳關(guān)聯(lián)即使在為應(yīng)用多重測試而調(diào)節(jié)時仍然是顯著的（在為16個獨立標(biāo)志物基 因座調(diào)節(jié)后，P = 〇. 0336)。在這些敘述的SNP位置（例如SNP rs3756007)處在用NMDA拮 抗劑藥物，諸如化合物A治療前對MDD患者的遺傳測試會幫助鑒定更可能接受來自用NMDA 拮抗劑藥物，諸如化合物A治療的卓越益處的那些患者，或患者組。
[0009] GABA受體是一種在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的GABA能神經(jīng)傳遞中牽涉的蛋白質(zhì)家 族。GABR-A2是GABA (哺乳動物腦中的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)）藉其起作用的異聚體五聚體 配體門控離子通道的GABA-A受體基因家族成員。GABA-A受體是許多重要的藥理劑，包括巴 比妥鹽酸類（barbiturates)、苯并二氮卓類（benzodiazepines)、和乙醇的作用位點。基因 GABR-A2在染色體4上，并且編碼γ-氨基丁酸（GABA)受體的亞基（alpha 2)。
[0010] SNP rs3756007的次要等位基因（其顯示與對化合物A的響應(yīng)增強的關(guān)聯(lián)）是 C(胞嘧啶）。SEQ ID N0:1代表GABR-A2基因的含有rs3756007 SNP的部分。相對于以SEQ ID N0:1顯示的序列，rs3756007 SNP在其中的位置401處。
[0011] SEQ ID N0:2代表GABR-A2基因的含有rsll503016 SNP的部分。相對于以SEQ ID N0:2顯示的序列，rsll503016 SNP在其中的位置401處。
[0012] SEQ ID N0:3代表GABR-A2基因的含有rsl7537359 SNP的部分。相對于以SEQ ID N0:3顯示的序列，rsl7537359 SNP在其中的位置401處。
[0013] SEQ ID N0:4代表GABR-A2基因的含有rsl372472 SNP的部分。相對于以SEQ ID N0:4顯示的序列，rsl372472 SNP在其中的位置401處。
[0014] SEQ ID N0:1-4中的序列敘述SNP位置處的次要等位基因堿基。
[0015] 本發(fā)明的各個方面與以下NMDA拮抗劑化合物結(jié)合特別有用：（S)-l-苯基-2-(吡 啶-2-基）乙胺（披露于W0 93/20052)。
[0016] 本發(fā)明容許選擇作為用NMDA拮抗劑藥物治療的候選者的患者，以預(yù)測升高或降 低的響應(yīng)NMDA拮抗劑藥物的可能性。特別地，若所述患者患上/患有抑郁且NMDA拮抗劑 藥物用于治療所述抑郁。
[0017] 依照本發(fā)明的一個方面，提供了評估個體對用NMDA拮抗劑治療的適合性的方法， 該方法包括a)在從個體采集的含有核酸的樣品中，測定選自下組的一個或多個單核苷酸 多態(tài)性位點處的核苷酸：rs3756007, rsll503016, rsl7537359,和rsl372472,其中每個是 GABR-A2基因序列的一部分，并且依靠存在的核苷酸評估個體對用NMDA拮抗劑治療的合適 性。在一個實施方案中，位置401(依照SEQ ID N0:1)或SNP rs3756007處胞嘧啶的存在 指示個體對用NMDA拮抗劑化合物治療的合適性。在一個實施方案中，位置401 (依照SEQ ID N0:2)或SNP rsll503016處胸腺嘧啶的存在指示個體對用NMDA拮抗劑化合物治療的 合適性。在一個實施方案中，位置401(依照SEQ ID N0:3)或SNP rsl7537359處胞嘧啶的 存在指示個體對用NMDA拮抗劑化合物治療的合適性。在一個實施方案中，位置401 (依照 SEQ ID N0:4)或SNP rsl372472處胸腺嘧啶的存在指示個體對用NMDA拮抗劑化合物治療 的合適性。
[0018] 依照本發(fā)明的一個方面，提供了評估個體對用NMDA拮抗劑治療的合適性的方法， 該方法包括a)在從個體采集的含有核酸的樣品中，依照SEQ ID NO: 1至4之任一（其中 每個是GABR-A2基因序列的一部分）中的位置測定位置401的核苷酸，并且依靠存在的核 苷酸評估個體對用NMDA拮抗劑治療的合適性。在一個實施方案中，位置401 (依照SEQ ID NO: 1)或SNP rs3756007處胞嘧啶的存在指示個體對用NMDA拮抗劑化合物治療的合適性。 在一個實施方案中，位置401(依照SEQ ID N0:2)或SNP rsll503016處胸腺嘧啶的存在指 示個體對用NMDA拮抗劑化合物治療的合適性。在一個實施方案中，位置401 (依照SEQ ID NO: 3)或SNP rsl7537359處胞嘧啶的存在指示個體對用NMDA拮抗劑化合物治療的合適性。 在一個實施方案中，位置401(依照SEQ ID N0:4)或SNP rsl372472處胸腺嘧啶的存在指 示個體對用NMDA拮抗劑化合物治療的合適性。
[0019] 依照本發(fā)明的另一個方面，提供了用于為用NMDA拮抗劑治療選擇患者的方法， 其包括在從患者獲得的含有核酸的樣品中，依照SEQ ID N0:1至4之任一（其中每個是 GABR-A2基因序列的一部分）中的位置測定位置401的核苷酸，并且若核酸在所述位置處擁 有次要等位基因，則對所述患者選擇用NMDA拮抗劑治療。
[0020] 依照本發(fā)明的另一個方面，提供了用于為用NMDA拮抗劑治療選擇患者的方法，所 述方法包括（i)提供來自患者的含有核酸的樣品；（ii)在患者的核酸中依照SEQ ID NO: 1 至4之任一（其中每個是GABR-A2基因序列的一部分）中的位置測定位置401的核苷酸，并 以其為基礎(chǔ)對患者選擇用NMDA拮抗劑治療。特別地，若患者的核酸具有位置401 (依照SEQ ID NO: 1)的胞嘧啶和/或位置401 (依照SEQ ID N0:2)的胸腺嘧啶和/或位置401 (依照 SEQ ID N0:3)的胞嘧啶和/或位置401 (依照SEQ ID N0:4)的胸腺嘧啶，則對患者選擇用 NMDA拮抗劑治療。即，若患者是純合的，具有在兩個等位基因上都具有位置401的胞嘧啶或 胸腺嘧啶，或者是雜合的，僅在一個等位基因上具有位置401的胞嘧啶或胸腺嘧啶。
[0021] 在上述發(fā)明的方面的具體實施方案中，在患者已經(jīng)測定為適合于用NMDA拮抗劑 治療，或者已經(jīng)選擇進(jìn)行此類治療時，用NMDA拮抗劑治療患者。
[0022] 依照本發(fā)明的另一個方面，提供了推薦治療的方法，該方法包括（a)選擇需要 治療抑郁的患者，該患者的基因組已經(jīng)鑒定為攜帶GABR-A2基因中單核苷酸多態(tài)性位置 rs3756007的胞嘧啶，和/或GABR-A2基因中SNP rsll503016的胸腺嘧啶，和/或GABR-A2 基因中SNP rsl7537359的胞嘧啶，和/或GABR-A2基因中SNP rsl372472的胸腺嘧啶；并 (b)推薦用NMDA拮抗劑治療患者。在一個實施方案中，患者是新診斷的GABR-A2基因的特 定基因型（上文提及的SNP的一個或另一個處存在的特定堿基）。在另一個實施方案中，患 者或患者的醫(yī)生知道患者的GABR-A2基因型，例如從歷史測定知道患者擁有GABR-A2基因 中單核苷酸多態(tài)性位置rs3756007處的胞嘧啶。
[0023] 依照本發(fā)明的另一個方面，提供了為患有抑郁的患者規(guī)定治療的方法，該方法 包括（a)測定患者的基因組是否已經(jīng)鑒定為攜帶GABR-A2基因中單核苷酸多態(tài)性位置 rs3756007處的胞嘧啶，和/或GABR-A2基因中SNP rsll503016處的胸腺嘧啶，和/或 GABR-A2基因中SNP rsl7537359處的胞嘧啶，和/或GABR-A2基因中SNP rsl372472處 的胸腺嘧啶；并且（b)若患者的基因組已經(jīng)鑒定為攜帶GABR-A2基因中單核苷酸多態(tài)性位 置rs3756007處的胞嘧啶，和/或GABR-A2基因中SNP rsll503016處的胸腺嘧啶，和/或 GABR-A2基因中SNP rsl7537359處的胞嘧啶，和/或GABR-A2基因中SNP rsl372472處的 胸腺嘧啶，規(guī)定患者用NMDA拮抗劑治療。
[0024] 依照本發(fā)明的另一個方面，提供了預(yù)測患有抑郁的患者是否會受益于用NMDA拮 抗劑藥物治療的方法，其包括在來自所述患者的含有核酸的樣品中測定GABR-A2基因中 SNP 位置 rs3756007,和 / 或 rsll503016,和 / 或 rsl7537359,和 / 或 rsl372472 處的核苷 酸，其中這些SNP位置之任一處的次要等位基因的存在指示與在所述一個或多個SNP位置 處具有主要等位基因純合子的個體相比，用NMDA拮抗劑藥物治療在個體中更可能是有效 的。在一個實施方案中，SNP位置rs3756007處胞嘧啶的存在指示與在所述位置處擁有胸 腺嘧啶的患者相比，用NMDA拮抗劑藥物的治療在所述患者中會更可能是有效的。
[0025] 依照本發(fā)明的另一個方面，提供了用于測定NMDA拮抗劑藥物在治療罹患抑郁的 患者的抑郁中的有效性的可能性的方法，其包括測定所述患者的GABR-A2基因是否包含單 核苷酸多態(tài)性位置rs3756007, rsll503016, rsl7537359或rsl372472之任一處的次要等 位基因，其中任何所述SNP位置處的次要等位基因的存在指示NMDA拮抗劑藥物比在患者 GABR-A2基因在所述位置處具有主要等位基因純合子時在治療抑郁中更可能是有效的。
[0026] 在上述發(fā)明的方面的具體實施方案中，若GABR-A2基因擁有rs3756007處的胞嘧 啶，則對患者選擇用NMDA拮抗劑治療，或者用NMDA拮抗劑治療。在上述發(fā)明的方面的其它 具體實施方案中，若GABR-A2基因擁有rs3756007處的胸腺嘧啶，則不對患者選擇用NMDA 拮抗劑治療，或者對所述患者取消用NMDA拮抗劑治療。
[0027] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括在與如SEQ ID NO: 1中限定的位置401對 應(yīng)的位置處在從患者獲得的樣品中測定GABR-A2基因的序列。在一個實施方案中，所述方 法包括測定從患者獲得的樣品中的GABR-A2基因序列在與如SEQ ID N0:1中限定的位置 401對應(yīng)的位置處是否是胞嘧啶，由此預(yù)測升高的響應(yīng)NMDA拮抗劑的可能性。在一個實施 方案中，所述方法包括測定從患者獲得的樣品中的GABR-A2基因序列在與如SEQ ID NO: 1 中限定的位置401對應(yīng)的位置處是否是胸腺嘧啶。
[0028] 本發(fā)明的方法適合于在抑郁和/或焦慮患者，特別是患有重度抑郁病癥（MDD)的 患者，患有單一或復(fù)發(fā)性抑郁發(fā)作的患者，治療難治性抑郁患者（即，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對其它抑 郁治療不響應(yīng)的患者；TRD)，雙相抑郁患者，廣泛性焦慮病癥患者（GAD)，強迫性病癥患者 (0⑶)，驚恐性病癥患者，創(chuàng)傷后應(yīng)激病癥患者（PTSD)，和社交焦慮病癥患者的情況下使用。 如此，本發(fā)明的方法適合于在患有MDD，TRD，GAD，0⑶，PTSD，雙相抑郁，驚恐性病癥或社交焦 慮病癥的患者的情況下使用。
[0029] 存在有描述新穎NMDA拮抗劑化合物的許多科學(xué)文章和專利文件。本領(lǐng)域技術(shù)人 員能夠鑒定在本發(fā)明中使用的NMDA拮抗劑。
[0030] 特別合適的具體NMDA拮抗劑化合物選自：氯胺酮和（s)-l-苯基-2-(吡 啶-2-基）乙胺（披露于W0 93/20052)。
[0031] 從患者獲得的樣品可以是含有細(xì)胞核酸的任何組織或任何生物樣品，例如含有循 環(huán)細(xì)胞或DNA的血液樣品。在一個實施方案中，血液樣品可以是全血、血漿、血清或沉淀的 血液（pelleted blood)。在一個實施方案中，樣品是組織樣品。組織樣品可以是新鮮的組 織樣品、冷凍的樣品、固定的或未固定的樣品。在另一個實施方案中，生物樣品是生物流體， 如痰、全血，或血液級分如血清或血漿。在另一個實施方案中，已經(jīng)使用最小程度侵入技術(shù) 獲得生物樣品，從而獲得細(xì)胞樣品，從該細(xì)胞樣品測定GABR-A2基因序列中一個或多個所 述SNP。在一個實施方案中，生物樣品必須含有足以檢測SNP身份的代表患者基因組的核 酸。
[0032] 從樣品生成分析用的核酸一般需要核酸擴增。許多擴增方法依賴于酶促鏈伸長 (諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、或自主序列復(fù)制）。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的擴增是 或牽涉指數(shù)擴增，諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)。
[0033] 可以通過本領(lǐng)域中的多種方法測定GABR-A2基因的位置401(依照SEQ ID N0:1 至4之任一）處的特定核苷酸（其分別對應(yīng)于rs3756007, rsll503016, rsl7537359和 rsl372472 SNP)。具體的方法包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)、與等位基因特異性探針或引物 雜交、等位基因特異性擴增（如擴增受阻突變系統(tǒng)-ARMS)、酶促突變檢測、質(zhì)譜術(shù)、單鏈構(gòu) 象多態(tài)性、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)、WAVE分析、變性梯度凝膠電泳、高分辨率熔解或 溫度梯度凝膠電泳或核酸測序。
[0034] 在一個實施方案中，通過測序測定GABR-A2基因中SNP位置處的核苷酸。在另一 個實施方案中，使用牽涉聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)的技術(shù)測定GABR-A2基因中SNP位置處的 核苷酸。在又一個實施方案中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用等位基因特異性引物，其檢測如SEQ ID NO: 1，2,3或4中限定的位置401處的堿基。如上文記錄的，位置401(依照SEQ ID NO: 1) 是稱為 rs3756007 的 SNP。
[0035] 在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了如上文描述的方法，其中用于測定GABR-A2 基因中 SEQ ID N0:l-4 的特定 GABR-A2 SNP(rs3756007, rsll503016, rsl7537359 或 rsl372472)/位置401的方法選自測序、WAVE分析、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)和擴增 反應(yīng)，如擴增受阻突變系統(tǒng)（ARMS)。ARMS記載于歐洲專利公開文本No. 0332435 (其內(nèi)容通 過提及收入本文），其公開并要求保護(hù)用于選擇性擴增相差少到1個堿基的模板序列的方 法，該方法現(xiàn)在通常稱為ARMSoZhongQhong等2006 Clinica Chimica Acta:364, 205-208) 描述了 RFLP。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了如上文描述的方法，其中用于測定從患者 獲得的樣品中 GABR-A2 基因中 SNP rs3756007，rsl 1503016, rsl7537359 或 rsl372472 處的 特定堿基的方法是擴增受阻突變系統(tǒng)。在一個實施方案中，ARMS可以包括使用瓊脂糖凝膠， 測序凝膠或?qū)崟rPCR。在一個實施方案中，ARMS包括使用實時PCR。ARMS測定法可以與檢 測反應(yīng)中的DNA存在的第二PCR反應(yīng)多重化/復(fù)合（multiplex)，由此指示成功的PCR。使 用用不同熒光標(biāo)簽標(biāo)記的TaqMan?探針，可以使用TaqMan?技術(shù)檢測兩個反應(yīng)的PCR產(chǎn)物。 使用ARMS而不是測序或RFLP檢測突變的優(yōu)點在于ARMS是更快的單一步驟測定法，需要更 少的處理和數(shù)據(jù)分析，并且ARMS可以相對于野生型多核苷酸的背景檢測樣品中的突變。擴 增反應(yīng)是核酸反應(yīng)，其導(dǎo)致靶核酸相對于非靶核酸的特異性擴增。
[0036] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)是一種公知的擴增反應(yīng)。
[0037] 術(shù)語"探針"指具有能夠與要檢測的等位基因的靶序列雜交的序列的單鏈序列特 異性寡核苷酸。
[0038] 術(shù)語"引物"指能夠充當(dāng)與拷貝的核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物合成的起始點的單 鏈DNA寡核苷酸序列或特異性引物。引物的長度和序列必須使得它們能夠引發(fā)延伸產(chǎn)物的 合成。
[0039] 術(shù)語"核酸"包括能夠在嚴(yán)格雜交條件下與上文鑒定的天然存在核酸或其互補物 雜交的那些多核苷酸。嚴(yán)格雜交條件指在包含50%甲酰胺，5x SSC(750mM NaCl，75mM檸檬 酸三鈉），50mM磷酸鈉（pH7. 6)，5x登哈特（Denhardt)氏溶液，10 %硫酸葡聚糖（dextran sulfate)，和20pg/ml變性的、剪切的鮭魚精DNA的溶液中于42 °C溫育過夜，接著在0. lx SSC中于約65°C清洗濾紙，持續(xù)至少30分鐘，例如兩次各30分鐘的清洗。
[0040] 許多祀物和信號擴增方法已經(jīng)記載于文獻(xiàn)中，例如Landegren，U等，Science 242:229-237 (1988)及 Lewis, R·，Genetic Engineering News 10:1,54-55(1990)中的這 些方法的一般綜述。這些擴增方法可以用于我們發(fā)明的方法，并且包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)、原位PCR、連接酶擴增反應(yīng)（LAR)、連接酶雜交、Qi3噬菌體復(fù)制酶、基于轉(zhuǎn)錄的擴增 系統(tǒng)（TAS)、基因組擴增伴轉(zhuǎn)錄物測序（GAWTS)、基于核酸序列的擴增（NASBA)和原位雜交。 可以依照本領(lǐng)域中已知的方法制備適合于在多種擴增技術(shù)中使用的引物。
[0041] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)是一種美國專利No. 4, 683, 195和4, 683, 202及其他中描 述的核酸擴增方法。PCR由DNA聚合酶產(chǎn)生的引物延伸反應(yīng)的重復(fù)循環(huán)組成。將靶DNA熱 變性，并雜交兩個寡核苷酸，所述寡核苷酸括入（bracket)要擴增的DNA的相反鏈上的靶序 列。這些寡核苷酸變?yōu)榕cDNA聚合酶一起使用的引物。通過引物延伸以生成兩條鏈的第二 個拷貝來復(fù)制DNA。通過重復(fù)熱變性、引物雜交和延伸的循環(huán)，可以在約2至4小時中將靶 DNA擴增100萬倍或更多。PCR是一種分子生物學(xué)工具，其必須與檢測技術(shù)結(jié)合使用以檢測 擴增結(jié)果。PCR的優(yōu)點是其通過在約4小時中將靶DNA的量擴增100萬至10億倍而提高 靈敏性。PCR可以用于擴增診斷背景中的任何已知的核酸（Mok等，（1994)，Gynaecologic Oncology, 52:247-252)。
[0042] 自主序列復(fù)制（3SR)是一種TAS變型，其牽涉經(jīng)由通過酶混合物和合適的寡核苷 酸引物介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄酶（RT)、聚合酶和核酸酶活性的序貫輪次進(jìn)行的核酸模板等溫擴增 (Guatelli 等（1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874)。使用對 RNA/DNA 異雙鏈體的 RNA 的酶促降解代替熱變性。將RNA酶Η和所有其它酶添加至反應(yīng)，并且在相同溫度且在沒有 進(jìn)一步試劑添加的情況下發(fā)生所有步驟。在此過程后，可以于42°C在1小時中實現(xiàn)10 6至 1〇9的擴增。
[0043] 連接擴增反應(yīng)或連接擴增系統(tǒng)（LAR/LAS)使用DNA連接酶和4種寡核苷酸（每個 靶鏈2種）。此，0.￥.和聽1113〇6，1?.8.(1989)6611〇11^〇8 4:560描述了此技術(shù)。寡核苷酸與 靶DNA上的鄰近序列雜交，并且通過連接酶連接。將反應(yīng)熱變性，并且重復(fù)循環(huán)。
[0044] Q β復(fù)制酶。在此技術(shù)中，使用噬菌體Q β的RNA復(fù)制酶（其復(fù)制單鏈RNA)擴增 靶DNA，如由Lizardi等（1988)Bio/Technology 6:1197描述的。首先，將靶0嫩與包含丁7 啟動子和QP 5'序列區(qū)的引物雜交。使用此引物，逆轉(zhuǎn)錄酶在該過程中生成將引物與其5' 端連接的cDNA。這兩個步驟與TAS方案相似。將所得的異雙鏈體熱變性。接著，使用含有 Q3 3'序列區(qū)的第二引物啟動第二輪cDNA合成。這生成含有Qi3噬菌體的5'和3'端兩 者及活性T7 RNA聚合酶結(jié)合位點的雙鏈DNA。T7 RNA聚合酶然后將雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄成新的 RNA，其模擬Q β。在廣泛清洗以除去任何未雜交的探針后，從靶物洗脫新的RNA，并通過Q β 復(fù)制酶復(fù)制。后一種反應(yīng)可以在約20分鐘中產(chǎn)生107倍擴增。
[0045] 在擴增出核酸后，許多技術(shù)可用于檢測單堿基對突變或多態(tài)性。一種此類技術(shù)是 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP)。SCCP檢測基于在電泳期間與參照DNA相比單鏈突變DNA的異常 遷移。突變產(chǎn)生單鏈DNA的構(gòu)象變化，產(chǎn)生遷移率轉(zhuǎn)變。熒光SCCP使用熒光標(biāo)記的引物以 幫助檢測。如此，使用熒光標(biāo)記引物擴增參照和突變體DNA。將擴增的DNA變性，并快速冷 卻以生成單鏈DNA分子，其通過非變性凝膠電泳檢查。
[0046] 化學(xué)錯配切割（CMC)基于通過羥胺、四氧化鋨和哌啶的組合對DNA錯配堿基對的 識別和切割。如此，用熒光標(biāo)記引物擴增參照DNA和突變體DNA兩者。將擴增子雜交，然后 使用四氧化鋨（其結(jié)合錯配的T堿基），或羥胺（其結(jié)合錯配的C堿基），接著是哌啶（其 在經(jīng)修飾的堿基的位點處切割）使其經(jīng)受切割。然后，通過電泳檢測切割的片段。
[0047] 還可以使用基于限制性片段多態(tài)性（RFLP)的技術(shù)。
[0048] 此外，可以使用基于 WAVE 分析的技術(shù)（Methods Mol. Med. 2004 ;108:173-88)。此 DNA片段分析系統(tǒng)可以用于檢測單核苷酸多態(tài)性，并且基于溫度調(diào)控的液相層析和高分辨 率基質(zhì)（Genet Test. 1997-98 ; 1 (3) : 201-6.)。
[0049] 實時PCR (又稱為定量PCR，實時定量PCR，或RTQ-PCR)是一種同時DNA量化和擴增 的方法（Expert Rev. Mol. Diagn. 2005 (2) :209-19)。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性擴增DNA。 在每輪擴增后，量化DNA。常見的量化方法包括使用插入雙鏈DNA和經(jīng)修飾的DNA寡核苷酸 (稱作探針）的熒光染料，其在與互補DNA雜交時發(fā)熒光。
[0050] 稱為Scorpion?引物的特異性引物可以用于高度靈敏且快速的DNA擴增系統(tǒng)。 此類引物在單一分子中組合探針與特異性靶序列，產(chǎn)生具有單分子動力學(xué)的熒光檢測系 統(tǒng)（Nucl. Acids Res. 2000,28:3752-3761)。這相對于其它熒光探針系統(tǒng)諸如分子燈塔 (Molecular Beacons)和TaqMan?具有的優(yōu)點在于不需要分開的探針結(jié)合擴增的革巴物， 使檢測更快且更有效。三種檢測方法的直接比較（Nucl. Acids Res 2000,28:3752-3761) 指示Scorpions'?比分子間探查系統(tǒng)更好地運行，特別是在快速的循環(huán)條件下。Scorpion? 引物的一種型式的結(jié)構(gòu)使得它通過在對感興趣的靶物特異性的探針序列側(cè)翼的6個左右 的堿基的互補莖序列在發(fā)夾環(huán)構(gòu)象中保持（Nat. Biotechnol. 1999, 17:804-807)。該莖也用 來與淬滅劑分子極其接近一起定位熒光報告染料（與5'端附接）。在此構(gòu)象中，不產(chǎn)生信 號。PCR阻斷劑分開發(fā)夾環(huán)與引物序列，其形成Scorpion?的3'端。阻斷劑阻止通讀，這會 導(dǎo)致在缺乏特異性靶物的情況下發(fā)夾環(huán)的解折疊。在PCR期間，照常從引物發(fā)生延伸。在 隨后的變性和退火步驟后，發(fā)夾環(huán)解折疊，并且若已經(jīng)擴增出正確的產(chǎn)物，則探針序列結(jié)合 新合成鏈上引物下游的特異性靶序列。此新結(jié)構(gòu)比初始發(fā)夾環(huán)在熱力學(xué)上更穩(wěn)定?，F(xiàn)在產(chǎn) 生熒光信號，因為熒光染料不再與淬滅劑極其接近。熒光信號與靶DNA的量成正比。
[0051] 一種備選的Scorpion?引物包含兩個互補標(biāo)記寡核苷酸的雙鏈體。雙鏈體的一個 寡核苷酸用5'端報告染料標(biāo)記，并且攜帶阻斷劑非編碼核苷酸和PCR引物元件兩者，而另 一個寡核苷酸用3'端淬滅劑染料標(biāo)記。然后，作用機制與上文描述的Scorpion?發(fā)夾引物 基本上相同：在實時定量PCR期間，5'端報告染料和3'端淬滅染料彼此分開，導(dǎo)致熒光發(fā) 射的顯著升高。
[0052] Scorpions?可以與擴增受阻突變系統(tǒng)（ARMS)組合使用（Nucl. Acids Res. 1989, 17:2503-2516, Nat. Biotechnol. 1999, 17:804-807)以使單堿基突變能夠被檢 出。在合適的PCR條件下，位于引物的3'端的單堿基錯配對于完全匹配等位基因的偏愛擴 增是足夠的（Newton等，Nucl. Acids Res. 17:2503-2516, 1989)，這容許區(qū)別緊密相關(guān)的物 種。使用上文描述的引物的擴增系統(tǒng)的基礎(chǔ)在于具有錯配的3'殘基的寡核苷酸在合適的 條件下在PCR中不會發(fā)揮引物功能。此擴增系統(tǒng)容許僅通過在瓊脂糖凝膠電泳后檢查反應(yīng) 混合物來基因分型。它是簡單且可靠的，并且會清楚區(qū)別基因座處的雜合子與任一等位基 因的純合子。ARMS不需要限制酶消化，如常規(guī)應(yīng)用的等位基因特異性寡核苷酸，或PCR產(chǎn)物 的序列分析。
[0053] 在一個實施方案中，核苷酸測定方法牽涉使用實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（實時PCR)， 其用檢測單堿基突變或多態(tài)性的等位基因特異性（ARMS)引物進(jìn)行。
[0054] 就GABR-A2基因的rs3756007/位置401 (依照SEQ ID NO: 1中的位置）處的堿 基/核苷酸而言，胞嘧啶在本文中稱為次要等位基因，并且胸腺嘧啶稱為主要等位基因。令 人驚訝地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了擁有次要等位基因的患有抑郁的患者比那些在GABR-A2基因中的 rs3756007處擁有主要等位基因（純合子）的患者更可能有利地響應(yīng)用NMDA拮抗劑治療抑 郁。
[0055] 在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了如上文描述的ARMS法，其中使用第一引物 對檢測次要等位基因，并使用第二引物對檢測主要等位基因；且其中每對中的一個引物包 含：
[0056] (a)具有對特定等位基因特異性的末端3'核苷酸的引物；和
[0057] (b)在引物的3'端的可能的額外錯配。
[0058] 在一個情況中，每對中的一個引物包含：
[0059] (a)含有引物序列和對靶序列特異性的別的序列兩者的單分子或核酸雙鏈體探 針；
[0060] (b)在所述單分子或核酸雙鏈體內(nèi)與淬滅劑分子極其接近的與探針的5'端附接 的熒光報告染料；
[0061] (c)在所述探針的一端的一個或多個非編碼核苷酸殘基；
[0062] (d)其中所述報告染料和淬滅劑分子在靶序列的擴增期間被分開。
[0063] 在一個實施方案中，探針是Scorpion?探針。
[0064] 在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了在自患者獲得的含有核酸的樣品中在SNP rs3756007, rsll503016, rsl7537359 或 rsl372472 處測定 GABR-A2 基因序列的方法，其包括 分別使用能夠識別與依照SEQ ID N0:1-4的位置401對應(yīng)的GABR-A2基因序列的ARMS引 物。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了在自患者獲得的樣品中在SNP rs3756007處測定 GABR-A2基因序列的方法，包括使用ARMS引物和伴侶引物，其經(jīng)優(yōu)化以擴增包含與依照SEQ ID NO: 1的位置401對應(yīng)的堿基的GABR-A2基因序列區(qū)。技術(shù)人員會理解"經(jīng)優(yōu)化以擴增" 包括測定正向引物和反向引物的最合適的長度和位置。在一個實施方案中，能夠識別特定 SNP堿基的ARMS引物可以是正向或反向引物的。在ARMS測定法中使用的正向反向引物經(jīng) 優(yōu)化以擴增小于500個堿基的區(qū)。在一個實施方案中，引物經(jīng)優(yōu)化以擴增小于250個堿基 的區(qū)。在一個實施方案中，引物經(jīng)優(yōu)化以擴增小于200個堿基的區(qū)。在一個實施方案中，弓丨 物經(jīng)優(yōu)化以擴增大于100個堿基的區(qū)。
[0065] 在一個實施方案中，ARMS正向引物能夠識別與如SEQ ID N0:1，2,3或4之任一項 中限定的位置401對應(yīng)的位置處的GABR-A2基因序列。在一個實施方案中，ARMS反向引物 能夠識別與如SEQ ID N0:1，2, 3或4之任一項中限定的位置401對應(yīng)的位置處的GABR-A2 基因序列。在此語境中，"識別"意指特異性雜交和/或能夠促進(jìn)引物自其延伸。ARMS測定 法中使用的任一引物可以包含鎖定核酸以增強或促進(jìn)與底物核酸雜交。鎖定核酸（LNA)寡 核苷酸含有連接核糖的2' -氧與4' -碳的亞甲基橋。此橋生成鎖定的3' -內(nèi)構(gòu)象，降低 核糖的構(gòu)象柔性，并且提高磷酸酯主鏈的局部構(gòu)造。Braasch和Corey已經(jīng)綜述了 LNA/DNA 雜合物的特性（Braasch 和 Corey, 2001，Chemistry&Biology 8:1-7)。
[0066] 幾項研究已經(jīng)顯示了包含LNA的引物對于互補DNA序列具有改善的親和力。在與 相同長度和序列的DNA:DNA復(fù)合物相比時，單LNA堿基的并入可以容許熔解溫度（Tm)升高 到高達(dá)41 °C，并且還可以將Tm值提高多達(dá)9. 6°C。Braasch和Corey提出LNA堿基的納入 會對短于10個堿基的寡核苷酸具有最大的影響。
[0067] 已經(jīng)綜述了使用LNA設(shè)計PCR引物的暗示（Latorra, Arar和 Hurley, 2003, Molecular and Cellular Probes 17, 253-259)。注意到穩(wěn)固的引物設(shè)計原則 尚未得到建立，但是優(yōu)化PCR引物中的LNA替代是復(fù)雜的，且依賴于數(shù)目、位置和序列背景。 Ugozolli 等（Ugozolli, Latorra, Pucket, Arar 和 Hamby, 2004, Analytical Biochemistry 324, 143-152)描述了在使用5'核酸酶測定法在實時PCR中使用LNA探針檢測SNPoLatorra 等（Latorra, Campbell, Wolter 和 Hurley, 2003, Human Mutation 22, 79-85)合成一系列在 3'端和在與3'端鄰近的位置處含有LNA堿基的引物，用作等位基因特異性引物。雖然相對 于DNA引物降低從錯配LNA序列的引發(fā)，但是個別反應(yīng)的優(yōu)化是需要的。
[0068] 在一個實施方案中，ARMS正向和/或反向引物包含如下的序列，其中一個或多個 標(biāo)準(zhǔn)的DNA堿基已經(jīng)用LNA堿基替代。
[0069] 在一個實施方案中，提供了 ARMS探針，其能夠結(jié)合源自在ARMS測定法中使用如上 文描述的ARMS引物對的擴增產(chǎn)物。在一個實施方案中，ARMS探針包含如下的序列，其中一 個或多個標(biāo)準(zhǔn)的DNA堿基已經(jīng)用LNA堿基替代。在一個實施方案中，ARMS探針包含5'端的 Yakima Yellow?熒光標(biāo)簽。在一個實施方案中，ARMS探針包含3'端的BHQ?淬滅劑。技 術(shù)人員會認(rèn)識到探針在擴增產(chǎn)物中結(jié)合（且因此探針序列互補）的位置不僅限于決定擴增 產(chǎn)物的正向和反向引物所施加的邊界。
[0070] 可以使用對照探針確認(rèn)ARMS測定法如意圖的那樣起作用，并且確認(rèn)ARMS測定法 中使用的樣品中有DNA。技術(shù)人員會理解對照探針會靶向至任何選擇的基因。
[0071] 在本發(fā)明的另一個方面，提供了如上文描述的方法，其中用于測定SNPrs3756007 處的GABR-A2基因序列的方法包括測定通過逆轉(zhuǎn)錄從患者的生物學(xué)樣品提取的 GABR-A2基因 mRNA生成的cDNA序列。此類樣品可以是新鮮的樣品，檔案樣品或其它 臨床材料。從經(jīng)福爾馬林固定的組織提取RNA已經(jīng)記載于Bock等，2001 Analytical Biochemistry: 295116-117,從非固定的組織提取RNA的規(guī)程，通過逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA的 方案，PCR 擴增和測序記載于 Sambrook, J.和 Russell, D. W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,2001。
[0072] 本發(fā)明的又一個方面提供了診斷試劑盒，其包含能夠鑒定選自下組的GABR-A2 SNP之一的次要等位基因的雜交或擴增引物和能夠鑒定選自下組的GABR-A2 SNP之一的主 要等位基因的雜交或擴增引物：rs3756007，rsll503016，rsl7537359和rsl372472,和任選 地使用說明書。
[0073] 本發(fā)明的又一個方面提供了診斷試劑盒，其包含能夠檢測GABR-A2中的 rs3756007 SNP(對應(yīng)于位置401，如SEQ ID N0:1中限定）的ARMS正向或反向引物，和任 選地ARMS伴侶引物，及任選地使用說明書。取決于哪條引物（正向或反向）在要檢測的等 位基因的位置處結(jié)合，另一條引物稱為"伴侶"引物。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了 診斷試劑盒，其包含包括一個或多個LNA堿基且能夠識別與如SEQ ID NO: 1中限定的位置 401對應(yīng)的位置處的GABR-A2序列的ARMS突變體引物，和任選地ARMS伴侶引物，及任選地 使用說明書。在一個實施方案中，診斷試劑盒可以在預(yù)測作為用NMDA拮抗劑治療的候選者 的患者會響應(yīng)所述治療的可能性的方法中使用。在一個備選的實施方案中，診斷試劑盒可 以在選擇作為用NMDA拮抗劑治療抑郁的候選者的患者以進(jìn)行所述治療中使用。
[0074] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了能夠識別與依照SEQ ID NO: 1的位置401對應(yīng)的 位置處的胸腺嘧啶或胞嘧啶的引物或探針用于預(yù)測患者對用NMDA拮抗劑治療抑郁的響應(yīng) 的用途。
[0075] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了能夠識別與依照SEQ ID NO:2的位置401對應(yīng)的 位置處的胸腺嘧啶或腺嘌呤的引物或探針用于預(yù)測患者對用NMDA拮抗劑治療抑郁的響應(yīng) 的用途。
[0076] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了能夠識別與依照SEQ ID N0:3的位置401對應(yīng)的 位置處的胸腺嘧啶或胞嘧啶的引物或探針用于預(yù)測患者對用NMDA拮抗劑治療抑郁的響應(yīng) 的用途。
[0077] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了能夠識別與依照SEQ ID N0:4的位置401對應(yīng)的 位置處的胸腺嘧啶或腺嘌呤的引物或探針用于預(yù)測患者對用NMDA拮抗劑治療抑郁的響應(yīng) 的用途。
[0078] 在又一個方面，提供了對依照SEQ ID N0:1的GABR-A2基因的位置401，或依照SEQ ID N0:2的GABR-A2基因的位置401，或依照SEQ ID N0:3的GABR-A2基因的位置401，或依 照SEQ ID N0:4的GABR-A2基因的位置401特異性的引物或探針在制造用于預(yù)測患有抑郁 的患者對NMDA拮抗劑的響應(yīng)的組合物或試劑盒中的用途。
[0079] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了與包含與依照SEQ ID N0:1-4之任一的位置401 對應(yīng)的位置處的堿基的序列相同或部分互補的長度至少12個核堿基，諸如至少12,15,20， 25, 30, 35,40,45, 50, 75,100或更多的寡核苷酸。在一個具體的實施方案中，寡核苷酸小于 50個核堿基。在序列與靶序列部分互補時，它必須能夠與所述序列雜交，使得容許檢測和/ 或自其的鏈延伸。
[0080] 在一個具體的實施方案中，如上文描述的方法可以用于評估NMDA拮抗劑的藥物 遺傳學(xué)。藥物遺傳學(xué)是引起對藥物的不同響應(yīng)的遺傳變異的研究。通過測定在從患者獲得 的樣品中在SNP rs3756007或其它3個所述GABR-A2基因 SNP之任一處的GABR-A2基因序 列并且分析患者對NMDA拮抗劑的響應(yīng)，可以闡明NMDA拮抗劑的藥物遺傳學(xué)。
[0081] 在一個實施方案中，可以使用用于預(yù)測作為用NMDA拮抗劑治療的候選者的患者 會響應(yīng)所述治療的可能性的方法選擇抑郁患者或患者群體以用NMDA拮抗劑治療。
[0082] 在一個實施方案中，可以使用用于預(yù)測作為用NMDA拮抗劑治療的候選者的患有 抑郁或焦慮的患者會響應(yīng)所述治療的可能性的方法預(yù)測抑郁患者或患者群體對用NMDA拮 抗劑治療的響應(yīng)性。
[0083] 會將NMDA拮抗劑并入適合于對有此需要的受試者的藥物施用的組合物或配制劑 中，其通過例如將化合物與一種或多種藥學(xué)可接受載體、賦形劑、緩沖劑、佐劑、穩(wěn)定劑、或 其它材料混合進(jìn)行，如上文描述的。
[0084] 如本文中使用的，術(shù)語"藥學(xué)可接受"屬于與合理的益處/風(fēng)險比相稱的在合理的 醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)適合于與受試者（例如人）的組織接觸使用而沒有過度毒性、刺激、變應(yīng) 性應(yīng)答、或其它問題或并發(fā)癥的化合物、材料、組合物和/或劑型。在與配制劑的其它成分 相容的意義上，每種載體、賦形劑等也必須是"可接受的"。
[0085] 合適的載體、稀釋劑、賦形劑等可以參見標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)教科書。參見例如Handbook of Pharmaceutical Additives,第 2版（Μ· Ash和 I. Ash編），2001(Synapse Information Resources,Inc. , Endicott, New York,USA) ；Remington, s Pharmaceutical Sciences, 第 20 版，pub. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000 或 Handbook of Pharmaceutical Excipients,第 2 版，1994。
[0086] 配制劑可以常規(guī)地以單位劑量形式呈現(xiàn)，并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域中公知的任何方 法制備。此類方法包括使活性化合物與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體結(jié)合的步驟。一般 地，通過均一且密切地使活性化合物與液體載體或細(xì)碎固體載體或兩者結(jié)合，然后在必要 時將產(chǎn)物定形來制備配制劑。
[0087] 配制劑可以為液體、溶液、懸浮液、乳劑、酏劑、糖漿劑、片劑、錠劑、顆粒劑、粉劑、 膠囊劑、扁囊劑、丸劑、安瓿、栓劑、陰道栓（pessaries)、軟膏劑、凝膠、糊劑、乳膏、噴霧劑、 噴霧、泡沫、洗劑（lotions)、油類、大丸劑（boluses)、藥糖劑（electuary)、或氣霧劑形式。 [0088] 適合于口服施用（例如通過攝?。┑呐渲苿┛梢猿尸F(xiàn)為離散單元，諸如膠囊劑、扁 囊劑或片劑，其各含有預(yù)先確定量的活性化合物；為粉劑或顆粒劑；為水性或非水性液體 中的溶液或懸浮液；或為水包油液體乳劑或油包水液體乳劑；為大丸劑；為藥糖劑；或為糊 劑。
[0089] 片劑可以通過常規(guī)手段，例如壓縮或模壓（molding)，任選用一種或多種輔助成 分生成?？梢酝ㄟ^在合適的機器中壓縮任選與下列各種混合的自流形式諸如粉劑或顆粒 劑的活性化合物制備壓制片：一種或多種粘合劑（例如聚維酮（povidone)，明膠，阿拉伯 膠（acacia)，山梨糖醇，西黃蓍膠，羥丙基甲基纖維素）；填充劑或稀釋劑（例如乳糖，微 晶纖維素，磷酸氫鈣）；潤滑劑（例如硬脂酸鎂，滑石，硅土）；崩解劑（例如淀粉羥乙酸鈉 (sodium starch glycolate)，交聯(lián)的聚維酮，交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉）；表面活性或分散劑 或濕潤劑（例如月桂基硫酸鈉）；和防腐劑（例如對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸丙酯， 山梨酸）?？梢酝ㄟ^在合適的機器中模壓用惰性液體稀釋劑濕潤的粉末化合物的混合物生 成模制片。任選地，可以將片劑涂層或評分，并且可以配制為使得提供其中的活性化合物的 緩慢或受控釋放，其使用例如不同比例的羥丙基甲基纖維素來提供期望的釋放概況。任選 地，可以給片劑提供腸衣，在除胃之外的腸部分中提供釋放。
[0090] 適合于鼻施用的配制劑（其中載體是固體）包括具有例如范圍為約20至約500 微米的粒度的粗粉，其以采用鼻煙的方式施用，即通過經(jīng)由鼻道從貼近鼻保持的粉末容器 快速吸入。適合于以例如鼻噴霧劑、滴鼻劑或通過霧化劑施用氣霧劑施用的配制劑（其中 載體是液體）包括活性化合物的水性或油性溶液。
[0091] 適合于通過吸入施用的配制劑包括那些通過使用合適的推進(jìn)劑，諸如二氯二氟甲 烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳，或其它合適的氣體從加壓包以氣霧劑噴霧呈現(xiàn) 的。
[0092] 適合于直腸施用的配制劑可以呈現(xiàn)為具有合適基質(zhì)（包括例如可可油或水楊酸 酯）的栓劑。
[0093] 適合于胃腸外施用（例如通過注射，包括皮膚、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi)）的 配制劑包括水性和非水性等張、無熱原、無菌注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、防腐 齊IJ、穩(wěn)定劑、抑菌劑、和使配制劑與意圖接受者的血液等張的溶質(zhì)；和水性和非水性無菌懸 浮液，其可以包含懸浮劑和增稠劑，和脂質(zhì)體或設(shè)計為將化合物靶向至血液組分或一種或 多種器官的其它微粒系統(tǒng)。在此類配制劑中使用的合適的等張媒介物的例子包括氯化鈉注 射液，林格氏溶液，或乳酸鹽林格氏溶液。通常，溶液中活性化合物的濃度是約lng/ml至約 10 μ g/ml，例如約10ng/ml至約1 μ g/ml。配制劑可以在單位劑量或多劑量密封容器，例如 安瓿或小瓶中呈現(xiàn)，并且可以在冷凍干燥（凍干）條件中貯存，就在使用前僅需要添加無菌 液體載體，例如注射用水?？梢詮臒o菌粉末、顆粒、和片劑制備即時注射溶液和懸浮液。配 制劑可以為脂質(zhì)體或設(shè)計為將活性化合物靶向至血液組分或一種或多種器官的其它微粒 系統(tǒng)的形式。
[0094] 特定疾病狀態(tài)的治療性或預(yù)防性處理需要的每種療法的劑量大小一定會隨治療 的宿主、施用途徑和所治療的疾病的嚴(yán)重性而變化。
[0095] 因而，治療任何特定患者，并且考慮已知修飾藥物作用的各種因素，包括疾病的嚴(yán) 重性和類型、體重、性別、飲食、施用時間和路徑、其它藥物和其它相關(guān)臨床因素的從業(yè)人員 可以確定最佳劑量。還可能有必要或期望降低聯(lián)合治療的組分的上文提及的劑量以降低毒 性。治療有效劑量可以通過體外或體內(nèi)方法確定。
[0096] 本文中描述的組合物可以為如下的形式，所述形式適合于口服施用，例如為片劑 或膠囊劑，適合于鼻施用或吸入施用，例如為粉末或溶液，適合于胃腸外注射（包括靜脈 內(nèi)，皮下，肌肉內(nèi)，血管內(nèi)或輸注），例如為無菌溶液，懸浮液或乳劑，適合于表面施用，例如 為軟膏劑或乳膏，適合于直腸施用，例如為栓劑，或者施用路徑可以通過直接注射到腫瘤中 或者通過區(qū)域遞送或通過局部遞送進(jìn)行。
[0097] 可以通過體外或體內(nèi)方法確定治療有效劑量。計算治療藥物劑量是一項復(fù)雜的任 務(wù)，需要考慮藥物、藥動學(xué)和藥物遺傳學(xué)?？紤]已知修飾藥物作用的各種因素，包括疾病的 嚴(yán)重性和類型、體重、性別、飲食、施用時間和路徑、其它藥物和其它相關(guān)臨床因素，主治內(nèi) 科醫(yī)生會確定給定患者的治療藥物劑量。然而，通常會對溫血動物施用NMDA拮抗劑，從而 在需要時以分開劑量給予，接受范圍為例如〇. 〇lmg/kg至75mg/kg體重的日劑量。NMDA拮 抗劑可以口服諸如以片劑、扁膠劑或膠囊劑施用。NMDA拮抗劑也可以胃腸外施用。在此類 情況中，會使用較低的劑量。因此，例如對于靜脈內(nèi)施用，一般會使用范圍為0. 〇lmg/kg至 30mg/kg體重的劑量。
[0098] 在一個實施方案中，NMDA拮抗劑選自下組：（S)-1_苯基-2-(吡啶-2-基）乙胺和 氯胺酮。
[0099] NMDA拮抗劑的有效量會取決于例如治療目標(biāo)、施用路徑、和患者的狀況。因而，治 療學(xué)家有可能滴定劑量，并且在需要時修改施用路徑以獲得最佳的治療效果。典型的日劑 量或間隔劑量，諸如每周，每兩周或每月范圍可以是約〇. 5mg至多達(dá)300mg，500mg，lOOOmg 或1200mg或更多，這取決于上文提及的因素。
[0100] 我們設(shè)想NMDA拮抗劑可以作為單一療法或者與其它藥物組合使用。本發(fā)明也可 用于輔助療法，或者作為一線療法。
[0101] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法另外包括對患者施用NMDA拮抗劑，所述患者依 照上文描述的方法選擇或預(yù)測為響應(yīng)用NMDA拮抗劑的治療。
[0102] 在一個實施方案中，所述方法對患者的生物學(xué)樣品實施以測定與位置401 (依照 SEQ ID N0:1-4之一或另一）對應(yīng)的GABR-A2基因中的位置處的等位基因，進(jìn)一步包括對鑒 定為適合于用藥物治療的患者施用一定量的NMDA拮抗劑。在一個具體的實施方案中，在施 用步驟后對患者施用NMDA拮抗劑。
[0103] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了 NMDA拮抗劑在制備用于依照上文描述的方法選 擇或預(yù)測為響應(yīng)或更有利響應(yīng)用NMDA拮抗劑治療的患者或患者群體的藥物中的用途。
[0104] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了治療依照如本文描述的方法選擇或預(yù)測為具有升 高的響應(yīng)NMDA拮抗劑的可能性的患者或患者群體的方法,包括對所述患者施用NMDA拮抗 劑。
[0105] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了治療患有抑郁或焦慮的患者的方法，其包括依照 上文描述的本發(fā)明方法測定患者是否會有利響應(yīng)NMDA拮抗劑，并且若他們鑒定為可能響 應(yīng)用NMDA拮抗劑治療，則對所述患者施用有效量的NMDA拮抗劑。
[0106] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了治療患有抑郁或焦慮的患者的方法，其包括：
[0107] (i)提供來自患者的含有核酸的樣品，
[0108] (ii)測定 GABR-A2 基因中 SNP rs3756007，rsll503016，rsl7537359 或 rsl372472 之一或另一處的等位基因；并
[0109] (iii)若患者的細(xì)胞DNA在所述位置處擁有次要等位基因，則對患者施用有效量 的NMDA拮抗劑。
[0110] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了治療患有抑郁或焦慮的患者的方法，其包括：
[0111] (iv)提供來自患者的含有核酸的樣品；
[0112] (V)測定GABR-A2基因中SNP位置rs3756007處的等位基因；并
[0113] (vi)若患者的細(xì)胞DNA在所述位置處擁有胞嘧啶，則對患者施用有效量的NMDA拮 抗劑。
[0114] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了治療作為用NMDA拮抗劑治療的候選者的患者的 方法，其包括：
[0115] ⑴在如SEQ ID N0:1中限定的以下位置：位置401處測定自患者獲得的樣品中 的GABR-A2堿基是否是胞嘧啶；并
[0116] (ii)若步驟（i)中測定的堿基是胞嘧啶，則對所述患者施用有效量的NMDA拮抗 劑。
[0117] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了治療作為用NMDA拮抗劑治療的候選者的患者的 方法，其包括：
[0118] (i)在依照SEQ ID N0:l-4之任一的位置401處測定自患者獲得的樣品中的 GABR-A2序列是否是次要等位基因；并
[0119] (ii)若步驟⑴的回答為是，則對所述患者施用有效量的NMDA拮抗劑。
[0120] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了治療方法，其包括：
[0121] (a)選擇需要治療抑郁或焦慮的患者，患者的基因組已經(jīng)鑒定為攜帶GABR-A2基 因中單核苷酸多態(tài)性位置rs3756007處的胞嘧啶；并
[0122] (b)用NMDA拮抗劑治療患者。
[0123] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了一種生成可銷售藥物的方法，該方法包括：
[0124] (a)制備含有NMDA拮抗劑的包裝；并
[0125] 在所述包裝中包含推薦使用所述NMDA拮抗劑治療患者中的抑郁的標(biāo)簽或印刷插 頁，所述患者的基因組包含GABR-A2基因中單核苷酸多態(tài)性位置rs3756007處的胞嘧啶，和 /或GABR-A2基因中單核苷酸多態(tài)性位置rsll503016處的胸腺嘧陡，和/或GABR-A2基因 中單核苷酸多態(tài)性位置rsl7537359處的胞嘧啶，和/或GABR-A2基因中單核苷酸多態(tài)性位 置rsl372472處的胸腺嘧啶。
[0126] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了 NMDA拮抗劑在制造藥物中的用途，所述藥物用于 治療依照上文描述的方法鑒定為可能響應(yīng)用NMDA拮抗劑治療的患者。
[0127] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了 NMDA拮抗劑在制造用于治療抑郁或焦慮患者的 藥物中的用途，所述患者的細(xì)胞DNA依照本文描述的任何方法已經(jīng)測定為擁有與依照SEQ ID NO: 1的位置401對應(yīng)的GABR-A2基因中位置處的胞嘧啶。
[0128] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了在治療患有抑郁或焦慮的患者中使用的NMDA 拮抗劑，其中患者的細(xì)胞DNA已經(jīng)測定為擁有在與位置401(依照SEQ ID NO: 1)對應(yīng)的 GABR-A2基因中的胞嘧啶。
[0129] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了在治療患有抑郁或焦慮的患者中使用的NMDA 拮抗劑，所述患者的細(xì)胞DNA已經(jīng)鑒定為擁有GABR-A2基因中rs3756007, rsll503016， rsl7537359或rsl372472 SNP之任一或另一處的次要等位基因。
[0130] 在本發(fā)明的又一個方面，提供了在一名或多名患者中治療抑郁或焦慮中使用的 NMDA拮抗劑，所述患者的細(xì)胞DNA先前已經(jīng)鑒定為擁有GABR-A2基因中單核苷酸多態(tài)性位 置rs3756007處的胞嘧啶，和/或單核苷酸多態(tài)性位置rsll503016處的胸腺嘧啶，和/或 單核苷酸多態(tài)性位置rsl7537359處的胞嘧啶，和/或單核苷酸多態(tài)性位置rsl372472處的 胸腺嘧啶。
[0131] 如上文記錄的，本發(fā)明的各個方面適合于在患有重度抑郁病癥（MDD)的患者，患 有單一或復(fù)發(fā)性抑郁發(fā)作的患者，治療難治性抑郁患者（即，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對其它抑郁治療不 響應(yīng)的患者；TRD)，雙相抑郁患者，廣泛性焦慮病癥患者（GAD)，強迫性病癥患者（0⑶)，驚 恐性病癥患者，創(chuàng)傷后應(yīng)激病癥患者（PTSD)，和社交焦慮病癥患者的情況下使用。
[0132] 如上文記錄的，以下NMDA拮抗劑化合物：（S)-1_苯基-2-(吡啶-2-基）乙胺（披 露于W0 93/20052)和氯胺酮特別適合于在本發(fā)明的多個方面中使用。 實施例
[0133] 本發(fā)明通過以下非限制性實施例例示。
[0134] 實施例1 :從化合物A的II期研究中登記的個體（研究中的患者總數(shù)是152)收集 基因組DNA樣品。II期研究設(shè)計為測量化合物A在治療抑郁中的效力?；颊呋趯⑺麄兿?定為對抑郁治療中使用的藥物的不良響應(yīng)者的其先前治療史選擇以在前述Π 期研究中登 記。使用TaqMan?測定法測試編碼腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF)和GABAa受體的alpha-2 亞基（GABR-A2)的基因中的常見遺傳變異（單核苷酸多態(tài)性，SNP)以測量其對用化合物 A(N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA)拮抗劑）治療抑郁的響應(yīng)的影響。Montgomery-Asberg 抑郁分級量表（MADRS;Montgomery SA，Asberg M(April 1979). "A new depression scale designed to be sensitive to change，'· British Journal of Psychiatry 134 (4) : 382-89)用作治療響應(yīng)的測量。選擇32種SNP以在GABR-A2中基因分型，并且選擇 6種SNP以在BDNF中基因分型。
[0135] BDNF的遺傳分析的結(jié)果沒有證明對治療響應(yīng)變化的貢獻(xiàn)。然而，來自GABR-A2基 因的結(jié)果確實指示對從許多SNP的基線起的MADRS變化的影響其中rs3756007 SNP顯示 最強的聯(lián)系。表1列出了經(jīng)過測試平均起來次要等位基因積極影響用化合物A治療后的 MADRS變化的那些遺傳變異。還顯示了用藥物治療的患者（治療組）的P值（therapeutic pvalue)〇
[0136]
【權(quán)利要求】
1. 一種用于為用NMDA拮抗劑藥物治療選擇患者的方法，其包括在來自所述患者的 含有核酸的樣品中測定GABR-A2基因中單核苷酸多態(tài)性（SNP)位置rs3756007和/或， rsll503016,和/或rsl7537359,和/或rsl372472處的核苷酸，其中若存在有rs3756007 處的胞嘧啶，或rsll503016處的胸腺嘧啶，或rsll503016處的胸腺嘧啶，或rsl372472處 的胸腺嘧啶，則對所述患者選擇用NMDA拮抗劑藥物治療。
2. -種推薦治療的方法，該方法包括： (a) 選擇需要治療抑郁和/或焦慮的患者，所述患者的基因組已經(jīng)鑒定為在GABR-A2基 因中的rs3756007, rsll503016, rsl7537359或rsl372472之任一處攜帶次要等位基因；并 (b) 推薦用NMDA拮抗劑治療所述患者。
3. 如權(quán)利要求1或2中要求保護(hù)的方法，其中所述NMDA拮抗劑藥物選自下組： (S)-l-苯基_2_(批陡-2-基）乙胺和氯胺酮。
4. 如權(quán)利要求1或2中要求保護(hù)的方法，其中所述NMDA拮抗劑藥物是（S)-l-苯 基_2_(批陡-2-基）乙胺。
5. 如前述權(quán)利要求中任一項要求保護(hù)的方法，其中所述抑郁和/或焦慮選自：重度抑 郁病癥（major depressive disorder, MDD)、單一或復(fù)發(fā)性抑郁發(fā)作（single or recurrent depressive episode)、治療難治性抑郁（treatment-refractory depression，TRD)、雙相 抑郁（bipolar depression)、廣泛性焦慮病癥（general anxiety disorder，GAD)、強迫 性病癥（obsessive compulsive disorder，OCD)、驚恐性病癥（panic disorder)、創(chuàng)傷后 應(yīng)激病癥（post traumatic stress disorder，PTSD)、和社交焦慮病癥（social anxiety disorder)〇
6. 如權(quán)利要求1中要求保護(hù)的方法，其中所述含有核酸的樣品是實體組織樣品或生物 流體樣品。
7. 如前述權(quán)利要求中任一項要求保護(hù)的方法，其中通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)、與等 位基因特異性探針或引物雜交、等位基因特異性擴增（諸如擴增受阻突變系統(tǒng)-ARMS)、 酶促突變檢測、質(zhì)譜術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)、WAVE分析、變性 梯度凝膠電泳、高分辨率熔解或溫度梯度凝膠電泳或核酸測序測定GABR-A2基因中位置 rs3756007, rsll503016, rsl7537359 或 rsl372472 處的核苷酸。
8. 如權(quán)利要求7中要求保護(hù)的方法，其中通過測序或等位基因特異性擴增測定 GABR-A2 基因中位置 rs3756007, rsll503016, rsl7537359 或 rsl372472 處的核苷酸。
9. 能夠測定 GABR-A2 基因中 rs3756007, rsll503016, rsl7537359 或 rsl372472 SNP 之任一處的核苷酸的寡核苷酸引物用于預(yù)測患有抑郁的患者是否可能有利響應(yīng)用NMDA拮 抗劑藥物治療的用途。
10. -種治療方法，其包括： (a) 選擇需要治療抑郁的患者，所述患者的基因組已經(jīng)鑒定為在GABR-A2基因中的單 核苷酸多態(tài)性位置rs3756007處攜帶胞嘧啶；并 (b) 用NMDA拮抗劑治療所述患者。
11. 一種治療患有抑郁或焦慮的患者的方法，其包括對患有抑郁或焦慮的患者施用有 效量的NMDA拮抗劑藥物，所述患者的細(xì)胞DNA已經(jīng)測定為在GABR-A2基因中的rs3756007， rsll503016, rsl7537359或rsl372472之任一處包含次要等位基因。
12. -種生成可銷售藥物的方法，該方法包括： (a) 制備含有NMDA拮抗劑的包裝；并 (b) 在所述包裝中包含推薦使用所述NMDA拮抗劑治療患者中的抑郁的標(biāo)簽或印刷插 頁，所述患者的基因組包含GABR-A2基因中單核苷酸多態(tài)性位置rs3756007處的胞嘧啶。
13. 如權(quán)利要求10-12中任一項要求保護(hù)的方法，其中所述NMDA拮抗劑選自： (S)-l-苯基_2_(批陡-2-基）乙胺和氯胺酮。
14. 一種用于治療一名或多名患者中的抑郁或焦慮的NMDA拮抗劑，所述患者的細(xì)胞 DNA已經(jīng)測定為在GABR-A2基因中在稱為rs3756007的單核苷酸多態(tài)性處擁有胞嘧啶。
15. 如權(quán)利要求14中要求保護(hù)的NMDA拮抗劑，其選自：(S)-1-苯基-2-(吡啶-2-基） 乙胺和氯胺酮。
【文檔編號】C12Q1/68GK104114714SQ201280069535
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月14日
【發(fā)明者】D·J·麥卡錫, M·A·史密斯 申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司