用于預(yù)防和治療呼吸道合胞病毒感染的聯(lián)合抗原和dna疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了使用包含RSV抗原和編碼所述RSV抗原的DNA的組合來(lái)治療和預(yù)防呼吸道合胞病毒(RSV)感染的癥狀。
【專利說(shuō)明】用于預(yù)防和治療呼吸道合胞病毒感染的聯(lián)合抗原和DNA疫 苗
[0001] 序列表
[0002] 本申請(qǐng)包括以ASCII格式提交的并據(jù)此整體以引用方式并入的序列表。2012年8 月2日創(chuàng)建的ASCII拷貝的名稱為"030276-9016_SequenceListing_ST25.txt"，其大小為 116, 697個(gè)字節(jié)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及使用包含RSV抗原肽和編碼所述RSV抗原肽的DNA的組合來(lái)治療和預(yù) 防呼吸道合胞病毒（RSV)感染。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 人RSV屬于副黏液病毒科的肺病毒屬，是兒童和老年人中下呼吸道感染的主要原 因，但在年齡小于三歲的嬰幼兒中最常見(jiàn)。在如今的美國(guó)，保守的估計(jì)表明老年人中每年有 大約330萬(wàn)呼吸道疾病病例。與甲型流感病毒疾病相似，RSV在每年冬天流行，在整個(gè)一生 中反復(fù)再次感染RSV非常常見(jiàn)。雖然開(kāi)發(fā)抗RSV的疫苗是一項(xiàng)最優(yōu)先考慮的工作，但是由于 相關(guān)的疫苗誘發(fā)疾病（VID)尚無(wú)安全有效的抗RSV疫苗可用。VID在受試者中因來(lái)自RSV 抗原的增強(qiáng)的炎性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)而由強(qiáng)烈的病原性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致。
[0006] 更安全有效的RSV疫苗應(yīng)當(dāng)無(wú)害并誘導(dǎo)針對(duì)病毒的正確的免疫反應(yīng)。然而，第一 種候選疫苗即在20世紀(jì)60年代開(kāi)發(fā)的福爾馬林滅活RSV(FI-RSV)疫苗在后續(xù)自然暴露于 病毒后誘發(fā)嚴(yán)重的疾病，而不是用作抗感染的疫苗。其導(dǎo)致80%接種疫苗后的嬰幼兒入院 和兩例死亡。得自這些兒童的外周血淋巴細(xì)胞表明與原初或RSV感染對(duì)照相比的T淋巴細(xì) 胞高反應(yīng)性。
[0007] 在用FI-RSV免疫然后用活RSV攻毒的動(dòng)物模型中揭露了類似的VID發(fā)病。小鼠 中增強(qiáng)的VID組織病理學(xué)變化可通過(guò)RSV攻毒前⑶4+T細(xì)胞或IL-4的去除而消除，從而進(jìn) 一步表明FI-RSV誘導(dǎo)的病理學(xué)變化在該動(dòng)物模型中為T(mén)細(xì)胞介導(dǎo)的。
[0008]RSV的F和G蛋白用作重要的中和性和主要的保護(hù)性抗原，但是也會(huì)導(dǎo)致VID。具 體地講，據(jù)發(fā)現(xiàn)，用呼吸道合胞病毒（RSV)G糖蛋白（G)免疫的小鼠在RSV攻毒后表現(xiàn)出VID 并發(fā)生了非典型肺嗜酸性粒細(xì)胞增多。CD4+T細(xì)胞的去除導(dǎo)致疾病的嚴(yán)重性較輕，從而表明 G抗原內(nèi)的序列可能包含過(guò)度刺激T細(xì)胞反應(yīng)的表位。
[0009]雖然在RSV攻毒時(shí)會(huì)發(fā)生VID的情況下需要RSV疫苗，但是尚未得到可避免進(jìn)一 步導(dǎo)致肺病理學(xué)變化的過(guò)激反應(yīng)（諸如VID)的RSV疫苗。理想的抗RSV感染的疫苗應(yīng)當(dāng)滿 足兩個(gè)要求：1)誘導(dǎo)RSV特異性中和抗體；以及2)不刺激會(huì)導(dǎo)致VID的過(guò)度T細(xì)胞反應(yīng)。 已經(jīng)測(cè)試了許多方法，諸如使用DNA疫苗、腺病毒載體、Thl型佐劑和經(jīng)口遞送，但是迄今為 止無(wú)一取得成功。因此，本領(lǐng)域需要開(kāi)發(fā)將誘導(dǎo)抗RSV感染的中和抗體但抑制炎性CD4+T細(xì) 胞的疫苗。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明涉及抗呼吸道合胞病毒（RSV)感染的疫苗，該疫苗包含RSV抗原肽和編碼 該RSV抗原肽的核酸，其中該疫苗刺激iTreg細(xì)胞（CD4+、CD25'F〇XP3+、IL-10+)。該疫苗的RSV抗原肽可以為F糖蛋白、G糖蛋白、SEQIDNO:4(優(yōu)化的氨基酸RSVG氨基酸序列）、 SEQIDNO:25(優(yōu)化的氨基酸RSVF氨基酸序列）及其功能片段。該疫苗可以具有選自 5 : 1和1 : 5以及I: 1和2 : 1的核酸和抗原肽質(zhì)量比。本發(fā)明的疫苗可以是核酸。 核酸可以是RNA、DNA或cDNA。該核酸編碼選自以下的RSV抗原肽：F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ IDNO:4 (優(yōu)化的氨基酸RSVG氨基酸序列）、SEQIDNO:25 (優(yōu)化的氨基酸RSVF氨基酸 序列）及其功能片段。DNA可存在于環(huán)形質(zhì)粒的線性表達(dá)盒中。質(zhì)?？蛇x自pVAX、pcDNA3. 0 和proVAX。質(zhì)粒還可以包含選自以下的啟動(dòng)子：CMV、SV40早期啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、 金屬硫蛋白啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒啟動(dòng)子和多角體啟動(dòng)子。
[0012] 本發(fā)明還涉及包括疫苗施用裝置和如上所述的疫苗的疫苗接種試劑盒。試劑盒的 疫苗施用裝置可以為疫苗槍、針或電穿孔裝置。試劑盒可以包括微創(chuàng)電穿孔裝置。
[0013] 本發(fā)明還涉及用于預(yù)防或治療受試者中的呼吸道合胞病毒感染的方法，該方法包 括向有需要的受試者施用如上所述的疫苗。該方法還保護(hù)受試者免于發(fā)生呼吸道合胞病毒 攻毒后的氣道高反應(yīng)性（AHR)。
[0014] 本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)抗呼吸道合胞病毒感染的中和抗體并抑制炎性T細(xì)胞的方法， 該方法包括向有需要的受試者施用所述疫苗，其中誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞而抑制自身反應(yīng)性CD4+ 和CD8+T細(xì)胞。疫苗可通過(guò)電穿孔而施用，例如使用微創(chuàng)電穿孔裝置，其中電穿孔路徑選自 皮內(nèi)和肌內(nèi)。
[0015] 本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防進(jìn)行呼吸道合胞病毒（RSV)免疫的受試者中的疫苗誘 發(fā)疾病的方法，該方法包括向有需要的受試者施用如上所述的疫苗，其中受試者在遭遇自 然RSV感染前已接受了福爾馬林滅活RSV(FI-RSV)或RSV抗原的免疫。疫苗可通過(guò)電穿孔 而施用，例如使用微創(chuàng)電穿孔裝置，其中電穿孔路徑可以為皮內(nèi)和肌內(nèi)。
[0016] 附圖簡(jiǎn)述
[0017] 圖1顯示了NIH/3T3細(xì)胞中的質(zhì)粒pr〇VAX/G的真核表達(dá)。在用pr〇VAX/G轉(zhuǎn)然后 48h從NIH/3T3細(xì)胞提取了總RNA。用于RT-PCR的模板如下：泳道1，得自具有RT的轉(zhuǎn)染 NIH/3T3細(xì)胞的cDNA;泳道2,proVAX載體對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞；泳道3,作為陰性對(duì)照的得自非轉(zhuǎn) 染NIH/3T3細(xì)胞的RNA。
[0018] 圖2A-2B顯示了在大腸桿菌（E.coli)BL21(DE3)中重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE 的考馬斯藍(lán)染色。圖2A-2B顯示了 ：泳道M，蛋白分子標(biāo)記；泳道1，未誘導(dǎo)的大腸桿 菌BL21(DE3);泳道2,由IPTG以0. 5mM誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3);泳道3,未誘導(dǎo)的 BL21(DE3)pET28a(+);泳道 4,由IPTG以 0· 5mM誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)pET28a;泳道 5， 未誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)pET28a(+)/G;泳道6和10，由IPTG以0.5mM誘導(dǎo)的大腸桿 菌BL21(DE3)pET28a(+)/G;泳道7，純化的多聚組氨酸標(biāo)簽重組蛋白；泳道8，在0.5mMIPTG 誘導(dǎo)下由pET28a(+)/G轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)裂解物的上清液；以及泳道9,在0. 5mM IPTG誘導(dǎo)下由pET28a(+) /G轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)裂解物的沉淀物。
[0019] 圖3顯示了多聚組氨酸標(biāo)簽重組G蛋白的Western印跡分析。大腸桿菌BL21 (DE3) 裂解物得自在LB肉湯中生長(zhǎng)并用0. 5mM IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞。將蛋白樣品在12% SDS-PAGE 上分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。使膜與山羊抗RSV抗體反應(yīng)，并通過(guò)與偶聯(lián)的抗山羊二 抗反應(yīng)而可視化。泳道1，在0. 5mM IPTG誘導(dǎo)下由pET28a(+)/G轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3) 裂解物的上清液；泳道2,由pET28a(+)/G轉(zhuǎn)染的大腸桿菌BL21 (DE3)裂解物的不溶性部 分；泳道3,鎳柱純化的重組RSVG蛋白。
[0020] 圖4A-4B顯示了體液反應(yīng)的分析。在最后一次免疫后第7天從Balb/c小鼠采集 血清樣品。使用紫外線滅活的RSV通過(guò)ELISA確定RSVG特異性抗體（圖4A)和RSVF特 異性抗體（圖4B)。結(jié)果以一式三份的三個(gè)組的數(shù)據(jù)平均值表示，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。所 示的數(shù)據(jù)總結(jié)了三個(gè)實(shí)驗(yàn)之一，它們都展示出相似的結(jié)構(gòu)。單星號(hào)表示P< 〇. 05,雙星號(hào)表 示p< 0· 01。
[0021] 圖5顯示了通過(guò)DNA和蛋白疫苗聯(lián)合免疫誘導(dǎo)了T細(xì)胞反應(yīng)的損害。從已用PSB 或proVAX/G或His-G免疫或用proVAX+His-G(抗原錯(cuò)配的）或proVAX/G+OVA(抗原錯(cuò)配 的）聯(lián)合免疫或用proVAX/G+His-G(抗原匹配的）聯(lián)合免疫的小鼠中分離了T細(xì)胞。將T 細(xì)胞用作為特異性抗原的紫外線照射RSV抗原（從左邊起的第三個(gè)數(shù)據(jù)列）、作為非特異性 抗原的BSA(從左邊起的第二個(gè)數(shù)據(jù)列）或作為陽(yáng)性對(duì)照刺激劑的PMA+Ion(從左邊起的第 一個(gè)數(shù)據(jù)列）在體外進(jìn)行再刺激。如實(shí)施例1中所述測(cè)定T細(xì)胞增殖。所示的數(shù)據(jù)是得自 三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。單星號(hào)表示P< 〇. 05,雙星號(hào)表示p< 0. 001。
[0022] 圖6A-6B顯示了免疫小鼠的肺RSV滴度。
[0023] 圖7A-7D顯示了在RSV攻毒后與總細(xì)胞相比的所存在的嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞 和單核細(xì)胞的量。在最后一次免疫后第14天,將小鼠經(jīng)鼻內(nèi)用IO6TCID5tl活RSV進(jìn)行攻毒。 在RSV攻毒后5天將小鼠處死，并分析BAL。顯示了總嗜酸性粒細(xì)胞（圖7A)、單核細(xì)胞（圖 7B)、淋巴細(xì)胞（圖7C)和總細(xì)胞（圖7D)的平均值土SEM(η= 6/組）。單星號(hào)表示與PBS 組相比P< 0.05。
[0024] 圖8A-8D顯示了在RSV攻毒后與總細(xì)胞相比的所存在的嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞 和單核細(xì)胞的量。在最后一次免疫后第14天,將小鼠經(jīng)鼻內(nèi)用IO6TCID5tl活RSV進(jìn)行攻毒。 在RSV攻毒后5天將小鼠處死，并分析BAL。顯示了總嗜酸性粒細(xì)胞（圖8Α)、單核細(xì)胞（圖 8Β)、淋巴細(xì)胞（圖8C)和總細(xì)胞（圖8D)的平均值土SEM(η= 6/組）。單星號(hào)表示與PBS 組相比P< 0.05。
[0025] 圖9A-9D顯示了響應(yīng)于乙酰氯化膽堿的頸靜脈內(nèi)施用的全身體積描記。RSV在攻 毒后5天，通過(guò)響應(yīng)于各種劑量（X軸）下乙酰氯化膽堿的頸靜脈內(nèi)施用的全身體積描記測(cè) 量了氣道阻塞，并在y軸上表示為動(dòng)態(tài)阻力（Rrs)(圖9Α和9C)和動(dòng)態(tài)順應(yīng)性（Cldyn)(圖 9B和9D)。原初小鼠未進(jìn)行預(yù)處理和攻毒。單星號(hào)表示與其它組相比p< 0. 05。
[0026] 圖10A-10H顯示了蘇木精和伊紅染色后肺組織的組織學(xué)檢查。RSV攻毒后5天， 對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，摘除肺組織并在福爾馬林中固定。切取石蠟包埋組織的萍切片，用蘇 木精和伊紅染色。對(duì)于得自原初/未攻毒的小鼠（圖10A)、PBS小鼠（圖10B)、FI-RSV小 鼠（圖 10C)、proVAX/G小鼠（圖 10D)、His-G小鼠（圖 10E)、proVA+His-G小鼠（圖 10F)、 proVAX/G+0VA小鼠（圖10G)和proVAX/G+His-G小鼠（圖10H)的組織，顯示了各放大倍數(shù) 下（放大倍數(shù)100倍或400倍）的（每組6只的）代表性切片。
[0027] 圖11A-11H顯示了蘇木精和伊紅染色后肺組織的組織學(xué)檢查。RSV攻毒后5天， 對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，摘除肺組織并在福爾馬林中固定。切取石蠟包埋組織的薄切片，用蘇 木精和伊紅染色。對(duì)于得自原初/未攻毒的小鼠（圖11A)、PBS小鼠（圖11B)、FI-RSV小 鼠（圖 11C)、proVAX/G小鼠（圖 11D)、His-G小鼠（圖 11E)、proVA+His-G小鼠（圖 11F)、 proVAX/G+OVA小鼠（圖11G)和proVAX/G+His-G小鼠（圖11H)的組織，顯示了各放大倍數(shù) 下（放大倍數(shù)100倍或400倍）的（每組6只的）代表性切片。
[0028] 圖12A-12E顯示了蘇木精和伊紅染色后肺組織的組織學(xué)檢查。RSV攻毒后5天，對(duì) 小鼠實(shí)施安樂(lè)死，摘除肺組織并在福爾馬林中固定。切取石蠟包埋組織的薄切片，用蘇木精 和伊紅染色。對(duì)于得自proVAX/F小鼠（圖12A)、His-F小鼠（圖12B)、proVA+His-F小鼠 (圖 12C)、proVAX/F+0VA小鼠（圖 12D)和proVAX/F+His-F小鼠（圖 12E)的組織，顯示了 各放大倍數(shù)下（放大倍數(shù)100倍或400倍）的（每組6只的）代表性切片。
[0029] 圖13顯示了圖10中所述的肺組織的組織病理學(xué)評(píng)分。如實(shí)施例1中所述，由病 理學(xué)家以設(shè)盲方式在蘇木精和伊紅染色組織中評(píng)估織病理學(xué)評(píng)分（HPS)。單星號(hào)表示與其 它組相比P< 0.05。
[0030] 圖14A-14B顯示了在用活RSV攻毒后免疫小鼠的體重?fù)p失。在RSV攻毒后，每天 對(duì)小鼠稱重，并將體重歸一化到第0天的基礎(chǔ)體重。單星號(hào)表示與其它組相比P< 0. 05。
[0031] 圖15A-1?顯示了在RSV攻毒后第5天通過(guò)qPCR檢查的小鼠肺組織中的細(xì)胞因 子產(chǎn)生情況。測(cè)量了IL_4(圖15A)、IL-5(圖15B)、IL-13(圖15C)和IFN-T(圖15D)。單 星號(hào)表示P<0.05,雙星號(hào)表示p<0.01，而三星號(hào)表示p<0.001。
[0032] 圖16A-16N顯示了T細(xì)胞表型的熒光活化細(xì)胞分選（FACS)分析。聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的 iTreg細(xì)胞可在體內(nèi)介導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞抑制并在體外抑制同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。淋 巴細(xì)胞得自最后一次免疫后7天的小鼠，并用抗⑶4-FITC和抗⑶25TECy5mAb染色，然后 用抗IL-10-PE和抗Foxp3-APCmAb進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。圖16A顯示了SSC-H與FSC-H的關(guān)系 圖。圖16B顯示了CD4與CD25的關(guān)系圖。圖16C-16N顯示了IL-10(x軸）和Foxp3(y軸） 共表達(dá)。將CD4+CD251R1)(圖 16I-16N)和CD4+CD25+(圖 16C-16H) (R2)T細(xì)胞針對(duì)IL-10 和Foxp3的共表達(dá)進(jìn)行分類。所示的結(jié)果是三個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。百分率表示雙陽(yáng)性細(xì) 胞的百分比。
[0033]圖17A-17B顯示 了總脾細(xì)胞中CD4+CD25Toxp3+IL-10+(圖17B)或 ⑶4+CD25+Foxp3+IL-10+(圖17A) T細(xì)胞的百分率匯總。三星號(hào)表示與其它組相比時(shí)p < 0·001。
[0034] 圖18顯示了通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移的⑶細(xì)胞介導(dǎo)的抑制。通過(guò)已用proVAX/ G+His-G聯(lián)合免疫的Balb/c小鼠或通過(guò)原初小鼠制備了細(xì)胞的⑶4+⑶25-或⑶4++⑶25+亞 組，并過(guò)繼轉(zhuǎn)移到原初Balb/c小鼠中。然后在轉(zhuǎn)移后24小時(shí)將受體小鼠用His-G免疫,并 用于在免疫后7天進(jìn)行脾細(xì)胞分離。將受體的脾細(xì)胞用作為特異性抗原的紫外線照射RSV 抗原在體外進(jìn)行再刺激，并通過(guò)MTT法測(cè)量了增殖反應(yīng)。
[0035] 圖19顯示了通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移的⑶4+0025_供體1'細(xì)胞介導(dǎo)的抑制。通過(guò)已用proVAX/ G+His-G聯(lián)合免疫的Balb/c小鼠或通過(guò)原初小鼠制備了細(xì)胞的⑶4+⑶25-或⑶4++⑶25+亞 組，并過(guò)繼轉(zhuǎn)移到原初Balb/c小鼠中。然后在轉(zhuǎn)移后24小時(shí)將受體小鼠用His-G免疫， 并用于在免疫后7天進(jìn)行脾細(xì)胞分離。將受體動(dòng)物的脾細(xì)胞（作為應(yīng)答細(xì)胞）與得自原 初C57BL/6小鼠的用絲裂霉素C處理過(guò)的脾細(xì)胞（作為同種異體的刺激細(xì)胞）混合以進(jìn)行 MLR。單星號(hào)表示p< 0. 05,雙星號(hào)表示p< 0. 01。
[0036] 圖20A-20F顯示了通過(guò)從聯(lián)合免疫小鼠過(guò)繼轉(zhuǎn)移CD4+CD25_iTreg細(xì)胞而改善肺 炎性反應(yīng)。在最后一次免疫后第7天從通過(guò)proVAX/G+His-G(抗原錯(cuò)配的）或proVAX/ G+OVA(抗原錯(cuò)配的）聯(lián)合免疫的小鼠純化了⑶4+CD25+和⑶4+⑶25_T細(xì)胞，將它們經(jīng)靜脈內(nèi) 過(guò)繼轉(zhuǎn)移到之前用His-G免疫的小鼠中,然后進(jìn)行RSV攻毒。RSV攻毒后5天,對(duì)小鼠實(shí)施 安樂(lè)死，摘除肺組織并在福爾馬林中固定。切取石蠟包埋組織的薄切片，用蘇木精和伊紅染 色。對(duì)于得自原初小鼠（圖20Α)、His-G小鼠（圖20Β)、"得自proVAX/G+His-G的CD4+CD25+" 小鼠（圖 20C)、"得自proVAX/G+His-G的CD4+CD25"' 小鼠（圖 20D)、"得自proVAX/G+OVA 的CD4+CD25+" 小鼠（圖 20E)和"得自proVAX/G+OVA的CD4+CD251'小鼠（圖 20F)的組織， 顯示了各放大倍數(shù)下（放大倍數(shù)100倍或400倍）的（每組6只的）代表性切片。
[0037] 圖21顯示了圖20中所述的肺組織的組織病理學(xué)評(píng)分。如實(shí)施例1中所述，由病 理學(xué)家以設(shè)盲方式在蘇木精和伊紅染色組織中評(píng)估織病理學(xué)評(píng)分（HPS)。單個(gè)星號(hào)表示p < 0· 05。
[0038] 詳細(xì)描述
[0039] 本發(fā)明涉及用于治療和保護(hù)受試者免受RSV感染同時(shí)抑制因之前的RSV抗原免疫 而導(dǎo)致的疫苗誘發(fā)疾病的方法。
[0040] 疫苗誘發(fā)疾?。╒ID)的原因是原初（naive)個(gè)體在遭遇自然RSV感染前用RSV抗 原（諸如F/G蛋白）免疫時(shí)使炎性反應(yīng)加重的傾向，這些炎性反應(yīng)包括大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、 肺嗜酸性粒細(xì)胞增多和2型細(xì)胞因子產(chǎn)生。然而，抗體在保護(hù)中具有重要作用。中和抗體 的被動(dòng)轉(zhuǎn)移可保護(hù)免疫缺陷個(gè)體或兒童免受RSV感染，并且小鼠模型已表明用抗RSV中和 單克隆抗體進(jìn)行治療明顯減少了RSV復(fù)制并與疾病嚴(yán)重性的炎性和臨床標(biāo)志的顯著降低 相關(guān)。由于被動(dòng)免疫療法在兒童中的高成本，致力于誘導(dǎo)高水平的抗RSV中和抗體的疫苗 引起了人們的巨大興趣。
[0041] 本發(fā)明的疫苗包含編碼RSV蛋白的核酸及其同源重組RSV蛋白以避免RSV感染并 且還改善RSV誘導(dǎo)的肺部炎性疾病。該疫苗通過(guò)與福爾馬林滅活RSV(FI-RSV)感染一樣 高地誘導(dǎo)抗RSV感染中和抗體而提供肺中病毒復(fù)制的明顯降低，但通過(guò)誘導(dǎo)iTreg(⑶4+、 ⑶25-、F〇XP3+、IL10+)細(xì)胞而抑制炎性T細(xì)胞。通過(guò)用DNA和蛋白一起進(jìn)行聯(lián)合免疫誘導(dǎo)了 抗原特異性iTreg細(xì)胞。iTreg刺激細(xì)胞生成高水平的IL-10,其表明刺激B細(xì)胞產(chǎn)生中和 抗體。該策略誘導(dǎo)高水平的中和抗體以及抗原特異性iTreg細(xì)胞，這些細(xì)胞抑制炎性T細(xì) 胞并減輕病變。因此，該策略可有效地避免RSV感染，VID即使有也甚微。
[0042] 使用蛋白和編碼同源抗原的核酸進(jìn)行聯(lián)合免疫而在體內(nèi)誘導(dǎo)iTreg具有若干優(yōu) 點(diǎn)：1)其相對(duì)簡(jiǎn)單，因?yàn)橹恍枰┯孟薅ǖ牡鞍卓乖捌浔磉_(dá)質(zhì)粒；2)其誘導(dǎo)強(qiáng)效的iTreg 而以抗原特異性方式抑制T細(xì)胞；3)其還誘導(dǎo)高水平的抗體。該方法可掃除RSV疫苗開(kāi)發(fā) 的主要障礙，因?yàn)榫哂须p重功能（如本文所公開(kāi)，誘導(dǎo)中和抗體和iTreg細(xì)胞）的疫苗可能 是有效的，而無(wú)VID副作用。
[0043] 1.定義
[0044] 本文所用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述特定的實(shí)施方案，并非旨在進(jìn)行限制。如在說(shuō)明書(shū) 和所附權(quán)利要求書(shū)中所用，單數(shù)形式"一"、"一個(gè)/種"和"該/所述"包括多個(gè)指代物，除 非上下文另有明確指出。
[0045] 關(guān)于本文中數(shù)字范圍的引述，明確地包括相同精度的介于其間的每個(gè)居間數(shù)字。 例如，對(duì)于6-9的范圍，除了 6和9以外還包括數(shù)字7和8,而對(duì)于范圍6. 0-7. 0,明確地包 括數(shù)字 6· 0、6· 1、6· 2、6· 3、6· 4、6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9 和 7. 0。
[0046] 如本文所用的"氣道高反應(yīng)性"（AHR)是指氣道異常使得它們太易狹窄和/或?qū)?能夠引起氣道受限的刺激反應(yīng)性太高。AHR可以是因氣道炎癥或氣道重塑（諸如，通過(guò)膠 原沉積）引起的呼吸系統(tǒng)的功能改變。氣流受限是指氣道變窄，這可能是不可逆的或可逆 的。膠原沉積、支氣管痙攣、氣道平滑肌肥大、氣道平滑肌收縮、粘液分泌、細(xì)胞沉積、上皮破 壞、上皮滲透性的改變、平滑肌功能或敏感性的改變、肺實(shí)質(zhì)異常以及氣道內(nèi)和周?chē)慕?rùn) 疾病可引起氣流受限或氣道高反應(yīng)性。許多這些致病因素可與炎癥相關(guān)。
[0047] 如本文所用的"共有"、"共有序列"或"優(yōu)化序列"可意指基于特定抗原多種亞型 的比對(duì)分析而構(gòu)建的合成核酸序列或相應(yīng)的多肽序列。該序列可用于誘導(dǎo)針對(duì)特定抗原多 種亞型或血清型的廣泛免疫。可將合成抗原（諸如融合蛋白）操縱成共有序列（或共有抗 原）。
[0048] 如本文關(guān)于核酸序列所用的"片段"或"功能片段"意指核酸序列或其部分，所述核 酸序列或其部分編碼能夠引起哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的多肽，所述免疫反應(yīng)與全長(zhǎng)野生型RSV抗原交叉反應(yīng)。片段可以是選自編碼本文所示的蛋白片段的各種核苷酸序列中的至少一種 的DNA片段。片段可以是編碼RSV抗原的一部分的核酸序列，其中所述部分編碼可在哺乳 動(dòng)物中引起免疫反應(yīng)的表位，所述免疫反應(yīng)與全長(zhǎng)野生型RSV抗原交叉反應(yīng)。
[0049] 如本文關(guān)于多肽序列所用的"片段"或"功能片段"意指能夠引起哺乳動(dòng)物免疫 反應(yīng)的多肽，所述免疫反應(yīng)與全長(zhǎng)野生型RSV抗原交叉反應(yīng)。共有蛋白的片段可包含共有 蛋白的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%、至少90%或至少95%。片段可以是特定RSV蛋白（諸如G糖蛋白或F糖蛋白）的 全長(zhǎng)多肽抗原的一部分的肽序列，并編碼可在哺乳動(dòng)物中引起免疫反應(yīng)的表位，該免疫反 應(yīng)與全長(zhǎng)野生型RSV多肽抗原序列交叉反應(yīng)。RSV蛋白的片段可包含全長(zhǎng)RSV蛋白的至少 10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少 90%或至少95%，并能夠產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
[0050] 如本文所用的"nTreg細(xì)胞"是T細(xì)胞（⑶4+、⑶25+、Foxp3+)，其主要機(jī)理是通過(guò)抑 制常規(guī)CD4和CD8T細(xì)胞的增殖反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)外周耐受，并可抑制自然免疫和變應(yīng)性疾病。轉(zhuǎn) 錄因子Foxp3是必需的并足以實(shí)現(xiàn)nTreg細(xì)胞的免疫抑制活性。nTreg細(xì)胞在體內(nèi)響應(yīng)抗 原攻毒或自我平衡擴(kuò)增而容易地增殖，并表現(xiàn)出比常規(guī)CD4T細(xì)胞更高的自我平衡分裂速 率。nTreg細(xì)胞具有自身抗原的高親和力T細(xì)胞受體，從而允許這些細(xì)胞通過(guò)自身抗原而得 到有效活化從而抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞。
[0051] 如本文所用的"肽"或"多肽"可意指連接的氨基酸序列并且可以為天然的、合成 的或天然和合成的修飾或組合。
[0052] 如本文所用的"治療"可意指通過(guò)預(yù)防、抑制、壓制或完全消除疾病而保護(hù)動(dòng)物免 于疾病。預(yù)防疾病涉及在疾病發(fā)作之前向動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物。抑制疾病涉及在引起 疾病后，但是在其臨床表現(xiàn)之前向動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物。壓制疾病涉及在疾病的臨床 表現(xiàn)之后向動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物。
[0053] 如本文所用的"受試者"可意指想要或需要進(jìn)行RSV疫苗免疫的哺乳動(dòng)物。它們 可以為人、黑猩猩、狗、貓、馬、牛、小鼠或大鼠。
[0054] 如本文所用的"超抗原"可意指一類抗原，它們導(dǎo)致T細(xì)胞的非特異性活化，從而 使得多克隆T細(xì)胞活化和大規(guī)模細(xì)胞因子釋放。與普通抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)相比（其中 機(jī)體T細(xì)胞中0. 001-0.OOOl%被活化），超抗原能夠活化高達(dá)20%的機(jī)體T細(xì)胞。大量的活 化T細(xì)胞產(chǎn)生大規(guī)模的免疫反應(yīng)，其不是超抗原上任何特定表位特異性的，因此逐漸損害 適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的基本強(qiáng)度之一，即，其以高親和力靶向抗原的能力。更重要的是，大量活 化的T細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子，其中最重要的干擾素γ(IFN-Y)。該過(guò)量的IFN-Y繼而 活化巨噬細(xì)胞。活化的巨噬細(xì)胞繼而過(guò)量產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，諸如IL-UIL-6和TNF-α。 TNF-a作為機(jī)體炎性反應(yīng)的一部分是尤其重要的。在正常情況下，其以低水平局部釋放并 有助于免疫系統(tǒng)打敗病原體。然而，當(dāng)其在血液中并以高水平全身性釋放時(shí)（由于超抗原 結(jié)合所導(dǎo)致的大量T細(xì)胞活化），其可導(dǎo)致嚴(yán)重且致命的癥狀，包括休克和多器官衰竭。
[0055] 如本文所用的"基本上相同的"可意指第一氨基酸序列與第二氨基酸序列在1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100 個(gè)氛 基酸的區(qū)域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% 相同。
[0056] 如這里所用的"變體"可意指因氨基酸的插入、缺失或保守取代而使氨基酸序列不 同，但是保持至少一種生物活性的肽或多肽。"生物活性"的代表性實(shí)例包括被特異性抗體 結(jié)合或促進(jìn)免疫反應(yīng)的能力。變體還可以意指其氨基酸序列與參考蛋白的氨基酸序列基本 上相同的蛋白，其保持至少一種生物活性。氨基酸的保守取代，即用具有相似性質(zhì)（例如， 親水性、帶電荷區(qū)域的程度和分布）的不同氨基酸替代氨基酸，在本領(lǐng)域被認(rèn)為通常涉及 微小的變化。這些微小的變化可部分地通過(guò)考慮氨基酸的親疏水性指數(shù)來(lái)鑒定，如本領(lǐng)域 中所理解的。Kyte等人，J.Mol.Biol. 157 :105-132 (1982)。氨基酸的親疏水性指數(shù)基于其 疏水性和電荷的考慮。在本領(lǐng)域中已知的是，具有相似親疏水性指數(shù)的氨基酸可被取代并 且仍然保留蛋白功能。在一個(gè)方面，具有±2的親疏水性指數(shù)的氨基酸被取代。氨基酸的 親水性還可用于揭示將產(chǎn)生保留生物功能的蛋白的取代。在肽的背景下對(duì)氨基酸的親水性 的考慮允許計(jì)算該肽的最大局部平均親水性，這一有用的指標(biāo)已報(bào)道與抗原性和免疫原性 相關(guān)。具有相似親水性值的氨基酸的取代可產(chǎn)生保留生物活性例如免疫原性的肽，如本領(lǐng) 域中所理解?？衫糜H水性值在彼此±2內(nèi)的氨基酸進(jìn)行取代。氨基酸的疏水性指數(shù)和親 水性值受該氨基酸的特定側(cè)鏈影響。與該觀察一致，應(yīng)理解與生物功能相容的氨基酸取代 依賴于氨基酸的相似性，尤其是那些氨基酸的側(cè)鏈的相似性，如通過(guò)疏水性、親水性、電荷、 大小和其它性質(zhì)所揭示。
[0057] 2.疫苗
[0058] 本發(fā)明涉及包含呼吸道合胞病毒（RSV)抗原和編碼所述RSV抗原的核酸的疫苗。 該疫苗通過(guò)如本文所述的病毒RSV抗原和編碼所述RSV抗原的核酸使有需要的受試者聯(lián)合 免疫。該疫苗向有需要的受試者提供在后續(xù)RSV攻毒后的抗原特異性免疫反應(yīng)?？乖禺?性免疫反應(yīng)生成與通過(guò)福爾馬林滅活RSV(FI-RSV)疫苗所生成的水平相當(dāng)?shù)母咚降闹?和抗體。然而，該疫苗與基于FI-RSV的疫苗的不同之處在于：對(duì)iTreg細(xì)胞（⑶4+、⑶25_、 FoxP3+、IL10+)進(jìn)行誘導(dǎo)，這導(dǎo)致與通過(guò)FI-RSV疫苗免疫的受試者相比肺異常的明顯減輕。 iTreg刺激的細(xì)胞生成高水平的IL-10,其表明刺激B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體。iTreg刺激還導(dǎo) 致更少的在使受試者再次暴露于RSV感染時(shí)疫苗誘發(fā)疾病所特有的總體炎癥和T細(xì)胞向肺 中的浸潤(rùn)。該疫苗還可以通過(guò)保護(hù)受試者在RSV攻毒后免于發(fā)生氣道高反應(yīng)性（AHR)或氣 道阻塞而預(yù)防和治療受試者的呼吸道合胞病毒感染。該疫苗還可以改善RSV感染的肺組織 病理。該疫苗還可以減輕活RSV攻毒后疾病的嚴(yán)重性，包括對(duì)抗體重減輕。
[0059]FI-RSV因Th2 (⑶4+)型反應(yīng)的活化而誘發(fā)VID，這導(dǎo)致B細(xì)胞活化因子和其它相 關(guān)的細(xì)胞因子諸如IL-3、IL-4、IL-5、CD40配體、IL-10、IL-13、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激 因子（GM-CSF)和嗜酸粒細(xì)胞趨化因子的釋放。RSVG糖蛋白（G)疫苗在RSV攻毒后誘發(fā) VID，因?yàn)橥瑫r(shí)誘導(dǎo)了Thl和Th2型反應(yīng)。Thl釋放巨噬細(xì)胞活化效應(yīng)子和其它相關(guān)細(xì)胞因 子，諸如干擾素-￥(正^￥)、61?^、腫瘤壞死因子〇〇'嚦-〇)、11^-3、了嚦-0和11^-2。所 述疫苗以抗原依賴性方式同時(shí)抑制Thl和Th2反應(yīng)，而生成與Th2輔助細(xì)胞所生成的相似 的中和抗體滴度，從而誘導(dǎo)中和并降低RSV感染水平。
[0060] 該疫苗通過(guò)疫苗接種而消除T細(xì)胞（Thl、Th2、Thl7)反應(yīng)。疫苗聯(lián)合免疫活性誘 導(dǎo)iTreg(CD4+、CD25_、Foxp3+)細(xì)胞。iTreg細(xì)胞在調(diào)節(jié)對(duì)急性感染的適應(yīng)性和固有性免疫 反應(yīng)中以及在消除病毒清除后的炎癥中均發(fā)揮著作用。iTreg刺激的細(xì)胞可生成高水平的 IL-10,其刺激B細(xì)胞生成中和抗體。該疫苗不誘導(dǎo)nTreg細(xì)胞。RSV感染實(shí)際上可引起受 RSV感染的受試者中⑶4+⑶25+nTreg的去除，從而導(dǎo)致疾病嚴(yán)重性增加，包括體重?fù)p失加 重、固有細(xì)胞募集到支氣管肺泡灌洗（BAL)液和肺以及產(chǎn)IFN-Y的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的 水平增加。
[0061] 用所述疫苗進(jìn)行聯(lián)合免疫不僅保護(hù)了受試者免受RSV攻毒的影響，還抑制了會(huì)導(dǎo) 致VID的加重的肺部炎癥。對(duì)RSV感染的預(yù)防和VID的減少的原因可能是誘導(dǎo)了高水平的 抗原特異性中和抗體和iTreg細(xì)胞，而iTreg細(xì)胞可以抗原特異性方式抑制T細(xì)胞記憶增 殖。這種聯(lián)合免疫上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10的水平，而下調(diào)RSV誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子，諸如 IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ。
[0062] 該疫苗可具有質(zhì)量比為 10 : 1、9 : 1、8 : 1、7 : 1、6 : 1、5 : 1、4 : 1、3 : 1、 2 : 1、1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9 或I: 10 的 RSV編碼 核酸與RSV抗原。該疫苗可具有10 : 1至I : 10、9 : 1至I: 9、8 : 1至8 : 1、7 : 1 至I: 7、6 ： 1至I: 6、5 ： 1至I : 5、4 : 1至 I : 4、3 ： 1至 1 : 3 或 2 ： 1至 1 : 2 的RSV編碼核酸與RSV抗原質(zhì)量比范圍。
[0063]a.抗原
[0064] 該疫苗可包含RSV抗原。RSV抗原可由核酸編碼。核酸可以為編碼RSV抗原或其 片段的DNA、RNA或cDNA。RSV抗原可以為導(dǎo)致免疫反應(yīng)的肽或蛋白?？乖捎|發(fā)免疫系統(tǒng) 產(chǎn)生抗體。核酸可編碼為全長(zhǎng)RSV抗原的片段的RSV抗原，并具有存在于RSV抗原上能夠 觸發(fā)免疫應(yīng)發(fā)的表位。RSV抗原可以為全長(zhǎng)RSV抗原的片段，并具有存在于RSV抗原上能夠 觸發(fā)免疫應(yīng)發(fā)的表位。通過(guò)免疫反應(yīng)所生成的抗體然后可殺滅或中和被視為外來(lái)物和可能 有害的侵入者的抗原。RSV抗原可以是被主要組織相容性復(fù)合體（MHC)結(jié)合并呈遞到T細(xì) 胞受體的任何分子或分子片段。RSV抗原可以是免疫原，其為能夠促使適應(yīng)性免疫反應(yīng)的分 子。
[0065] 根據(jù)本發(fā)明，RSV抗原可衍生自任何類型，諸如亞型A或亞型B，或天然存在的或 重組的RSV的任何菌株，優(yōu)選地衍生自人類RSV菌株。RSV菌株的實(shí)例包括但不限于亞型A 菌株，諸如Long(ATCC?VR-26)、A2(ATCC?VR-1540)、RSB1734、RSB5857、RSB6190、 RSB6256、RSB642 和RSB6614;亞型B菌株，諸如Bl、18537、8/60 和 9320、S2、RSS-2、RSP112/ Sweden/02-03、RSP120/Sweden/02-03、RSP121/Sweden/02-03、RSP122/Sweden/02-03、RSP13/Sweden/02-03)、RSP140/Sweden/02-03、RSP16/Sweden/02-03、RSP171/ Sweden/02-03、RSP 183/Sweden/02-03、RSP191/Sweden/02-03、RSP199/Sweden/02-03、 RSP212/Sweden/02-03、RSP41/Sweden/02-03、RSP45/Sweden/02-03、RSP56/Sweden/02-03、 RSP58/Sweden/02-03、RSP67/Sweden/02-03和RSP94/Sweden/02-03。
[0066] 本公開(kāi)證實(shí)了通過(guò)用編碼RSVF抗原的DNA疫苗及其F蛋白進(jìn)行聯(lián)合免疫或通過(guò) 用編碼RSVG抗原的DNA疫苗及其G蛋白進(jìn)行聯(lián)合免疫得到的保護(hù)效力，其得到的對(duì)RSV 攻毒的保護(hù)與通過(guò)FI-RSV得到的相當(dāng)。其它RSV抗原可具有相似的效力。該保護(hù)可歸因 于與FI-RSV類似的對(duì)高水平中和抗體的誘導(dǎo)，然而，聯(lián)合免疫保護(hù)與iTreg的誘導(dǎo)相關(guān)并 導(dǎo)致更少的炎癥和T細(xì)胞向肺的浸潤(rùn)，S卩，明顯減少肺異常。
[0067] 該疫苗包含RSV抗原肽和編碼所述RSV抗原肽的DNA。在一些實(shí)施方案中，RSV抗 原肽選自人RSVF和G蛋白。
[0068] 本文還提供編碼所述抗原的DNA。該DNA可包含編碼所述抗原的編碼序列。該DNA 還可以包含另外的序列，其編碼通過(guò)肽鍵連接到抗原的接頭或標(biāo)簽序列。
[0069] (I)RSVF和G抗原
[0070]RSV抗原可以是人RSV融合蛋白（在本文也稱為"RSVF"、"RSVF蛋白"和"F蛋 白"）或其片段或變體。人RSV融合蛋白在RSV亞型A與B之間是保守的。RSV抗原可以是 得自RSVLong菌株（GenBankAAX23994.I;SEQIDNO:1)的RSVF蛋白或其片段或變體， 其由SEQIDNO:26的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBankAY911262. 1(SEQ IDNO:6)的第 5660-7384 位。RSV抗原可以是得自RSVA2 菌株（GenBankAAB59858. 1)的 RSVF蛋白或其片段或變體。RSV抗原可以是單體、RSVF蛋白的二聚體或三聚體、或其片 段或變體。RSV抗原可以是優(yōu)化氨基酸RSVF氨基酸序列或其片段或變體。例如，RSV抗 原可以是RSVF的第412-524位氨基酸或其優(yōu)化氨基酸序列。RSV抗原可以是RSVF的第 412-524位氨基酸或其優(yōu)化氨基酸序列的二聚體的融合蛋白，諸如SEQIDNO:25。RSV抗 原可以是由SEQIDNO:23、24或26編碼的RSVF蛋白。
[0071]RSVF的融合后形式在免疫動(dòng)物中引起高滴度的中和抗體并保護(hù)動(dòng)物免受RSV攻 毒的影響。本發(fā)明利用受權(quán)利要求書(shū)保護(hù)的疫苗中的這種免疫反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，RSVF蛋 白可以是融合前形式或融合后形式。
[0072]RSV抗原可以是人RSV附著糖蛋白（在本文也稱為"RSVG"、"RSVG蛋白"和"G 蛋白"）或其片段或變體。人RSVG蛋白在RSV亞型A與B之間不同?？乖梢允堑米訰SV Long菌株（GenBankAAX23993;SEQIDN0:2)的RSVG蛋白或其片段或變體，其由SEQID N0:19的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBankAY911262. 1(SEQIDN0:6)的 第4687-5583位。RSV抗原可以是得自以下的RSVG蛋白或其片段或變體：RSV亞型B分 離株H5601(SEQIDNO:46)、RSV亞型B分離株H1068(SEQIDNO:48)、RSV亞型B分離株 H5598(SEQIDN0:50)、RSV亞型B分離株H1123(SEQIDN0:52)。RSV抗原可以是優(yōu)化氨 基酸RSVG氨基酸序列或其片段或變體。例如，抗原可以是RSVG蛋白的第67-298位氨基 酸或其優(yōu)化氨基酸序列，諸如SEQIDN0:4。RSV抗原可以是由SEQIDN0:3、5、19、20、21、 22、45、47、49或51編碼的RSVG蛋白。
[0073] (2)其它RSV抗原
[0074]RSV抗原可以是人RSV非結(jié)構(gòu)蛋白1( "NS1蛋白"）或其片段或變體。例如，RSV 抗原可以是得自RSVLong菌株（GenBankAAX23987.I;SEQIDNO:28)的RSVNSl蛋白 或其片段或變體，其由SEQIDNO:27的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBank AY911262.I(SEQIDNO:6)的第 99-518 位。
[0075]RSV抗原可以是人RSV非結(jié)構(gòu)蛋白2 ( "NS2蛋白"）或其片段或變體。例如，RSV 抗原可以是得自RSVLong菌株（GenBankAAX23988.1;SEQIDN0:30)的RSVNS2 蛋白 或其片段或變體，其由SEQIDNO:29的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBank AY911262.I(SEQIDNO:6)的第 628-1002 位。
[0076]RSV抗原可以是人RSV核衣殼（"N"）蛋白或其片段或變體。例如，RSV抗原可以是 得自RSVLong菌株（GenBankAAX23989.I;SEQIDNO:32)的RSVN蛋白或其片段或變體， 其由SEQIDNO:31的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBankAY911262. 1(SEQ IDNO:6)的第 1140-2315 位。
[0077]RSV抗原可以是人RSV磷蛋白（"P"）或其片段或變體。例如，RSV抗原可以是得 自RSVLong菌株（GenBankAAX23990.I;SEQIDNO:34)的RSVP蛋白或其片段或變體，其 由SEQIDN0:33的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBankAY911262. 1(SEQID NO:6)的第 2346-3071 位。
[0078]RSV抗原可以是人RSV基質(zhì)蛋白（"M"）或其片段或變體。例如，RSV抗原可以是 得自RSVLong菌株（GenBankAAX2399LI;SEQIDNO:36)的RSVM蛋白或其片段或變體， 其由SEQIDNO:35的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBankAY911262. 1(SEQ IDNO:6)的第 3261-4031 位。
[0079]RSV抗原可以是人RSV小疏水（"SH"）蛋白或其片段或變體。例如，RSV抗原可以是 得自RSVLong菌株（GenBankAAX23992.I;SEQIDNO:38)的RSVSH蛋白或其片段或變體， 其由SEQIDNO:37的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBankAY911262. 1(SEQ IDNO:6)的第 43〇2_4496 位。
[0080]RSV抗原可以是人RSV基質(zhì)蛋白2-1 ( "M2-1"）或其片段或變體。例如，RSV抗 原可以是得自RSVLong菌株（GenBankAAX23995.I;SEQIDNO:40)的RSVM2-1 蛋白或 其片段或變體，其由SEQIDNO:39的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBank AY911262.I(SEQIDNO:6)的第 7605-8189 位。
[0081]RSV抗原可以是人RSV基質(zhì)蛋白2-2( "M2-2"）或其片段或變體。例如，RSV 抗原可以是得自RSVLong菌株（GenBankAAX23997.1;SEQIDN0:42)的RSVM2-2 蛋 白或其片段或變體，其由SEQIDNO:41的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列對(duì)應(yīng)于 GenBankAY9Il262. 1(SEQIDNO:6)的第 8158_843〇 位。
[0082]RSV抗原可以是人RSV聚合酶L("L"）蛋白或其片段或變體。例如，RSV抗原可以 是得自RSVLong菌株（GenBankAAX23996.I;SEQIDNO:44)的RSVL蛋白或其片段或變 體，其由SEQIDN0:43的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBankAY911262. 1(SEQ IDNO:6)的第 8497-14994 位。
[0083]RSV抗原可以是NSl、NS2、N、P、M、SH、M2-1、M2-2或L蛋白的優(yōu)化氨基酸序列。
[0084] (3)RSV抗原匯總
[0085]RSV抗原可以是人RSV抗原或重組抗原，諸如由人RSV基因組（SEQIDNO:6)編碼 的蛋白的任何一種。抗原可以是SEQIDN0:l、2、4、25、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 48、50或52的人RSV或其重組蛋白或共有蛋白、其片段或其變體。RSV抗原可以是由SEQ 10勵(lì)：3、5、19、20、21、22、23、24、26、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或51編碼的 人RSV或其重組蛋白或共有蛋白、其片段或其變體。
[0086] SEQIDNO: 1和26表示得自RSVLong菌株的RSVF蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
[0087] SEQIDNO:2和19表示得自RSVLong菌株的RSVG蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
[0088] SEQIDNO:3、5、20、21和22表示編碼SEQIDNO:4的優(yōu)化氨基酸RSVG氨基酸序 列的核苷酸序列。SEQIDNO:20編碼SEQIDNO:4的氨基酸序列。SEQIDNO:3和21表 示編碼SEQIDNO:4的氨基酸序列的原核（大腸桿菌）密碼子優(yōu)化序列，并且SEQIDNO: 5和22表示編碼SEQIDNO:4的氨基酸序列的原核的真核（小鼠）密碼子優(yōu)化序列。
[0089] SEQIDNO:6表示RSVLong菌株的人RSV基因組的核苷酸序列。
[0090] SEQIDNO: 23和24表示編碼SEQIDNO: 25的優(yōu)化氨基酸RSVF氨基酸序列的 核苷酸序列。SEQIDNO:23編碼SEQIDNO:25的氨基酸序列。SEQIDNO:24表示編碼 SEQIDNO:25的氨基酸序列的原核（大腸桿菌）密碼子優(yōu)化序列。
[0091] SEQIDNO:27和28表示得自RSVLong菌株的RSVNSl蛋白的氨基酸和核苷酸 序列。
[0092] SEQIDNO:29和30表示得自RSVLong菌株的RSVNS2蛋白的氨基酸和核苷酸 序列。
[0093] SEQIDNO:31和32表示得自RSVLong菌株的RSVN蛋白的氨基酸和核苷酸序 列。
[0094] SEQIDNO:33和34表示得自RSVLong菌株的RSVP蛋白的氨基酸和核苷酸序 列。
[0095] SEQIDNO:35和36表示得自RSVLong菌株的RSVM蛋白的氨基酸和核苷酸序 列。
[0096] SEQIDNO:37和38表示得自RSVLong菌株的RSVSH蛋白的氨基酸和核苷酸序 列。
[0097] SEQIDNO:39和40表示得自RSVLong菌株的RSVM2-1蛋白的氨基酸和核苷酸 序列。
[0098] SEQIDNO:41和42表示得自RSVLong菌株的RSVM2-2蛋白的氨基酸和核苷酸 序列。
[0099] SEQIDNO:43和44表示得自RSVLong菌株的RSVL蛋白的氨基酸和核苷酸序 列。
[0100]SEQIDNO:45和46表示得自RSV亞型B分離株H5601的RSVG蛋白的氨基酸和 核苷酸序列。
[0101]SEQIDNO:47和48表示得自RSV亞型B分離株H1068的RSVG蛋白的氨基酸和 核苷酸序列。
[0102] SEQIDNO:49和50表示得自RSV亞型B分離株H5598的RSVG蛋白的氨基酸和 核苷酸序列。
[0103] SEQIDNO:51和52表示得自RSV亞型B分離株H1123的RSVG蛋白的氨基酸和 核苷酸序列。
[0104]b.載體
[0105] 該疫苗可包含編碼抗原的RSV核酸，并且該核酸可位于載體中。載體因此可包含 編碼上述抗原的核酸。載體能夠表達(dá)抗原。載體可以為表達(dá)構(gòu)建體，其通常為用于將特定基 因引入靶細(xì)胞的質(zhì)粒。一旦表達(dá)載體處于細(xì)胞內(nèi)部，就通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制核糖體復(fù) 合物生成由基因編碼的蛋白。常常對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行工程改造以含有用作增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)并導(dǎo) 致表達(dá)載體上所攜帶的基因有效轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明的載體表達(dá)大量的穩(wěn)定信使RNA， 并因此表達(dá)蛋白。
[0106] 包含編碼抗原的DNA的特定DNA載體為proVAX/G(SEQIDNO:22)，其對(duì)應(yīng)于RSV G糖蛋白（全長(zhǎng)核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBank:AY911262. 1(RSV基因組；SEQIDNO:6)的第 4687-5583位；全長(zhǎng)核苷酸序（SEQIDNO:19))的第67-298位氨基酸的編碼區(qū)。包含編碼 抗原的DNA的另一種特定DNA載體為proVAX/F(SEQIDN0:23)，其對(duì)應(yīng)于RSVF融合蛋白 (全長(zhǎng)核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBank:AY911262.I(SEQIDNO:6)的第5660-7384位；全長(zhǎng)F 融合蛋白核苷酸序列（SEQIDNO:26))的第412-524位氨基酸的編碼區(qū)的二聚體。編碼區(qū) 可進(jìn)行密碼子優(yōu)化，即，在一種生物體中相對(duì)于另一種生物體、遠(yuǎn)親生物體更頻繁應(yīng)用的密 碼子，以及添加或修飾Kozak序列和/或內(nèi)含子的修飾，和/或除去不希望的序列，比如潛 在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
[0107] 載體可具有表達(dá)信號(hào)，諸如強(qiáng)啟動(dòng)子、強(qiáng)終止密碼子，啟動(dòng)子與克隆基因之間距離 的調(diào)節(jié)，以及轉(zhuǎn)錄終止序列和PTIS(便攜式翻譯起始序列）的插入。
[0108] (1)表達(dá)載體
[0109] 載體可以為環(huán)形質(zhì)?；蚓€性核酸。環(huán)形質(zhì)粒和線性核酸能夠在適當(dāng)?shù)氖茉囌呒?xì)胞 中指導(dǎo)特定核苷酸序列的表達(dá)。載體可具有可操作地連接到編碼抗原的核苷酸序列的啟動(dòng) 子，所述核苷酸序列可以可操作地連接到終止信號(hào)。載體還可以含有核苷酸序列正確翻譯 所需的序列。包含所關(guān)注的核苷酸序列的載體可以是嵌合的，這意味著其至少一種組分與 其至少一種其它組分異源。核苷酸序列在表達(dá)盒中的表達(dá)可受組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子的控制，所述啟動(dòng)子僅在宿主細(xì)胞暴露于一些特定的外部刺激時(shí)才開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。
[0110] 就多細(xì)胞生物而言，啟動(dòng)子也可對(duì)特定的組織或器官或發(fā)育階段有特異性。
[0111] (2)環(huán)形或線性載體
[0112] 載體可以為環(huán)形質(zhì)粒，其可通過(guò)整合進(jìn)細(xì)胞基因組而轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞或在染色體外存 在（例如，具有復(fù)制起點(diǎn)的自主復(fù)制質(zhì)粒）。
[0113] 載體可以為pVAX、pcDNA3.0或proVAX，或能夠表達(dá)DNA并且使細(xì)胞能夠?qū)⑿蛄蟹?譯成由免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原的任何其它表達(dá)載體。本文還提供了能夠經(jīng)由電穿孔有效遞送 至受試者并表達(dá)一種或多種所需抗原的線性核酸疫苗或線性表達(dá)盒（"LEC"）。LEC可以 為無(wú)任何磷酸骨架的任何線性DNA。DNA可編碼一種或多種抗原。LEC可含有啟動(dòng)子、內(nèi)含 子、終止密碼子、多腺苷酸化信號(hào)。抗原的表達(dá)可受啟動(dòng)子控制。LEC可不含任何抗生素抗 性基因和/或磷酸骨架。LEC可不含與所需抗原基因表達(dá)無(wú)關(guān)的其它核酸序列。
[0114]LEC可源自能夠被線性化的任何質(zhì)粒。質(zhì)粒能夠表達(dá)抗原。質(zhì)?？梢詾閜NP(波多 黎各/34)或pM2 (新喀里多尼亞/99)。質(zhì)?？梢詾閜VAX、pcDNA3. 0或proVAX，或能夠表達(dá) DNA并且使細(xì)胞能夠?qū)⑿蛄蟹g成由免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原的任何其它表達(dá)載體。
[0115] LEC可以為pcrM2。LEC可以為pcrNP。pcrNP和pcrMR可分別源自pNP(波多黎各 /34)和pM2(新喀里多尼亞/99)。LEC可與抗原以5 : 1與1 : 5之間，或I: 1與2 : 1 之間的質(zhì)量比結(jié)合。
[0116] (3)啟動(dòng)子、內(nèi)含子、終止密碼子和多腺苷酸化信號(hào)
[0117] 載體可具有啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以為能夠驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)并調(diào)節(jié)分離核酸的表達(dá)的任 何啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子為經(jīng)由DNA依賴性RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄所需的順式作用序列元件，該聚合 酶轉(zhuǎn)錄本文所述的抗原序列。對(duì)用于指導(dǎo)異源核酸的表達(dá)的啟動(dòng)子的選擇取決于特定的應(yīng) 用。啟動(dòng)子在載體中可定位在與其在自然環(huán)境中距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的大約相同距離。然而， 可允許該距離的變化，而不喪失啟動(dòng)子功能。
[0118] 啟動(dòng)子可與編碼抗原的核酸序列和轉(zhuǎn)錄物的有效多腺苷酸化、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和 翻譯終止所需的信號(hào)可操作地連接。啟動(dòng)子可以為CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、SV40晚 期啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒啟動(dòng)子、多角體蛋白 啟動(dòng)子或經(jīng)證實(shí)在真核細(xì)胞中表達(dá)有效的另一啟動(dòng)子。
[0119] 載體可包括增強(qiáng)子和具有功能剪接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子。載體可含有結(jié)構(gòu)基 因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)以提供有效終止。終止區(qū)可從與啟動(dòng)子序列相同的基因獲得或可從不 同的基因獲得。
[0120]c.疫苗的賦形劑和其它組分
[0121] 疫苗還可以包含其它組分，諸如轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑、佐劑。藥學(xué) 上可接受的賦形劑可以是作為媒介物、佐劑、載體或稀釋劑的功能分子。藥學(xué)上可接受的賦 形劑可以是轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑，其可包含表面活性劑例如免疫刺激復(fù)合物（ISCOMS)、弗氏不完全 佐劑、LPS類似物（包括單磷酰脂質(zhì)A)、胞壁酰肽、醌類似物、小囊泡例如角鯊烯和角鯊烯、 透明質(zhì)酸、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、鈣離子、病毒蛋白、聚陰離子、聚陽(yáng)離子或納米顆?；蚱渌阎?轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。
[0122] 轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑可以為聚陰離子、聚陽(yáng)離子，包括多聚L谷氨酸（LGS)或脂質(zhì)。轉(zhuǎn)染促 進(jìn)劑可以為多聚L-谷氨酸。多聚L-谷氨酸可以低于6mg/ml的濃度存在于疫苗中。轉(zhuǎn)染 促進(jìn)劑還可以包括表面活性劑例如免疫刺激復(fù)合物（ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似 物（包括單磷酰脂質(zhì)A)、胞壁酰肽、醌類似物、小囊泡例如角鯊烯和角鯊烯，并且也可將透 明質(zhì)酸與基因構(gòu)建體一同施用。在一些實(shí)施方案中，DNA質(zhì)粒疫苗還可以包含轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑 例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體，包括作為DNA-脂質(zhì)體混合物的卵磷脂脂質(zhì)體或其它本領(lǐng)域已知的脂質(zhì) 體（參見(jiàn)例如W09324640)、鈣離子、病毒蛋白、聚陰離子、聚陽(yáng)離子或納米顆?；蚱渌阎?的轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑為聚陰離子、聚陽(yáng)離子，包括多聚L-谷氨酸（LGS)或脂質(zhì)。疫 苗中轉(zhuǎn)染劑的濃度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于lmg/ml、低于0. 750mg/ml、低于0. 500mg/ ml、低于 0· 250mg/ml、低于 0· 100mg/ml、低于 0· 050mg/ml或低于 0· 010mg/ml。
[0123] 藥學(xué)上可接受的賦形劑可以為佐劑。佐劑可以是在替代質(zhì)粒中表達(dá)的其它基因， 或作為蛋白與疫苗中的上述質(zhì)粒一起遞送。佐劑可選自：α-干擾素（IFN-a)、i3-干擾素 (IFN-β)、γ-干擾素、血小板衍生生長(zhǎng)因子（TOGF)、TNFa、TNFβ、GM-CSF、表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)、皮膚T細(xì)胞吸引趨化因子（CTACK)、上皮胸腺表達(dá)趨化因子（TECK)、粘膜相關(guān)上皮 趨化因子（MEC)、IL-12、IL-15、MHC、⑶80、⑶86,包括信號(hào)序列缺失的并任選包含來(lái)自IgE 的信號(hào)肽的IL-15。佐劑可以為IL-12、IL-15、IL-28、CTACK，TECK、血小板衍生生長(zhǎng)因子 (PDGF)、TNFa、TNFP、GM-CSF、表皮生長(zhǎng)因子（EGF)、IL-I、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其組合。
[0124] 可以為有用佐劑的其它基因包括編碼以下的基因：MCP-l、MIP-la、MIP-lp、IL-8、 RANTES、L-選擇素、P-選擇素、E-選擇素、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-I、VLA-I、Mac-1、 ρ150· 95、PECAM、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18 突變形 式、⑶40、⑶40L、血管生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、IL-7、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子、Fas、TNF受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、 KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-l、Ap-l、Ap-2、p38、p65Rel、 MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAPK、SAP-1、JNK、干擾素應(yīng)答基因、NFkB、Bax、TRAIL、 TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANKLIGAND、0x40、0x40LIGAND、 NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2 及其功能片段。
[0125] 疫苗還可以包含1994年4月I日提交的美國(guó)專利No. 021，579(其以引用方式整 體并入本文）中描述的基因疫苗促進(jìn)劑。
[0126] 可根據(jù)待使用的施用模式來(lái)配制疫苗。注射用疫苗藥物組合物可以是無(wú)菌、無(wú)熱 原以及無(wú)顆粒的?？墒褂玫葷B制劑或溶液。等滲添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山 梨醇和乳糖。疫苗可包含血管收縮劑。等滲溶液可包括磷酸緩沖鹽水。疫苗還可以包含穩(wěn) 定劑，包括明膠和白蛋白。穩(wěn)定劑可使制劑在室溫或環(huán)境溫度下穩(wěn)定更長(zhǎng)時(shí)間，包括LGS或 聚陽(yáng)離子或聚陰離子。
[0127] 3.接種疫苗進(jìn)行治療或預(yù)防的方法
[0128] 本發(fā)明還涉及用于預(yù)防和治療患者中的呼吸道合胞病毒（RSV)感染的方法。該方 法包括向有需要的受試者施用如本文所述的抗RSV疫苗。疫苗包含RSV抗原肽和編碼所述 RSV抗原肽的核酸。聯(lián)合免疫疫苗可刺激iTreg細(xì)胞，包括但不限于⑶4+、⑶25_、FoxP3+、 IL-IO+O
[0129]聯(lián)合免疫可用于治療或改善疫苗誘發(fā)疾?。╒ID)，疫苗誘發(fā)疾病的原因是原初個(gè) 體在遭遇自然RSV感染前用FI-RSV或其G抗原或其F抗原免疫時(shí)使炎性反應(yīng)加重的傾向， 這些炎性反應(yīng)包括大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、肺嗜酸性粒細(xì)胞增多和2型細(xì)胞因子產(chǎn)生。VID改善 可通過(guò)病毒攻毒后肺組織病理學(xué)變化的減小而指示，和/或與淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的 增殖和浸潤(rùn)的明顯抑制相關(guān)。例如，VID的改善可由表現(xiàn)出⑶4+⑶25_FoxP3+IL-10+表型的 G抗原特異性iTreg細(xì)胞的誘導(dǎo)所致。iTreg刺激的細(xì)胞可生成高水平的IL-10,其刺激B 細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體。
[0130] 聯(lián)合免疫可誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子11-10水平的上調(diào)，而下調(diào)RSV誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因 子,諸如IL-4、11-5、IL-13 和IFN-γ。
[0131] 疫苗劑量可以為1μg至IOmg活性組分/kg體重/次,并且可以為20μg至IOmg 組分/kg體重 / 次。可每 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治療的疫苗劑量數(shù)可以為1、2、 3、4、5、6、7、8、9 或 10。
[0132]a.施用
[0133] 可根據(jù)制藥領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)配制疫苗?？煽紤]諸如特定受試者的 年齡、性別、體重和狀況以及施用途徑等因素，按醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的劑量和技術(shù)施用 此類組合物。受試者可以為哺乳動(dòng)物，諸如人、馬、牛、豬、綿羊、貓、狗、大鼠或小鼠。
[0134] 可預(yù)防性或治療性地施用疫苗。在預(yù)防性施用中，可按足以誘導(dǎo)iTreg反應(yīng)的量 施用疫苗。在治療性應(yīng)用中，可按足以引起治療效果的量向有需要的受試者施用疫苗。將 足以實(shí)現(xiàn)這一目的的量定義為"治療有效劑量"。對(duì)該用途有效的量將取決于（例如）所施 用的疫苗方案的特定組成、施用方式、疾病的階段和嚴(yán)重程度、患者的總體健康狀況和處方 醫(yī)師的判斷。
[0135]可通過(guò)如Donnelly等人（Ann.Rev.Immunol.I5 :617_648 (I"7));Felgner等人 (美國(guó)專利No. 5, 580, 859,1996年 12 月 3 日公布）；Felgner(美國(guó)專利No. 5, 703, 055,1997 年12月30日公布）以及Carson等人（美國(guó)專利No. 5, 679, 647,1997年10月21日）中描 述的本領(lǐng)域熟知的方法施用疫苗，所有這些參考文獻(xiàn)的內(nèi)容均以引用方式整體并入本文。 疫苗的DNA可復(fù)合到可（例如）使用疫苗槍施用給個(gè)體的顆?；蛐≈?。本領(lǐng)域的技術(shù)人員 將了解，藥學(xué)上可接受的載體（包括生理學(xué)上可接受的化合物）的選擇取決于（例如）表 達(dá)載體的施用途徑。
[0136] 可經(jīng)由多種途徑遞送疫苗。典型的遞送途徑包括腸胃外施用，例如皮內(nèi)、肌內(nèi)或皮 下遞送。其它途徑包括經(jīng)口施用、鼻內(nèi)和陰道內(nèi)途徑。尤其對(duì)于疫苗的DNA而言，可將疫苗 遞送至個(gè)體組織的胞間隙（Feigner等人，美國(guó)專利No. 5, 580, 859和No. 5, 703, 055,它們的 內(nèi)容均以引用方式整體并入本文）。也可將疫苗施用至肌肉，或可經(jīng)由皮內(nèi)或皮下注射，或 經(jīng)皮，諸如通過(guò)離子電滲療法施用。也可采用疫苗的表皮施用。表皮施用可涉及機(jī)械或化 學(xué)刺激表皮的最外層以刺激對(duì)刺激物的免疫反應(yīng)（Carson等人，美國(guó)專利No. 5, 679, 647， 其內(nèi)容以引用方式整體并入本文）。
[0137] 也可配制疫苗用于經(jīng)由鼻通道施用。其中載體為固體的適合鼻腔施用的制劑可包 括粒度（例如）在約10至約500微米范圍內(nèi)的粗粉，以采用鼻煙的方式，即通過(guò)鼻通道從 接近鼻子的粉末容器中迅速吸入而施用所述粗粉。制劑可以為鼻噴劑、滴鼻劑，或通過(guò)噴霧 器經(jīng)氣溶膠施用。制劑可包括疫苗的水或油溶液。
[0138] 疫苗可以為液體制劑，諸如混懸劑、糖漿劑或酏劑。疫苗也可以為供腸胃外、皮下、 皮內(nèi)、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用（例如，注射用）的制劑，諸如無(wú)菌混懸劑或乳劑。
[0139] 可將疫苗摻入脂質(zhì)體、微球或其它聚合物基質(zhì)（Feigner等人，美國(guó)專利 No. 5, 703, 055 ;Gregoriadis，LiposomeTechnology，第ItoIII卷（第 2 版，1993 年），其 內(nèi)容以引用方式整體并入本文）。脂質(zhì)體可由磷脂或其它脂質(zhì)組成，并且可以為制備和施用 相對(duì)簡(jiǎn)單的無(wú)毒、生理學(xué)上可接受且可代謝的載體。
[0140] 可經(jīng)由電穿孔，諸如通過(guò)其內(nèi)容以引用方式并入本文的美國(guó)專利No. 7, 664, 545 中描述的方法施用疫苗。電穿孔可通過(guò)美國(guó)專利No. 6, 302, 874、No. 5, 676, 646、 No. 6, 241，701、No. 6, 233, 482、No. 6, 216, 034、No. 6, 208, 893、No. 6, 192, 270、 No. 6, 181，964、No. 6, 150, 148、No. 6, 120, 493、No. 6, 096, 020、No. 6, 068, 650 和 No. 5, 702, 359中描述的方法和/或設(shè)備進(jìn)行，它們的內(nèi)容以引用方式整體并入本文?？山?jīng) 由微創(chuàng)裝置進(jìn)行電穿孔。
[0141] 微創(chuàng)電穿孔裝置（"MID"）可以為用于將上述疫苗和相關(guān)流體注射進(jìn)機(jī)體組織的 設(shè)備。該裝置可包括空心針、DNA盒和流體遞送機(jī)構(gòu)，其中該裝置適于啟動(dòng)使用中的流體遞 送機(jī)構(gòu)以便在將針插入所述機(jī)體組織的同時(shí)（例如，自動(dòng)地）將DNA注射進(jìn)機(jī)體組織。這 樣的優(yōu)點(diǎn)在于，在插入針的同時(shí)能夠逐漸注射DNA和相關(guān)流體，導(dǎo)致流體在機(jī)體組織更均 勻的分布。由于注射的DNA在更大的區(qū)域分布，注射時(shí)經(jīng)受的疼痛可得以減輕。
[0142]MID可將疫苗注射進(jìn)組織，無(wú)需使用針。MID可注射作為細(xì)流或射流的疫苗，其 力量使得疫苗刺入組織表面并進(jìn)入下層組織和/或肌肉。細(xì)流或射流后面的力可通過(guò)壓 縮氣體（諸如二氧化碳）在一瞬間通過(guò)微型孔的膨脹提供。微創(chuàng)電穿孔裝置及其使用方 法的實(shí)例在已公布的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 20080234655、美國(guó)專利No. 6, 520, 950、美國(guó)專利 No. 7, 171，264、美國(guó)專利No. 6, 208, 893、美國(guó)專利No. 6, 009, 347、美國(guó)專利No. 6, 120, 493、 美國(guó)專利No. 7, 245, 963、美國(guó)專利No. 7, 328, 064和美國(guó)專利No. 6, 763, 264中有描述，它們 每一者的內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0143]MID可包括產(chǎn)生無(wú)痛刺入組織的高速液體射流的注射器。此類無(wú)針注射器可 商購(gòu)獲得。本文可用的無(wú)針注射器的實(shí)例包括美國(guó)專利No. 3, 805, 783、No. 4, 447, 223、 No. 5, 505, 697和No. 4, 342, 310中描述的無(wú)針注射器，它們每一者的內(nèi)容以引用方式并入 本文。
[0144] 可使用無(wú)針注射器，通常通過(guò)使組織表面與注射器接觸，以便用足以使疫苗穿透 進(jìn)組織的力啟動(dòng)藥劑射流的遞送，將呈適于直接或間接電遷移形式的所需疫苗引入（例 如，注射）至待治療的組織中。例如，如果待治療的組織為粘膜、皮膚或肌肉，則用足夠的力 將藥劑射向粘膜或皮膚表面以使藥劑穿透角質(zhì)層并進(jìn)入真皮層，或分別進(jìn)入下層組織和肌 肉。
[0145] 無(wú)針注射器很適合將疫苗遞送至所有類型的組織，尤其是皮膚和粘膜。在一些實(shí) 施方案中，無(wú)針注射器可用于將含有疫苗的液體推至表面并進(jìn)入受試者的皮膚或粘膜?？?使用本發(fā)明方法治療的各類組織的代表性實(shí)例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽喉、 肺、心臟、腎、肌肉、乳房、結(jié)腸、前列腺、胸腺、睪丸、皮膚、粘膜組織、卵巢、血管或其任何組 合。
[0146]MID可具有使組織電穿孔的針電極。通過(guò)在多電極陣列中多對(duì)電極之間產(chǎn)生脈沖 (例如呈矩形或正方形模式的設(shè)置）提供比在一對(duì)電極之間產(chǎn)生脈沖改善的結(jié)果。例如， 標(biāo)題為"NeedleElectrodesforMediatedDeliveryofDrugsandGenes" 的美國(guó)專利 No. 5, 702, 359公開(kāi)了針陣列，其中在治療期間可使多對(duì)針產(chǎn)生脈沖。在如同全面闡述地 以引用方式并入本文的該申請(qǐng)中，將針布置成圓形陣列，但是具有使得能夠在反向針電極 對(duì)之間產(chǎn)生脈沖的連接器和轉(zhuǎn)換設(shè)備?？墒褂糜糜趯⒅亟M表達(dá)載體遞送至細(xì)胞的一對(duì)針 電極。在美國(guó)專利No. 6, 763, 264中描述了這種裝置和系統(tǒng)，其內(nèi)容以引用方式并入本文。 作為另外一種選擇，可使用單針裝置，其允許用類似于普通注射針的單根針來(lái)注射DNA和 進(jìn)行電穿孔并施加比目前使用的裝置遞送的脈沖電壓低的脈沖，從而減輕患者經(jīng)受的電感 覺(jué)。
[0147]MID可包括一個(gè)或多個(gè)電極陣列。陣列可包括兩根或更多根具有相同直徑或不同 直徑的針。針均勻或不均勻地間隔開(kāi)。針可在0.005英寸與0.03英寸之間，在0.01英寸 與0.025英寸之間，或在0.015英寸與0.020英寸之間。針的直徑可以為0.0175英寸。針 可間隔開(kāi) 〇· 5mm、I. 0mm、I. 5mm、2. 0mm、2. 5mm、3. 0mm、3. 5mm、4.Omm或更遠(yuǎn)。
[0148]MID可由脈沖發(fā)生器和一步遞送疫苗和電穿孔脈沖的兩針或多針疫苗注射器 組成。脈沖發(fā)生器可允許經(jīng)由以閃存卡運(yùn)行的個(gè)人計(jì)算機(jī)靈活編程脈沖和注射參數(shù)， 以及全面記錄并存儲(chǔ)電穿孔和患者數(shù)據(jù)。脈沖發(fā)生器可在短時(shí)間內(nèi)遞送多個(gè)電壓脈 沖。例如，脈沖發(fā)生器可在持續(xù)期間遞送3個(gè)IOOms的15V脈沖。這種MID的實(shí)例為 Inovio Pharmaceuticals的Elgen 1000系統(tǒng)，其在內(nèi)容以引用方式并入本文的美國(guó)專利 No. 7, 328, 064中有描述。
[0149] MID可以為CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals)裝置和系統(tǒng)，這是促進(jìn)將大分 子（諸如DNA)引入機(jī)體或植物中的選定組織的細(xì)胞內(nèi)的模塊化電極系統(tǒng)。該模塊化電極 系統(tǒng)可包括多個(gè)針電極；皮下針；提供從可編程恒定電流脈沖控制器向所述多個(gè)針電極的 導(dǎo)電性連接的電連接器；和電源。操作員可握住安裝在承載結(jié)構(gòu)上的所述多個(gè)針電極并將 它們牢牢插入機(jī)體內(nèi)或植物的選定組織。然后大分子經(jīng)由皮下針遞送至選定的組織。激活 可編程恒定電流脈沖控制器并將恒定電流電脈沖施加到所述多個(gè)針電極。施加的恒定電 流電脈沖促進(jìn)大分子引入所述多個(gè)電極之間的細(xì)胞。通過(guò)借助恒定電流脈沖限制組織內(nèi) 的功率耗散將由于細(xì)胞過(guò)熱導(dǎo)致的細(xì)胞死亡減到最少。美國(guó)專利No. 7, 245, 963中描述了 Cellectra裝置和系統(tǒng)，其內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0150] Elgen 1000系統(tǒng)可包括提供空心針的裝置；和流體遞送機(jī)構(gòu)，其中該設(shè)備適于啟 動(dòng)使用中的流體遞送機(jī)構(gòu)以便在將針插入所述機(jī)體組織的同時(shí)（例如，自動(dòng)地）將流體 (本文所述的疫苗）注射進(jìn)機(jī)體組織。優(yōu)點(diǎn)是在插入針的同時(shí)能夠逐漸注射流體，導(dǎo)致流體 在機(jī)體組織更均勻的分布。還認(rèn)為，由于注射的流體的體積在更大的區(qū)域分布，注射時(shí)經(jīng)受 的疼痛得以減輕。
[0151] 另外，自動(dòng)注射流體有利于自動(dòng)監(jiān)測(cè)并記錄注射的實(shí)際流體劑量。如果需要，可通 過(guò)控制單元對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行存儲(chǔ)以用于通過(guò)文件進(jìn)行記錄的目的。
[0152] 應(yīng)了解，注射速率可以為線性的或非線性的并且可在將針插入待治療受試者的皮 膚后和將其進(jìn)一步插入機(jī)體組織的同時(shí)進(jìn)行注射。
[0153] 可通過(guò)本發(fā)明的設(shè)備將流體注入其中的合適組織包括腫瘤組織、皮膚或肝組織， 但是可以為肌肉組織。
[0154] 該設(shè)備還可以包括用于指導(dǎo)將針插入機(jī)體組織內(nèi)的針插入機(jī)構(gòu)。流體注射速率受 針插入速率控制。這樣的優(yōu)點(diǎn)在于，可控制針插入和流體的注射，使得可根據(jù)需要使插入速 率與注射速率匹配。這還使得儀器更易于為使用者操作。如果需要，可提供用于自動(dòng)將針 插入機(jī)體組織內(nèi)的機(jī)構(gòu)。
[0155] 使用者可選擇何時(shí)開(kāi)始流體注射。然而理想的是，當(dāng)針尖到達(dá)肌肉組織時(shí)開(kāi)始注 射并且所述設(shè)備可包括用于感測(cè)針已經(jīng)插入開(kāi)始流體注射的足夠深度的機(jī)構(gòu)。這意味著， 當(dāng)針已到達(dá)所需深度（通常為肌肉組織開(kāi)始的深度）時(shí)可自動(dòng)提示開(kāi)始流體注射。例如可 取肌肉組織開(kāi)始的深度為預(yù)設(shè)針插入深度，例如將認(rèn)為足夠使針通過(guò)皮膚層的4mm的值。
[0156] 感測(cè)機(jī)構(gòu)可包括超聲探針。感測(cè)機(jī)構(gòu)可包括用于感測(cè)阻抗或電阻變化的機(jī)構(gòu)。在 這種情況下，所述機(jī)構(gòu)可能不會(huì)同樣記錄針在機(jī)體組織內(nèi)的深度，但是將更適于感測(cè)當(dāng)針 從不同類型的機(jī)體組織移至肌肉內(nèi)時(shí)阻抗或電阻的變化。這些替代方案的任一種提供相對(duì) 準(zhǔn)確且操作簡(jiǎn)檔的感測(cè)可開(kāi)始注射的機(jī)構(gòu)。如果需要，可進(jìn)一步記錄針的插入深度并可將 其用于控制流體的注射，使得在記錄針插入的深度時(shí)確定待注射的流體體積。
[0157] 所述設(shè)備還可以包括：支撐針的底座；和將底座容納于其中的殼，其中底座可相 對(duì)于殼移動(dòng)，使得當(dāng)?shù)鬃鄬?duì)于殼處于第一向后位置時(shí)針縮回在殼內(nèi)，并當(dāng)?shù)鬃幱跉?nèi) 的第二向前位置時(shí)針伸出殼外。這對(duì)于使用者而言有利，因?yàn)榭稍诨颊叩钠つw上將殼對(duì)準(zhǔn)， 然后可通過(guò)相對(duì)于底座移動(dòng)殼將針插入患者的皮膚內(nèi)。
[0158] 如上所述，可取的是實(shí)現(xiàn)受控的流體注射速率，使得當(dāng)將針插入皮膚時(shí)使流體在 針的長(zhǎng)度上均勻地分布。流體遞送機(jī)構(gòu)可包括適于以受控的速率注射流體的活塞傳動(dòng)機(jī) 構(gòu)。例如可通過(guò)伺服電機(jī)激活活塞傳動(dòng)機(jī)構(gòu)。然而，可通過(guò)使底座相對(duì)于殼以軸向移動(dòng)而 啟動(dòng)活塞傳動(dòng)機(jī)構(gòu)。應(yīng)了解，可提供用于流體遞送的替代機(jī)構(gòu)。因此，例如，可提供可擠壓 以按受控或不受控速率進(jìn)行流體遞送的密閉容器代替注射器和活塞系統(tǒng)。
[0159] 上述設(shè)備可用于任何類型的注射。然而，設(shè)想在電穿孔領(lǐng)域中尤其有用，因此其還 包括用于向針施加電壓的機(jī)構(gòu)。這允許針不僅用于注射，還在電穿孔期間用作電極。這特 別有利，因?yàn)檫@意味著向與注射流體相同的區(qū)域施加電場(chǎng)。電穿孔一直存在的問(wèn)題在于，很 難使電極與先前注射的流體精確對(duì)準(zhǔn)，因此使用者往往在更大的區(qū)域注射大于所需體積的 流體并且向更大的區(qū)域施加電場(chǎng)以試圖保證注射物質(zhì)與電場(chǎng)之間的重疊。使用本發(fā)明，在 實(shí)現(xiàn)電場(chǎng)與流體之間的良好切合的同時(shí)可減小注射流體的體積和施加電場(chǎng)的大小。
[0160] 4.接種抗RSV感染的疫苗的方法
[0161] 本發(fā)明還涉及為受試者接種抗RSV感染的疫苗的方法。該方法包括向有需要的受 試者施用如本文所述的抗RSV疫苗。疫苗可包含RSV抗原肽和編碼所述RSV抗原肽的核酸。 疫苗可刺激iTreg細(xì)胞，包括但不限于CD4+、CD25_、FoxP3+、IL-10+，其繼而生成抗原特異性 響應(yīng)。iTreg刺激細(xì)胞可生成高水平的IL-10,其刺激B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體。
[0162] 5.用于誘導(dǎo)抗RSV感染的中和抗體并抑制炎性T細(xì)胞的方法
[0163] 本發(fā)明還涉及用于在受試者中誘導(dǎo)抗RSV感染的中和抗體并抑制炎性T細(xì)胞的方 法。該方法包括向有需要的受試者施用如本文所述的抗RSV疫苗。該疫苗可包含RSV抗 原肽和編碼所述RSV抗原肽的核酸。該疫苗可刺激iTreg細(xì)胞，包括但不限于⑶4+、⑶25' F〇xP3+、IL-10+。iTreg刺激細(xì)胞可生成高水平的IL-10,其刺激B細(xì)胞生成中和抗體。抑制 炎性T細(xì)胞包括誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞。
[0164] 該方法利用抗原特異性免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)通過(guò)用如上所述的RSV抗原和編碼 所述RSV抗原的核酸對(duì)受試者進(jìn)行聯(lián)合免疫而產(chǎn)生。
[0165] 6.用于抑制RSV攻毒后的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)的方法
[0166] 本發(fā)明還涉及用于在受試者中抑制RSV攻毒后的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)的方 法。該方法包括向有需要的受試者施用如本文所述的抗RSV疫苗。該疫苗可包含RSV抗 原肽和編碼所述RSV抗原肽的核酸。該疫苗可刺激iTreg細(xì)胞，包括但不限于⑶4+、⑶25、 F〇xP3+、IL-10+。iTreg刺激細(xì)胞可生成高水平的IL-10,其刺激B細(xì)胞生成中和抗體。抑制 炎性T細(xì)胞包括抑制自身反應(yīng)性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞。
[0167] 7.改善疫苗誘發(fā)疾?。╒ID)的方法
[0168] 本發(fā)明還涉及改善VID的方法。該方法包括向有需要的受試者施用如本文所述的 抗RSV疫苗。疫苗可包含RSV抗原肽和編碼所述RSV抗原肽的核酸。該疫苗可刺激iTreg 細(xì)胞，包括但不限于CD4+、CD25_、FoxP3+、IL-10+。iTreg刺激細(xì)胞可生成高水平的IL-10,其 刺激B細(xì)胞生成中和抗體。可將受試者在遭遇自然RSV感染前用福爾馬林滅活RSV(FI-RSV) 或RSV抗原免疫。
[0169] 8.用于保護(hù)受試者免于發(fā)生RSV攻毒后的氣道高反應(yīng)性（AHR)的方法
[0170] 本發(fā)明還涉及用于保護(hù)受試者免于發(fā)生RSV攻毒后的氣道高反應(yīng)性（AHR)的方 法。該方法包括向有需要的受試者施用如本文所述的抗RSV疫苗。疫苗可包含RSV抗原 肽和編碼所述RSV抗原肽的核酸。該疫苗可刺激iTreg細(xì)胞，包括但不限于⑶4+、⑶25' F〇xP3+、IL-10+。iTreg刺激細(xì)胞可生成高水平的IL-10,其刺激B細(xì)胞生成中和抗體?？蓪?受試者在遭遇自然RSV感染前用福爾馬林滅活RSV(FI-RSV)或RSV抗原免疫。該方法利用 抗原特異性免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)通過(guò)用如上所述的RSV抗原和編碼所述RSV抗原的核酸 對(duì)受試者進(jìn)行聯(lián)合免疫而產(chǎn)生。
[0171]RSV可在之前對(duì)RSV致敏的受試者中觸發(fā)AHR。對(duì)RSV致敏是指之前暴露于RSV 一次或多次使得產(chǎn)生對(duì)RSV的免疫反應(yīng)。與變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的反應(yīng)（例如組胺釋放、鼻炎、浮 腫、血管舒張、支氣管收縮、氣道炎癥）通常不會(huì)在將原初個(gè)體首次暴露于RSV時(shí)發(fā)生，但是 一旦產(chǎn)生了針對(duì)RSV的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)后，個(gè)體即對(duì)RSV"致敏"。AHR或氣道阻塞可 在致敏受試者再次暴露于RSV時(shí)發(fā)生。一旦受試者對(duì)RSV致敏，變態(tài)反應(yīng)可在隨后每次暴 露于RSV時(shí)變得更糟，因?yàn)槊看沃匦卤┞队诓粌H產(chǎn)生變態(tài)癥狀，還進(jìn)一步增加針對(duì)RSV產(chǎn)生 的抗體的水平和針對(duì)RSV的T細(xì)胞反應(yīng)的水平。
[0172] 有發(fā)生氣道高反應(yīng)性風(fēng)險(xiǎn)的受試者是這樣的受試者，其已暴露于足以觸發(fā)AHR的 RSV或有暴露于足以觸發(fā)AHR的RSV的風(fēng)險(xiǎn)，但尚未表現(xiàn)出可測(cè)量或可檢測(cè)的AHR特征或癥 狀。有發(fā)生RSV誘發(fā)的AHR風(fēng)險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物是這樣的哺乳動(dòng)物，其之前已對(duì)RSV致敏，并已 暴露于一定量的足以觸發(fā)AHR的RSV或有暴露于一定量的足以觸發(fā)AHR的RSV(即，RSV的 觸發(fā)劑量或攻毒劑量）的風(fēng)險(xiǎn)，但尚未表現(xiàn)出可測(cè)量或可檢測(cè)的AHR特征或癥狀。
[0173]炎癥的特征通常在于炎性介質(zhì)（例如細(xì)胞因子或趨化因子）的釋放，這些炎性介 質(zhì)將炎癥中涉及到的細(xì)胞募集到組織。RSV攻毒后的AHR涉及引起一種類型的針對(duì)RSV的 免疫反應(yīng)（例如Th2型免疫反應(yīng)），這可導(dǎo)致釋放炎性介質(zhì)，這些炎性介質(zhì)募集哺乳動(dòng)物炎 癥中涉及到的細(xì)胞，其存在可導(dǎo)致組織損害，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡。Th2型免疫反應(yīng)的特征部分 在于釋放誘導(dǎo)IL-4、IL-5和IL-13的細(xì)胞因子。
[0174] 9.聯(lián)合療法
[0175] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"聯(lián)合"在施用其它療法的背景下是指使用不止一種療法。使用 術(shù)語(yǔ)"聯(lián)合"不限制向感染個(gè)體施用療法的順序。可以在將第二療法施用給已患有或疑似 患有RSV感染、中耳炎或與之相關(guān)的呼吸道病癥的受試者之前（例如1分鐘、45分鐘、30分 鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、 2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周）、同時(shí)或之后（例如1分鐘、45分鐘、30分鐘、45分 鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3 周、4周、5周、6周、8周或12周）施用第一療法。任一另外的療法可以按任何順序與其它 另外的療法一起施用。在某些實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的疫苗與一種或多種療法（例如， 同時(shí)施用以預(yù)防、治療、管理和/或改善RSV感染（例如，急性RSV疾病或RSVURI和/或 LRI)、中耳炎和/或癥狀或呼吸道病癥或與之相關(guān)的其它癥狀的療法）聯(lián)合施用。
[0176] 可與本發(fā)明的疫苗聯(lián)合施用的療法的非限制性實(shí)例包括任何合適且有效量的組 合物或藥物組合物中的任一種，所述組合物包含對(duì)此調(diào)節(jié)、治療或療法有需要的細(xì)胞、組 織、器官、動(dòng)物或患者的至少一種RSV抗體，任選地還包含選自以下的至少一種：至少一種 TNF拮抗劑（例如但不限于TNF抗體或片段、可溶性TNF受體或片段、其融合蛋白或小分 子TNF拮抗劑）、抗風(fēng)濕藥物（例如甲氨喋呤、金諾芬、金硫葡糖、硫唑嘌呤、依那西普、硫代 蘋(píng)果酸金鈉、硫酸羥氯喹、來(lái)氟米特、柳氮磺胺吡啶）、肌肉松弛劑、麻醉藥物、非留體抗炎 藥（NSAID)、止痛藥物、麻醉藥物、鎮(zhèn)靜藥物、局部麻醉藥物、神經(jīng)肌肉阻斷劑、抗微生物藥 物（例如氨基糖苷、抗真菌藥物、抗寄生蟲(chóng)藥物、抗病毒藥物、碳青霉烯、頭孢菌素、氟喹諾 酮、大環(huán)內(nèi)酯、青霉素、磺酰胺、四環(huán)素、另外的抗微生物藥物）、抗牛皮癬藥、皮質(zhì)類固醇、促 合成代謝類留醇、糖尿病相關(guān)藥物、礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)劑、甲狀腺劑、維生素、鈣相關(guān)激素、止瀉藥 物、鎮(zhèn)咳藥物、止吐藥物、抗?jié)兯幬?、輕瀉藥物、抗凝血?jiǎng)⒋偌t細(xì)胞生成素（例如促紅素 α)、非格司亭（例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭（GM-CSF、Leukine)、免疫療法、免疫球蛋 白、免疫抑制劑（例如巴利昔單抗、環(huán)胞菌素、達(dá)珠單抗）、生長(zhǎng)激素、激素替代藥物、雌激 素受體調(diào)節(jié)劑、散瞳劑、睫狀肌麻痹劑、烷基化劑、抗代謝藥物、有絲分裂抑制劑、放射藥物、 抗抑郁藥物、抗狂躁劑、安定藥、抗焦慮藥、催眠藥、擬交感神經(jīng)藥、刺激劑、多奈哌齊、他克 林、哮喘藥物、β激動(dòng)劑、吸入類固醇、白三烯抑制劑、甲基黃嘌呤、色苷酸、腎上腺素或類似 物、阿法鏈道酶（Pulmozyme)、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑，或U.S.Pharmacopoeia和/或 Physician'sDeskReference中所列的任何其它藥劑。此類細(xì)胞因子的非限制性實(shí)例包 括但不限于IL-I至IL-23的任一者。合適的劑量是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)例如Wells等人編 輯，PharmacotherapyHandbook，第 2 版，AppletonandLange，Stamford，Conn. (2000);PDR Pharmacopoeia,TarasconPocketPharmacopoeia2000,精裝本，TarasconPublishing, LomaLinda,Calif. (2000)，這些參考文獻(xiàn)的每一者均以引用方式整體并入本文。
[0177] 10.試劑盒
[0178]本文提供可用于對(duì)受試者進(jìn)行疫苗接種的試劑盒。該試劑盒可包括疫苗，其包含 抗原肽和編碼所述抗原肽的DNA;以及MID。該試劑盒還可以包括使用試劑盒并進(jìn)行分析、 監(jiān)測(cè)或治療的說(shuō)明。
[0179]試劑盒還可以包括一個(gè)或多個(gè)容器，諸如小瓶或瓶子，而每個(gè)容器容納單獨(dú)的試 齊IJ。試劑盒還可以包括書(shū)面說(shuō)明，其可以描述如何開(kāi)展或解讀分析、監(jiān)測(cè)、治療或本文所述 的方法。試劑盒還可以包括疫苗施用裝置。疫苗施用裝置可以為疫苗槍、用于施用疫苗的 針、或連接到用于遞送疫苗的導(dǎo)管的電穿孔裝置。
[0180]本發(fā)明具有通過(guò)以下非限制性實(shí)施例示出的多個(gè)方面。 實(shí)施例
[0181] 實(shí)施例1
[0182] 材料和方法
[0183] 以下是用于下述實(shí)施例2-8的材料和方法的描述。
[0184]對(duì)于動(dòng)物和細(xì)胞，6-8周齡的Balb/c小鼠購(gòu)自中國(guó)北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物研究所，在12小時(shí)的光照循環(huán)下照料，并喂養(yǎng)無(wú)病原體的食物和水。所有動(dòng)物方案均得 到中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物福利委員會(huì)的批準(zhǔn)。將NIH/3T3細(xì)胞系（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (八丁0：)，1?〇。1^1116，]\?，舊六0(^-1658)和冊(cè)口-2(六丁0：，〇(^-23)維持在設(shè)為371：和5%0) 2 的潮濕培養(yǎng)箱中的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM) (Gibco/BRL，NY，USA)中，該培養(yǎng) 基補(bǔ)充有10%胎牛血清$03)和青霉素/鏈霉素（6讓〇〇/81^)。
[0185]對(duì)于細(xì)菌菌株和質(zhì)粒，將大腸桿菌TOP 10(中國(guó)北京天根生化科技有限公司）用 作進(jìn)行操縱的宿主菌株，并將大腸桿菌BL21(DE3)(天根公司）用作表達(dá)菌株。真核表達(dá)載 體proVAX之前在該實(shí)驗(yàn)室中由巨細(xì)胞病毒（CMV)啟動(dòng)子和hCG-β先導(dǎo)序列構(gòu)建（Du等 人，TheJournalofGeneMedicine9 :136-146(2007))。原核表達(dá)載體pET28a(+)(Novagen Inc，WI，USA)包含T7啟動(dòng)子并允許表達(dá)融合到多聚組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白。所有細(xì)菌培 養(yǎng)均使用在適當(dāng)時(shí)補(bǔ)充有卡那霉素的LB培養(yǎng)基（中國(guó)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公 司）在搖瓶中進(jìn)行。蛋白表達(dá)通過(guò)購(gòu)自Invitrogen(CA,USA)的異丙基β-D-I-巰基半乳 糖苷（IPTG)誘導(dǎo)。
[0186] 對(duì)于質(zhì)粒構(gòu)建和真核表達(dá)，使用了編碼RSVG糖蛋白的第67-298位氨基酸的優(yōu)化 形式的基因（全長(zhǎng)RSVG核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBank:ΑΥ911262. 1(RSV基因組；SEQIDNO: 6)的第 4687-5583 位；RSVG糖蛋白氨基酸序列（GenBankAAX23993;SEQIDNO:2);RSV G糖蛋白核苷酸序列（SEQIDNO:19))。優(yōu)化氨基酸RSVG氨基酸序列的核苷酸序列（SEQ IDNO:20)通過(guò)外包（中國(guó)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）進(jìn)行了小鼠密碼子優(yōu)化 (SEQIDNO:22)和合成。密碼子優(yōu)化不僅消除了G片段的稀有密碼子，還移除了N端的66 個(gè)氨基酸的跨膜域（Ghildyal等人，JournalofGeneralVirology86:1879-1884(2005))。 將密碼子優(yōu)化的基因在EcoRI和XhoI限制性位點(diǎn)亞克隆進(jìn)真核表達(dá)載體proVAX，并指定 為proVAX/G。通過(guò)限制性消化和測(cè)序確認(rèn)了其正確性。將純化的質(zhì)粒用Lipofectamine根 據(jù)制造商的說(shuō)明（Irwitrogen，CA,USA)轉(zhuǎn)染進(jìn)了NIH/3T3細(xì)胞。在48h后收獲轉(zhuǎn)染子，根 據(jù)前人所述的方案（Jin等人，Vaccine22:2925-2935(2004))提取了總細(xì)胞RNA。用以下 特異性引物組通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR)檢測(cè)了所關(guān)注的基因的表達(dá)：正向引物， 5, -ATGCATAAGGTGACTCCT-3,（SEQIDN0:7);反向引物，5, -TTACTGCCGTGGGGTGTT-3'（SEQ IDNO:8)。
[0187] 使用了編碼RSVF融合蛋白的第412-524位氨基酸的優(yōu)化形式的基因（全長(zhǎng)RSV F融合蛋白核苷酸序列對(duì)應(yīng)于GenBank:AY911262. 1(SEQIDNO:6)的第5660-7384位；RSV F融合蛋白氨基酸序列（GenBankAAX23994.I;SEQIDN0:1);RSVF融合蛋白核苷酸序列 (SEQIDNO:26))。對(duì)優(yōu)化氨基酸RSVF氨基酸序列的核苷酸序列（SEQIDNO:23)針對(duì)原 核（即，大腸桿菌）表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化（SEQIDNO:24)。
[0188] 對(duì)于質(zhì)粒構(gòu)建和原核表達(dá)，將編碼RSVG糖蛋白（SEQIDNO:21)第67-298位氨基 酸的原核密碼子優(yōu)化基因通過(guò)類似的程序亞克隆進(jìn)原核表達(dá)載體，并指定為pET28a(+)/G。 將編碼RSVF(SEQIDNO:24)第412-524位氨基酸的原核密碼子優(yōu)化基因通過(guò)類似的程序 亞克隆進(jìn)原核表達(dá)載體，并指定為pET28a(+)/F。通過(guò)限制性消化和測(cè)序確認(rèn)了其正確性。 將大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞用pET28a(+)/G通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法（Molecularcloning:A laboratorymanual,第 2 版，J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis編輯，ColdSpring HarborLaboratoryPress，1989)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并用 0. 5mmol/L的IPTG在 37°C下誘導(dǎo)了蛋 白表達(dá)。4h后，收集細(xì)胞、洗滌并重懸在PBS中。在超聲處理后從細(xì)胞中分離了可溶性部 分和包含包涵體的不溶性部分。根據(jù)制造商手冊(cè)使之穿過(guò)BiologicDuoFIowTM色譜系統(tǒng) (Bio-Rad，CA,USA)上的Ni-NTASuperfloW柱（QIAGENGmbH，Hilden，Germany)而對(duì)重組 蛋白進(jìn)行了純化。通過(guò)12%SDS-PAGE對(duì)純化的蛋白進(jìn)行分析。
[0189] 對(duì)于western印跡分析，使蛋白樣品在12%SDS-PAGE凝膠上接受電泳，然后使用 Bio-Rad轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，CA,USA)轉(zhuǎn)移到纖維素膜上。在與2%BSA混合的PBST中過(guò)夜 封閉后，將膜用山羊抗RSV抗血清（Meridian，Me，USA)以I: 2000的稀釋度在4°C下孵育 2h。將膜用150mMPBST洗滌三次，然后用封閉緩沖液（與2%BSA混合的PBST)中的牛抗 山羊IgG-HRP偶聯(lián)物（SantaCruz，CA，USA)以1 : 1000的稀釋度在室溫下孵育lh。通過(guò) ECL法根據(jù)制造商的說(shuō)明（GEHealthcareEurope,Uppsala,Sweden)檢測(cè)了免疫復(fù)合物。
[0190] 對(duì)于RSV母液制備，從ATCC(目錄號(hào)VR-26)獲得RSV Long菌株，然后在含有5% CO2的潮濕氛圍中在37°C下在HEp-2細(xì)胞中傳播。將病毒以4 : 1的感染復(fù)數(shù)（m. 0.i.)加 入DMEM中的細(xì)胞。Ih后，將含有2%FCS的DMEM加入搖瓶，并監(jiān)測(cè)3-4天的細(xì)胞感染。通 過(guò)在3,OOOXg和4°C下離心以除去細(xì)胞碎片而收獲RSV，等分，然后儲(chǔ)藏在-80°C下直至使 用。
[0191]如Kim等人，AmericanJournalofEpidemiology89 :422-434 (1969)所述制備了 福爾馬林滅活RSV(FI-RSV)。簡(jiǎn)而言之，將1份福爾馬林（約37% -40% )用4, 000份澄 清的病毒裂解物在37°C下孵育3天，然后通過(guò)在50,OOOXg下離心Ih而沉淀。將病毒按 1 : 25在最小必需培養(yǎng)基（MEM)中稀釋，然后用氫氧化鋁（4mg/ml)沉淀，以原始體積的 1/100重懸在無(wú)血清MEM中，然后儲(chǔ)藏在4°C下。
[0192] 對(duì)于小鼠的免疫和攻毒，使用EndoFreePlasmidGiga試劑盒（QIAGEN，Hilden, Germany)根據(jù)制造商的建議分離了用于免疫的質(zhì)粒DNA。將質(zhì)粒和重組蛋白均溶于PBS。對(duì) 于疫苗接種，將小鼠隨機(jī)分組，每組9只動(dòng)物，如表1所列。將小鼠經(jīng)肌內(nèi)用FI-RSV、質(zhì)粒、 質(zhì)粒+蛋白或鹽水溶液之一在第〇、14和28天免疫。在免疫前以及免疫后以2周的間隔對(duì) 小鼠采集血樣。在最后一次免疫后第14天將小鼠經(jīng)鼻內(nèi)用RSV(50μ1中IO6TCID5tl)攻毒。 在攻毒后每天對(duì)小鼠稱重。將數(shù)據(jù)表示為攻毒第〇天時(shí)基礎(chǔ)體重的百分率。5天后將小鼠 處死，測(cè)定肺泡灌洗液中的肺病毒滴度和白細(xì)胞浸潤(rùn)。
[0193] 表1.免疫組
[0194]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗呼吸道合胞病毒（RSV)感染的疫苗，其包含RSV抗原肽和編碼所述RSV抗原 肽的核酸，其中所述疫苗刺激iTreg細(xì)胞（CD4+、CD25-、FoxP3+、IL-10+)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述RSV抗原肽選自F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ ID NO :4 (優(yōu)化的氨基酸RSV G氨基酸序列）、SEQ ID NO :25 (優(yōu)化的氨基酸RSV F氨基酸序 列）及其功能片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述核酸為DNA并且所述DNA編碼選自以下的所 述RSV抗原肽：F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ ID NO :4 (優(yōu)化的氨基酸RSV G氨基酸序列）、SEQ ID NO :25 (優(yōu)化的氨基酸RSV F氨基酸序列）及其功能片段。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其中所述DNA存在于環(huán)形質(zhì)粒的線性表達(dá)盒中。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其中所述質(zhì)粒選自pVAX、pcDNA3. 0和proVAX。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其中所述質(zhì)粒還包含選自以下的啟動(dòng)子：CMV、SV40早 期啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒啟 動(dòng)子和多角體啟動(dòng)子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述核酸和抗原肽處于選自5 : 1和1 : 5、1 : 1 和2 : 1的質(zhì)量比。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗能夠電穿孔到有需要的受試者中。
9. 一種疫苗接種試劑盒，其包括疫苗施用裝置和根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述疫苗施用裝置選自疫苗槍、針和電穿孔裝 置。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中所述電穿孔裝置為微創(chuàng)電穿孔裝置。
12. -種用于預(yù)防或治療患者中的呼吸道合胞病毒感染的方法，所述方法包括向有需 要的受試者施用根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述受試者還受到保護(hù)免于發(fā)生呼吸道合胞病 毒攻毒后的氣道高反應(yīng)性（AHR)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述RSV抗原肽選自F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ ID NO :4 (優(yōu)化的氨基酸RSV G氨基酸序列）、SEQ ID NO :25 (優(yōu)化的氨基酸RSV F氨基酸 序列）及其功能片段。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述疫苗通過(guò)電穿孔而施用。
16. -種誘導(dǎo)抗呼吸道合胞病毒感染的中和抗體并抑制炎性T細(xì)胞的方法，所述方法 包括向有需要的受試者施用根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗。
17. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中抑制炎性T細(xì)胞包括誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞，并抑制自 身反應(yīng)性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述RSV抗原肽選自F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ ID N0:4(優(yōu)化的氨基酸RSV G氨基酸序列）、SEQ ID N0:25(優(yōu)化的氨，基酸RSV F氨基酸 序列）及其功能片段。
19. 一種治療或預(yù)防接受呼吸道合胞病毒（RSV)免疫的受試者中的疫苗誘發(fā)疾病的方 法，所述方法包括向有需要的受試者施用根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中將所述受試者在遭遇自然RSV感染前用福爾馬 林滅活RSV(FI-RSV)或RSV抗原免疫。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述RSV抗原肽選自F糖蛋白、G糖蛋白、SEQ IDN0:4(優(yōu)化的氨基酸RSVG氨基酸序列）、SEQIDN0 :25(優(yōu)化的氨，基酸RSVF氨基酸 序列）及其功能片段。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述疫苗經(jīng)由電穿孔而施用。
23. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述電穿孔途徑選自皮內(nèi)和肌內(nèi)。
24. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述疫苗通過(guò)微創(chuàng)電穿孔裝置進(jìn)行電穿孔。
【文檔編號(hào)】C12N15/45GK104302325SQ201280069412
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月10日
【發(fā)明者】王賓, 陳璇, 俞慶齡 申請(qǐng)人:北京艾棣維欣生物技術(shù)有限公司