具有用于定向交聯(lián)和固定化的熱點(diǎn)的生物活性蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及與天然蛋白相比具有持久穩(wěn)定性的新穎的生物活性的環(huán)突變蛋白，其具有位于遠(yuǎn)離活性中心處的用于定向固定化和交聯(lián)性能的熱點(diǎn)。本發(fā)明另外涉及遺傳工程改造所述生物活性蛋白的方法、以及根據(jù)本發(fā)明修飾的其它生物學(xué)材料。
【專利說明】具有用于定向交聯(lián)和固定化的熱點(diǎn)的生物活性蛋白

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及與天然蛋白相比具有持久穩(wěn)定性的新穎的生物活性的環(huán)突變蛋白。本發(fā)明的另一個方面是經(jīng)由定位環(huán)插入遺傳工程改造生物活性蛋白、特別是酶的方法。
[0002]更具體地，本發(fā)明涉及與天然蛋白相比具有持久穩(wěn)定性和活性的新穎的環(huán)突變蛋白、特別是酶，其具有位于活性中心遠(yuǎn)處的用于蛋白的定向固定化和交聯(lián)的熱點(diǎn)。該特定發(fā)明的另一個方面是經(jīng)由定位環(huán)插入遺傳工程改造這些蛋白、優(yōu)選酶的方法，所述方法用于建立用于定向固定化和交聯(lián)的熱點(diǎn)。

【背景技術(shù)】
[0003]酶是生物催化劑，并且由于它們的高活性、選擇性和特異性，它們被廣泛地用在工業(yè)過程中。在所有酶中，纖維素酶(降解纖維素的酶)正在變成對于生物技術(shù)和酶工程而言是非常重要的材料。這是因?yàn)槔w維素是地球上最豐富的聚合物。纖維素酶正在越來越多地被用于多種工業(yè)目的，因此，已經(jīng)將大量努力付諸它們的表達(dá)以及它們的定位誘變研究。
[0004]在最近的30年中，纖維素酶在工業(yè)過程中的應(yīng)用已經(jīng)增加至相當(dāng)大的量。纖維素酶被廣泛地用在紡織品工業(yè)中，特別是用于紡織品的生物精處理(b1polishing)以改善織物質(zhì)量，用于斜紋粗棉布服裝的酶洗(b1stoning)以得到流行的老化外觀。它們還被廣泛地用在飼料、食品工業(yè)中，用在紙漿和紙加工中，和用在洗衣店中。在最近的十年中，幾項(xiàng)研究聚焦于使用纖維素酶來轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素生物質(zhì)以產(chǎn)生生物燃料作為化石燃料的替代性可再生能源。
[0005]許多研究提議使用交聯(lián)劑來增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，但是它們似乎對活性具有不利的影響，因?yàn)樗鼈儼邢蛞部赡艽嬖谟诨钚灾行母浇哪承╊愋偷陌被?。已知與戊二醛等試劑交聯(lián)會通過限制酶的構(gòu)象柔性(由于與賴氨酸殘基的非特異性結(jié)合)而降低酶活性(Busto等人,1997 ；Domen 等人,1990)。
[0006]通常已知被固定化在支持物上的或交聯(lián)的酶和其它生物分子具有用作生物傳感器或生物催化劑的改善的性能。此外，可以將它們回收用于重復(fù)使用。但是，使用可用技術(shù)對生物分子的固定化高度依賴于生物分子的性能和固定化支持物或表面的性能。在大多數(shù)情況下，固定化或交聯(lián)會造成酶活性的下降或干擾生物分子的配體結(jié)合性能。大多數(shù)可用于交聯(lián)或固定化的方法不會實(shí)現(xiàn)定向結(jié)合。該事件是一個幾乎隨機(jī)的過程，其中可以從許多不同位點(diǎn)固定目標(biāo)蛋白，這會造成酶活性的下降。例如，許多研究提議使用交聯(lián)劑來增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，但是它們似乎對活性具有不利的影響，因?yàn)樗鼈儼邢蛞部赡艽嬖谟诨钚灾行母浇哪承╊愋偷陌被?Busto等人，1997 ；Rao等人，1998 ；Yuan等人，1999)。
[0007]定向固定化是當(dāng)前用于克服該生物活性降低的方法。用于固定化或交聯(lián)的蛋白取向的改變是有問題的，且通常是個案特異性的。在許多情況下，該想法被用于促進(jìn)從支持物向氧化還原生物傳感器中的酶的電子轉(zhuǎn)移(Ferapontova等人，2002)。為此目的，使用革巴酶上的半胱氨酸殘基將所述酶固定在含有二硫化物基團(tuán)或由金制成的支持物上。但是，該方法存在一個重大缺點(diǎn)。并非所有生物分子都含有游離半胱氨酸殘基或其位置允許生物分子的定向固定化的半胱氨酸殘基。美國專利申請?zhí)?009/0120809描述了一種硝基還原酶，其被修飾成包含多個摻入其結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸殘基，用于將所述酶定向固定化在貴金屬電極上。另外，有些研究通過將半胱氨酸殘基引入酶表面中解決了該問題(Ferapontova等人，2002 ； Gwen in 等人，2007 ；Kal Iwass 等人，1993 ；Kapp 等人，2006 ； Viswanath 等人，1998)。但是該方法的應(yīng)用限于不總是有利的二硫化物-硫醇互換化學(xué)。
[0008]另外，在一些情況下，使用定位誘變技術(shù)來直接地改變蛋白取向用于固定化。有些情況涉及定位交換的組氨酸殘基或His標(biāo)簽的應(yīng)用(Nakamura等人，2011 ；Porath等人，1975)。通常將這些固定在固定化的金屬螯合物(IMAC)或金支持物上(Andreescu等人，2001)。但是，該方法的一個重要缺點(diǎn)是，在添加競爭性的配體以后，固定化是可逆的(Jerker, 1992)。另外，經(jīng)常將His-標(biāo)簽添加至目標(biāo)蛋白的N-或C-末端，因此這可以限制要僅固定化至N-和C-末端上的蛋白的適當(dāng)取向。這會限制該方法在某些蛋白中的應(yīng)用，所述蛋白在從N或C-端固定化以后會正確地定向。
[0009]某些反應(yīng)基團(tuán)在蛋白表面上的富集，是指導(dǎo)生物分子的定向固定化的另一種方法。為此目的，Guisan等人在已經(jīng)富含Lys基團(tuán)的青霉素G酰化酶的表面上引入3個賴氨酸殘基(Abian等人，2004)。已經(jīng)證實(shí)，乙醛?；?瓊脂糖上的固定化速率增加了超過10倍，并且酶的熱穩(wěn)定性增加。Terreni等人設(shè)計(jì)了這樣的蛋白:其具有在相同酶的β鏈的C-端末端上與3個甘氨酸交替的3個賴氨酸的標(biāo)簽，所述標(biāo)簽也改善了在PGA上的固定化(Serra等人，2009)。后一種方法具有與使用His標(biāo)簽相同的缺點(diǎn)，因?yàn)樵摲椒ǖ膽?yīng)用限于某些蛋白。如果活性中心靠近蛋白的N或C-末端(在此處插入賴氨酸環(huán)，從而造成活性的下降)，本申請也可能具有缺點(diǎn)。
[0010]前述方法的組合也適用于文獻(xiàn)中。例如，PCT專利申請WO 03/044189描述了經(jīng)修飾的蛋白，即經(jīng)修飾的HIV-1衣殼蛋白p24，其由包含被稱作聚K的核苷酸片段(其編碼連續(xù)至少6個賴氨酸殘基)的核苷酸序列編碼，和第二種經(jīng)修飾的蛋白，其由包含被稱作聚H的核苷酸片段(其編碼連續(xù)至少6個組氨酸殘基)的核苷酸序列編碼。這些聚賴氨酸和聚組氨酸標(biāo)簽也位于蛋白的N-端或C-端。因此，如早前所述，該方法具有受限的應(yīng)用。
[0011]在本發(fā)明中，以位于遠(yuǎn)離蛋白的活性中心的方式插入氨基酸環(huán)，以便建立用于交聯(lián)和固定化的局部聞未和力點(diǎn)。
[0012]成功地改善了蛋白、優(yōu)選酶的操作穩(wěn)定性。在本發(fā)明中，生產(chǎn)了經(jīng)修飾的蛋白，其含有在用于定向固定化或交聯(lián)的表面上的熱點(diǎn)。為此目的，優(yōu)選地使用定位誘變將富含賴氨酸和甘氨酸的內(nèi)環(huán)(endo-loop)插入酶的表面中，以建立用于固定化和交聯(lián)的局部高親和力點(diǎn)。選擇的環(huán)位置是高度溶劑可接近的且柔性的位點(diǎn)，其位于遠(yuǎn)離活性中心處，以便不會干擾酶的活性。內(nèi)環(huán)向蛋白的插入是有問題的過程，因?yàn)椴迦氲男蛄锌赡芨蓴_目標(biāo)蛋白的合成、折疊途徑和總體結(jié)構(gòu)。實(shí)際上，在現(xiàn)有技術(shù)所報道的那些試驗(yàn)中，證實(shí)了內(nèi)環(huán)突變蛋白是邊緣功能性的或完全功能失調(diào)的(Amatore和Baneyx, 2003 ；Doi等人，1997 ；Doi等人，1998 ;Heinis等人，2006 ;Manoil和Bailey, 1997)。在與現(xiàn)有技術(shù)的驚人對比中，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的內(nèi)環(huán)突變體酶是完全功能性的，其含義是，這樣的突變體與野生型酶相比已經(jīng)保留所有生物活性。在許多情況下，還注意到與天然酶相比折疊狀態(tài)的持久穩(wěn)定性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]在本發(fā)明中，包括與天然蛋白相比具有持久穩(wěn)定性和活性的新穎環(huán)突變蛋白，其具有位于遠(yuǎn)離活性中心處的熱點(diǎn)，以便提供蛋白的定向固定化和交聯(lián)。
[0014]具體地，本發(fā)明涉及新穎的生物活性的突變蛋白，其包含對應(yīng)天然蛋白的所有必需三級結(jié)構(gòu)元件和至少一個表面暴露的非天然結(jié)構(gòu)元件，其特征在于，所述非天然結(jié)構(gòu)元件位于蛋白一級結(jié)構(gòu)內(nèi)并且形成表面暴露的肽環(huán)，所述肽環(huán)建立熱點(diǎn)以允許定向蛋白固定化和折疊的蛋白三級結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)穩(wěn)定性。
[0015]所述生物活性的突變蛋白包含對應(yīng)天然蛋白的所有必需三級結(jié)構(gòu)元件和至少一個表面暴露的非天然結(jié)構(gòu)元件，其特征在于，所述非天然結(jié)構(gòu)元件位于蛋白一級結(jié)構(gòu)內(nèi)并且形成表面暴露的肽環(huán)，所述肽環(huán)建立熱點(diǎn)以允許定向蛋白固定化和蛋白三級結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)穩(wěn)定性，其中所述天然蛋白優(yōu)選地選自包含酶、抗體、受體、抗體片段、結(jié)合蛋白和合成肽的蛋白。
[0016]該具體發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案是上述的新穎的生物活性的突變蛋白，其中所述突變蛋白優(yōu)選地是酶，且優(yōu)選纖維素酶，更優(yōu)選內(nèi)切葡聚糖酶(EGI)，最優(yōu)選從里氏木霉(Trichoderma reesei)提取的內(nèi)切葡聚糖酶。
[0017]本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案是生物活性的環(huán)突變蛋白，其建立熱點(diǎn)以允許定向蛋白固定化和蛋白三級結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)穩(wěn)定性，具有一個表面暴露的非天然結(jié)構(gòu)元件，其特征在于，所述非天然結(jié)構(gòu)元件位于蛋白一級結(jié)構(gòu)內(nèi)并且形成表面暴露的肽環(huán)，其特征在于，所述非天然結(jié)構(gòu)元件是包含至少5個且至多15個氨基酸、最優(yōu)選地包含10個氨基酸的氨基酸環(huán)。
[0018]本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案是生物活性的環(huán)突變蛋白，其具有一個表面暴露的非天然結(jié)構(gòu)元件，其特征在于，所述非天然結(jié)構(gòu)元件位于蛋白一級結(jié)構(gòu)內(nèi)并且形成表面暴露的肽環(huán)，這會建立熱點(diǎn)以允許定向蛋白固定化和蛋白三級結(jié)構(gòu)的持久穩(wěn)定性，其特征在于，所述非天然結(jié)構(gòu)元件是包含賴氨酸和甘氨酸氨基酸序列的環(huán)，且所述環(huán)優(yōu)選地包含交替的賴氨酸和甘氨酸氨基酸序列，最優(yōu)選被定義為KKGGKKKGGK的序列。
[0019]最優(yōu)選地，本文描述的突變體酶是從里氏木霉提取的內(nèi)切葡聚糖酶，其含有位于活性中心的幾乎180°的對側(cè)上的內(nèi)環(huán)；在高度溶劑可接近的區(qū)域中，且在距離活性中心殘基的Ca平均28人的第112個和第113個殘基之間的柔性區(qū)域中。
[0020]本發(fā)明的另一個方面是遺傳工程改造生物活性的突變蛋白的方法，所述方法的特征在于以下步驟:(1)沿著靶蛋白基因的外顯子區(qū)域限定位點(diǎn)，所述位點(diǎn)用于插入形成表面暴露的環(huán)的寡核苷酸，(2)限定DNA引物的序列，所述序列包含由所述形成環(huán)的寡核苷酸橋連的末端重疊端部，所述引物被設(shè)計(jì)成經(jīng)由所述重疊端部沿著所述選擇的插入位點(diǎn)的區(qū)域雜交，(3)化學(xué)合成DNA引物，所述DNA引物包含由所述形成環(huán)的寡核苷酸序列橋連的所述重疊端部，(4)應(yīng)用重疊PCR延伸技術(shù)，以制備在靶蛋白基因的外顯子的指定區(qū)域內(nèi)含有所述形成環(huán)的寡核苷酸序列的突變基因，(5)應(yīng)用適當(dāng)?shù)腄NA分離技術(shù)以純化所述突變基因，(6)表達(dá)所述突變基因，和(7)分離含有所述肽環(huán)的所述靶蛋白的突變體。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了寡核苷酸序列，其在基因表達(dá)水平被特別地設(shè)計(jì)以形成翻譯后肽環(huán)。更具體地，寡核苷酸代碼包含通過定位誘變通過添加賴氨酸和甘氨酸殘基的多個密碼子而修飾的內(nèi)切葡聚糖酶基因。優(yōu)選地，所述基因選自里氏木霉(QM9414)egll基因的密碼子優(yōu)化形式。密碼子優(yōu)化和修飾的里氏木霉(QM9414) egll基因的核苷酸序列作為SEQ NO I給出，且最優(yōu)選地，所述內(nèi)切葡聚糖酶基因由以下序列編碼:在SEQ NO I中描述的核酸序列，所述序列的反向補(bǔ)體，所述序列的補(bǔ)體，所述序列的反轉(zhuǎn)，或與前述序列中的任一個的核酸序列具有至少60%序列同一性的序列:
[0022]SEQ NO I:
[0023]>egll_L5_ 基因
[0024]gaattccagcaaccgggtacctctactccagaggttcacccaaagttgactacttacaagtgtactaagtccggtggttgtgttgctcaag acacttccgttgttttggactggaactacagatggatgcacgacgctaactacaactcctgtactgttaacggtggtgttaacactactttgtg tccagacgaggctacttgtggaaagaactgtttcatcgagggtgttgactatgctgcttccggtgttactacttctggttcctccttgactatg aaccagtacatgccatcttcctctggtggttactcttctgtttccccaagattgtacttgttggacaagaagggtaagaagaagggtaagaaa tccgacggtgaatacgttatgttgaagttgaacggtcaagagttgtctttcgacgttgacttgtccgctttgccatgtggtgaaaacggttcct tgtacttgtctcagatggacgaaaatggtggtgctaaccagtacaatactgctggtgctaactacggttctggttactgtgatgctcagtgtcc agttcagacttggagaaacggtactttgaacacttcccaccagggattctgttgtaacgagatggacatcttggagggaaattccagagctaac gctttgactccacactcttgtactgctactgcttgtgactctgctggttgtggttttaacccatacggttccggttacaagtcttactacggtc caggtgacactgttgacacttccaagactttcactatcatcactcagttcaacactgacaacggttctccatccggtaacttggtttccatcac tagaaagtaccagcagaacggtgttgatattccatctgctcaaccaggtggtgacactatttcctcttgtccatccgcttcagcttatggtgga ttggctactatgggaaaggctttgtcctctggaatggttttggttttctccatctggaacgacaactcccaatacatgaactggttggactctg gtaatgctggtccatgttcttctactgagggtaacccatccaacatcttggctaacaacccaaacactcacgttgttttctccaacatcagatg gggtgacattggttccactacaaactctactgctccaccaccaccacctgcttcctctactactttctccactactagaagatcctccactact tcttcctctccatcctgtactcaaactcactggggacaatgtggtggtattggttactccggttgtaagacttgtacttccggtactacttg tc agtactccaacgactactactcgcaatgccttgctctaga
[0025]預(yù)見到與SEQ NO I具有大于80%、優(yōu)選地超過85%、更優(yōu)選地超過90%和最優(yōu)選地超過95%的同一性的核苷酸序列修飾。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含:內(nèi)切葡聚糖酶基因的啟動子或表達(dá)；賴氨酸和甘氨酸殘基的多個密碼子；和內(nèi)切葡聚糖酶基因的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述內(nèi)切葡聚糖酶啟動子是得自pPicz a A質(zhì)粒的AOXl啟動子,且更優(yōu)選地,所述構(gòu)建體包含pPicz a A質(zhì)粒。

【具體實(shí)施方式】
[0027]在該詳細(xì)描述中，為了例證本發(fā)明，提供了關(guān)于“具有用于定向交聯(lián)和固定化的熱點(diǎn)的生物活性蛋白”的優(yōu)選實(shí)施方案，所述實(shí)施方案無意限制在所附權(quán)利要求中定義的范圍。
[0028]在該特定發(fā)明中，描述了與天然蛋白相比具有持久穩(wěn)定性的新穎的生物活性的環(huán)突變蛋白，其具有位于遠(yuǎn)離活性中心處的用于蛋白的定向固定化和交聯(lián)的熱點(diǎn)。
[0029]該特定發(fā)明的另一個方面是通過定位環(huán)插入遺傳工程改造這些蛋白、優(yōu)選酶的方法，所述環(huán)用于建立用于定向固定化和交聯(lián)的熱點(diǎn)。
[0030]在該特定發(fā)明中描述的蛋白選自這樣的蛋白:其為任意重組突變蛋白，包括酶、抗體、受體、抗體片段、結(jié)合蛋白和合成肽。
[0031]本文中使用的“活性中心”可以表示帶有催化基團(tuán)和底物結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域。
[0032]本文中使用的“酶”可以表示，催化分子底物向分子產(chǎn)物的特異性轉(zhuǎn)化的多肽。
[0033]生物活性的突變蛋白表示保留天然蛋白的功能作用的帶有內(nèi)環(huán)的突變蛋白。保留(除了工程環(huán)以外)天然蛋白的總體三維結(jié)構(gòu)的突變蛋白被稱作包含天然蛋白的所有必需三級結(jié)構(gòu)元件。
[0034]本文中使用的術(shù)語“突變體酶”是與天然酶相差一個或多個由突變造成的特征的酶。本文中使用的術(shù)語“突變”是基因或染色體的核苷酸序列的永久性的遺傳變化。本文中使用的術(shù)語“天然酶”可以與“野生型酶”互換使用，并且是在細(xì)胞內(nèi)處于它的天然狀態(tài)且未被變性劑(諸如熱、化學(xué)物質(zhì)、酶作用或提取的苛刻條件)改變的酶。
[0035]本文中使用的“內(nèi)環(huán)”表示包含短肽的形成環(huán)的結(jié)構(gòu)元件，其特異性地位于折疊的突變蛋白的表面且暴露于水。
[0036]如本文中所述的術(shù)語“非天然結(jié)構(gòu)元件”是在對應(yīng)天然蛋白中不存在的結(jié)構(gòu)。鑒于所述非天然肽環(huán)在天然蛋白中不存在，必須使用遺傳修飾技術(shù)將它的寡核苷酸序列工程改造成靶蛋白基因，從而在蛋白表達(dá)以后產(chǎn)生期望的突變蛋白。在表達(dá)的突變蛋白中，內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)反映了特定形成環(huán)的肽向天然蛋白的基本序列的內(nèi)型添加。
[0037]“內(nèi)型添加”在本文中表示，在N和C端氨基酸殘基之間的合適點(diǎn)處將所述肽摻入天然基本序列中。所述合適點(diǎn)表示位于天然折疊蛋白的表面上的、沿著天然蛋白基本序列的任意區(qū)域。肽的摻入表示工程改造突變蛋白基本序列NX-PP-YC的作用，所述基本序列NX-PP-YC含有位于天然蛋白基本序列NXYC內(nèi)的所述肽PP。
[0038]N和C在本文中表示基本序列的N和C末端，且X和Y描述了就摻入位點(diǎn)而言位于N和C端的一個或多個氨基酸殘基。因此，突變蛋白可以視作包含整個野生型序列的多肽序列，僅僅在某個非末端點(diǎn)處延伸額外的形成環(huán)的肽的短塊。
[0039]如本文中所述的蛋白的“持久穩(wěn)定性”表示折疊的蛋白對抗變性的持久熱穩(wěn)定性以及折疊的蛋白對抗變性劑變性的持久穩(wěn)定性。術(shù)語”變性”表示解折疊的過程。取決于條件，變性可以是可逆的或不可逆的。進(jìn)行至較高溫度可以起使蛋白變性的作用，即，熱變性。變性劑還可以是尿素、鹽酸胍、表面活性劑、PH極端條件和有機(jī)溶劑。該術(shù)語也描述了在相同條件下作為天然蛋白起作用的穩(wěn)定折疊的功能蛋白。通過使用術(shù)語“條件”，應(yīng)當(dāng)理解，這些條件是生物學(xué)工作條件諸如pH和溫度。
[0040]本文中使用的“定向蛋白固定化”可以表示從預(yù)選擇位點(diǎn)改變蛋白，以能夠通過共價力或非共價力將蛋白連接至表面。
[0041]本文中使用的術(shù)語“熱點(diǎn)”可以表示蛋白內(nèi)具有強(qiáng)固定化親和力的區(qū)域。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了分離的核酸序列，其包含通過定位誘變通過添加賴氨酸和甘氨酸殘基的多個密碼子而修飾的內(nèi)切葡聚糖酶基因。優(yōu)選地，所述基因選自里氏木霉(QM9414)egll基因的密碼子優(yōu)化形式。密碼子優(yōu)化的里氏木霉(QM9414) egll基因的核苷酸序列作為SEQ NO I給出，且最優(yōu)選地，所述內(nèi)切葡聚糖酶基因由在SEQ NO I中描述的核酸序列編碼。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包含:內(nèi)切葡聚糖酶基因的啟動子或表達(dá)；賴氨酸和甘氨酸殘基的多個密碼子；和內(nèi)切葡聚糖酶基因的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述內(nèi)切葡聚糖酶啟動子是得自pPicz a A質(zhì)粒的AOXl啟動子,且最優(yōu)選地,所述構(gòu)建體包含pPicz a A質(zhì)粒。
[0044]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本文描述的寡核苷酸序列的特征在于，它包含用于經(jīng)由定位誘變而插入表面暴露的內(nèi)環(huán)序列的插入位點(diǎn)，且優(yōu)選地，所述插入位點(diǎn)是折疊的蛋白中編碼遠(yuǎn)離活性中心的氨基酸的任意位點(diǎn)。
[0045]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸序列，其中插入位點(diǎn)位于現(xiàn)有環(huán)內(nèi)的活性中心的幾乎180°的對側(cè)上，且更優(yōu)選地，插入位點(diǎn)位于現(xiàn)有環(huán)區(qū)域內(nèi)的高度溶劑可接近的且柔性的區(qū)域。最優(yōu)選地，插入位點(diǎn)位于第345個和第346個堿基之間。
[0046]寡核苷酸序列的特征在于，它包含使用重疊PCR延伸方法通過定位誘變引入的表面暴露的內(nèi)環(huán)序列。通過該方法，初步PCR會產(chǎn)生重疊基因區(qū)段，然后將其用作另一個PCR的模板DNA以建立全長產(chǎn)物。
[0047]因此，寡核苷酸序列的特征在于，它包含使用重疊PCR延伸方法通過定位誘變引入的表面暴露的內(nèi)環(huán)序列。通常應(yīng)用4種引物和優(yōu)選的3個PCR反應(yīng)循環(huán)。
[0048]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸序列的特征在于，它包含使用重疊PCR延伸方法通過定位誘變引入的表面暴露的內(nèi)環(huán)序列，所述重疊PCR延伸方法使用4種引物和優(yōu)選的3個PCR反應(yīng)循環(huán)，且最優(yōu)選地，引物 1(5’ CCG GAATT CCAGCAACCGGGTACCAGCACC3’)與 egll 基因的 5’ 末端互補(bǔ)且含有EcoRI限制性酶切割位點(diǎn)(顯示為粗體字母且標(biāo)有下劃線)；引物2(5，ACCTTTCTTACCC TTCTTCTTACCCT TCTT GTCCAAGTACAATCTTG3’ )與
egll基因的在第329個和第345個堿基之間的17個核苷酸互補(bǔ)且含有編碼KKGGKKKGGK的表面暴露的內(nèi)環(huán)插入序列(5，ACCTTTCTTACCCTTCTTCTTACCCTTCTT3’ )(顯示為粗體字母且標(biāo)有下劃線);引物 3(5’ AAGAAGGGTAAGAAGAAGGGTA AGAAAGGT
TCCGACGGTGAATACGGT3’ )與egll基因的在第346個和第364個堿基之間的18個核苷酸互補(bǔ)且含有編碼KKGGKKKGGK的表面暴露的內(nèi)環(huán)插入序列(5’ AAGAAGGGTAAGAAGAAGGGTAA
GAAAGGT3’)(顯示為粗體字母且標(biāo)有下劃線)；引物4 (5’ CCG TCTAGAGCAAGGCATTGCGAGTAGTAG3’ )與egll基因的3’末端互補(bǔ)且含有XbaI限制性酶切割位點(diǎn)(顯示為粗體字母且標(biāo)有下劃線)。
[0049]在基因水平，形成表面暴露的環(huán)的寡核苷酸表示這樣的寡核苷酸序列:其被設(shè)計(jì)成，在表達(dá)以后，形成位于突變蛋白的水可接近的表面處的肽環(huán)結(jié)構(gòu)。所述寡核苷酸必須沿著野生型外顯子在適當(dāng)位點(diǎn)處經(jīng)過遺傳工程改造。為遺傳操作選擇的位點(diǎn)必須是這樣的位點(diǎn):其在突變基因表達(dá)以后產(chǎn)生天然樣蛋白結(jié)構(gòu)。天然樣蛋白結(jié)構(gòu)表示這樣的三級(總體)結(jié)構(gòu):其帶有天然蛋白的所有必需結(jié)構(gòu)元件以及一個(或可能多個)額外的位于表面上的內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。簡言之，為遺傳操作選擇的位點(diǎn)必須不會干擾正常的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后加工事件，且它必須允許蛋白折疊遵循天然途徑，從而產(chǎn)生具有天然樣結(jié)構(gòu)和一個(或可能多個)額外環(huán)的突變蛋白?！安迦搿焙汀拔稽c(diǎn)”的概念與最初的使用限制性酶和連接酶的工作相一致，由此沿著DNA的位點(diǎn)被完全切掉，插入額外DNA片段，并連接所述片段。就采用重疊PCR延伸技術(shù)的發(fā)明而言，寡核苷酸再次似乎在特定位點(diǎn)插入天然外顯子中，因此導(dǎo)致這樣的術(shù)語的應(yīng)用。但是，實(shí)現(xiàn)這樣的變化的機(jī)制是完全不同的，并且依賴于DNA聚合酶和適當(dāng)?shù)剡x擇的DNA引物的應(yīng)用。因此，術(shù)語諸如“位點(diǎn)”和“插入”在本發(fā)明中的應(yīng)用限于重疊PCR延伸技術(shù)的范圍和背景。
[0050]本文中使用的術(shù)語“重疊PCR延伸”可以表示這樣的方法:其允許使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)且不使用限制性內(nèi)切核酸酶或T4 DNA連接酶，將寡核苷酸序列插入選擇的寡核苷酸序列中。最初PCR會產(chǎn)生重疊基因區(qū)段，所述基因區(qū)段然后被用作另一個PCR的模板DNA以建立全長產(chǎn)物。內(nèi)部引物在中間區(qū)段上產(chǎn)生重疊的、互補(bǔ)的3'末端，并引入核苷酸置換、插入或缺失(用于定位誘變或用于基因剪接)，編碼在鄰接基因區(qū)段的連接部處發(fā)現(xiàn)的核苷酸。這些中間產(chǎn)物的重疊鏈在隨后PCR中在該Y區(qū)域處雜交，并被延伸以產(chǎn)生通過側(cè)接引物擴(kuò)增的全長產(chǎn)物，所述全長產(chǎn)物可以包括限制性酶位點(diǎn)用于將所述產(chǎn)物插入用于克隆目的的表達(dá)載體中。
[0051]本文中使用的“外顯子”可以表示，在已經(jīng)通過剪接除去前體RNA的內(nèi)含子以后，由RNA分子的成熟形式表示的核酸序列(DNA或RNA)。成熟的RNA分子可以是信使RNA或非編碼RNA (諸如rRNA或tRNA)的功能形式。
[0052]本文中使用的術(shù)語“基因表達(dá)”可以表示，將來自基因的信息用于合成功能性基因產(chǎn)物的過程。這些產(chǎn)物經(jīng)常是蛋白。
[0053]本文中使用的術(shù)語“雜交”可以表示一個核酸與另一個核酸的互補(bǔ)堿基配對相互作用，其導(dǎo)致雙鏈體、三鏈體或其它高階結(jié)構(gòu)的形成，并且在本文中與“退火”可互換地使用。
[0054]本文中使用的“重疊末端”可以表示這樣的寡核苷酸序列:其彼此互補(bǔ)，并且位于寡核苷酸序列的5’或3’末端處。這些寡核苷酸序列在5’或3’末端處包含與插入環(huán)區(qū)段對應(yīng)的插入序列。
[0055]因此，通過使用術(shù)語“至少60%同一性”，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不僅包括具體的示例性核苷酸序列的應(yīng)用。也預(yù)見到對所述序列的修飾，諸如在序列中的缺失、插入或置換，其:
[0056]a)產(chǎn)生“沉默”變化，其不會實(shí)質(zhì)上影響蛋白分子的功能性能。例如，預(yù)見到反映遺傳密碼的簡并性或?qū)е略诮o定位點(diǎn)處產(chǎn)生化學(xué)等效氨基酸的核苷酸序列改變，或者
[0057]b)促進(jìn)活性的改善或底物特異性的修飾。
[0058]本文中使用的術(shù)語“密碼子”是一組3個鄰近的核苷酸，也稱為三聯(lián)體，其規(guī)定用于蛋白合成的氨基酸的類型和順序。如本文中所述的術(shù)語“啟動子”是促進(jìn)特定基因的轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。
[0059]里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶I基因是用于定位誘變的模板。通過定位誘變將環(huán)插入該基因中。插入內(nèi)切葡聚糖酶I基因中的環(huán)是用于產(chǎn)生插入環(huán)的內(nèi)切葡聚糖酶I蛋白的突變基因。在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中重組地表達(dá)該基因。插入環(huán)的內(nèi)切葡聚糖酶I蛋白是將用于定向固定化或交聯(lián)研究的產(chǎn)物。
[0060]在該具體發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，將4種不同的10個氨基酸的長環(huán)(由賴氨酸和甘氨酸殘基組成)引入內(nèi)切葡聚糖酶I (EGI)中，即里氏木霉的主要內(nèi)切葡聚糖酶。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)EGI_L5是最穩(wěn)定的環(huán)突變體酶。成功地在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)和純化突變體內(nèi)切葡聚糖酶I (EGI_L5)和天然內(nèi)切葡聚糖酶I (EGI)。分析了故意突變對酶的穩(wěn)定性和活性的影響。
[0061]材料和方法
[0062]微牛物、酶和化學(xué)物質(zhì):
[0063]使用大腸桿菌(Escherichia coli)ToplOF作為用于擴(kuò)增載體和亞克隆的宿主。將巴斯德畢赤酵母 KM71H(aoxl:ARG4, arg4) (Invitrogen, San Diego, USA)用于重組蛋白表達(dá)。將pPICZ a A載體(Invitrogen, San Diego, USA)用于克隆和蛋白表達(dá)。pPICZ a A質(zhì)粒含有用于克隆的基因產(chǎn)物的細(xì)胞外分泌的α因子分泌信號、用于在大腸桿菌中選擇的Zeocin抗性基因、用于克隆的基因的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的醇氧化酶(AOX)啟動子。將Pfu聚合酶和Rapid Ligat1n Kit (Fermentas)用于克隆目的。將Taq聚合酶(Qiagen)用于菌落PCR0所有包含的化學(xué)物質(zhì)都是分析級。
[0064]蛋白測定:使用BCA蛋白測定試劑 (Pierce)確定蛋白濃度。將牛血清白蛋白用作蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
[0065]酶測定:一式三份地進(jìn)行所有CMC活性測定，具有低于10%的標(biāo)準(zhǔn)差。一式兩份地或一式三份地進(jìn)行所有4-MUC活性測定，具有低于10%的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0066]提供下述實(shí)施例來例證本發(fā)明，且無意限制本發(fā)明的范圍。
[0067]實(shí)施例1:
[0068]內(nèi)切葡聚糖酶的定位誘變:
[0069]應(yīng)用重疊PCR延伸方法來引入環(huán)突變。根據(jù)文獻(xiàn)(Vallejo等人，1994)，設(shè)計(jì)重疊 PCR 延伸引物(正向 egll:5’ CCGGAATTCCAGCAACCGGGTAC CAGCACC3’，反向 egll:5’ CCGTCTAGAGCAAGGCATTGCGAGTAGTA G3’，正向重疊延伸引物:5’ AAGAAGGGTAAGAAGAAGGGTAAGAAAGGTTCCGACGGTGAATAC GGT3 '反向重疊延伸引物:5 ’ ACCTTTCTTACCCTTCTTCTTACCCTTCTTGTCCAAGTACAATCTTG3’)。將環(huán)突變引入在第112個和第113個氨基酸之間。通過測序來證實(shí)構(gòu)建體的保真度。
[0070]實(shí)施例2:
[0071]egll和經(jīng)修飾的egll (egll_L5)基因的克隆
[0072]從GeneART得到在每個臂上攜帶EcoRI和XbaI限制位點(diǎn)的密碼子優(yōu)化的(用于巴斯德畢赤酵母)內(nèi)切葡聚糖酶I合成基因(egll)。合成基因的蛋白序列與里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I (GenBank登記號M15665)相同。將EcoRI和XbaI位點(diǎn)添加至基因側(cè)接區(qū)域。將合成基因用EcoRI和XbaI消化，并使用Rapid Ligat1n Kit (Fermentas)重新連接進(jìn)pPicz a A載體的EcoR1-XbaI位點(diǎn)中。將egll亞克隆進(jìn)大腸桿菌ToplOF細(xì)胞中。在有25 μ g/ml zeocin存在下在低鹽LB平板上培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞。選擇Zeocin陽性的菌落，放入 PCR 試管中，并用 5 ’ AOX (5' -GACTGGTTCCAATTG ACAAGC-3')和 3 ’ AOX (5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3/ )引物進(jìn)行菌落PCR作為正常PCR反應(yīng)，但是在95°C進(jìn)行主要變性步驟10分鐘而不是5分鐘。選擇菌落PCR陽性菌落,并使用MiniPrep Kit (Qiagen)分離重組質(zhì)粒。
[0073]實(shí)施例3:
[0074]突變體酶的轉(zhuǎn)化和篩選:
[0075]在轉(zhuǎn)化之前，將重組質(zhì)粒pPICz a A_egll用SacI線性化。該過程導(dǎo)致線性化的載體的一個或多個拷貝通過同源重組穩(wěn)定整合進(jìn)巴斯德畢赤酵母KM71H的5’ AOXl染色體基因座中。所有得到的轉(zhuǎn)化體是突變體(緩慢利用甲醇的表型)。根據(jù)組合化學(xué)轉(zhuǎn)化和電穿孔的方法(Wu和Letchworth, 2004)，制備感受態(tài)巴斯德畢赤酵母KM71H細(xì)胞。將約I μ g線性化的重組質(zhì)粒與感受態(tài)KM71H細(xì)胞混合。立即將混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的0.2cm電穿孔比色皿中并在冰上孵育5分鐘。在電穿孔以后，立即將約Iml冰冷的IM山梨醇加入比色皿中。充電電壓、電容和電阻分別是1.5kV、25F和200。將轉(zhuǎn)化混合物鋪展在含有100 μ g/mlzeocin的YPD平板上。將平板在30°C孵育,直到菌落出現(xiàn)和生長(約3天)。選擇Zeocin陽性的菌落，放入PCR試管中，將所述試管微波處理并立即放在冰水浴上，并向每個試管加入10 μ I冷ddH20，將I μ I該細(xì)胞混合物用作菌落PCR的模板。使用5’ AOX和3’ AOX引物進(jìn)行菌落PCR。選擇菌落PCR陽性的菌落。
[0076]在含有藍(lán)色偶氮基羧甲纖維素(Azo-CMC) (0.25% w/v)作為底物的緩沖的最低甲醇瓊脂(Buffered Minimal Methanol Agar, BMM-瓊脂)平板(10mM憐酸鉀，pH6.0, 1.34%YNB，4X 10-5%生物素，0.5%甲醇)上選擇多拷貝轉(zhuǎn)化體。根據(jù)在菌落周圍的透明地帶的相對半徑，選擇更有活性的表達(dá)酶的轉(zhuǎn)化體。當(dāng)所述酶有活性時，它會降解Azo-CMC，并作為酶促水解的結(jié)果而在菌落周圍產(chǎn)生透明地帶。
[0077]實(shí)施例4:
[0078]重組巴斯德畢赤酵母菌株的小規(guī)模表達(dá):
[0079]將生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶I和它的環(huán)突變體的巴斯德畢赤酵母重組菌落接種進(jìn)50mLBMG培養(yǎng)基(10mM磷酸鉀，pH6.0, 1.34% YNB，4 X 10-5%生物素和I %甘油)中，并在250ml帶有擋板的搖瓶中在30°C培養(yǎng)(250rpm)過夜。當(dāng)0D600達(dá)到10單位/ml時，通過離心(3000 Xg, 5min)來收集細(xì)胞。以30單位/ml的起始0D600，將細(xì)胞沉淀物再懸浮于BMM培養(yǎng)基(含有0.5% (w/v)甲醇以替代I %甘油的BMG)中。將培養(yǎng)物在30°C培養(yǎng)約120小時。每24小時加入甲醇至10g/L的終濃度。每24小時收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。
[0080]實(shí)施例5
[0081]—般發(fā)酵方法:
[0082]對EGI克隆E12和EGI_L5克隆D5進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。在發(fā)酵的第二部分中，加入甘油以促進(jìn)重組巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物的生長。在發(fā)酵過程中的不同時間點(diǎn)收集發(fā)酵產(chǎn)物，并針對在不同時間點(diǎn)收集的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和活性分析。克隆的生長速率以后，測量并計(jì)算在不同時間點(diǎn)收集的每個樣品的細(xì)胞干量(CDW)。對于每個樣品，根據(jù)每分鐘的4-MU形成速率(mM)，評價針對4-MUC的活性。使用在發(fā)酵罐內(nèi)的特異性甲醇探針，監(jiān)測在每個發(fā)酵時間點(diǎn)的甲醇濃度。生產(chǎn)EGI和EGI_L5的克隆的發(fā)酵數(shù)據(jù)分析指示，發(fā)現(xiàn)EGI和EGI_L5在補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中生長速率和表達(dá)譜是非常類似的。發(fā)現(xiàn)酶活性和酶產(chǎn)量隨著甲醇濃度增加而增加。
[0083]如預(yù)期的，在兩種發(fā)酵的甘油分批和甘油補(bǔ)料分批階段中沒有產(chǎn)生酶。在用甲醇誘導(dǎo)AOX啟動子24小時以后開始產(chǎn)生EGI，在20小時以后開始產(chǎn)生EGI_L5。在甲醇補(bǔ)料分批階段中，細(xì)胞生長是最低的。每種生產(chǎn)的重組酶的活性在發(fā)酵結(jié)束時是最大的。
[0084]實(shí)施例6:
[0085]重組巴斯德畢赤酵母菌株的生物反應(yīng)器培養(yǎng):
[0086]以2L的起始體積，以18ml/h/L甘油和l_12ml/h/L甲醇的補(bǔ)料速率，在7.5L發(fā)酵罐(B1FlollO, New Brunswick Scientific)中在28°C和pH5培養(yǎng)攜帶內(nèi)切葡聚糖酶I和它的環(huán)突變體的巴斯德畢赤酵母克隆。與PTMl痕量金屬溶液一起使用Invitrogen Corp.的發(fā)酵培養(yǎng)基處方進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。在發(fā)酵的甘油分批和甘油補(bǔ)料分批階段中，使用甘油作為唯一碳源。在發(fā)酵的甲醇補(bǔ)料分批階段中，使用甲醇作為AOX啟動子的誘導(dǎo)物。使用特異性的甲醇探針(Raven B1tech)，監(jiān)測甲醇水平。將發(fā)酵產(chǎn)物過濾，緩沖液更換，并使用 Sartocon Micro 和 Ultrafiltrat1n System(Sartorius-Stedim)濃縮。使用具有 0.45微米截止值的Sartocon Slice200HydroSart膜以及具有10kDa和1kDa截止值的聚醚砜(PES)膜。
[0087]實(shí)施例7:
[0088]SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、酶譜分析和使用胰蛋白酶的限制蛋白酶解:
[0089]使用酶譜凝膠分析，定性地監(jiān)測生產(chǎn)的重組酶的活性。將4-MUC用作分析的底物。發(fā)現(xiàn)在巴斯德畢赤酵母中重組地生產(chǎn)的EGI具有超過一個對4-MUC具有活性的蛋白帶(50、70和10kDa)。認(rèn)為這些是不同的糖基化(70kDa)和/或二聚化產(chǎn)物(10kDa)。胰蛋白酶對EGI蛋白的限制蛋白酶解已經(jīng)指示，50kDa產(chǎn)物作為蛋白水解性降解的結(jié)果存在。EGI_L5在酶譜分析中表現(xiàn)出對4-MUC的更低活性。還發(fā)現(xiàn)它具有超過一種酶促活性成分(其中約10kDa產(chǎn)物是優(yōu)勢產(chǎn)物)和一種可能的糖基化產(chǎn)物(約70kDa)。發(fā)現(xiàn)兩種形式都對4-MUC有活性。
[0090]用5% (w/v)積層凝膠和12% (w/v)分離凝膠,將收集的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液在SDS-PAGE凝膠上泳動。將約15-20μ I上清液加載進(jìn)凝膠的每個孔中。電泳以后，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。對于酶譜分析，進(jìn)行天然SDS-PAGE。將凝膠用2.5% (v/v)TritonX-100-50mM醋酸鈉溶液(pH4.8)洗滌3次各10分鐘。然后，將凝膠用50mM醋酸鈉緩沖液(pH4.8)洗滌3次各10分鐘。使用4-MUC (4-甲基傘形基β -D-纖維二糖糖苷)作為底物進(jìn)行酶譜分析。在酶譜分析中使用Iml0.5mg/ml的4-MUC在50mM醋酸鈉緩沖液(pH4.8)中的溶液。在紫外線下顯影并記錄酶活性。酶譜分析以后，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。使用Gel-Doc(B1Rad)記錄所有凝膠照片。使用蛋白組學(xué)級胰蛋白酶(Sigma),在純化的EGI蛋白上進(jìn)行限制蛋白酶解。將胰蛋白酶溶解在50mM乙酸中至0.02 μ g/ μ I的終濃度。將0.02 μ g/μ I胰蛋白酶加入在50mM碳酸氫銨緩沖液(pH7.8)中的EGI酶中，使得樣品中的胰蛋白酶:蛋白的比率為l:50(w/w)。將消化反應(yīng)物在37°C孵育75分鐘，并在不同時間點(diǎn)(0-5-10-15-30-45-60-75分鐘)收集樣品。通過取出樣品的等分試樣并使樣品在SDS-PAGE凝膠上泳動，監(jiān)測蛋白消化的程度。
[0091]實(shí)施例8:
[0092]重組蛋白的純化:
[0093]在用RAC分批親和純化以后，將兩種酶純化至同質(zhì)性。從EGI粗制蛋白溶液中純化2個約70和10kDa的蛋白帶，并用RAC從EGI_L5粗制蛋白溶液純化僅一種約70kDa的糖基化形式。在EGI和EGI_L5的其它糖基化產(chǎn)物中，純化的組分是最有活性的產(chǎn)物。
[0094]使用再生的無定形纖維素(RAC)作為親和色譜基質(zhì)，純化EGI和EGI_L5。得到兩種酶的分批親和純化。將Avicel Phl05用于合成再生的無定形纖維素。在室溫進(jìn)行純化。用乙二醇洗脫重組纖維素酶，并用50mM醋酸鈉緩沖液(pH5)通過穿過1kDa截止值Vivaspin500膜旋轉(zhuǎn)過濾器(Sartorius-Stedim)的超濾進(jìn)一步除去和交換乙二醇(由于它對BCA蛋白測定的干擾)。
[0095]實(shí)施例9
[0096]證實(shí)溫度對酶活性的影響的實(shí)驗(yàn)
[0097]通過3，5- 二硝基水楊酸(DNS)方法，在50mM醋酸鈉緩沖液(pH4.8)中確定每種酶在不同溫度(15°C -95°C )對0.5% CMC (w/v)的活性(Ghose，1987)。將每種酶和底物峰在每種測定溫度預(yù)孵育5分鐘。將酶和底物在測定溫度孵育10分鐘。在550nm測量產(chǎn)生的還原糖。將葡萄糖用作標(biāo)準(zhǔn)品，并根據(jù)IUPAC方法將酶活性計(jì)算為CMC單位/ml，用于測量纖維素酶活性(Ghose，1987)。通過將酶在確定的溫度的最大活性作為100%，計(jì)算殘余酶活性。
[0098]使用DNS方法和作為底物的0.5% CMC (w/v)，確定通過發(fā)酵產(chǎn)生的EGI和EGI_L5的溫度活性譜。兩種重組酶在不同溫度的活性表現(xiàn)出類似的譜。EGI在45°C和55°C表現(xiàn)出最大活性，而發(fā)現(xiàn)EGI_L5在35°C具有最大活性。兩種酶在寬溫度范圍(15°C至65°C)內(nèi)表現(xiàn)出活性。盡管EGI_L5在55 °C具有與EGI相比降低的活性，它在65 °C、75 °C和85 °C表現(xiàn)出稍微更高的相對酶活性。兩種酶在75°C保持它們的活性的約40%，且在85°C保持它們的活性的30%。
[0099]實(shí)施例10
[0100]證實(shí)pH對酶活性的影響的實(shí)驗(yàn)
[0101]使用3，5- 二硝基水楊酸(DNS)方法，在55°C在不同的pH緩沖液中確定每種酶在不同pH(pH3-6)對0.5% CMC (w/v)的活性10分鐘。將pH3的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(10mM檸檬酸，200mM Na2HPO4)、pH4和pH5的50mM醋酸鈉緩沖液、pH6的50mM磷酸鈉緩沖液用于確定PH對酶活性的影響。在550nm測量產(chǎn)生的還原糖。將葡萄糖用作標(biāo)準(zhǔn)品。通過將酶在確定的pH的最大活性作為100%，計(jì)算殘余酶活性。
[0102]兩種酶都在pH5表現(xiàn)出最大活性。觀察到兩種酶的pH活性譜遵循非常類似的譜。發(fā)現(xiàn)酶在PH3是幾乎無活性的。發(fā)現(xiàn)EGI和EGI_L5酶對可溶性的底物4-MUC表現(xiàn)出Michaelis-Menten類型的動力學(xué)。確定了在45°C的動力學(xué)常數(shù)(Km和kcat)。發(fā)現(xiàn)EGI和EGI_L5的Km值分別為0.47mM和0.54mM。盡管Km值是類似的，EGI和EGI_L5kcat值存在顯著差異。發(fā)現(xiàn)EGI具有0.013秒―1的kcat值，而EGI_L5已經(jīng)表現(xiàn)出0.004秒―1的kcat值。
[0103]實(shí)施例U
[0104]4-MUC 測定
[0105]根據(jù)(Chernoglazov等人，1989),進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物的4-MUC測定。將發(fā)酵樣品在50mM醋酸鈉緩沖液(pH4.8)中與0.5mg/ml4-MUC 一起孵育。在45°C進(jìn)行動力學(xué)分析30分鐘。將4-甲基傘形酮(4-MU)用作標(biāo)準(zhǔn)品。用熒光分光光度計(jì)測量釋放的4-MU，在363nm激發(fā)和在435nm發(fā)射。將酶活性計(jì)算為每分鐘釋放的RFU或每分鐘釋放的4_MU(mM)。在45°C在50mM醋酸鈉緩沖液(pH4.8)中確定EGI和EGI_L5蛋白針對4-MUC的動力學(xué)常數(shù)(kcat和Km)。將6種不同底物濃度(50-2000 μ M)用于動力學(xué)測定。在測定中，將酶濃度保持在0.3 μ Μ。一式兩份地進(jìn)行所有測量。通過用OriginP1的程序?qū)⒆畛醯乃俾蕯?shù)據(jù)擬合至Michaelis-Menten方程式,計(jì)算動力學(xué)常數(shù)Km和kcat。
[0106]實(shí)施例12
[0107]穩(wěn)定性測定
[0108] 首先用約0.4mg/ml的每種酶在100°C孵育10分鐘，確定酶穩(wěn)定性。然后將酶在冰上冷卻10分鐘。對100°C孵育的和未孵育的酶樣品(在55°C和pH4.8)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)CMC測定
10分鐘。以保留活性的形式計(jì)算每種酶相對于它的正常活性的穩(wěn)定性。
[0109]

【權(quán)利要求】
1.生物活性的突變蛋白，其包含對應(yīng)天然蛋白的所有必需三級結(jié)構(gòu)元件和至少一個表面暴露的非天然結(jié)構(gòu)元件，其特征在于，所述非天然結(jié)構(gòu)元件位于蛋白一級結(jié)構(gòu)內(nèi)并且形成表面暴露的肽環(huán)，所述肽環(huán)用于建立熱點(diǎn)以允許定向蛋白固定化和折疊的蛋白三級結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)穩(wěn)定性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物活性的突變蛋白，其中所述突變蛋白選自包括酶、抗體、受體、抗體片段、結(jié)合蛋白和合成肽的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物活性的突變蛋白，其中所述突變蛋白優(yōu)選地是酶，更優(yōu)選地是纖維素酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物活性的突變蛋白，其中所述突變蛋白是內(nèi)切葡聚糖酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物活性的突變蛋白，其中內(nèi)切葡聚糖酶酶是里氏木霉(trichoderma reesei)的提取物。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物活性的突變蛋白，其中所述插入的表面暴露的肽環(huán)包含至少5個且至多15個氨基酸。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物活性的突變蛋白，其中所述插入的表面暴露的肽環(huán)是包含經(jīng)修飾的內(nèi)切核酸酶基因的寡核苷酸序列的翻譯后產(chǎn)物，所述內(nèi)切核酸酶基因具有選自賴氨酸和甘氨酸的氨基酸序列的多個密碼子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物活性的突變蛋白，其中所述插入的表面暴露的肽環(huán)包含交替的賴氨酸和甘氨酸氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物活性的突變蛋白，其中所述內(nèi)切核酸酶基因包含與SEQNO I具有至少60%序列同一性的核酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物活性的突變蛋白，其中所述插入的表面暴露的肽環(huán)被定義為 KKGGKKKGGK。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物活性的突變蛋白，其中所述插入的表面暴露的肽環(huán)位于所述蛋白的活性中心的基本上180°的對側(cè)上，在溶劑可接近的且柔性的現(xiàn)有環(huán)內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的生物活性的突變蛋白，其中所述插入的表面暴露的肽環(huán)位于距離活性中心殘基的Ca約28人的第112個和第113個殘基之間。
13.遺傳工程改造權(quán)利要求1中描述的生物活性的突變蛋白的方法，所述方法包括下述步驟: (1)沿著靶蛋白基因的外顯子區(qū)域限定位點(diǎn)，所述位點(diǎn)用于插入形成表面暴露的環(huán)的寡核苷酸， (2)限定DNA引物的序列，所述序列包含由所述形成環(huán)的寡核苷酸橋連的重疊端部，所述引物被設(shè)計(jì)成經(jīng)由所述重疊端部沿著所述選擇的插入位點(diǎn)的區(qū)域雜交， (3)化學(xué)合成DNA引物，所述DNA引物包含由所述形成環(huán)的寡核苷酸序列橋連的所述重疊端部， (4)應(yīng)用重疊PCR延伸，以制備含有所述形成環(huán)的寡核苷酸序列的突變基因，所述寡核苷酸序列位于靶蛋白基因的外顯子的指定區(qū)域內(nèi)， (5)應(yīng)用DNA分離以純化所述突變基因， (6)表達(dá)所述突變基因，和(7)分離含有所述表面暴露的肽環(huán)的所述靶蛋白的突變體。
14.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述寡核苷酸序列包含與SEQNO I SEQ NO I具有至少60%序列同一性的核酸序列。
15.寡核苷酸序列，其包含經(jīng)修飾的內(nèi)切葡聚糖酶基因的核苷酸序列，所述經(jīng)修飾的內(nèi)切葡聚糖酶基因具有選自賴氨酸和甘氨酸的氨基酸序列的多個密碼子。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的寡核苷酸，其中內(nèi)切核酸酶基因包含交替的賴氨酸和甘氨酸氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的寡核苷酸，其中所述內(nèi)切核酸酶基因選自里氏木霉(Trichoderma reesei) (QM9414) egll 基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的寡核苷酸，其中所述內(nèi)切葡聚糖酶基因由以下序列編碼:在SEQ NO I中描述的核酸序列，所述序列的反向補(bǔ)體，所述序列的補(bǔ)體，所述序列的反轉(zhuǎn)，或與前述序列中任一個的核酸序列具有至少60%序列同一性的序列。
19.核酸構(gòu)建體，其包含:內(nèi)切葡聚糖酶基因的啟動子或表達(dá)，所述內(nèi)切葡聚糖酶基因包含與SEQ NO I具有至少60%序列同一性的核酸序列；賴氨酸和甘氨酸殘基的多個密碼子；和所述內(nèi)切葡聚糖酶基因的核苷酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動子包含pPicza A質(zhì)粒。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的核酸構(gòu)建體,其中在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)宿主中，且最優(yōu)選地在巴斯德畢赤酵母KM71 H菌株中，表達(dá)pPicz a A質(zhì)粒。
22.核酸序列，其與SEQNO I具有至少60%序列同一性。
【文檔編號】C12N11/06GK104136607SQ201280067574
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月18日
【發(fā)明者】奧斯曼·尤格·賽澤曼, 剛?cè)へ惱贰ぐ⒖丝ㄆぜ{ 申請人:薩班哲大學(xué)