用于分離細胞外核酸的快速方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于從樣品分離細胞外核酸的方法，其中通過將所述細胞外核酸結合于帶有陰離子交換基團的固相，任選地使所述樣品穩(wěn)定，所述方法包括下列步驟：在結合混合物中將所述細胞外核酸結合于所述固相，所述結合混合物具有允許所述細胞外核酸結合于所述固相的所述陰離子交換基團的第一pH；其中所述樣品占所述結合混合物體積的至少85％；分離帶有所述被結合的細胞外核酸的所述固相；任選地清洗所述細胞外核酸；任選地從所述固相洗脫細胞外核酸。所述方法具有可以處理大樣品體積并且可以高得率快速分離細胞外核酸的優(yōu)點。所述方法特別適合于可自動化的過程。
【專利說明】用于分離細胞外核酸的快速方法
[0001]產生本發(fā)明的工作接受了歐洲共同體第七框架計劃(European Community’sSeventh Framework Programme) (FP7/2007-2013)的資助協(xié)議號 222916 下的資助。
【技術領域】
[0002]本文所公開的發(fā)明涉及從樣品、尤其是血液樣品或源自于血液的樣品例如血漿或血清分離細胞外核酸的方法以及相關的技術。
【背景技術】
[0003]已在血血漿、血清和其他體液中鑒定到細胞外核酸。在相應樣品中發(fā)現(xiàn)的細胞外核酸，由于它們受到保護而免受核酸酶影響(例如因為它們以蛋白脂質復合物的形式分泌、與蛋白質結合或被包含在囊泡內)這一事實，因此具有一定程度的抗降解性。許多醫(yī)學病癥、惡性腫瘤和感染過程中存在水平升高的細胞外核酸例如DNA和/或RNA，對于疾病進展的篩選、診斷、預后、監(jiān)測，對于鑒定潛在的治療靶點以及對于監(jiān)測治療反應來說，是尤為令人感興趣的。此外，母體血液中升高的胎兒DNA/RNA被用于確定例如性別同一性、評估染色體異常和監(jiān)測妊娠相關的并發(fā)癥。除了例如源自于腫瘤細胞或胎兒的哺乳動物細胞外核酸之外，包含細胞外核酸的樣品還可能包含未包含在細胞內的其他目標核酸。重要的非限制性實例是病原體核酸例如病毒核酸。病毒核酸從樣品例如尤其是血液樣品或源自于血液的樣品的有效分離，對于許多診斷應用來說也是重要的。因此，細胞外核酸在非侵入性診斷和預后中特別有用，并且可以在許多應用領域例如非侵入性產前遺傳檢測、腫瘤學、移植醫(yī)學或許多其他疾病中用作例如診斷標志物，并因此具有診斷相關性(例如胎兒來源或腫瘤來源的核酸)。然而，在健康人類中也發(fā)現(xiàn)了細胞外核酸。細胞外核酸的常見應用和分析方法被描述在例如下述文獻中:W097/035589，W097/34015, Swarup等，F(xiàn)EBS Letters581(2007)795-799，F(xiàn)leischhacker Ann.N.Y.Acad.Sc1.1075:40-49(2006)，F(xiàn)leischhacker 和 Schmidt, Biochmica et Biophysica Actal775 (2007) 191-232,Hromadnikova 等，(2006)DNA and Cell biology, Volume25, Numberllpp635-640 ;Fan 等，(2010)Clinical Chemistry56:80
[0004]因此,為了允許可靠的分析,細胞外核酸的有效分離是極為重要的。然而，細胞外核酸通常僅僅以低濃度包含在樣品中。例如，自由循環(huán)的核酸以l-100ng/ml血漿的濃度存在于血漿中。此外，細胞外核酸通常作為大小為500nt、300nt (當指示尺寸以及因此鏈長時，術語“nt”在DNA的情形中也包括“bp”)或甚至更小的片段(循環(huán)核小體)循環(huán)。此外，出于診斷目的打算鑒定的真正的目標細胞外核酸通常僅占總細胞外核酸的一小部分。例如，腫瘤特異性DNA片段非常稀少，并且通常以比“正常”細胞外核酸背景低1000倍的濃度被包含。因此，希望處理大樣品體積以便獲得足夠量的細胞外核酸，尤其是足夠量的包含在其中的稀有目標分子，以用于下游測定。
[0005]在現(xiàn)有技術中，已知幾種用于從樣品例如尤其是血漿樣品分離細胞外核酸的方法。在這里，幾種試劑盒也是可商購的。然而，盡管這些試劑盒提供了有用的結果，但它們也具有需要改進的缺點。
[0006]例如,QIAamp循環(huán)核酸試劑盒允許處理高達5ml的樣品量,用于分離細胞外核酸。然而，它需要手動核酸提取。自動進行大體積樣品的制備是困難的，這是由于所使用的化學試劑(裂解和結合緩沖液)造成相應的試劑盒需要操控高達25ml的總處理體積。然而，標準的機器人系統(tǒng)僅處理最大3ml的體積。此外，相應的試劑盒還需要幾個方法步驟。因此，不但允許處理大樣品體積而且同時允許自動進行分離過程的方法，將是有利的。旨在從無細胞樣品例如血漿分離例如病毒核酸的其他可商購試劑盒，只能處理相當小的樣品體積(參見例如ChargeSwitch? EasyPlex?病毒試劑盒)。在這里，較大樣品體積的處理將是有利的，因為這將允許提聞核酸得率。
[0007]因此，現(xiàn)有技術方法具有幾個缺點。為了克服現(xiàn)有技術的缺點，希望提供用于從大樣品體積分離細胞外核酸的方法。這將確保分離到足夠的細胞外核酸用于下游應用。如果這種要求得不到滿足，則存在著例如即使靈敏的方法也不能檢測到被分離的細胞外核酸群體中包含的目標分子的風險。此外，現(xiàn)有技術方法通常是耗時的，因此需要幾個操作步驟并因此需要在手上花費的時間。在這里，希望提供僅需要幾個步驟來分離細胞外核酸的簡單快速的方法。這也將減少在制備期間由操作中的錯誤造成的潛在錯誤。此外，希望提供適合于自動化的方法。一旦為常規(guī)測試建立起診斷靶之后，顧客例如在實驗室中需要自動化來管理更高的通量。自動化分離流程在診斷領域中將具有顯著優(yōu)勢，因為它降低由手動核酸分離期間發(fā)生的錯誤造成的錯誤結果的風險。然而，被設計用于執(zhí)行這樣的自動化核酸分離過程的機器人，受到它們可以操作的最大樣品體積的限制(參見上文)。因此，通過添加執(zhí)行分離過程所必需的試劑而增加樣品體積，直接減少了可以處理的樣品的量，并因此減少了可以通過自動化分離過程的單次運行而獲得的核酸的量。最后，現(xiàn)有技術的試劑盒通常需要用于裂解樣品的步驟。需要在現(xiàn)有技術中通常進行的相應的裂解步驟不僅僅是為了例如從細胞釋放出核酸。當從所謂的無細胞樣品例如血漿分離核酸時，通常也進行相應的裂解步驟，以便變性和/或消化蛋白質污染物或可能干擾例如核酸與固相的結合和/或可能導致不適當?shù)募兓钠渌廴疚镔|。為了進行相應的裂解步驟，通常添加大體積的裂解試劑例如離液序列高的試劑。執(zhí)行相應的增加體積的裂解步驟的必要性是一種缺點，因此這減小了可以在例如自動化系統(tǒng)中處理的真正樣品的體積。
[0008]US2005/0106602描述了從細胞材料樣品分離核酸的方法。沒有急性化學裂解。相反，使用了核酸結合基團，其用于雙重目的，即結合核酸和支持細胞的裂解。W02006/036243描述了類似的方法。
[0009] Melkonyan等的《跨腎核酸:從原理驗證到臨床試驗》(Transrenal nucleicacids: ^From proof of principle to clinical tests", 2008)描述了從尿液分離細胞外核酸。將樣品與Q-Sepharose陰離子交換基質相接觸以結合核酸，隨后對其進行清洗和洗脫。所使用的分離流程的詳細情況描述在Shekhtman等，“跨腎DNA分析的優(yōu)化:母體尿液中胎兒 DNA 的檢測”(Optimization of transrenal DNA analysis !Detection of fetalDNA in maternal urine) (Clinical Chemistry55:4,723-729 頁，(2009))中。Shekhtman等教導了在將核酸結合于固相之前大量稀釋尿液。將IOml尿液用IOml水稀釋，并將得到的稀釋樣品與Q-S印harose相接觸。在W02008/45505中描述了類似的方法，其還描述了用于從尿液或血漿分離無細胞核酸的基于柱子的方法。[0010]W002/48164描述了使用陰離子交換基質和電荷切換程序來分離核酸的方法。在第一PH下，使樣品與包含可電離基團的材料發(fā)生接觸，其中所述材料在其第一pH下具有正電荷，使得核酸被結合在材料中。核酸在更高的第二 PH下被釋放，在所述第二 pH下，材料上的電荷為負、中性或正電荷較少。沒有描述循環(huán)核酸例如腫瘤來源的細胞外核酸的分離。
[0011]DE102008063003描述了一種使用陰離子表面來分離核酸的方法。沒有描述使用大樣品體積的細胞外核酸的分離。DE102008063001還公開了一種使用陰離子交換基團和特別設計的用于結合核酸的固相來分離核酸的方法。
[0012]Kirsch等的“用于從其他體液分離自由循環(huán)的血漿DNA和無細胞DNA的改進方法” (An improved method for the isolation of free-circulating plasma DNA andcell-free DNA from other body fluids, 2008)描述了使用 NucleoSpin Plasma XS 試劑盒(Macherey-Nagel)分離無細胞核酸的方法。沒有使用用于結合核酸的陰離子交換表面。
[0013]本發(fā)明的目的是提供一種用于從含有細胞外核酸的樣品分離細胞外核酸的方法，所述方法避免了至少一個上面討論的現(xiàn)有技術的缺點。在特定實施方式中，本發(fā)明的目的是提供用于分離細胞外核酸的簡單快速的方法，所述方法適合于自動化并允許處理大樣品體積。
[0014]發(fā)明概述
[0015]本發(fā)明是基于下述發(fā)現(xiàn)，即可以通過使用特定流程從各種不同樣品有效地分離細胞外核酸，所述特定流程 包含使用結合細胞外核酸的陰離子交換材料。
[0016]根據(jù)第一方面，提供了用于從樣品分離細胞外核酸的方法，其中通過將所述細胞外核酸結合于帶有陰離子交換基團的固相，任選地使所述樣品穩(wěn)定，其中所述方法包括下列步驟:
[0017]a.在允許所述細胞外核酸結合于所述固相的所述陰離子交換基團的第一 pH下，將所述細胞外核酸結合于所述固相，其中所述樣品優(yōu)選地占所述結合混合物體積的至少85% ；
[0018]b.分離帶有所述被結合的細胞外核酸的所述固相；
[0019]c.任選地清洗所述細胞外核酸；
[0020]d.任選地從所述固相洗脫細胞外核酸。
[0021 ] 本發(fā)明的分離方法與現(xiàn)有技術中使用的方法相比具有顯著優(yōu)點，所述優(yōu)點在于它是快速的，允許處理大樣品體積，需要極少的操作步驟，提供高的細胞外核酸回收率，并且是可自動化的。為了有效分離細胞外核酸，所需要的僅僅是將樣品酸化以建立結合條件，將所述細胞外核酸結合于所述固相，并將帶有被結合的細胞外核酸的固相與剩余樣品分開。令人吃驚的是，為了制備用于核酸分離的樣品，裂解步驟不是必需的。此外，也不必需添加大體積的試劑或稀釋劑來制備用于核酸分離的樣品和例如建立結合條件。因此，所述方法具有結合混合物可以主要由樣品材料構成的優(yōu)點。這是優(yōu)于常規(guī)純化方法、例如基于使用聚硅酸和聚硅酸固相以及離液序列高的試劑的方法的重要優(yōu)點，在所述常規(guī)方法中，幾乎50%的結合混合物由為了裂解和/或制備樣品以備結合而不得不添加的化學物質構成。按照本發(fā)明進行以建立結合條件的酸化，對結合混合物的體積僅有很小的貢獻(通常小于10%或甚至小于5% )。因此，由于不必添加大體積的試劑來建立結合條件，因此可以在例如自動化系統(tǒng)中處理的樣品的量增至最大。這在使用在可以操作的樣品體積方面受到限制的自動化系統(tǒng)時是重要的優(yōu)點。憑借能夠在使用自動化過程時處理大樣品體積，本發(fā)明的方法能夠增加分離到的細胞外核酸的量。這進而能夠對細胞外核酸群體中包含的低豐度靶分子進行靈敏的檢測和/或分析。
[0022]根據(jù)第二方面，提供了一種用于從樣品分離細胞外核酸的方法，所述樣品是或源自于體液，優(yōu)選地選自血液、血漿、血清或尿液，并且其中所述樣品任選地被穩(wěn)定化，其中為了分離，將細胞外核酸結合于帶有陰離子交換基團的固相，其中所述方法包括下列步驟:
[0023]a.在結合混合物中將細胞外核酸結合于所述固相，所述結合混合物處于允許將所述細胞外核酸結合于所述固相的所述陰離子交換基團的< 6的第一 pH下；
[0024]b.分離帶有所述被結合的細胞外核酸的固相；
[0025]c.任選地清洗所述細胞外核酸；
[0026]d.優(yōu)選地在比用于將所述細胞外核酸結合于所述固相的第一 pH更高的第二 pH下，將所述細胞外核酸從所述固相洗脫；
[0027]e.從所述洗脫液分離所述細胞外核酸。
[0028]相應的方法允許將細胞外核酸從大樣品體積濃縮到可以例如通過常規(guī)的自動化系統(tǒng)容易地操作的較小樣品體積。在步驟e中使用適合的分離方法，例如在自動化系統(tǒng)上運行的已建立的分離方法，對被分離的細胞外核酸進行進一步純化。如上述步驟那樣包含本發(fā)明的概念以便將細胞外核酸從大樣品體積濃縮到小樣品體積具有可以提高細胞外核酸的總產率的優(yōu)點，這是因為與使用常規(guī)系統(tǒng)相比，可以更方便地處理明顯更大的樣品體積。
[0029]此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種在使用結合核酸的固相時提高小核酸的回收的方法。當分離核酸、尤其是較小的核酸例如細胞外核酸時，較小的核酸通常不被有效地回收，盡管它們最初在結合步驟中結合于核酸固相。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在將所述核酸結合于所述固相之前用聚合物、優(yōu)選為聚丙烯酸預處理結合核酸的固相，令人吃驚地提高了較小核酸的回收率。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了已用聚合物例如聚丙烯酸預處理的結合核酸的固相。此外，本發(fā)明提供了一種用于產生相應的結合核酸的固相的方法，所述方法包括將所述結合核酸的固相與聚合物相接觸，由此將所述聚合物結合于所述固相。此外，本發(fā)明涉及一種用于分離核酸、優(yōu)選為細胞外核酸的方法，其中使用了已用聚合物預處理的結合核酸的固相。用聚合物例如例如聚丙烯酸預處理所述固相，由于可以增加小核酸的回收，導致所述核酸固相的核酸結合特性得以改進。
[0030]對于本領域技術人員來說，從下面的描述和隨附的權利要求書，本申請的其他目的、特征、優(yōu)點和方面將變得顯而易見。然而，應該理解，下面的描述、隨附的權利要求書和具體實施例，盡管指示了本申請的優(yōu)選實施方式，但僅僅是為了說明而給出的。對于本領域技術人員來說，在閱讀了下文之后，在所公開的發(fā)明的精神和范圍內之內的各種改變和修改將變得顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1:使用3種不同珠子類型的DNA片段的百分得率
[0032]圖2:ccfDNA的富集(18S DNA雙重PCR測定法):通過分析結合步驟后的上清液和洗脫液的成功結合的對照[0033]圖3:磁性珠子(II型)的尺寸選擇性行為-使用兩種不同洗脫緩沖液的兩個洗脫步驟的珠子
[0034]圖4:ccfRNA的富集，使用GAPDH測定法測量
[0035]圖5:抑制試驗，用于分析濃縮物是否是PCR相容的，或者是否必須進行清理流程
[0036]圖6:使用3種不同類型的磁性陰離子交換珠子的病毒富集
[0037]圖7:與所有供體個體的參比相比的百分得率的中位數(shù)(在這里示出了三種不同DNA測定的結果)
[0038]圖8:在使用片段DNA測定(內部對照)后回收率的中位數(shù)
[0039]圖9:使用不同核酸濃度的分離效能
[0040]圖10:ccfDNA(18S)的回收-手動富集流程[0041 ]圖11:摻雜的DNA的回收-手動富集流程
[0042]圖12:胎兒DNA的富集，使用18S檢測測定法、Dysl4測定法和RhD測定法測量。
[0043]圖13:短的細胞外DNA片段的尺寸選擇性富集，通過APP測定法測量。
[0044]圖14:靶DNA在具有堿性pH值的緩沖液中的檢測，通過雙重18S DNA測定法測量。
[0045]圖15:較長DNA片段在低鹽洗脫緩沖液中的低得率回收。
[0046]圖16:鹽依賴性和尺寸選擇性，較長DNA片段在高鹽洗脫緩沖液中的回收，通過雙重18S檢測測定法測量。
[0047]圖17 =PCR相容性，摻有不同量靶DNA的洗脫緩沖液沒有PCR抑制。
[0048]圖18:在沒有其他鹽的情況下，較短DNA片段在堿性pH下的尺寸選擇性洗脫，通過雙重18S DNA檢測來測量。
[0049]圖19:使用具有不同pH和鹽濃度的洗脫緩沖液的ccf DNA的尺寸選擇性富集。
[0050]圖20:具有確定尺寸的DNA片段的鹽依賴性富集，使用APP測定法測量。
[0051]圖21:從母體血漿完全提取胎兒DNA，使用Dysl4測定法測量。
[0052]圖22 =PAA的添加提高DNA回收，正如通過雙重18S DNA測定法所測量的。
[0053]圖23:使用不同洗脫體積的DNA分離效率。
[0054]圖24:高效DNA結合和在洗脫緩沖液中的釋放，通過雙重18S DNA檢測測定法測量。
[0055]圖25:分離到的DNA的PCR檢測不受洗脫緩沖液組分的影響。
[0056]圖26 =DNA的pH值和珠子體積依賴性的富集。
[0057]圖27:使用I型或II型珠子的DNA富集的比較，使用18S檢測測定法測量。
[0058]圖28:從血清富集DNA。
[0059]發(fā)明詳述
[0060]本發(fā)明提供了一種用于從樣品分離細胞外核酸的方法，其中通過將細胞外核酸結合于帶有陰離子交換基團的固相，任選地將所述樣品穩(wěn)定化，其中所述方法包括下列步驟:
[0061] a.在允許將所述細胞外核酸結合于所述固相的陰離子交換基團的第一 pH下，將所述細胞外核酸結合于所述固相，其中樣品優(yōu)選地占所述結合混合物體積的至少85% ；
[0062]b.分離帶有被結合的細胞外核酸的固相；
[0063]c.任選地清洗細胞外核酸；[0064]d.任選地從固相洗脫細胞外核酸。
[0065]與所述方法相關的關鍵優(yōu)點描述在上面的發(fā)明概述中。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用帶有非特異性(即序列不依賴性)結合細胞外核酸的陰離子交換基團的固相，可以從各種樣品以高得率快速分離細胞外核酸。所述方法允許處理大樣品體積，這是由于為了建立結合條件，所需要的基本上僅僅是樣品的酸化。酸化僅僅少量增加樣品體積和結合混合物體積，因此與為了能夠分離核酸而必須添加大量裂解和/或結合試劑的常規(guī)方法相比，允許處理更大的樣品體積。正如在實施例中所示，取決于所使用的固相，本發(fā)明的方法可以獲得高達100%的回收率。因此，使用本發(fā)明的方法可能實現(xiàn)的較大樣品體積的處理，導致細胞外核酸的得率提高，這是重要的優(yōu)點，因為細胞外核酸通常以低濃度例如〈100ng/ml樣品被包含在樣品中。使用這樣的簡單方法處理大樣品體積的可能性，還允許在對能夠操作的溶液的最大體積有限制的自動化系統(tǒng)中執(zhí)行本發(fā)明。由于為了建立核酸的結合條件只向初始樣品添加非常小體積的試劑，因此自動化系統(tǒng)的最大操作體積可以盡可能多地被有效地用于初始樣品。通過允許處理較大體積并通過實現(xiàn)高回收率并因此實現(xiàn)提取的細胞外核酸的高得率，本發(fā)明的方法允許最大化核酸得率。因此，本發(fā)明的方法特別適合于從細胞外核酸含量低例如〈100ng/ml樣品的生物樣品例如體液回收細胞外核酸。本發(fā)明的方法可用于分離細胞外核酸，以便可以將它們直接用于下游應用例如隨后的分析方法，以便例如擴增、鑒定、定量和/或檢測提取的細胞外靶核酸群體中某些靶核酸的存在或不存在。因此，盡管本發(fā)明的方法非常簡單且快速這一事實，但分離到的核酸的純度足以用于標準的下游應用，例如在實施例中所示的分析和檢測測定法中。
[0066]此外，本發(fā)明的分離方法也可用作以處理流程，用于從大樣品體積分離并因此濃縮細胞外核酸。然后可以任選地使用標準的核酸分離流程對相應地濃縮的細胞外核酸進行進一步純化。將本發(fā)明的方法作為減小用于隨后純化步驟的樣品體積的濃縮流程來執(zhí)行，具有由于可以處理較大的 初始樣品體積，因此可以節(jié)省時間和成本并且可以提到細胞外核酸得率的優(yōu)點。因此，本發(fā)明的方法也可用作預處理流程，以便將細胞外核酸從大樣品體積濃縮到允許使用標準的核酸分離和相應的純化流程的較小的樣品體積，其可以在例如對可以操作的樣品體積有限制的已建立的自動化系統(tǒng)上運行。相應的預提取以及相應地濃縮步驟的合并，也允許建立并相應地改進使用自動化系統(tǒng)的細胞外核酸的常規(guī)試驗，這是因為分離結果尤其是在得率方面得以改善。
[0067]本發(fā)明的方法可以手動或使用自動化系統(tǒng)來進行。手動方法具有通?？梢蕴幚磔^大樣品體積的優(yōu)點(自動化系統(tǒng)由于它們的設計而通常在能夠處理的體積方面具有一定限制)。自動化系統(tǒng)具有可以同時處理許多樣品，并且自動化系統(tǒng)由于避免了操作誤差而傾向于誤差較小的優(yōu)點。通過分拆原始樣品樣品，平行地處理樣品部分，并將洗脫液或洗脫之前的陰離子交換材料重新合并，可以在一定程度上克服在樣品體積方面的限制。根據(jù)一種實施方式，按照本發(fā)明的方法、尤其是在權利要求1中所定義的方法，將包含在第一樣品中的細胞外核酸結合于固相。優(yōu)選地使用粒子、尤其是磁性粒子作為固相。然后將所述帶有被結合的細胞外核酸的固相與第二樣品的結合混合物相接觸，其中所述第二樣品優(yōu)選為同一原始樣品的分拆的部分，即將原始樣品分拆成第一和第二樣品。由此，將第一樣品的固相與第二樣品的固相合并，然后對合并的固相進行進一步處理。這種樣品分拆和洗脫液和/或固相的重新合并，允許使用只能處理有限樣品體積的自動化系統(tǒng)容易地處理較大樣品體積。
[0068]使用本發(fā)明時的另一個優(yōu)點在于不論樣品中細胞外核酸的稀釋度如何，回收率都能基本上保持相同。因此，本方法允許不論在lml、5ml、10ml或25ml樣品中是否存在相同量的核酸，都能以基本上相同的得率和相應地回收率分離細胞外核酸(參見實施例)。這在從大樣品體積分離低豐度細胞外核酸時是特別有利的，因為在使用本發(fā)明的方法時，低濃度不妨礙核酸的有效分離。
[0069]當在本文中使用時，術語“細胞外核酸”具體是指未被包含在細胞中的核酸。相應的細胞外核酸通常也被稱為無細胞核酸。這些術語在本文中作為同義詞使用。因此，細胞外核酸通常存在于樣品內細胞的外部或多個細胞的外部。術語“細胞外核酸”是指例如細胞外RNA以及細胞外DNA及其混合物。生物樣品例如體液或源自于體液的樣品例如血漿的無細胞級分(相應地部分)中存在的典型的細胞外核酸的實例，包括但不限于哺乳動物細胞外核酸例如細胞外腫瘤相關或腫瘤來源的DNA和/或RNA、其他細胞外疾病相關的DNA和/或RNA、表觀遺傳學修飾的0嫩、胎兒DNA和/或RNA、小干擾RNA例如miRNA和siRNA，以及非哺乳動物細胞外核酸例如從例如原核生物(例如細菌)、病毒或真菌釋放到細胞外核酸群體中的病毒核酸、病原體核酸。根據(jù)一種實施方式，細胞外核酸從作為生物樣品的體液或源自于體液的樣品獲得，所述體液例如血液、血漿、血清、唾液、尿液、液劑、腦脊液、痰液、淚液、汗液、羊水或淋巴液；優(yōu)選地，細胞外核酸從上述樣品的無細胞或貧細胞部分獲得。在本文中，我們將從循環(huán)體液或源自于循環(huán)體液的樣品、尤其是從循環(huán)體液的無細胞或貧細胞部分獲得的細胞外核酸，稱為循環(huán)的細胞外核酸或循環(huán)的無細胞核酸(ccf)。根據(jù)一種實施方式，術語細胞外核酸具體是指哺乳動物的細胞外核酸，優(yōu)選為疾病相關的細胞外核酸或疾病來源的細胞外核酸，例如腫瘤相關的細胞外核酸或腫瘤來源的細胞外核酸，由于炎癥或損傷、尤其是創(chuàng)傷而釋放的細胞外核酸，與其他疾病相關和/或由于其他疾病而釋放的細胞外核酸，或源自于胎兒的細胞外核酸。本文中描述的術語“細胞外核酸”還指從其他樣品、尤其是除了體液之外的生物樣品獲得的細胞外核酸。
[0070]正如上面討論的，本發(fā)明的方法還可用于分離作為細胞外核酸的一種實施方式的病毒核酸。本發(fā)明方法的效率導致后續(xù)的下游檢測方法靈敏度更高，使得可以在例如獻血中更可靠地檢測臨床上重要的病毒例如HIV或HCV。此外，由于病毒檢測的下限更低，因此可以改進抗病毒療法的監(jiān)測。當旨在分離病毒核酸時，優(yōu)選地將本發(fā)明的方法用作預處理流程，用于在進行其他核酸分離流程例如標準的表達核酸分離流程之前濃縮所包含的病毒核酸。
[0071]當在本文中使用時，術語“結合混合物”是指為結合步驟而制備，并且允許將樣品中包含的細胞外核酸結合于固相的陰離子交換基團的組合物。因此，結合混合物為細胞外核酸與固相的結合提供了適合的條件。結合混合物包含樣品和添加到樣品以便為結合步驟制備樣品的試劑和/或化合物。例如，可以向樣品添加酸化試劑和/或化合物以建立第一PH值。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，結合混合物體積的至少85%由樣品提供，并且如果處理穩(wěn)定化的樣品例如穩(wěn)定化的血漿或血清樣品，相應地由穩(wěn)定化的樣品提供。優(yōu)選地，結合混合物體積的至少90%、至少92%、至少94%、至少95%和最優(yōu)選地至少97%，由樣品和相應地任選被穩(wěn)定化的樣品提供。這確保了結合混合物主要由含有細胞外核酸的樣品(其任選地被穩(wěn)定化)構成。這允許處理大樣品體積(參見上文)。當在本文中使用時，術語“結合混合物”不包括固相。因此，在上述體積指標中沒有考慮固相的潛在體積貢獻。固相是否終究對結合混合物的體積有貢獻，還取決于用于結合細胞外核酸的固相。固相的適合實例在下文中描述。
[0072]根據(jù)一種實施方式，通過將樣品的pH調整到第一 pH來制備結合混合物。這可以通過加入酸化化合物和/或試劑來實現(xiàn)。酸化試劑的適合實例包括但不限于酸、酸性緩沖劑例如羧酸如乙酸、乙酸鈉/乙酸緩沖劑、檸檬酸/檸檬酸鹽緩沖劑、丙二酸、酒石酸、HC1、HClO4, HC103、甲酸、硼酸、H2SO4, H2SO3、酸性磷酸/磷酸鹽緩沖系統(tǒng)、MES或其他水溶性無機或有機酸。在優(yōu)選實施方式中，作為酸化化合物和/或試劑向樣品加入酸化溶液、優(yōu)選為酸化緩沖液，以在結合混合物中建立結合條件。酸化溶液可以含有能夠將得到的結合混合物的pH調整到第一 pH的緩沖物質。它可以另外地包含鹽，優(yōu)選在溶液中，尤其是在水性溶液中。優(yōu)選地，酸化溶液包含緩沖物質或不同緩沖物質的組合，其優(yōu)選地溶解在水中。酸化溶液的特別優(yōu)選的實例是乙酸鈉/乙酸緩沖劑的水性溶液，其濃度優(yōu)選為0.5至5M，更優(yōu)選為0.5至4M、0.5至3M，更優(yōu)選為約I至2M，并優(yōu)選地具有約2至約5的范圍內、更優(yōu)選約4的pH值。酸化溶液優(yōu)選地以約1:10至約1:1000的體積比(體積(酸化溶液):體積(樣品，相應地任選被穩(wěn)定化的樣品))，優(yōu)選地以約1:100至1:20的體積比，更優(yōu)選地以約1:30的體積比，最優(yōu)選地以約1:40的體積比添加到樣品。其他適合的緩沖系統(tǒng)包括例如乙酸鉀/乙酸、檸檬酸鈉(或鉀)/檸檬酸和磷酸鈉(或鉀)/磷酸。當處理作為樣品的體液(或源自于體液的樣品)例如血液、血漿或血清時，相應的比例是特別有用的。
[0073]根據(jù)一種實施方式，第一 pH低于提供在固相表面上的陰離子交換基團的可質子化基團的PKa值。用于將核酸結合于固相的第一 pH優(yōu)選地低于陰離子交換基團的可質子化基團的PKa值。如果陰離子交換基團包含超過一個可質子化基團，則第一 pH優(yōu)選地低于至少一個可質子化基團的pKa。優(yōu)選地,第一 pH比pKa值低至少0.5個單位,更優(yōu)選地至少
I個單位、至少1.5個單位、至少2個單位、至少2.5個單位,并且最優(yōu)選地比所述pKa值低至少3個單位。優(yōu)選地,所述pH高于4。
[0074]相應地使用的適合于將細胞外核酸結合于固相的陰離子交換基團的第一 pH值，還取決于陰離子交換基團的本質和/或陰離子交換基團在固相表面上的密度。所使用的鹽濃度也可能影響結合。適用于第一 PH值的pH值可以由專業(yè)技術人員確定。根據(jù)一種實施方式，第一 PH處于約4至約7的范圍內，更優(yōu)選地在選自4至6.5、4.5至6.5、5至6.5和5至6的范圍內。當使用實施例中描述的陰離子交換粒子時，為結合核酸例如DNA和/或RNA對相應的pH值特別地進行優(yōu)化。優(yōu)選地，結合混合物的pH ≤ 6.5，優(yōu)選地≤6。當旨在分離細胞外RNA時，優(yōu)選地使用≤5.5或≤5的酸性更強的第一 pH值，因為這可能提高RNA得率。樣品的酸化建立起第一pH，用于將細胞外核酸結合于固相的陰離子交換基團。此外，酸化對樣品進行處理，并因此可以例如通過釋放細胞外核酸、例如可以被捕獲在例如組蛋白復合體中的DNA來改善結合。
[0075] 結合發(fā)生的時間長度足以允許細胞外核酸與固相的顯著結合。適合的以及相應地必需的溫育時間取決于所使用的固相和陰離子交換基團的類型和量、樣品體積和樣品中細胞外核酸的濃度。例如，如果使用具有高陰離子交換基團密度并因此緊密結合細胞外核酸的固相，較短的溫育時間可能是足夠的。更長的溫育時間確保核酸高度有效地結合于固相，由此允許最大化細胞外核酸從樣品的回收。根據(jù)某些實施方式，溫育時間選自至少Imin.、至少2min.、至少5min.、至少lOmin、至少15min,更優(yōu)選為至少約20min。
[0076]在本發(fā)明的方法的步驟(b)中，將結合于固相的細胞外核酸與其余樣品分離開。為此目的，可以使用本領域中已知的任何手段。適合的手段還取決于用于結合的固相的類型，并且包括但不限于使用磁性固相時的磁性分離、使用例如非磁性粒子或膜時的離心、沉降、施加真空、過濾或層析。適合的固相在下文中描述，并且專業(yè)技術人員熟悉相應固相的操作。
[0077]在優(yōu)選實施方式中，用于分離核酸的整個方法在室溫下進行。
[0078]樣品、固相和酸化化合物和/或試劑可以以任何順序相接觸。在優(yōu)選實施方式中，向樣品加入至少一種酸化化合物和/或試劑，以便建立第一 PH并因此建立結合條件。然后將得到的結合混合物與固相相接觸，以將細胞外核酸結合于固相。任選地，在接觸后可以進行進一步的PH調節(jié)，以優(yōu)化結合條件或建立所需的第一pH。然而，首先提供固相，然后以任何順序添加樣品和至少一種酸化化合物和/或試劑，也在本發(fā)明的范圍之內，并且也取決于所使用的固相的類型?？梢允褂迷试S細胞外核酸結合于固相的任何適合的接觸順序。在步驟(b)之后，作為步驟(c)，可以任選地進行一個或多個清洗步驟。根據(jù)一種實施方式，將至少一種清洗溶液與帶有被結合的細胞外核酸的固相相接觸。為了確保被結合的核酸的最大回收，清洗條件優(yōu)選地被選擇成使得在清洗期間，沒有顯著量的結合于核酸結合基質的核酸從其上被移除。清洗緩沖液優(yōu)選為水性溶液，并且可以含有表面活性劑。適合的表面活性劑包括但不限于基于聚氧化乙烯的非離子型表面活性劑，優(yōu)選地選擇聚氧化乙烯脂肪醇醚、聚氧化乙烯烷基苯基醚和聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物。優(yōu)選的實例是例如濃度為約0.01% - 1%的TritonX-1OO或Bri j58。適合的清洗溶液在現(xiàn)有技術中也是已知的，因此在這里不需任何進 一步描述。如果例如打算將被分離的細胞外核酸不用進一步純化在例如診斷測定法中進行直接分析和/或檢測，則清洗是尤為推薦的。如果打算使用例如對潛在雜質敏感的方法(例如PCR方法)來直接分析被分離的細胞外核酸，則推薦進行至少兩個清洗步驟。根據(jù)一種實施方式，優(yōu)選地使用兩個不同體積的清洗溶液。在這里，第一清洗溶液的體積優(yōu)選地大于第二清洗溶液的體積。然而，如果隨后使用對雜質相當不敏感的檢測和/或分析方法，則清洗不是必需的。此外，如果將本發(fā)明的分離方法用于富集并因此將細胞外核酸濃縮在小樣品體積中，作為用于隨后的核酸分離方法和相應地純化流程的制備物時，清洗液不是強制性的。如果例如病毒核酸是細胞外核酸群體內的主要靶，則進行相應的后續(xù)分離流程是尤為推薦的。
[0079]根據(jù)一種實施方式，用于分離細胞外核酸的方法還包括從固相洗脫細胞外核酸的步驟(d)。
[0080]一般來說，可以使用任何適合的洗脫方法。優(yōu)選地，通過改變pH值來實現(xiàn)洗脫。因此，根據(jù)一種實施方式，洗脫在比用于將細胞外核酸結合于固相的第一 PH更高的第二 pH下進行。適用于將細胞外核酸從陰離子交換基團洗脫的第二 PH值的選擇，尤其取決于固相上存在的陰離子交換基團的本質、固相表面上陰離子交換基團的密度和洗脫溶液的離子強度。對于第二 pH來說,適合的pH值可以由專業(yè)技術人員確定。第二 pH優(yōu)選地比第一 pH高至少0.5個單位，比第一 pH高至少I個單位,更優(yōu)選地比第一 pH高至少1.5個單位或高至少2個單位。第二 pH可以低于、等于或高于陰離子交換基團的可質子化基團的pKa。然而，優(yōu)選地，它比pKa低至少I個單位,更優(yōu)選地比pKa低至少1.5個單位或比所述pKa低至少2個單位。優(yōu)選地，洗脫在≥8的第二 pH下進行。優(yōu)選地，洗脫在選自下列的pH范圍內進行:pH≥8并≤14，pH ^ 8并≤12.6，pH≥8并≤12，pH ^ 8并≤11，pH≥8并≤10和pH>8并≤9。用于洗脫的pH值可能還取決于洗脫液的其他目標應用。較低的洗脫pH值可能是有利的，這是因為相應的較低pH值與許多常見的下游反應(例如PCR)更相容。例如，如果需要單鏈DNA或者必須減少RNA污染物，則例如強堿性pH值、例如至少12的pH值可以被使用并且是有利的。根據(jù)一種實施方式，通過使用< lmol/1的氫氧化鈉溶液來實現(xiàn)洗脫。對于某些應用例如隨后用亞硫酸氫鹽試劑處理洗脫的DNA以便分析DNA甲基化模式來說，在> 12并≤14的pH下洗脫核酸以便將洗脫的DNA變性，可能也是有益的。如果在更高的pH值(例如10或更高)下進行洗脫，如果例如相應的中性pH值對于下游目標應用有益，則可以將包含核酸的洗脫液中和。此外，已發(fā)現(xiàn)RNA可以在較低pH值下洗脫。例如，當使用帶有聚乙烯亞胺基團的固相時(參見實施例)，RNA可以在8的pH值下被有效洗脫，而對于DNA來說，高于12的更高pH值更加適合。如果打算在洗脫步驟中回收RNA，由于RNA可能被損壞，因此優(yōu)選地不使用高PH值。如果由第二 pH所提供的洗脫強度不足以有效洗脫，則可以例如通過提高洗脫溶液中的鹽濃度來避免高于PH9的高pH值。
[0081]洗脫優(yōu)選地通過將結合于固相的細胞外核酸與洗脫溶液相接觸來實現(xiàn)。洗脫溶液優(yōu)選地包含能夠調節(jié)第二 PH的緩沖物質。具體來說，可以使用生物緩沖劑。適合的實例是濃度為約ImM至1M、優(yōu)選地IOmM至500mM、更優(yōu)選地50mM至約250mM、最優(yōu)選地75mM至150mM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)，并使用例如HCl調整到所需pH。然而，根據(jù)一種實施方式，使用緩沖物質的游離堿，例如作為游離堿的Tris。它可以在上述濃度范圍內使用。根據(jù)一種實施方式，使用包含Tris作為游離堿的洗脫溶液。含有所述游離堿的所述洗脫溶液的PH值可以例如在10至10.5的范圍內。根據(jù)一種實施方式，所述洗脫溶液不含鹽類，尤其是不含堿金屬鹽或堿土金屬鹽。正如實施例所示，使用包含Tris作為游離堿并且沒有其他鹽類的相應的洗脫溶液，允許選擇性地洗脫主要是小的核酸，其具有300nt或更短、優(yōu)選地250nt或更短、更優(yōu)選地200nt或更短、150nt或更短或甚至IOOnt或更短的長度，正如將在后面解釋并在實施例中示出的。因此，可以使用這些洗脫條件在洗脫緩沖液中富集相應的短核酸而不是更長的核酸。通過向包含Tris作為游離堿的洗脫溶液添加鹽類，也可能洗脫更長的核酸。如果對更長的核酸感興趣，可以調整鹽濃度，所述濃度取決于所需截止值。洗脫溶液優(yōu)選地是包含緩沖物質和任選地其他組分例如鹽、尤其是堿金屬鹽例如氯化鈉或氯化鉀的水性溶液，所述鹽的濃度為例如約0.05至約0.5M、優(yōu)選地約0.1至約0.2M、更優(yōu)選地約0.16M。所使用的鹽濃度對洗脫效率、尤其是較長核酸的洗脫效率有影響。鹽濃度越高，較長核酸的洗脫越高效。因此，提高鹽濃度增加較長核酸的洗脫效率。因此通過控制緩沖溶液中的鹽濃度，可以控制被洗脫的核酸的尺寸。例如，將洗脫溶液中的鹽、尤其是堿金屬鹽例如氯化鈉或氯化鉀的濃度提高到75mM或更高，導致尺寸為至少500nt的核酸以高于40%的回收率被洗脫。其他可能的緩沖劑包括但不限于HEPES、Tris-硼酸鹽和MOPS。因此，優(yōu)選地，洗脫在低鹽濃度下發(fā)生。使用低鹽濃度具有洗脫液可以直接用于下游測定法例如PCR反應的優(yōu)點。根據(jù)一種實施方式，使用包含IOOmM Tris-HCL(含有0.5-1.5%、優(yōu)選地0.9%的氯化鈉，pH9)的洗脫溶液。然而，使用更高的鹽濃度也在本發(fā)明的范圍之內，尤其是為了提高離子強度以避免例如高于10或高于12的高pH值(參見上文)，例如如果這樣的高PH值與下游目標反應不相容的話。根據(jù)一種實施方式，使用包含堿金屬氫氧化物例如氫氧化鈉或氫氧化鉀的洗脫溶液。正如由實施例所示，通過改變洗脫溶液中堿金屬氫氧化物的濃度，還可以影響主要被洗脫的核酸的尺寸。提高洗脫溶液中堿金屬氫氧化物的濃度，增加了被洗脫的核酸的尺寸。優(yōu)選地，結合于固相的細胞外核酸或具有所需尺寸范圍的細胞外核酸的至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %或至少98 %在步驟(d)中被從其洗脫。也可以通過加熱和/或振搖來幫助洗脫。
[0082]此外，通過在洗脫溶液中包含含有至少兩個陰離子基團的陰離子化合物，可以提高洗脫效率，尤其是對于洗脫較長核酸來說。相應的陰離子化合物支持核酸/陰離子交換復合物的破壞，因此支持洗脫。作為含有至少兩個陰離子基團的陰離子化合物，可以使用例如羧酸如草酸、苯六甲酸、苯均四酸和檸檬酸。此外，也可以使用聚合的陰離子化合物，例如聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸(PMA)、聚谷氨酸(PGA)和硫酸葡聚糖。相應的陰離子化合物也描述在W02011/037692中。正如實施例所示，當加入相應的陰離子化合物時，可以提高洗脫效率。
[0083]根據(jù)一種實施方式，本發(fā)明提供了按照尺寸分離核酸的方法。令人吃驚的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當使用陰離子交換基質來結合核酸時，可以簡單地通過調整和相應地改變洗脫PH，將被結合的核酸根據(jù)它們的尺寸從基質上洗脫。在較低洗脫pH下，只有小的核酸分子從陰離子交換基質上洗脫。當洗脫PH升高時，較大的核酸也可以被洗脫。這允許按照尺寸分離被結合的細胞外核酸。具體來說，已發(fā)現(xiàn)為了獲得這種尺寸分級效果，僅需要洗脫PH的小的變化。
[0084]根據(jù)一種實施方式，在高于第一 pH的第二 pH下，僅有一部分、相應地部分細胞外核酸從固相上洗脫，其中從固相上洗脫的細胞外核酸的平均長度短于保持結合于固相的細胞外核酸的平均長度。根 據(jù)一種實施方式，第二 pH在約7.5至10.5、優(yōu)選地約8至10、8.2至9.5、優(yōu)選地約8.5至9的范圍內。正如實施例所示，使用具有相應pH值的洗脫溶液允許實現(xiàn)尺寸選擇性洗脫，其中從固相上洗脫的細胞外核酸的平均長度短于保持結合于固相的細胞外核酸的平均長度?？梢酝ㄟ^調整洗脫條件來調整截止值。具體來說，洗脫溶液的PH值和鹽濃度是對截止值、因此對主要被洗脫的核酸的長度有影響的決定性特征。
[0085]取決于核酸群體例如被結合或洗脫的核酸中核酸的尺寸分布，核酸分子群體中的平均核酸長度，可以是指群體中一半的核酸分子具有比其更短的長度，另一半核酸分子具有比其更長的長度的核酸長度。然而，核酸分子群體中的平均核酸長度也可以是指在相應的核酸群體中出現(xiàn)頻率最高的核酸長度。對于其中某些核酸尺寸或某些核酸尺寸范圍占優(yōu)勢的偏態(tài)核酸群體來說，確定平均核酸長度的后一種選擇方案通常更加適合并因此是優(yōu)選的。通過調整洗脫條件，可以控制并因此改變被洗脫的核酸的長度和保持結合于陰離子交換基質的核酸的長度。因此，可以調整被洗脫和結合的核酸的尺寸和相應地尺寸范圍，從而獲得具有預先選擇的目標尺寸和相應地預先選擇的目標尺寸范圍的核酸。優(yōu)選地，使用所述第二 pH從固相上洗脫的核酸的平均長度與保持結合于固相的核酸的平均長度之間的差異，為至少約50nt、至少約75nt、至少約lOOnt、至少約150nt、至少約200nt、至少約250nt、至少約300nt、至少約350nt或至少約400nt。根據(jù)一種實施方式,在第一洗脫步驟中，在第
二pH值下從固相洗脫的細胞外核酸的平均長度在最大約700nt、最大約600nt、約IOnt至約 500nt、10nt 至約 400nt、15nt 至約 300nt、優(yōu)選地約 20nt 至約 250nt、20nt 至 200nt 或約50nt至約150nt的范圍內。此外，在這個第一洗脫步驟中，保持結合于固相的核酸的平均長度為至少約200nt、優(yōu)選地至少約250nt、至少約300nt、至少約400nt、至少約500nt、至少約600nt、至少約700nt、至少約1000nt或至少約1500nt。在優(yōu)選實施方式中，在第一洗脫步驟中，在第二 pH下從固相主要洗脫的細胞外核酸具有最大約lOOOnt、最大約700nt、最大約600nt、最大約500nt、優(yōu)選地最大約400nt、最大約300nt、最大約250nt或最大約200nt的長度，和/或在所述第一洗脫步驟中，長度為約200nt或更長、300nt或更長、350nt或更長、400nt或更長、500nt或更長、優(yōu)選地約700nt或更長、約800nt或更長或約1000nt或更長的核酸主要保持結合于固相。如上所述，核酸的長度被指明。因此，如果細胞外核酸是雙鏈分子(例如DNA)，則上面對于nt長度的指示是指bp。就此而言，術語“主要被洗脫”尤其是指至少50%、優(yōu)選地至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的指定組的核酸分子從核酸結合基質的洗脫。同樣地，就此而言，術語“主要保持結合”尤其是指少于50%、優(yōu)選地少于40%、少于30%、少于20%、少于10%或少于5%的指定組的核酸分子從核酸結合基質的洗脫。
[0086]在步驟(d)中，通過調整固相表面上正電荷的濃度，使得在步驟(d)期間只有較長核酸分子保持結合于基質，而較小的核酸被洗脫，可以實現(xiàn)短核酸的選擇性洗脫?？梢酝ㄟ^選擇在洗脫期間使用的PH值來控制截止值?？梢酝ㄟ^在洗脫步驟期間使用的pH來控制正電荷的調整。具體來說，通過添加洗脫溶液進行洗脫，所述洗脫溶液包含能夠在洗脫步驟期間提供第二 PH的緩沖物質。在優(yōu)選實施方式中，洗脫在低鹽濃度下進行。具體來說，洗脫溶液包含不超過0.5M的鹽、不超過0.3M的鹽、優(yōu)選地不超過0.27M的鹽、更優(yōu)選地不超過0.25M的鹽。
[0087]在特別優(yōu)選的實施方式中，使用包含含有二乙基氨基、優(yōu)選地二乙基氨基丙基的陰離子交換基團的固相。正如實施例中所示，包含相應的陰離子交換基團的固相具有顯著優(yōu)點。首先，獲得出色 的回收率，這也優(yōu)于其他陰離子交換表面。其次，可以使用溫和的洗脫條件，尤其是對于洗脫小核酸來說，這對于被分離的細胞外核酸的許多下游應用來說是有利的。第三，相應地官能化的固相特別好地適合于通過執(zhí)行尺寸選擇性洗脫來富集短的細胞外核酸。包含含有二乙基氨基、優(yōu)選地二乙基氨基丙基的陰離子交換基團的固相，有利地允許通過改變pH值和/或鹽濃度來調控被洗脫核酸的尺寸。正如由實施例所示，可以在狹窄的范圍內調整截止值，這引起可靠的尺寸選擇性洗脫。根據(jù)一種實施方式，在使用包含含有二乙基氨基、優(yōu)選地二乙基氨基丙基的陰離子交換基團的固相的實施方式中，第二 PH在約7.5至10.5、優(yōu)選地約7.5至9.5、約7.5至約9.0、優(yōu)選地約8.0 - 8.5的范圍內。具體來說，可以使用洗脫溶液，其包含用于調節(jié)所述PH值的緩沖物質和任選地鹽例如氯化鈉，所述鹽的濃度優(yōu)選為約0.1至約0.2M、更優(yōu)選為約0.16M。此外，正如由實施例所示，也可以通過洗脫溶液中包含的鹽的量來改變并因此控制被洗脫的核酸的尺寸。較大的鹽量導致較大核酸的洗脫。
[0088]進行尺寸選擇性洗脫具有幾個優(yōu)點。首先，由于正如簡介中所描述的，細胞外核酸主要具有小的尺寸，因此可以選擇性洗脫細胞外核酸。因此，可以使用這樣的洗脫條件，在所述洗脫條件中，高分子量核酸例如基因組DNA或其他較長的細胞內核酸不被相應的尺寸選擇性洗脫程序回收。這是重要的優(yōu)點，因為它減少或甚至避免了被分離的細胞外核酸被可能甚至在貧細胞或無細胞樣品中存在的殘留量的細胞內核酸例如基因組DNA污染，這是因為細胞內核酸可能被例如在儲存期間和/或細胞貧化過程中可能發(fā)生的消蝕或破壞的細胞釋放。本發(fā)明的方法允許在如上所述調整洗脫條件時消除分離的核酸中的相應的細胞內核酸污染例如基因組DNA，使得主要洗脫并因此回收尺寸為1，500nt或更小、優(yōu)選地1，OOOnt或更小的核酸。通過調整洗脫條件來消除基因組DNA的可能性是重要的優(yōu)點，因為這允許跳過超離心步驟，所述超離心步驟通常在16000g下進行以進一步澄清血漿，以便除去可能仍與包含的細胞碎片結合的相應的基因組DNA污染。這節(jié)省了在手上的時間和設備。此外，正如由實施例所示，通過調整洗脫緩沖液的PH值和/或鹽濃度，甚至可以按照尺寸分級尺寸為1，OOOnt或更小的細胞外核酸。由此可以確定哪個尺寸為1000nt或更小的小細胞外核酸群體被洗脫，并且例如可以主要洗脫并因此回收尺寸為500nt或更小、400nt或更小、300nt或更小、200nt或更小或甚至150nt或更小的核酸。此外，如本文中所述,如果例如對較長的核酸葉感興趣，但是打算將其作為分開的級分洗脫并因此回收，則也可以進行第二洗脫步驟。在該第二洗脫步驟中，使用允許洗脫較長核酸的條件。適合的條件描述在本文中。因此，由于本發(fā)明的方法提供了通過改變洗脫條件來控制被洗脫核酸的尺寸的可能性，因此它是非常靈活的。用于分離尺寸為1，OOOnt或更小、700nt或更小、600nt或更小、500nt或更小、400nt或更小、300nt或更小、200nt或更小或甚至IOOnt或更小的小核酸的特別適合的洗脫條件，也描述在實施例中。具體來說，使用包含pH值在8至10.5范圍內的緩沖物質例如Tris的洗脫溶液，允許選擇性地洗脫尺寸為1，OOOnt或更小、優(yōu)選為700nt或更小或甚至500nt或更小的核酸。例如，使用包含Tris作為游離堿并且pH約為10至10.5的洗脫溶液，允許選擇性地洗脫尺寸小于500nt并甚至小于300nt的核酸。此外，使用包含堿金屬氫氧化物例如氫氧化鈉或氫氧化鉀的洗脫溶液，允許選擇性地洗脫尺寸小于500nt、優(yōu)選地小于300nt的小核酸。正如由實施例所示，獲得的截止值取決于所使用的堿金屬氫氧化物的量。洗脫溶液中堿金屬氫氧化物的濃度越高，被洗脫的細胞外核酸的尺寸越大。因此，通過調整氫氧化物濃度，可以調整被洗脫的核酸的尺寸。當以緩沖劑的形式使用Tris時，優(yōu)選地使用在8至9.5、優(yōu)選地8.5至9范圍內的pH值。正如由實施例所示，使用相應的洗脫溶液允許選擇性地洗脫小核酸。截止值也可以受到在洗脫溶液中摻入鹽、優(yōu)選為堿金屬鹽例如氯化 鈉或氯化鉀的影響。正如由實施例所示，調整洗脫緩沖液中鹽的濃度對被洗脫的核酸的尺寸具有強烈影響。鹽濃度越高，從固相上洗脫的細胞外核酸越長。因此，如本文中所述，通過調整PH值、鹽濃度和/或影響洗脫效率的其他添加劑的摻入，可以進行尺寸選擇性洗脫。在這里，根據(jù)本申請以及尤其是實施例中給出的教示和指導，專業(yè)技術人員能夠提供具有所需截止值的洗脫溶液。
[0089]當進行尺寸選擇性洗脫時，優(yōu)選地固相帶有陰離子交換基團，所述陰離子交換基團包含可質子化基團，并且可質子化基團的PKa值在8至12、更優(yōu)選地9至11的范圍內。陰離子交換基團可以包含氮原子，優(yōu)選地所述陰離子交換基團源自于胺類。具體來說，陰離子交換基團是叔氨基，優(yōu)選為二烷基氨基，更優(yōu)選為二乙基氨基，特別優(yōu)選為二乙基氨基丙基。正如在實施例中所示，相應的叔胺顯示出特別良好的回收率，并且允許以定義明確的截止值進行可靠的尺寸選擇性洗脫。因此，當打算在洗脫期間進行尺寸選擇和相應地尺寸分級時，優(yōu)選地使用叔氨基、優(yōu)選為二烷基氨基、更優(yōu)選為二乙基氨基、特別優(yōu)選為二乙基氨基丙基。在某些實施方式中，固相材料具有含硅表面例如聚硅酸表面，并且使用硅烷基團，即通過硅烷化將陰離子交換基團偶聯(lián)到所述表面。例如，固相可以包含含硅表面、優(yōu)選為聚硅酸表面，并且可以用包含陰離子交換基團的硅烷化合物、優(yōu)選地用二乙基氨基丙基三甲氧基硅烷進行衍生。優(yōu)選地，固相表面不用另一種硅烷化合物進行衍生。最優(yōu)選地，使用磁性粒子作為固相。
[0090]根據(jù)一種實施方式，尺寸分級洗脫步驟包含下列步驟:
[0091]aa)在高于第一pH的第二pH下，將至少一部分結合于固相的細胞外核酸從固相上洗脫，其中在這一步驟中從固相上洗脫的核酸的平均長度短于保持結合于固相的核酸的平均長度；
[0092]bb)任選地從固相上洗脫在步驟aa)中保持結合于固相的核酸。在此，可以使用任何洗脫方法。
[0093]優(yōu)選地，在步驟bb)中使用高于第二 pH的第三pH來實現(xiàn)洗脫。第三pH優(yōu)選地可以被選擇成使得基本上所有的在步驟aa)中保持結合于固相的核酸在步驟bb)中從其上洗脫下來。在這種情況下，術語“基本上所有的”是指至少70%、優(yōu)選地至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少98%的被結合的核酸。第三pH優(yōu)選地比第二 pH高至少0.1個單位、至少0.2個單位、至少0.3個單位、至少0.5個單位、至少0.75個單位、至少I個蛋白、至少1.25個單位、至少1.5個單位、至少1.75個單位或至少2個單位。此外，第二 pH與第三pH之間的差優(yōu)選為3個單位或更小，更優(yōu)選為2個單位或更小、1.5個單位或更小、I個單位或更小、0.7個單位或更小或0.5個單位或更小。已發(fā)現(xiàn)，小的差異例如
0.5個pH單位的差異已經足以用于尺寸選擇性洗脫。
[0094]根據(jù)一種實施方式，在一種實施方式的步驟(bb)的洗脫期間的鹽濃度和/或溫度與步驟(aa)的洗脫期間相 比沒有顯著差異，尤其是沒有顯著升高。優(yōu)選地，鹽濃度的差異不超過100mM、更優(yōu)選地不超過50mM、最優(yōu)選地不超過25mM。此外,根據(jù)一種實施方式,用于洗脫的溫度的差異不超過10°C，更優(yōu)選地不超過5°C或不超過2.5°C。此外，優(yōu)選地，在第一和第二洗脫步驟中，除了 PH值之外的其他洗脫條件優(yōu)選地也相近。
[0095]在本發(fā)明的方法中，在步驟(a)之前和/或步驟(a)與(b)以及任何隨后的步驟(C)和(d)(如果進行相應的任選步驟(C)和⑷的話)之間，可以進行其他處理步驟。根據(jù)一種實施方式，在步驟(a)之前不進行其中使用的試劑使樣品(其任選地是穩(wěn)定化的樣品)體積增加超過15%的樣品消化步驟。優(yōu)選地，在步驟(a)之前不進行其中使用的試劑使樣品體積增加超過10%、更優(yōu)選地超過5%的樣品消化步驟，最優(yōu)選地，不使用使體積增加超過2.5%的試劑來消化樣品。由此確保了結合混合物主要由包含細胞外核酸(其任選地被穩(wěn)定化)的樣品材料構成，從而如上所解釋地確保細胞外核酸的最高得率。
[0096]取決于待處理的樣品類型，已發(fā)現(xiàn)，分離結果可以由于樣品組成的變化而變。可以通過用適合的手段預處理樣品(其任選地是穩(wěn)定化的樣品)，來提高分離結果的均一性。因此，在本發(fā)明的范圍之內包括在步驟(a)之前進行樣品預處理步驟。然而，所述預處理步驟不應顯著增加樣品的體積并因此增加結合混合物的體積。優(yōu)選地,如果終究使用增加體積的試劑的話(參見上文)，在相應的樣品預處理步驟期間使用的試劑對結合混合物的體積的貢獻小于5 %、優(yōu)選地小于2.5 %、更優(yōu)選地小于2 %、小于1.5%或小于I %。適合的預處理步驟包括但不限于對樣品的機械、化學、物理或酶作用。預處理步驟的實例包括但不限于在珠磨機中研磨樣品、使用超聲、加熱、冷凍和融化、添加去污劑和/或添加降解蛋白質的化合物例如降解蛋白質的酶例如水解酶或蛋白酶。根據(jù)一種實施方式，在步驟a)之前進行預處理步驟，其中在步驟a)之前想樣品添加至少一種降解蛋白質的化合物、優(yōu)選為蛋白水解酶、優(yōu)選為蛋白酶例如蛋白質酶，和/或去污劑。
[0097]根據(jù)一種實施方式，在步驟c)之前，不使用離液序列高的鹽來處理樣品。
[0098]優(yōu)選地，樣品是包含細胞外核酸的生物樣品。樣品可以例如選自全血、血漿、血清、痰液、淚液、淋巴液、尿液、汗液、液劑、腦脊液、腹水、乳液、糞便、支氣管灌洗液、唾液、羊水、鼻分泌物、陰道分泌物、精液、傷口分泌物和排泄物，以及細胞培養(yǎng)上清液和從其他拭子樣品獲得的上清液。根據(jù)一種實施方式，樣品是體液、身體分泌物或身體排泄物，優(yōu)選為包含細胞外核酸的體液或源自于體液的樣品，最優(yōu)選為全血、血漿或血清。樣品包含細胞外核酸。根據(jù)另一種實施方式，樣品是源自于人類或動物的非流體樣品，例如糞便、組織或活檢樣品?？梢允褂帽景l(fā)明的方法處理的樣品的其他實例包括但不限于生物樣品細胞懸液、細胞培養(yǎng)物、細胞培養(yǎng)物的上清液等，其包含細胞外核酸。
[0099]根據(jù)一種實施方式，包含細胞外核酸的樣品是無細胞或貧細胞樣品。相應的無細胞或貧細胞樣品可以例如從含細胞的樣品，通過使用適當?shù)募夹g除去細胞來獲得。典型的實例是可以從全血獲得的血漿或血清。如果樣品包含大量細胞，如例如使用全血時的情形，則將細胞與其余樣品分離開，以便獲得包含細胞外核酸的無細胞以及相應的細胞減少的樣品級分。因此，根據(jù)一種實施方式，從含細胞的樣品除去細胞以提供包含細胞外核酸的無細胞或貧細胞樣品，并使用本發(fā)明的方法從其分離細胞外核酸。這個細胞去除步驟僅僅是任選的，并且如果處理(以及相應地獲得以用于處理)僅包含少量殘留細胞的樣品例如血漿或血清，則該步驟可以廢棄。然而，為了改進結果，優(yōu)選地也除去相應的殘留細胞(或可能殘留的細胞)，因為它們可能在分離期間污染細胞外核酸。取決于樣品類型，可以例如通過離心、優(yōu)選為高速離心，或通過離心之外的手段例如過濾、沉降或者如果打算避免離心步驟的話結合于(任選地磁性 )粒子的表面，來分離并去除細胞，包括殘留細胞。相應的細胞去除步驟也可以被容易地包括在自動樣品制備流程中。被相應地去除的細胞也可以進一步處理，以便例如分析細胞內核酸?？梢岳鐚⒓毎麅Υ妫?或可以從被去除的細胞分離生物分子例如核酸或蛋白。
[0100]根據(jù)一種實施方式，從中分離細胞外核酸的樣品是穩(wěn)定化的樣品。許多樣品例如血液樣品或源自于血液的樣品例如血漿或血清，在收集后使用適合的穩(wěn)定劑進行穩(wěn)定化。例如血液或源自于血液的樣品例如例如血漿或血清，通常至少通過添加抗凝劑、優(yōu)選為螯合劑例如EDTA或檸檬酸鈉進行穩(wěn)定化?？梢约尤胨褂玫姆€(wěn)定化作用以保護樣品中的細胞外核酸群體。在本領域中已知幾種實現(xiàn)樣品穩(wěn)定化、包括樣品中包含的細胞外核酸群體的穩(wěn)定化的方法。穩(wěn)定化防止細胞外核酸的降解和/或防止細胞外核酸被細胞內核酸、尤其是從樣品中包含的細胞釋放的基因組DNA的污染。一種常用的穩(wěn)定化方法使用甲醛來穩(wěn)定細胞膜，由此減少細胞裂解，此外，甲醛抑制核酸酶。相應的方法描述在例如US7, 332，277和US7, 442，506中。穩(wěn)定血液樣品的可替選方法描述在例如US2010/0184069和US2010/0209930中。用于穩(wěn)定化樣品的優(yōu)選方法公開在2011年9月26日提交的歐洲專利申請EP11182819.0和2011年9月26日提交的美國專利申請61/539，245中，以及今天提交并要求上述歐洲和美國申請的優(yōu)先權的相應的PCT申請中。
[0101]根據(jù)一種實施方式，樣品是穩(wěn)定化的樣品，其通過將樣品與下述物質相接觸來穩(wěn)定化:
[0102]a)至少一種凋亡抑制劑，[0103]b)至少一種高滲劑，其使樣品中包含的細胞穩(wěn)定，和/或
[0104]c)至少一種式I的化合物
[0105]:
【權利要求】
1.一種通過將細胞外核酸結合于帶有陰離子交換基團的固相以從樣品分離所述細胞外核酸的方法，所述方法包括下列步驟: a.在結合混合物中將所述細胞外核酸結合于所述固相，所述結合混合物具有允許所述細胞外核酸結合于所述固相的所述陰離子交換基團的第一 pH;其中所述樣品占所述結合混合物體積的至少8 5 % ； b.分離帶有所述被結合的細胞外核酸的所述固相； c.任選地清洗所述細胞外核酸； d.任選地從所述固相洗脫細胞外核酸。
2.權利要求1的方法，其包含下列步驟: a.酸化所述樣品以建立結合條件，并在結合混合物中將所述細胞外核酸結合于所述固相，所述結合混合物具 有允許所述細胞外核酸結合于所述固相的所述陰離子交換基團的(6.5的第一 pH，其中所述樣品占所述結合混合物體積的至少85%，并且其中所述固相由磁性粒子提供； b.分離帶有所述被結合的細胞外核酸的所述固相； c.任選地清洗所述細胞外核酸； d.從所述固相洗脫細胞外核酸。
3.權利要求1或2的方法，其包含下列步驟: a.酸化所述樣品以建立所述結合條件，并在結合混合物中將所述細胞外核酸結合于所述固相，所述結合混合物具有允許所述細胞外核酸結合于所述固相的所述陰離子交換基團的< 6.5的第一 pH，其中所述樣品占所述結合混合物體積的至少85%，并且其中所述固相由帶有叔氨基、優(yōu)選為二烷基氨基、更優(yōu)選為二乙基氨基丙基的磁性粒子提供； b.分離帶有所述被結合的細胞外核酸的所述固相； c.任選地清洗所述細胞外核酸； d.從所述固相洗脫細胞外核酸，其中被洗脫的核酸的長度和保持結合于所述陰離子交換基質的核酸的長度通過調整洗脫條件來控制，其中長度為約1000nt或更長、優(yōu)選地700nt或更長、更優(yōu)選地500nt或更長的核酸在所述洗脫步驟中絕大多數(shù)保持結合于所述固相。
4.權利要求2或3的方法，其中在步驟d.中，通過調整所述固相表面上正電荷的濃度，使得在步驟d.期間只有較長的核酸分子保持結合于所述固相，而較小的核酸被洗脫，來實現(xiàn)短核酸的選擇性洗脫，其中截止值通過選擇在洗脫期間使用的PH值來控制。
5.權利要求2至4的一項或多項的方法，其中在步驟d.中，細胞外核酸按照它們的尺寸被選擇性洗脫，其中所述尺寸分級洗脫步驟包括在高于所述第一 PH的第二 pH下洗脫一部分結合于所述固相的細胞外核酸，其中在這一步驟中從所述固相洗脫的核酸的平均長度短于保持結合于所述固相的核酸的平均長度。
6.權利要求1至5的一項或多項的方法，其通過將細胞外核酸結合于帶有陰離子交換基團的固相，用于從貧細胞或無細胞樣品、優(yōu)選為血漿或血清分離所述細胞外核酸，其中所述固相由優(yōu)選地帶有叔胺、優(yōu)選地包含二乙基氨基丙基的磁性粒子提供，所述方法包括下列步驟: a.酸化所述樣品以建立所述結合條件，并在結合混合物中將所述細胞外核酸結合于所述固相，所述結合混合物具有允許所述細胞外核酸結合于所述固相的所述陰離子交換基團的< 6的第一 pH，其中所述樣品占所述結合混合物體積的至少85% ； b.分離帶有所述被結合的細胞外核酸的所述固相； c.任選地清洗所述細胞外核酸； d.從所述固相洗脫細胞外核酸，其中在步驟d.中，細胞外核酸按照它們的尺寸被選擇性洗脫，其中所述尺寸分級洗脫步驟包括在高于所述第一 PH并> 8的第二 pH下洗脫一部分結合于所述固相的細胞外核酸，其中在這一步驟中從所述固相洗脫的核酸的平均長度短于保持結合于所述固相的核酸的平均長度，并且其中長度為約1000nt或更長、優(yōu)選地700nt或更長、更優(yōu)選地500nt或更長的核酸在所述洗脫步驟中絕大多數(shù)保持結合于所述固相。
7.權利要求2至6的一項或多項的方法，其中在步驟d)中，所述核酸按照它們的尺寸被選擇性洗脫，其中截止值由在所述洗脫期間使用的PH值和/或鹽濃度來控制。
8.權利要求1至7的一項或多項的方法，其中將所述樣品分拆，將所述樣品部分平行地進行處理，并將洗脫液或洗脫之前的陰離子交換材料重新合并。
9.權利要求1至8的一項或多項、尤其是權利要求1的方法，其中所述結合混合物通過將所述樣品的PH調整到所述第一 pH來制備。
10.權利要求1至10的一項或多項、尤其是權利要求1和9的方法，其中步驟a)具有一個或多個下述特征: i)所述第一 PH低于所述固相的陰離子交換基團的可質子化基團的pKa值； ?)向所述樣品加入至少一種酸化試劑和/或化合物，優(yōu)選為酸性溶液，以調整所述第-pH; iii)所述第一pH ( 6.5,優(yōu)選地< 6 ； iv)所述第一pH在選自4至6.5,4.5至6.5、5至6.5和5至6的范圍內；和/或 V)所述樣品占所述結合混合物體積的至少90%、至少95%或至少97%。
11.權利要求1至10的一項或多項、尤其是權利要求1和權利要求9和10的方法，其中所述樣品具有一個或多個下述特征: a)它是無細胞、貧細胞或含細胞的樣品； b)它選自全血、血漿、血清、淋巴液、尿液、液劑、腦脊液、腹水、乳液、支氣管灌洗液、唾液、羊水、精液、體液、身體分泌物、鼻分泌物、陰道分泌物、傷口分泌物和排泄物以及源自于上述樣品的樣品，尤其是從上述樣品通過移除細胞而產生的無細胞或貧細胞的樣品； c)它選自全血、血漿和/或血清； d)它是血衆(zhòng)； e)它是穩(wěn)定化的樣品；和/或 f)它是穩(wěn)定化的血漿樣品。
12.權利要求1至11的一項或多項、尤其是權利要求1和權利要求9至11的一項或多項的方法，其中所述被分離的細胞外核酸具有一個或多個下述特征: a)它們作為從所述樣品分離的總核酸的一部分而被分離； b)它們主要包含DNA； c)它們主要包含RNA；d)它們包含DNA和RNA的混合物； e)它們包含循環(huán)的細胞外核酸； f)它們包含疾病相關的核酸； g)它們包含腫瘤相關或腫瘤來源的核酸； h)它們包含炎性相關的核酸； i)它們包含胎兒核酸； j)它們包含病毒核酸； k)它們包含病原性核酸；和/或 I)它們包含哺乳動物細胞外核酸。
13.權利要求1至12的一項或多項、尤其是權利要求1和權利要求9至12的一項或多項的方法，其中在步驟d)中，在比用于將所述細胞外核酸結合于所述固相的第一pH更高的第二 PH下，從所述固相洗脫細胞外核酸。
14.權利要求13的方法，其具有一個或多個下述特征: i)洗脫在≥8的第二 pH下進行； ?)在步驟d中使用洗脫溶液； iii)在步驟d中，細胞外核酸按照它們的尺寸被選擇性洗脫，并且其中所述尺寸分級洗脫步驟包含下列步驟: aa)在高于所述第一 pH的第二 pH下將一部分結合于所述固相的細胞外核酸從其上洗脫，其中在這個步驟中從所述固相洗脫的核酸的平均長度短于保持結合于所述固相的核酸的平均長度； bb)任選地,優(yōu)選地在高于所述第二 pH的第三pH下,將在步驟aa)中保持結合于所述固相的細胞外核酸從所述固相洗脫。
15.權利要求1至14的一項或多項、尤其是權利要求1和權利要求9至14的一項或多項的方法，其中用于結合所述細胞外核酸的所述固相具有一個或多個下列特征: (i)使用磁性粒子作為固相； (?)所述固相帶有在所述第一 PH下帶正電荷的陰離子交換基團類型； (iii)所述固相帶有包含可質子化基團的陰離子交換基團類型，并且所述可質子化基團的PKa值優(yōu)選地在8至12、優(yōu)選地9至11的范圍內； (iv)所述固相帶有包含氮原子的陰離子交換基團類型，所述陰離子交換基團優(yōu)選為氨基，尤其是叔氨基例如二烷基氨基，優(yōu)選為二乙基氨基； (v)所述固相帶有在所述第一pH下不強烈結合于核酸的惰性配體，所述惰性配體優(yōu)選為不帶電荷的配體，尤其是包含至少一個羥基的配體，優(yōu)選為包含2，3- 二羥基丙基的配體； (vi)所述固相攜帶的所述陰離子交換基團與惰性配體的比例在約1:1至約1:10、優(yōu)選地約1:2至約1:5的范圍內，更優(yōu)選為約1:3 ;和/或 (vii)所述固相的表面用包含所述陰離子交換基團的硅烷化合物衍生，并且優(yōu)選地不用另一種硅烷化合物衍生。
16.權利要求1至15的一項或多項、尤其是權利要求1和權利要求9至15的一項或多項的方法，其具有一個或多個下列特征:(i)所述樣品是穩(wěn)定化的樣品，優(yōu)選為穩(wěn)定化的體液； (?)在步驟a)之前從所述樣品移除細胞，從而提供包含細胞外核酸的貧細胞或無細胞的樣品。
17.權利要求1至16的一項或多項、尤其是權利要求1和權利要求9至16的一項或多項的方法，其中在所述結合步驟a)之前將所述固相用聚合物進行預處理。
18.權利要求17的方法，其中所述聚合物是聚酸，優(yōu)選為聚丙烯酸。
19.權利要求1至18的一項或多項、尤其是權利要求1和權利要求9至18的一項或多項的方法，其具有一個或多個下述特征: (i)所述被分離的細胞外核酸被進一步純化； (?)對所述被分離的細胞外核酸進行處理和/或分析，并優(yōu)選地進行: aa)修飾； bb)與至少一種酶相接觸； cc)擴增； dd)反轉錄； ee)克??； ff)測序； gg)與探針相接觸； hh)檢測； ?)鑒定；和/或 jj)定量； 和/或 (iii)對所述被分離的細胞外核酸進行分析，以鑒定、檢測、篩查、監(jiān)測或排除疾病、感染和/或至少一種胎兒特征。
20.一種用于從樣品分離細胞外核酸的方法，所述樣品是或源自于體液，優(yōu)選地選自血液、血漿或血清，其中為了進行分離，將細胞外核酸結合于帶有陰離子交換基團的固相，其中所述方法包括下列步驟: a.在結合混合物中，在允許所述細胞外核酸結合于所述固相的所述陰離子交換基團的(6的第一 pH下，將所述細胞外核酸結合于所述固相； b.分離帶有所述被結合的細胞外核酸的固相； c.任選地清洗所述細胞外核酸； d.在比用于將所述細胞外核酸結合于所述固相的第一pH更高的第二 pH下，將所述細胞外核酸從所述固相洗脫； e.從所述洗脫液分離所述細胞外核酸。
21.權利要求20的方法，其具有一個或多個下列特征: a)所述樣品是穩(wěn)定化的樣品； b)在步驟a)之前從所述樣品移除細胞； c)按照權利要求19對所述被分離的細胞外核酸進行處理和/或分析； d)所述方法具有在權利要求1至18的一項或多項中所限定的一個或多個特征； e)所述樣品占所述結合混合物體積的至少85%。
22.—種具有改進的特征的結合核酸的固相的生產方法，所述方法包括將結合核酸的固相與選自聚丙烯酸、馬來酸共聚物、聚磺酸酯、聚磷酸酯和聚(dT)的聚合物相接觸，并將所述聚合物結合于所述結合核酸的固相，其中當用于權利要求1至19的一項或多項的核酸分離方法中時，已用所述 聚合物處理的結合核酸的固相與未處理的結合核酸的固相相比，對長度小于500nt的核酸提供更高的得率。
【文檔編號】C12N15/10GK103930546SQ201280055508
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年9月25日 優(yōu)先權日:2011年9月26日
【發(fā)明者】馬丁·霍利茨, 安妮特·諾孔, 馬庫斯·施普倫格-豪塞爾斯, 彼得·格林菲爾德, 克里斯托夫·埃爾巴赫 申請人:凱杰有限公司