專利名稱：核酸和細(xì)胞疫苗的組分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗的組分，特別是疫苗的組分中含有核酸和基因修飾的抗原呈遞細(xì)胞，以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
用核酸序列，包括DNA或者RNA序列，作為接種的方法已經(jīng)于最近十年期間發(fā)展起來了。DNA疫苗是比較容易制造的，而且穩(wěn)定、造價(jià)低。另外，重復(fù)性的使用DNA疫苗不會產(chǎn)生明顯的載體特異性免疫反應(yīng)。當(dāng)裸的質(zhì)粒DNA打進(jìn)小小鼠的皮膚和肌肉，DNA將會被旁邊的細(xì)胞吸收掉。這些非淋巴組織表達(dá)質(zhì)粒所編碼的蛋白，然后這抗原肽在與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類或者II類分子結(jié)合后向T淋巴細(xì)胞上呈遞(Annu.Rev.Immunel.2000，18927)。
DNA免疫接種對抗不同的病原體感染和惡性疾病的能力已經(jīng)在動物模型上研究過(Annu Rev.Immunol.1997，15617-648)。DNA免疫接種可以抑制自身免疫疾病以及抑制過敏反應(yīng)(Nat.Med.19962899-905，Nat.Med.1996，2540-544)。最近的研究結(jié)果表明，人體上用DNA疫苗能產(chǎn)生對抗瘧疾感染和HIV多肽的細(xì)胞性免疫反應(yīng)(Science1998，282476-480，Lancet 1998，3511320-1325)。
典型地，質(zhì)粒DNA載體有兩個(gè)主要單元(1)質(zhì)粒骨架，用于傳送輔助因子；(2)轉(zhuǎn)錄單元，包括啟動子、抗原性核苷酸序列以及多聚腺苷酸附加序列，它們一起指導(dǎo)蛋白的合成。
當(dāng)今DNA疫苗的主要問題是不像我們想象的那么有效。從臨床前工作和臨床試驗(yàn)中得不到滿意的結(jié)果，讓人們對DNA疫苗的應(yīng)用產(chǎn)生嚴(yán)重懷疑。所以，疫苗效率的改善成為DNA疫苗發(fā)展的一個(gè)重要目標(biāo)。
樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)是造血來源的專職化的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)。雖然所有DCs具有共同的抗原(Ag)處理和T細(xì)胞激活化的功能，但是DCs細(xì)胞含有多種子型細(xì)胞類型和各種各樣的功能。
腫瘤表達(dá)一些能被T細(xì)胞識別的蛋白質(zhì)抗原，成為癌癥免疫療法的潛在目標(biāo)。樹突狀細(xì)胞(DCs)具有向T細(xì)胞呈遞抗原的獨(dú)特能力。這種特性已用于開發(fā)治療癌癥疫苗。在臨床試驗(yàn)上用DC接種去對抗非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)和黑色素瘤，已觀察到對抗腫瘤免疫反應(yīng)和腫瘤衰退的誘導(dǎo)(Annu Rev Med.1999，50507-529)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的總的目的是提供一個(gè)新的疫苗組分。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一個(gè)生產(chǎn)所述的疫苗組分的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一個(gè)藥物組分。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一個(gè)疫苗組分，其含有編碼抗原性分子的核酸序列和修飾的抗原呈遞細(xì)胞，不限于樹突狀細(xì)胞(DCs)。
本發(fā)明的一個(gè)特別目的是提供一個(gè)疫苗組分可用于防止和/或治療癌癥、傳染病、老年性癡呆病、過敏、自身免疫疾病和血液病。
本發(fā)明的再一個(gè)特別的目的是提供一個(gè)疫苗組分含有樹突狀細(xì)胞子類，稱為血漿細(xì)胞狀樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)或者是干擾素生產(chǎn)細(xì)胞(IPCs)。這種樹突狀細(xì)胞子類經(jīng)過遺傳工程改造為可表達(dá)免疫調(diào)控分子。
這些和其它的發(fā)明目的在本發(fā)明的相應(yīng)權(quán)利要求中有相關(guān)定義。
簡單地講，本發(fā)明提供了一個(gè)新穎的疫苗組分。該組分包括一個(gè)編碼抗原分子的核苷酸序列和基因修飾的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，更好的方式是把核苷酸序列和基因修飾的抗原呈遞細(xì)胞預(yù)先培養(yǎng)成混合物。
編碼抗原的核苷酸序列可以是一個(gè)裸露的DNA或RNA序列。另外，編碼抗原的核苷酸序列更好的是插人和包含在一個(gè)載體中，這時(shí)核苷酸序列置于啟動子、增強(qiáng)子和/或其他調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄控制下。本發(fā)明所述的載體優(yōu)選為包含編碼抗原基因的質(zhì)粒DNA載體。該載體可能也包含其他核苷酸序列，這些序列可調(diào)節(jié)或控制對象宿主的免疫應(yīng)答。接受該疫苗組分的對象優(yōu)選為哺乳動物，更好的對象為人。這樣的免疫應(yīng)答調(diào)控序列可能是非甲基化的胞苷磷酸鳥苷(CpG)序列，或者是編碼參于調(diào)節(jié)對象免疫反應(yīng)的異種(xenogenic)分子(蛋白/多肽)的基因序列。
用于本發(fā)明的疫苗組分中的APCs細(xì)胞為適合于向其它細(xì)胞處理和呈遞抗原的細(xì)胞類型，特別是向免疫系統(tǒng)的CD4+和CD8+T細(xì)胞。更好的APCs的例子包括專職性APCs，比如DCs、IPCs、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和B細(xì)胞。更佳的APCs細(xì)胞類型是具有pDC/IPCs特征和功能的細(xì)胞，特別是可表達(dá)Toll-like受體9(TLR9)和P2X7受體，在微生物刺激下分泌細(xì)胞因子和產(chǎn)生大量I型α-干擾素和β-干擾素并且刺激免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞。
此外，APCs應(yīng)是被基因修飾的，或被其他方式修飾過，從而可表達(dá)免疫反應(yīng)調(diào)控分子。這樣的分子能通過提高抗原的輸送，刺激Th1或Th2細(xì)胞因子的分泌，激活A(yù)PCs，郎格罕氏(Langerhans)細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞和/或者提高免疫反應(yīng)，來增強(qiáng)對象的免疫反應(yīng)。另外，特別是在自身免疫疾病和過敏中，免疫反應(yīng)調(diào)控分子能幫助抑制免疫反應(yīng)或者誘導(dǎo)對象的免疫耐受性或無變應(yīng)性。用于修改APCs的合適的基因包括細(xì)胞因子基因、白介素基因、粘附分子、干擾素基因、趨化因子基因和趨化因子受體基因和編碼熱休克蛋白的基因、腫瘤壞死因子(TNF)、抗細(xì)胞凋亡劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)分子、生長因子和藥物學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明的疫苗組分中除了核酸序列和APCs以外也包括其他附加分子。這些附加分子可提高或抑制對象的免疫反應(yīng)，增加APCs的抗原呈遞，刺激Th1或Th2細(xì)胞因子的分泌，激活A(yù)PCs、郎格罕氏(Langerhans)細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞和/或調(diào)控APCs的免疫功能。
本發(fā)明的疫苗組分中最有效的組分包括基因修飾的pDCs或者是I型干擾素(IFN)生產(chǎn)細(xì)胞(IPCs)和編碼MHC結(jié)合的抗原并含有CpG基序(CpG motifs)的質(zhì)粒DNA。
本發(fā)明也涉及一種治療和防止疾病的方法，即將本發(fā)明的疫苗組分給予對象，優(yōu)選是哺乳類，最好是人類，以及其應(yīng)用。本發(fā)明的疫苗組分包括編碼與疾病相關(guān)的抗原性分子的核酸序列。例如，對于傳染病，核酸序列編碼與疾病有關(guān)的且來自感染微生物的蛋白質(zhì)或多肽，例如病毒、細(xì)菌、真菌、原生動物或寄生蟲的多肽或蛋白質(zhì)。在人體和動物上用編碼感染微生物的蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列和修飾APCs一起來接種，將會誘導(dǎo)引起對抗編碼的蛋白質(zhì)或多肽的特異性的免疫反應(yīng)。
癌癥通常有改變的或反常的基因表達(dá)。蛋白質(zhì)在癌細(xì)胞里反常水平的表達(dá)可以作為T細(xì)胞攻擊的目標(biāo)。本發(fā)明的疫苗組分中也包括編碼與腫瘤相關(guān)的抗原的核酸序列。
本發(fā)明也包括一個(gè)生產(chǎn)本疫苗組分的方法。這個(gè)方法包括在用本疫苗組分去治療或防止疾病時(shí)，設(shè)計(jì)鑒定與MHC結(jié)合的和與疾病或紊亂相關(guān)的抗原分子。
更好的具體化，是將編碼鑒定后的抗原分子的核酸序列引進(jìn)入一個(gè)質(zhì)粒DNA載體中，最好是一個(gè)含有非甲基化的CpG序列的質(zhì)粒載體中。分離APCs，可從對象(或接受者)的本體的APCs中來。APCs更好是特殊的樹突狀細(xì)胞子型，類似pDCs類型和(自然)干擾素導(dǎo)致細(xì)胞類型(NIPCs)并且具有在例如象質(zhì)粒DNA的刺激下能產(chǎn)生I型干擾素的能力。APCs由一個(gè)或幾個(gè)編碼免疫共刺激分子的基因修改過后，調(diào)節(jié)了APC的功能和刺激了免疫效應(yīng)細(xì)胞。最后，將編碼抗原的核苷酸序列和基因修飾APC混合在一起，孵育，完成制造方法以及結(jié)束本發(fā)明的疫苗組分的具體化。
因此，根據(jù)本發(fā)明而獲得正結(jié)果的主要特點(diǎn)是將基因修飾的APCs和編碼抗原的核苷酸序列一起使用。本發(fā)明的另外的特點(diǎn)是在使用前預(yù)先孵育疫苗中的兩個(gè)主要成份。
這樣的預(yù)先孵育允許APCs攝取核苷酸序列。在進(jìn)入APCs后，抗原序列將會被處理和呈遞，然后CpG序列結(jié)合到不同的受體上包括TLR9，結(jié)果激活了APCs和產(chǎn)生了免疫調(diào)控的分子，例如I型干擾素和細(xì)胞因子。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)——與以前的DNA疫苗組分比較，本發(fā)明的疫苗組分在長腫瘤的小鼠上應(yīng)用具有更優(yōu)的抗腫瘤效率；——與單用核苷酸序列或者是編碼抗原的核苷酸序列的質(zhì)粒作疫苗相比，本發(fā)明的疫苗組分治療癌癥具有5倍以上的效應(yīng)；——與用含有編碼抗原的核苷酸序列的質(zhì)粒DNA或者是空的質(zhì)粒載體作疫苗相比，本發(fā)明的疫苗組分對在體內(nèi)活化腫瘤特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)具有8倍以上的效應(yīng)；——與唯一用基因修飾的APCs和其MHC-I類分子裝載了抗原多肽作疫苗相比，本發(fā)明的疫苗組分對在體內(nèi)活化腫瘤特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)具有2倍以上的效應(yīng)；——用本發(fā)明的疫苗組分接種能活化和誘導(dǎo)識別在疫苗組分含有的腫瘤肽的腫瘤特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)；——與削弱的或失活的病原體相比，能消除引進(jìn)未完全失活的病原體的風(fēng)險(xiǎn)；——為了打破對自身抗原耐受和在對象上引導(dǎo)對抗自身抗原的免疫反應(yīng)，本疫苗也能包括異種屬的核苷酸序列；——通過簡單地交換編碼抗原的核苷酸序列，能用于治療和/或防止大范圍疾病和紊亂；以及——通過對疫苗組分的抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，允許引進(jìn)免疫調(diào)控的分子。
本發(fā)明所具有的其它優(yōu)點(diǎn)將在下面作具體化的描述。
簡要


通過參考以下的描述與附圖，將會對由本發(fā)明的對象和優(yōu)點(diǎn)作進(jìn)一步更好的理解。
圖1為本發(fā)明生產(chǎn)或準(zhǔn)備疫苗組分的方法流程圖；圖2為圖1中提供的疫苗中提供核苷酸的方法流程圖；圖3為圖1中提供的疫苗中提供APC的方法流程圖；圖4為圖1中疫苗生產(chǎn)方法的附加步驟的流程圖。
圖5為說明以莫洛尼氏(Moloney)鼠白血病病毒載體構(gòu)造的含鼠CD40配體(CD40L)基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體(RVV-mCD40L)的概要圖；圖6為說明用RVV-mCD40L來轉(zhuǎn)導(dǎo)DCs。在重復(fù)性的轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選以后，DCs容易地在它們的細(xì)胞表面表達(dá)CD40L，而且超過96％的DCs表達(dá)CD40L，這些細(xì)胞被用于本發(fā)明所述的疫苗組分的一個(gè)例子中；圖7A說明在親代BM185wt腫瘤細(xì)胞上免疫反應(yīng)激活分子的表達(dá)。
圖7B說明在DCs上表達(dá)B220分子；圖8說明在D2SC/wt，基因修飾的D2SC/CD40L和D2SC/GM-CSF細(xì)胞上表達(dá)CD8、CD11c、MHC類II(I-A)、B7.1、B7.2和CD40L分子；圖9說明由Western blot檢測DCs表達(dá)TLR9蛋白質(zhì)。
圖10概要地表明空的pVAX-1載體的一部分和含有小基因(minigene)序列跨過人的e1a2融合區(qū)域的pVAX-e1a2載體的一部分。另外，圖上表明通過體外pVAX-1和pVAX-e1a2質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)錄結(jié)合的翻譯分析，檢查出小基因序列編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)品；圖11A顯示D2SC/wt和D2SC/CD40L細(xì)胞誘導(dǎo)同種異體T細(xì)胞增生的能力。與未改造過的親代DCs比較，被基因修飾的DCs誘導(dǎo)8倍以上同種異體T細(xì)胞增生；圖11B說明D2SC/wt和D2SC/CD40L引導(dǎo)自體T細(xì)胞增生。與未改造過的親代DCs比較，被基因修飾的DCs誘導(dǎo)4倍以上的自體T細(xì)胞增生。
圖12.A說明將基因修飾的DCs用于接種時(shí)的滴定的最佳劑量，該DCs在注射前裝載了腫瘤溶解物；圖12B說明通過單獨(dú)接種脈沖腫瘤溶解物抗原的基因修飾DCs對長腫瘤小鼠的治療；圖13表明在只用腫瘤溶解物的單獨(dú)治療，或者脈沖腫瘤溶解物的基因修飾的DCs的單獨(dú)治療，在長腫瘤的小鼠上誘導(dǎo)產(chǎn)生了腫瘤特異性的CTLs。
(a)用裝載腫瘤溶解物的D2SC/CD40L或D2SC/GM-CSF細(xì)胞來單獨(dú)接種，產(chǎn)生了能特異殺死親代BM185wt腫瘤細(xì)胞的腫瘤CTLs。(b)值得注意的是，腫瘤CTLs不殺死同源的A20淋巴瘤。
圖14概要地說明本發(fā)明使用的小鼠接種模型的一個(gè)例子；圖15說明在長有bcr/abl陽性腫瘤的小鼠上用不同的疫苗組分來接種后腫瘤消失的小鼠的百分比。另外，為了檢驗(yàn)所誘導(dǎo)的免疫保護(hù)性的效力和特異性，用活的親代BM185wt腫瘤細(xì)胞再次挑戰(zhàn)腫瘤消失的小鼠。
圖16說明用pVAX-e1a2和DC/CD40L來接種誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異性的和e1a2特異性的CD8+T細(xì)胞；圖17說明本發(fā)明的疫苗組分與其它的疫苗組分在長有bcr/abl陽性腫瘤的小鼠的治療效果上的比較；圖18.A說明在用不同的疫苗策略進(jìn)行免疫后，在體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。從腫瘤消失的小鼠中形成的CTLs是特異性地直接對抗親代腫瘤細(xì)胞，BM185wt細(xì)胞。
圖18B說明在用不同的疫苗組分接種以后，在體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤特異性的T細(xì)胞的應(yīng)答。從腫瘤消失的小鼠上提取的在體外培養(yǎng)產(chǎn)生的CTLs，識別在TAP缺陷的RMA-S細(xì)胞上裝載的e1a2肽；圖19說明在體外T細(xì)胞擴(kuò)展以后產(chǎn)生的CD8+CTLs的百分比；圖20說明特異性的CD8+T細(xì)胞識別在H-2LdIg復(fù)合物上裝載的e1a2肽；以及圖21說明一個(gè)可指導(dǎo)本發(fā)明所述的效果的機(jī)制的假說。
具體實(shí)施例方式
除非其他定義，這里所有被使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語可被本發(fā)明所屬領(lǐng)域的人理解。
以下提供在本發(fā)明中使用的許多的一般定義的參考Singleton P and Sainsbury D，Dictionary of microbiology and molecular biology，3rd ed.，2002，Walker，The Cambridgedictionary of science and technology，1988，Rieger R，et al.，eds.，Glossary of genetics，5thed.，1991，Hale WG and Marham JP，Harper Collins dictionary of biology，1991，Abbas A，et al.，Cellular and Molecular Immunology，2003，Blood 20011587-600.為了發(fā)明的清晰理解，本發(fā)明涉及以下定義。
除非另外說明，“核酸序列”的定義包括雙鏈和單鏈的DNA，寡核苷酸，cDNA和RNA.在定義中也包括像DNA-RNA，DNA-DNA之類的雜交體。在核苷酸序列或核酸序列的含義中也包括本領(lǐng)域的人所知的堿基修改，比如自然發(fā)生的結(jié)構(gòu)變異和人工合成的非自然發(fā)生的類似物。
“免疫應(yīng)答”指的是由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和分子介導(dǎo)的在一個(gè)個(gè)體上發(fā)生的集體和協(xié)合的對外來物質(zhì)入侵的反應(yīng)。
“免疫系統(tǒng)”指的是提供對抗外來生物體的免疫或保護(hù)的集體性功能的分子、細(xì)胞、組織和器官。
“CpG基序(CpG-motifs)”指的是比如在細(xì)菌、酵母、昆蟲和neomatode DNA中的未甲基化“CpG二核苷酸”或“CpG基序”。在許多細(xì)菌質(zhì)粒上已鑒定了CpG基序并且它們可作為DNA疫苗的潛在佐劑(Immunol.Today 1998，1989-97)。CpG-DNA現(xiàn)已知道是一個(gè)強(qiáng)力的Th1-like佐劑，它不僅促進(jìn)MHC-I類的限制性CTL對蛋白質(zhì)或多肽的交叉激活(cross-priming)，而且觸發(fā)Th1介導(dǎo)的抗體反應(yīng)(Immunity.2001 14499-502)。在其它方面，不含有CpG基序的DNA序列具有抑制免疫系統(tǒng)的作用(Arthritis and rheumatism.2003，481701-1707)。
“P2受體(P2receptors)”指的是細(xì)胞外核苷酸的受體。P2受體被劃分成兩個(gè)亞型G蛋白質(zhì)耦聯(lián)受體(P2Y)和配體門控離子通道受體(P2X)(Curr Opin Cell Biol.1996，8474-483)。
“抗原呈遞細(xì)胞(APC)”指的是具有抗原處理和抗原呈遞功能的細(xì)胞。這些APCs在其細(xì)胞表面顯示與MHC分子結(jié)合的蛋白質(zhì)抗原的肽片段，并且激活抗原特異性的T細(xì)胞。除了顯示肽片段-MHC結(jié)合體之外，APCs也表達(dá)最適宜T細(xì)胞激活的共刺激分子。特別是，APC特指專職性APC，包括DCs、IPCs、NIPCs、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞，尤其是pDCs，IPCs，NIPCs，以及具有pDCs/IPCs/NIPCs特征和功能的專職化的APCs，例如在微生物刺激后能表達(dá)TLR9并產(chǎn)生或分泌I型干擾素和進(jìn)一步分泌TNF-a的細(xì)胞。
“修飾APCs”指的是通過用病毒載體或由非病毒載體處理后，獲取基因或蛋白信息的抗原呈遞細(xì)胞。遺傳修飾的結(jié)果使基因或蛋白物質(zhì)進(jìn)入或結(jié)合到抗原呈遞細(xì)胞中并在那里表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面是提供含有分離或極大純化的異種核苷酸序列或編碼抗原分子核酸序列和基因修飾抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的疫苗組分。
疫苗組分更好地是作為核苷酸序列和APCs的相互混合物來提供的。比如，核苷酸序列和APCs更好地是預(yù)先混合和孵育后才引入對象。與以前的DNA疫苗比較，本發(fā)明的疫苗組分獲得增強(qiáng)的免疫應(yīng)答和優(yōu)越的治療和保護(hù)效果，特別是在消滅已存在癌細(xì)胞和保護(hù)宿主抵抗腫瘤細(xì)胞的再挑戰(zhàn)。
以本發(fā)明的核苷酸序列編碼的抗原分子、RNA或更好是與MHC結(jié)合的抗原肽/蛋白質(zhì)，當(dāng)引入對象中產(chǎn)生對抗原的免疫應(yīng)答。該抗原更好的是一個(gè)產(chǎn)生免疫性的分子，一個(gè)產(chǎn)生免疫性的分子片段，比如產(chǎn)生免疫性的蛋白質(zhì)、肽或核糖核酸分子或其片段。
本發(fā)明的基于核酸的疫苗可以是單價(jià)的或多價(jià)的疫苗。在單價(jià)疫苗的構(gòu)成中，核苷酸序列編碼一個(gè)抗原分子，而在多價(jià)疫苗的構(gòu)成中，核苷酸序列包含至少一個(gè)編碼異源或同源抗原的多抗原的異源基因。因此用多價(jià)疫苗注入對象從而引進(jìn)和呈遞了多個(gè)抗原，造成激活和識別不同抗原的抗原特異性的T細(xì)胞。本發(fā)明也包括抗原序列的幾個(gè)重復(fù)拷貝，比如，提供為兩倍體或三倍體等。
本疫苗組分的核苷酸序列也包括其它免疫共刺激或調(diào)控的序列，比如編碼具有免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)效應(yīng)的蛋白質(zhì)或肽分子的基因序列。共刺激的DNA序列，比如未甲基化的CpG基序也可包括在核苷酸序列中。
本發(fā)明所述的核苷酸序列更好但不限于的是，一起輸入的裸露DNA或RNA，更好的方案是與基因修飾的APCs作為混合物輸入。如果提供的為RNA序列，核酸序列也包括允許在對象(接受者)細(xì)胞中翻譯的基序。同樣，如果提供的為DNA，核酸序列包括基序，比如啟動子、可能的增強(qiáng)子和/或其它調(diào)控核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的元素。
然而，編碼抗原的核苷酸序列，更好是包括在一個(gè)具有啟動子轉(zhuǎn)錄控制的載體中，比如，包括在含有表達(dá)控制序列的載體表達(dá)盒中。此外，載體或含有表達(dá)控制序列的載體更好是包括其它的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄/翻譯所需和要求的調(diào)控序列，包括但不限于多聚腺苷酸化(polyadenylation)序列，轉(zhuǎn)錄序列和增強(qiáng)子。載體中含有的啟動子或增強(qiáng)子可以有細(xì)胞類型特異性或組織特異性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)性設(shè)計(jì)或疫苗構(gòu)建，啟動子可是可誘導(dǎo)或有選擇性地被激活。接種人體的適當(dāng)?shù)膯幼永影ú《締幼?，比如巨?xì)胞病毒(CMV)啟動子。本發(fā)明的載體可以是微生物載體或非微生物載體。
本發(fā)明所述的一個(gè)載體的例子是脂質(zhì)體。多種陽離子脂質(zhì)形式已被用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞。將聚乙二醇的衍生物插入脂類膜或脂質(zhì)體，可能增加脂質(zhì)體在靜脈輸注后的循環(huán)半衰期。
另一類被活躍研究的合成載體是陽離子聚合物。一般原則是在帶正電荷的聚合物和帶負(fù)電荷的DNA分子之間形成復(fù)合物。與陽離子脂類比較，陽離子聚合物對凝聚DNA是高效的。優(yōu)選作為基因傳遞的聚合物例子是多聚L-賴氨酸、聚乙烯基亞氨(polyethylenimine(PEI)和多聚葡萄糖氨(polyglucosamines)和多聚脂質(zhì)體(polylipid)。
并且，小顆粒，比如納米顆粒(nanoparticles)也能作為本發(fā)明的載體使用。
本發(fā)明所述的更優(yōu)選的載體是編碼MHC結(jié)合抗原的DNA質(zhì)粒載體。質(zhì)粒DNA的骨架更好的是包含具有促有絲分裂活性的免疫調(diào)節(jié)序列或輔助因子。本發(fā)明所述的細(xì)菌DNA質(zhì)粒載體的應(yīng)用，無論是裸露DNA還是埋在脂質(zhì)體或陽離子聚合物里，或小顆粒，提供了進(jìn)一步的顯著優(yōu)勢。這些質(zhì)粒DNA載體也包括免疫刺激的CpG核苷酸序列。因此，除了在對象上傳遞和表達(dá)本發(fā)明的抗原，質(zhì)粒載體還能刺激對象的免疫應(yīng)答。
另外，病毒系統(tǒng)也能被用于傳遞和隨后生產(chǎn)本發(fā)明的抗原或免疫調(diào)控分子。病毒是傳遞核苷酸序列有吸引力的載體，因?yàn)樗鼈儼l(fā)展了進(jìn)入寄主細(xì)胞和表達(dá)它們的基因的特殊和高效率的方法。在病毒載體發(fā)展中的主要挑戰(zhàn)是安全問題。復(fù)制缺陷型病毒載體或復(fù)制型病毒載體目前都用于基因治療。用病毒載體來進(jìn)行基因傳遞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。迄今在臨床試驗(yàn)有至少四種類型病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、單純皰疹病毒和腺病毒相關(guān)病毒。其它研究中的病毒包括痘病毒，呼吸道腸道病毒(reovirus)，lentive病毒，新城疫病毒，甲病毒屬(alphaviruses)和多泡狀口腔炎病毒，這些都可以作為載體供本發(fā)明所用。
本發(fā)明的APCs是專門對免疫系統(tǒng)處理和呈遞抗原的細(xì)胞類型。本發(fā)明的APCs更好的是專職性APCs，包括但不限于DCs、IPCs、NIPCs、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞、朗格罕氏(Langherhans)細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、骨髓來源細(xì)胞、從干細(xì)胞分化的細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和/或各種各樣的上皮細(xì)胞和骨髓間質(zhì)細(xì)胞。混合至少兩種類型的APCs也可用于本發(fā)明。目前更好的APCs類型是pDCs、IPCs、NIPCs或具有pDCs/IPCs/NIPCs特征，更好的特征是能表達(dá)TLR9和可誘導(dǎo)生產(chǎn)I型干擾素(IFN)。這些細(xì)胞在抵抗微生物時(shí)扮演重要的角色，并且它們能交叉激活宿主T細(xì)胞以及作為先天的和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的聯(lián)結(jié)。
本發(fā)明的樹突狀細(xì)胞子型更好的是pDCs/IPCs，有處理和呈遞與MHC結(jié)合抗原的高能力，當(dāng)裝載病毒或細(xì)菌DNA時(shí)高水平產(chǎn)生I型干擾素，表達(dá)P2X7受體和toll-like受體，比如TLR9。
TLRs在宿主抵御感染時(shí)扮演重要角色。TLRs識別病原生物相關(guān)分子和負(fù)責(zé)激活宿主防御系統(tǒng)的信號，特別是促炎癥細(xì)胞因子。因?yàn)獒槍pG-DNA的細(xì)胞型應(yīng)答是通過TLR9來調(diào)節(jié)的，所以TLR9對本發(fā)明是特別重要的。TLR9是在樹突狀細(xì)胞(DCs)和巨噬細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上。TLR9不觸發(fā)CpG-DNA的內(nèi)吞作用而是激活DCs內(nèi)吞作用的下游。
因此，本發(fā)明中的APCs優(yōu)選自pDCs或其它具有上述特征和功能的APCs。
本發(fā)明所述的接種組分中的APCs是遺傳修飾的APCs。因此，APCs被修飾而表達(dá)調(diào)控分子，比如，增強(qiáng)或抑制或誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的耐受或過敏的分子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和/或根據(jù)設(shè)計(jì)或接種策略的其它細(xì)胞生存調(diào)整反應(yīng)。APCs也可以被修飾而增加抗原處理和呈遞，激活A(yù)PCs和/或提高效應(yīng)細(xì)胞的免疫功能。因此，遺傳物質(zhì)被引進(jìn)或轉(zhuǎn)移入APCs，或者從附加體位置暫時(shí)性表達(dá)，或者整合到APCs的宿主基因組而穩(wěn)定地表達(dá)，或提供作為一個(gè)穩(wěn)定的染色體外的元素。用于修飾APCs適當(dāng)?shù)幕虬?xì)胞因子基因、白介素基因、黏附分子、干擾素基因(比如，I型干擾素I IFN-a和IFN-b)，趨化因子基因、趨化因子受體基因、抗細(xì)胞凋亡基因和編碼不同免疫共刺激分子、免疫調(diào)控的分子、配體(如CD40L)和受體并且藥物中可接受載體的基因。
例如，CD40配體在參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)中扮演重要角色。CD40已成為B細(xì)胞、單核細(xì)胞和DCs細(xì)胞功能的一個(gè)關(guān)鍵信號。在抗原刺激和與DCs共激活后，CD40L(CD154)表達(dá)在被激活的T細(xì)胞里。CD40-CD40L相互作用導(dǎo)致DCs的活化和分化。在CD40-CD40L活化時(shí)，DCs獲取了誘導(dǎo)高水平生產(chǎn)細(xì)胞因子IL-12的能力，極化CD4+T細(xì)胞往Th1型發(fā)展，提高CD8+T細(xì)胞的增值和激活NK細(xì)胞。因此，CD40-CD40L互相作用作為觸發(fā)用于適應(yīng)性免疫反應(yīng)中的共激動分子表達(dá)和有效的T細(xì)胞活化作用。因此，本發(fā)明的APCs能通過基因修飾而提供高效率的CD40表達(dá)或CD40L表達(dá)。
修飾APCs適當(dāng)?shù)幕騻鬟f方案包括但不限于病毒和非病毒方法。能用的病毒載體舉例包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、胞疹和腺病毒相關(guān)病毒、牛痘病毒(vaccina virus)、單純皰疹病毒和lentvirus。基因的非病毒傳遞入APCs包括但不限于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入，脂質(zhì)體、電脈沖擊(electroporation)微注射(microinjection)和微生物來源的載體和從微生物中獲得的毒素。
此外，APCs更好地表達(dá)其它細(xì)胞表面分子包括但不限于對T細(xì)胞和其它類型的免疫細(xì)胞有效活化所要求的黏附分子和共激化分子。另外，本發(fā)明的APCs更好地表達(dá)趨化因子和趨化因子受體和FLIt3配體。
具體化，本發(fā)明的APCs可能從對象獲得，更好的但不限于，給予組分接種的同樣的對象，比如，使用自體同源APCs。選擇地，也包括同源異體的APCs或同源的APCs(來自于對象的同一雙胞胎)。
另一具體化，在體外或體內(nèi)，APCs能通過本領(lǐng)域公知方法可選地被富集或被純化和/或被擴(kuò)增。例如，不限于，在細(xì)胞因子的存在下，從外周血液、臍帶血或骨髓來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞激活和分化獲得APCs。
在進(jìn)一步具體化，疫苗組分被提供為包括編碼外來抗原的核苷酸序列和基因修飾的APCs的預(yù)處理混合物。
在APCs攝進(jìn)或內(nèi)吞核苷酸序列后，核苷酸序列被處理。CpG基序更好的是包括在APCs中激活toll-like受體途徑的核苷酸序列中，和刺激I型IFN-a和IFN-b的生產(chǎn)，以及呈遞編碼的抗原。這次事件可發(fā)生在核苷酸序列和修飾APCs的孵育期間，早于疫苗組分的注射。因此在孵育后，修飾的APCs、呈遞MHC結(jié)合抗原和表達(dá)或分泌免疫共刺激分子，在給對象打入疫苗時(shí)可直接或間接地激活初始APCs。本發(fā)明所使用的修飾APCs可接著移居到淋巴腺器官，能直接地或間接地活化初始T細(xì)胞、B細(xì)胞和DCs，因此獲得對抗外來抗原更加快速、增強(qiáng)的和更高效率的治療和對外來抗原的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
因此，本發(fā)明所述的混合核苷酸序列和修飾APCs是對于獲得疫苗的高效率的優(yōu)先的和新穎的步驟。
此外，一旦注入對象中，核苷酸序列或含有核苷酸序列的載體將被對象的細(xì)胞吞進(jìn)并在其中表達(dá)。隨后，合成的抗原分子在細(xì)胞液內(nèi)被蛋白酶體(proteasome)處理成多肽。
此外，在疫苗輸入以后，專職性APCs可直接地獲取抗原或從其他被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中釋放的抗原。本發(fā)明的轉(zhuǎn)染載體或核苷酸序列的細(xì)胞溶解，導(dǎo)致釋放編碼抗原從而被APCs攝取。
本疫苗構(gòu)成中編碼抗原分子的核苷酸序列和(遺傳)修飾APCs被提供和引入等滲溶液，優(yōu)選為緩沖溶液，或引入藥物上可接受的溶液、膠凝體，適用于注入對象，優(yōu)選是人體。這樣的溶液的一個(gè)例子是磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)。
本發(fā)明的接種溶液除核苷酸序列和APCs以外可包含附加的分子。這些附加分子包括調(diào)節(jié)分子(可以調(diào)節(jié)(提高或壓制)對象的免疫反應(yīng)，增加APCs的抗原呈遞，刺激Th1或Th2細(xì)胞因子的分泌，激活A(yù)PCs、朗格罕氏(Langherhans)細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞和/或提高APCs的免疫作用)，還包括細(xì)胞因子、黏附分子、熱休克蛋白質(zhì)和趨化因子，比如白介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、TNFα、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、IFNγ、I型IFN-α，IFN-β，熱休克蛋白質(zhì)(hsp)70、hsp90、gp96、CD40L和B7，載體和佐劑。
溶液也可包括調(diào)控免疫反應(yīng)的載體和佐劑，增加抗原呈遞，再指導(dǎo)疫苗對應(yīng)免疫系統(tǒng)和/或促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞。佐劑包括，但不限于，礦物鹽佐劑或礦物鹽膠凝體佐劑、顆粒佐劑、毒素、微粒佐劑、黏膜佐劑和免疫刺激性佐劑。佐劑的例子包括氫氧化鋁、磷酸鋁膠凝、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、細(xì)菌超級抗原、角鯊烯或角鯊烯水包油(oil-in-water)佐劑形式、生物可降解和生物相容性聚酯、聚合脂質(zhì)體、三萜系配糖或皂角苷、N-乙?；?胞壁酰-L-蘇-D-異谷氨酰胺(N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin)、LPS和單磷酸類脂A和非活性的微生物。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是在對象上使用疫苗產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在這種情況下，疫苗組分，包括編碼抗原分子的的核苷酸序列和基因修飾的APCs，被用藥于對象，更好的為哺乳類對象和更好的為人體。
在本發(fā)明的進(jìn)一步體現(xiàn)是按照本發(fā)明所述注入對象所需的有效量的疫苗組分從而治療和/或預(yù)防對象疾病的方法，更好的對象是哺乳動物，最好的對象是人體。
本發(fā)明同樣指一種疫苗組分，含有編碼抗原的核苷酸序列和基因修飾的APCs，用作藥劑。在其它具體化，本發(fā)明教導(dǎo)了疫苗組分可用于生產(chǎn)治療或預(yù)防傳染病的藥劑的用途，其中編碼傳染物質(zhì)相關(guān)抗原的核苷酸序列是介入疾病的。而另一個(gè)具體化是疫苗組分可用于生產(chǎn)治療或預(yù)防癌癥的藥劑的用途，該核苷酸序列編碼由癌細(xì)胞表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原。
用于治療或預(yù)防傳染病的本發(fā)明的疫苗組分是由以下的傳染物質(zhì)導(dǎo)致的，包括但不限于，病毒、細(xì)菌、真菌、原生動物和寄生生物。不管怎樣，疫苗組分中含有編碼與致病性微生物相關(guān)的抗原分子的核苷酸序列。此外，這個(gè)抗原分子更好地由被接種的對象的免疫系統(tǒng)識別為非己物。
病毒性疾病可通過本發(fā)明疫苗來治療或預(yù)防，包括由以下病毒所引起的疾病腺病毒、蟲媒病毒、柯薩奇病毒、巨細(xì)胞病毒、刺病毒(echinovirus)、棘病毒(echovirus)、漢坦病毒(hantavirus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、單純皰疹I(lǐng)型病毒、單純皰疹I(lǐng)I型病毒、阿氏病病毒(Aujeszky′s disease virus，ADV)、I型和II型HIV(HIVenv蛋白也能作為抗原分子)、流行性感冒病毒(NP抗原能作為抗原分子)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、乳頭瘤病毒(papilloma)、乳多空病毒(papova)、骨髓灰質(zhì)炎病毒、呼吸道合胞病毒(syncytial)、鼻病毒(rhinovirus)、牛疫(rinderpest)、引致腹瀉的輪狀病毒(rotavirus)、風(fēng)疹病毒和水痘。
傳染病也可用本發(fā)明的疫苗組分來防治和/或治療，引起傳染病的例子有軍團(tuán)菌、分枝桿菌屬(hsp65抗原可能被用作分枝桿菌結(jié)核病抗原分子)、菌質(zhì)、奈瑟氏菌和立克次氏體。
本發(fā)明的疫苗組分可能也可治療原生動物引起的疾病，包括由kokzidioa、利什曼和錐蟲(trypanosoma)造成的疾病。但是相應(yīng)的寄生蟲病能由衣原體，瘧疾寄蟲、立克次氏體和利什曼主要鼠傳染(抗原分子可能是LACK抗原)造成。
本發(fā)明的疫苗組分也很適用于預(yù)防和/或治療癌癥。疫苗中的核苷酸序列編碼在特定癌癥類型中與腫瘤相關(guān)的抗原分子。
許多癌癥具有在癌細(xì)胞中基因或染色體易位的特征。這樣的易位引起兩個(gè)或更多編碼序列或部分連接起來，然后形成雜交或融合蛋白或多肽。這樣的雜交蛋白可能被病人的免疫系統(tǒng)識別為非自體，因此具有抗原性。一個(gè)最具特色的典型例子是易位造成癌癥基因的雜交，是來自于費(fèi)城(pH1)染色體易位，發(fā)生在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)和急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL)的病人。在染色體22和染色體9之間的易位形成合成bcr-abl融合轉(zhuǎn)錄的費(fèi)城染色體。在ALL中，斷裂點(diǎn)發(fā)生在bcr基因第一內(nèi)含子從而形成e1a2融合基因和產(chǎn)生具有致癌活力的一個(gè)185kDa酪氨酸激酶。
另外，許多癌癥的特征是特定基因及基因產(chǎn)物的反常的表達(dá)。腫瘤相關(guān)抗原不但在腫瘤中而且在宿主的正常組織中表達(dá)。為了誘導(dǎo)一個(gè)有效的抗腫瘤的免疫應(yīng)答，接種必須克服對自身抗原的免疫耐性。本發(fā)明的一個(gè)可選擇方法是選用異種來源的抗原，比如，在DNA質(zhì)粒載體中提供含有編碼腫瘤相關(guān)抗原的核苷酸序列從而沖破對自身抗原的免疫耐性而誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。另外，免疫系統(tǒng)中包含未從免疫系統(tǒng)發(fā)展過程中除掉的自身反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞。自身反應(yīng)的淋巴細(xì)胞可由在種類之間的交叉反應(yīng)來觸發(fā)。對小鼠自身抗原的交叉反應(yīng)免疫可由在異源的DNA免疫后識別相應(yīng)的人蛋白質(zhì)的免疫來誘導(dǎo)。因此，為在對象內(nèi)獲得一個(gè)免疫反應(yīng)，編碼自身抗原的核苷酸序列更好的是提供在異源的載體中。比如，異源DNA質(zhì)粒載體(包含異源序列、異種的基因序列、外來的基因序列)，為了打破對自身抗原的耐性，更好的是編碼異源蛋白質(zhì)和多肽的基因序列。
腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的非限制例子中，編碼序列可用于在本發(fā)明的疫苗組分中，包括KS 1/4全癌抗原，卵巢癌抗原(CA125)，前列腺酸磷酸鹽，前列腺特異的抗原，黑色素瘤相關(guān)抗原p97，黑色素瘤抗原gp75，高分子重黑色素瘤抗原，MAGE抗原家族，T細(xì)胞受體γ鏈可選擇閱讀碼框蛋白(TARP)抗原，前列腺特異的膜抗原和e1a2融合蛋白抗原和bcr/abl融合蛋白。
治療黑色素瘤、胰臟癌、乳腺癌和前列腺癌的疫苗目前被使用在臨床試驗(yàn)中。與以前的癌癥疫苗相比，對這些癌癥類型使用本發(fā)明的疫苗組分會得到優(yōu)越結(jié)果。進(jìn)一步用本發(fā)明的疫苗組分治療和/或防止非限定的癌癥例子是以下類型癌癥人體肉瘤和癌，比如，成纖維瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨發(fā)生肉瘤、脊索瘤、血管瘤、肉皮瘤、淋巴血管瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌癥、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭狀的腺癌、囊腺瘤、髓心癌、支氣管癌、腎臟細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜癌、松果體癌、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦膜膠質(zhì)瘤、黑色素瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜胚細(xì)胞瘤；白血病，比如，急性淋巴母細(xì)胞的白血病(ALL)，和急性髓細(xì)胞性白血病(成髓細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞、單核細(xì)胞和紅細(xì)胞)，慢性白血病(慢性單核細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞內(nèi)的白血病和慢性淋巴細(xì)胞內(nèi)的白血病)，原發(fā)性紅血球增多癥，淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病病)，多重性骨髓瘤，瓦爾登(Waldenstrm’s)巨球蛋白血癥，重鏈疾??；病毒引起的癌癥。
本發(fā)明的疫苗組分可用于消除已存在腫瘤或病原生物，治療癌癥或傳染病。但是，疫苗組分也可能或供選擇地用于保護(hù)對象，更好的對象是哺乳動物，最好的對象是人類，免受疾病遭遇或保護(hù)免受挑戰(zhàn)或腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)或致病性傳染物質(zhì)(微生物)的復(fù)發(fā)。在這種情況下，疫苗被使用為預(yù)防癌癥或傳染病，例如，有預(yù)防疾病的特性。
過敏和超敏反應(yīng)的不同的形式可由本發(fā)明來治療，通過在載體中使用適當(dāng)?shù)木幋a抗原的核苷酸序列。序列的使用取決于過敏的類型，并且能由本行專業(yè)人士選擇出來。例如，針對花生過敏癥，載體可包含編碼Arah 2抗原的核苷酸序列。
本發(fā)明的疫苗組分可被修飾而能治療I型糖尿病，但不限于，包含編碼胰島素的全部或部分核苷酸序列。疫苗組分也可用于治療老年性癡呆病人、不同的血液病、遺傳性的疾病、移植相伴或獲得的疾病及其獲得性的免疫缺陷。
本發(fā)明的疫苗組分可被引入一個(gè)對象，更好的對象是哺乳動物，最好的對象是人類，使用適當(dāng)?shù)暮团R床可接受的接種途徑，包括但不限于，皮下給藥、肌內(nèi)給藥、動脈內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥，血管內(nèi)給藥、口服，皮內(nèi)給藥，腹腔內(nèi)給藥，直接注入淋巴結(jié)內(nèi)和注入腫瘤內(nèi)。編碼抗原分子的核苷酸序列和基因修飾的APCs更好的是在引入前預(yù)先混合，比如，引入本發(fā)明的疫苗組分的兩個(gè)組分的混合物。
疫苗可通過所有常規(guī)手段引入，但不限于，包括注射器，管套針，導(dǎo)尿管，電穿孔，無針引進(jìn)等。
引入的劑量取決于受治療或接種的對象的狀況和大小以及引入疫苗組分的數(shù)量，引入頻率，引入路線，療法的類型，比如治療和/或預(yù)防，被治療或被接種的疾病類型。繼續(xù)的治療方案，包括部位、藥量和頻率可由對象的最初的反應(yīng)和臨床評斷來決定。然而，在癌癥的治療上，更好的是給予至少三次重復(fù)性接種。所用的疫苗組分的使用量可由本領(lǐng)域熟知的方法運(yùn)用在動物的藥量反應(yīng)試驗(yàn)的結(jié)果來確定。
另外本發(fā)明的另一方面是提供用本發(fā)明的接種方法來制備的試劑盒。第一具體化試劑盒包括一個(gè)含有編碼抗原分子的核苷酸序列和基因修飾的APCs混合物的容器。抗原分子更好地同疾病，如傳染病或癌癥關(guān)聯(lián)在一起，通過注入試劑盒的內(nèi)容對對象進(jìn)行治療或預(yù)防，更好的對象是哺乳動物和最好的對象是人類。
其它具體化試劑盒包含第一容器，包括制備編碼一個(gè)抗原分子的核苷酸序列，以及第二容器，包含遺傳修飾APCs的制品。在引入對象前，更好是將第一和第二容器的內(nèi)含物交互混合，即將第一容器的內(nèi)含物加入到第二容器的內(nèi)含物，或者將第二容器的內(nèi)含物加入到第一容器的內(nèi)含物里或?qū)⒌谝缓偷诙萜鞯膬?nèi)含物單獨(dú)地加入到所提供的第三個(gè)供混合的容器內(nèi)。混合物在注入對象之前可在一起孵育，更好的對象是哺乳動物和最好的對象是人類。
本發(fā)明的試劑盒包含疫苗組分，配藥構(gòu)成(治療或預(yù)防疾病或紊亂(disorder)，比如傳染病、癌癥、自身免疫疾病、過敏或糖尿病)。試劑盒中至少有一個(gè)容器，更好的是容器中含有基因修飾的APCs容器，也可包括另外的物質(zhì)和佐劑，可增加APCs的抗原呈遞，激活A(yù)PCs和/或提高APCs的免疫功能。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供生產(chǎn)疫苗組分的方法。如圖1的流程圖所示，在步驟S1，提供一個(gè)編碼抗原分子的核苷酸序列(誘導(dǎo)對抗一個(gè)所希望的免疫反應(yīng))。在步驟S2提供了基因修飾的APCs，如DCs、pDCs、IPCs、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和/或B細(xì)胞。在步驟S3，核苷酸序列和APCs混合從而完成本方法和結(jié)束本發(fā)明的疫苗組分的生產(chǎn)。
圖2更具體地說明在圖1中步驟S1的核苷酸序列的提供。在可選步驟S11，編碼與疾病或紊亂相關(guān)的抗原分子的核苷酸序列被鑒定和分離，這些疾病或紊亂是由疫苗組分來治療或預(yù)防的。該鑒定以及至少部分的鑒定可用本領(lǐng)域所知的MHC-結(jié)合肽基序查詢。本領(lǐng)域所知的方法，包括化學(xué)合成DNA序列和PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，可用于獲得相關(guān)的核苷酸序列。然后在步驟S12，鑒定和分離所得的核苷酸序列被克隆進(jìn)合適的載體。載體是經(jīng)選擇適應(yīng)于引入對象而且一但進(jìn)入對象，能表達(dá)核苷酸序列，隨后得到希望的抗原分子。所獲的載體然后被繁殖在步驟S13，即在寄主細(xì)胞內(nèi)，體外(in vitro)等。
圖1中提供APC的步驟S2在圖3中有較詳細(xì)的說明。在步驟S21中，分離APCs更好是從接受疫苗組分的對象上取得或前述的其它來源中取得。在該步驟S21，一個(gè)特別有利APC亞類，比如DCs或DC亞類，可被選擇和分離。在步驟S22，APCs是被(遺傳)修飾過。在這種情況下，引入一個(gè)或幾個(gè)基因，比如CD40L基因，編碼調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)分子的基因，基因可作為額外染色體元素或被插入APCs的染色體上而進(jìn)入抗原呈遞細(xì)胞。
在圖4中進(jìn)一步S31步驟中，另有物質(zhì)加入了載體-APCs混合物中。這些物質(zhì)至少包括細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子、熱休克蛋白和前面所提的一般調(diào)節(jié)接受疫苗組分的對象的免疫反應(yīng)和免疫細(xì)胞和/或提高效應(yīng)細(xì)胞和APCs的免疫作用的佐劑。核苷酸序列和修飾APCs的混合物也可能加上另外的物質(zhì)，更好是在步驟S32作為疫苗使用之前預(yù)先孵育，孵育的物理?xiàng)l件可以由本行業(yè)專業(yè)人士決定。為了提高核苷酸序列的被內(nèi)吞，孵育更好持續(xù)至少5分鐘，更好至少幾個(gè)小時(shí)。孵育時(shí)間由其它生理因素典型地表明，比如孵出溫度。通常，過夜，例如至24小時(shí)是適當(dāng)?shù)?，但不限于，直到孵出時(shí)間為限。溫度在孵育期間是更好的是至少4℃，最好為室溫(約20-25℃)或約37℃。孵育溶液的酸堿度更好是中性或輕微酸性。為了提高內(nèi)吞作用更好是通過共離心法將核苷酸序列(質(zhì)粒)和APCs被迫的結(jié)合在一起?；蛘哂闷渌募夹g(shù)，或者增加其他的技術(shù)，比如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑。
以下是用本發(fā)明的疫苗組成接種來對抗急性白血病的例子。因此，核苷酸序列編碼的抗原分子是同該類型癌癥相關(guān)的。但是，本領(lǐng)域應(yīng)知本發(fā)明并不局限于這個(gè)特殊的疾病和抗原而可被用于治療和/或預(yù)防上面所提的任何疾病或紊亂。
實(shí)施例本發(fā)明的疫苗組分與各種各樣的其它接種方法比較，包括用抗原肽和編碼的抗原肽質(zhì)粒DNA來接種。
細(xì)胞系
A20(H-2d)是從BALB/c小鼠上獲得的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系，在本發(fā)明研究中用作CTL靶。A20細(xì)胞表達(dá)B220、MHC-I、MHC-II和CD19分子。
腫瘤細(xì)胞(BM185wt，H-2d)是小鼠急性白血病細(xì)胞系(pre-B ALL)。它是用編碼人的一個(gè)185 kDa bcr/abl致癌蛋白的反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞而建立的(Cell 1995，82981-988)。BM185wt細(xì)胞在其細(xì)胞表面表達(dá)B220、CD19和MHC-I分子。
D2SC/wt細(xì)胞(或D2SC/1)是由Paola Paglia博士熱心提供的。本發(fā)明中所使用D2SC/wt，(H-2d)是從BALB/c小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄病毒無限增殖而獲得的。(J.Immunel.Methods 1994，174269-279)D2SC/wt細(xì)胞大多顯示發(fā)育未全的DC形態(tài)，免疫表型和功能屬性，包括MHC組II分子的組成性表達(dá)(低)、共刺激分子B7/BB1，熱穩(wěn)定Ag，和ICAM-1，和具有有效的Ag呈遞功能(J Immunol Methods.1994，174269-279.，J.Immunol.1999，162(7)3757-3760)。
RMA-S是TAP2缺陷的腫瘤細(xì)胞系。它是從來自B6小鼠用勞舍爾氏(Rauscher)白血病毒誘導(dǎo)的T細(xì)胞淋巴瘤RBL-5而建立(Nature(London)1986，319675-678)。
細(xì)胞培養(yǎng)DCs細(xì)胞培養(yǎng)于IMDM培養(yǎng)基而且加有10％熱滅活的胎牛血清(FCS)(GibcoBRL，Life Technologies Ltd.，Scotland，UK)，2mM L-谷氨酸鹽，100IU/ml青霉素/鏈霉素，10mM hepes和5×10-5M 2-巰基乙醇。細(xì)胞被孵育在37℃和7％二氧化碳的濕潤空氣中。
腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液(ICN Biomedicals，Inc.Costa Mesa，CA)添加熱滅活的胎牛血清(FCS)(GibcoBRL，Life Technologies Ltd.Scotland，UK)，2mM L-谷氨酸鹽，100 IU/ml青霉素/鏈霉素，10mM hepes，0.1mM丙酮酸鈉，5x10-5M 2-巰基乙醇和10mM非必需氨基酸。細(xì)胞被孵育在37℃和5％二氧化碳的濕潤空氣中。
MHC-結(jié)合肽基序的搜索合成ALL特異性的e1a2融合蛋白的氨基酸序列用于篩選對小鼠MHC-I抗原(H-2Kd)的結(jié)合力(表I)(來自Kenneth Parker博士研制的HLA多肽結(jié)合預(yù)測程序，http//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind)。一個(gè)九氨基酸序列，AFHGDAEAL，位于e1a2融合蛋白的連接點(diǎn)區(qū)域(表I和圖10)，對結(jié)合小鼠H-2Kd顯示有高的計(jì)分。覆蓋e1a2微型蛋白多肽由標(biāo)準(zhǔn)方法合成和由高壓液相色譜(HPLC)純化。在實(shí)驗(yàn)中所使用的是高計(jì)分結(jié)合肽(AFHGDAEAL，SEQ ID NO5，看作為e1a2肽)和低計(jì)分結(jié)合肽(HGDAEALQR，SEQ ID NO6，看作為肽8)。肽K(ATGFKQSSK，SEQ ID NO7)與H-2Kd不結(jié)合而用作為控制肽。
以下的表I說明用肽結(jié)合預(yù)測程序來搜索HLA-肽基序的結(jié)果，以及所用的使用參數(shù)計(jì)分在500之上被認(rèn)為非常高計(jì)分的結(jié)合。
表1

遺傳修飾DCs
基于反轉(zhuǎn)錄病毒來進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的系統(tǒng)已被開發(fā)了。反轉(zhuǎn)錄病毒的前病毒經(jīng)處理而除去所有的gag、pol和env基因，僅保留下3′-和5′-LTRs。有缺陷的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可從包裝細(xì)胞系的上清液中獲得。
在本發(fā)明中，反轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見圖5)，(從MFG-mGMCSF包裝細(xì)胞系中獲得(Dr.Richard Mulligan饋贈，Children’s Hospital，Harvard Medical School，USA))和Moloney小鼠白血病病毒載體(MoMLV)，(PG1a.muCD40L(Dr.M.Brenner饋贈，Baylor College ofMedicine，USA))用于修飾DCs。
本發(fā)明所使用的DCs被修飾后釋放GM-CSF或在其細(xì)胞表面表達(dá)CD40L分子。使用muCD40L或MFG-mGMCSF反轉(zhuǎn)錄病毒載體將CD40L基因或GM-CSF轉(zhuǎn)入DCs。本發(fā)明所使用的DCs被修飾后釋放GM-CSF或在其細(xì)胞表面表達(dá)CD40L分子。在凝聚胺(polybrene)(10μg/ml，Sigma)存在下，D2SC/wt細(xì)胞由重復(fù)性的自旋離心來轉(zhuǎn)導(dǎo)。簡言之，105個(gè)細(xì)胞懸浮在0.5ml病毒上層清液和凝聚胺中，細(xì)胞和病毒共離心，10000rpm，在室溫下進(jìn)行60分鐘。離心后，上層清液被除去并將細(xì)胞懸浮在新的培養(yǎng)液中，細(xì)胞被孵育在37℃和7％二氧化碳的濕潤空氣中，24小時(shí)后再進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)導(dǎo)。DCs轉(zhuǎn)導(dǎo)效率因重復(fù)的離心而明顯提高。多輪的轉(zhuǎn)導(dǎo)后，表達(dá)CD40L分子的細(xì)胞的相應(yīng)百分比在圖6中說明。
在重復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，約70-80％的DCs表達(dá)CD40L轉(zhuǎn)基因。D2SC/CD40L細(xì)胞進(jìn)一步由轉(zhuǎn)基因的表達(dá)而被篩選。并且大約96％的DCs表達(dá)CD40L基因產(chǎn)物。CD40L基因表達(dá)多年保持穩(wěn)定，且即使在重復(fù)性解凍-結(jié)冰操作后依然穩(wěn)定。DCs在它們的細(xì)胞表面明確表達(dá)了CD40L?？聪旅娴膱D6。
根據(jù)廠商的說明書(CytoscreenTM，immuneassay kit，Biosource Int.，California，USA，BD Bioscience，U.S.A)，由ELISA方法來評估在D2SC/wt以及CD40L和GM-CSF基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后的DCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12、GM-CSF、IFN-γ的產(chǎn)生。在D2SC/GM-CSF細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GM-CSF分泌是11，370pg/ml/106細(xì)胞/24小時(shí)。
D2SC/wt和基因修飾的D2SC/CD40L和D2SC/GM-CSF DCs腫瘤細(xì)胞的免疫表型特性描述細(xì)胞與小鼠抗表面分子的單克隆抗體一起培養(yǎng)(2×105細(xì)胞/0.5μg mAbs，BD，Pharmingen，San Diego，CA)。以下的mAbs被使用了CD40-FITC(異硫氰酸熒光素共軛的mAB)，CD40L-PE(巰基化藻紅蛋白)，I-A-FITC，H-2Kd-FITC，B7.1-FITC，B7.2-PE，CD 11c-FITC，CD8α-PE，B220-FTIC，B220-PE，Thy1.2-FITC，Thy1.1-PE，IgG1-FITC，IgG2-PE。細(xì)胞表型在FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)上分析。
腫瘤細(xì)胞的免疫表型(BM185/wt)在圖7A中說明。BM185細(xì)胞在它們的細(xì)胞表面表達(dá)B220，CD19和MHC-I，I-A分子。但是，BM185wt細(xì)胞缺乏共刺激分子和CD40分子的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。
B220分子在D2SC/wt細(xì)胞的表達(dá)在圖7B中可見。因此D2SC/wt細(xì)胞表達(dá)標(biāo)記物(markers)，CD8a+，CD11c+(見圖8)；B220+，被視為小鼠DCs子類型，血漿細(xì)胞狀樹突狀細(xì)胞(pDCs)的典型標(biāo)志。
親代的D2SC/wt細(xì)胞和基因修飾的樹突狀細(xì)胞免疫表型(D2SC/CD40L)的比較及其說明可見圖8。親代的D2SC/wt細(xì)胞具有發(fā)育未全的DC表型和在它們的細(xì)胞表面表達(dá)MHC-1，I-A，CD8α、CD11.c、B7.1和B7.2，正如圖所示，但是缺乏CD40配體的表達(dá)。與之相比，在D2SC/CD40L細(xì)胞里CD40L是明確表達(dá)了。但是，在D2SC/CD40L細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12的分泌未查出。D2SC/CD40L細(xì)胞體外(inv itro)成長動力學(xué)與它們的親代細(xì)胞相似(數(shù)據(jù)未顯示)。
蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)根據(jù)制造商的說明書(Sigma)，DCs被溶解在緩沖液里，含有1％NP40、0.1％SDS、TBS和蛋白酶抑制劑的混合劑(cocktail)中。在4℃下，細(xì)胞在緩沖液中用超聲波處理。在經(jīng)過5000rpm、5分鐘、4℃離心后，收集可溶蛋白質(zhì)并用蛋白質(zhì)印跡法來分析。根據(jù)制造商的說明書(BioRad，USA，Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)，蛋白質(zhì)在12％SDS聚丙烯酰胺凝體中分離并轉(zhuǎn)移在PVDF濾紙上。初級的多克隆抗體，兔抗小鼠TLR9(Cat.No IMG-431，Imgenex，San Diago，USA)，在TBS緩沖中1∶1000稀釋后用(10mM Tris-Cl and 150mM NaCl，pH 8.0)。次級抗體是與辣根過氧化物酶(HRP)共軛的羊抗兔抗體。在圖9中說明本發(fā)明中的DCs表達(dá)小鼠TLR9受體。
D2SC/wt細(xì)胞是從脾臟中分離出的功能完全而發(fā)育未成熟的樹突狀細(xì)胞。D2SC/wt細(xì)胞表達(dá)一些熟知的標(biāo)記物，比如在一種DCs亞類即pDCs上發(fā)現(xiàn)的CD11c+，B220+，CD8α+，MHC-IIlow，TLR9+標(biāo)記。另外，當(dāng)與病毒、細(xì)菌和CpG DNA相互作用時(shí)，D2SC/wt細(xì)胞釋放很多I型干擾素-α和干擾素-β。由在原位雜交研究可檢查出D2SC/wt細(xì)胞表達(dá)極高拷貝數(shù)目的I型干擾素mRNA(Scand.J.Immunol.1997，46235-41；ElorantaML.，et al unpublished data)，從而得出D2SC/wt細(xì)胞是在小鼠中相當(dāng)于假定的人體自然干擾素產(chǎn)生細(xì)胞而且是樹突狀細(xì)胞的一種pDC/IPCs子類的結(jié)論。
質(zhì)粒DNA載體最近的研究表明，空的質(zhì)粒pcDNA3載體骨架包含一定數(shù)量的非甲基化的CpG基序。(Science 1996，273352-354)通過豬的白細(xì)胞和質(zhì)粒pcDNA3的孵育，在豬的白細(xì)胞中誘導(dǎo)高水平的干擾素-α和IL-6的產(chǎn)生。使pcDNA3的CpG二核苷酸上所有胞苷甲基化，則廢除了誘導(dǎo)干擾素-α產(chǎn)生的能力(Vet Immunol Immunopathol.200，7845-56)。
pVAX-1是根據(jù)FDA的推薦而從pcDNA3.1載體修改而構(gòu)建的(Invitrogen，CA，USA)。pVAX-1是一個(gè)3.0kb的質(zhì)粒載體，為開發(fā)人的癌癥疫苗而設(shè)計(jì)。
克隆編碼e1a2融合肽的微基因進(jìn)入含有CpG基序的質(zhì)粒載體為放大核苷酸序列而設(shè)計(jì)PCR引物，該核苷酸序列編碼預(yù)定的與MHC-I類型結(jié)合的e1a2融合肽。微基因的生產(chǎn)以補(bǔ)平反應(yīng)開始(Pharmacia)，使用了以下重疊的引物5’-TGCTAGCATGATCTGGCCCAACGACGGCGAGGGCGCCTTCCACGGCGACGCCGAGGCCCTGCAGCGC-3’(見SEQ ID NO1)和5’-AATCGATCACAGGCCCTGGGGCTCGAAGTCGCTGGCCACGGGGCGCTGCAGGGC-3’(參見SEQ ID NO2)。根據(jù)制造商的推薦，除上述兩引物外，反應(yīng)混合物包括Klenow片段(大腸桿菌DNA聚合酶I)、dNTPs和酶緩沖液。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)，接著使用同樣引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，加入PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNTPs，操作為95℃、1分鐘，隨后35個(gè)周期，每個(gè)周期為95℃、30秒，65℃、30秒和72℃、30秒。獲得的PCR片段被分離和最初地被克隆進(jìn)入pUC19質(zhì)粒載體的Nhe I/Cla I位置(NewEngland BioLabs)。Nhe I/Cla I片段然后被插入pBK-CMV質(zhì)粒載體(Stratagene)。在pBK-CMV含e1a2融合微基因的Nhe I/Kpn I片段最后被克隆入pVAX-1質(zhì)粒載體(Invitrogen，CA，USA)的Nhe1和Kpn1位置。一旦插入載體，e1a2融合微基因置于CMV啟動子的控制下。pVAX-e1a2結(jié)構(gòu)由DNA消化和DNA測序所證實(shí)。根據(jù)制造商的說明書，用Qiagen EndoFree Plasmid Maga Maga kit放大質(zhì)粒(Qiagen，Santas Clarita，CA，USA)。質(zhì)粒DNA純度由UV分光光度測定法和agarose膠凝電泳法來確定。純化的DNA以O(shè)D 260nm/OD 280nm吸收比率大于1.9是可用的。
空的pVAX-1載體和含編碼微型e1a2融合蛋白的核苷酸序列的載體pVAX-e1a2的圖見圖10。微型e1a2融合基因序列和對應(yīng)的多氨基酸序列被分別顯示在SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。
由一個(gè)體外轉(zhuǎn)錄聯(lián)結(jié)翻譯的分析法(TNT，Promega)測試pVAX-e1a2質(zhì)粒結(jié)構(gòu)所生產(chǎn)的產(chǎn)物大小。約1μg質(zhì)粒DNA以50μl體積孵育2小時(shí)，30℃，該混合物包含25μl兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解物、2μl TNT反應(yīng)緩沖液、1μl TNT T7RNA聚合酶，1μl的1mM氨基酸減去甲硫氨酸的混合物，4μl(35S)甲硫氨酸10mCi/ml和1μl的40U/μl的RNA RNAasin核醣核酸抑制劑。取3μl容量的反應(yīng)物裝載于16％SDS聚丙烯酰胺膠凝上。在烘干以后，膠凝體暴露于放射自顯影的照片。結(jié)果在圖10表明，e1a2融合蛋白只出現(xiàn)于pVAX-e1a2而不出現(xiàn)于空的pVAX-1。另外，用Lipofectin試劑轉(zhuǎn)染后，pVAX-e1a2轉(zhuǎn)錄在COS-7細(xì)胞系被檢測到(數(shù)據(jù)未顯示)?？傊?，pVAX-e1a2質(zhì)粒DNA，含96bp核苷酸序列跨過e1a2基因的融合區(qū)域，被轉(zhuǎn)錄和表達(dá)在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中。
幼稚T細(xì)胞的激活從脾臟制備單細(xì)胞的懸浮液。從BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠脾臟分離T細(xì)胞。從C57BL/6J小鼠脾臟用Percoll梯度所富集的T細(xì)胞作為同種異體T細(xì)胞的來源。根據(jù)制造廠家的說明書，從BALB/c小鼠使用MACS CD4或CD8 microBeads來分離純化CD4+或CD8+T細(xì)胞(Miltenyi Biotec，Germany)。刺激者(DCs)在輻射(50Gy，從137Cs)后用分級的量添加進(jìn)人反應(yīng)細(xì)胞(脾臟細(xì)胞或T細(xì)胞，2×105細(xì)胞/孔)在96-孔園底的微板上執(zhí)行(Becton，Dickinson)。實(shí)驗(yàn)一式三份執(zhí)行在最終容量為200μl/well。增殖化的測量由在第三天加入[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷(1μCi/孔)(Amersham International，Amersham，UK)，培養(yǎng)6小時(shí)，隨后收獲到glass-fibre濾紙和放入閃爍計(jì)數(shù)器(Beta counter，Pharmacia)來執(zhí)行。
基因修飾引發(fā)了未成熟的DCs刺激T細(xì)胞的能力作為一種未成熟的DCs，非修飾D2SC/wt細(xì)胞是差的T細(xì)胞刺激者。因此，比較了D2SC/wt和D2SC/CD40L刺激天然的同種異體T細(xì)胞增殖的能力。在圖11A說明，與非修飾親代DCs(D2SC/wt)比較，CD40L基因修飾的DCs(D2SC/CD40L)刺激同種異源T細(xì)胞增殖是高8倍。
D2SC/wt與D2SC/CD40L誘導(dǎo)天然的自體同源T細(xì)胞增殖的能力進(jìn)行了比較。在圖11B說明，與非修飾親代DCs(D2SC/wt)比較，CD40L基因修飾的DCs(D2SC/CD40L)刺激自身的T細(xì)胞增殖是高4倍。DCs被修飾而釋放GM-CSF(D2SC/GM-CSF)也可導(dǎo)致強(qiáng)的自體同源和自身T細(xì)胞增殖(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，在DCs上CD40配體表達(dá)是具有功能活躍的和參與了T細(xì)胞的刺激。明顯地，D2SC/CD40L細(xì)胞可獲取了在體內(nèi)注射后直接敏化自身T細(xì)胞的能力。在皮膚下注射后，發(fā)現(xiàn)DCs遷移入脾臟和淋巴結(jié)(數(shù)據(jù)未顯示)。
腫瘤抗原的制備自體的腫瘤溶胞產(chǎn)物是從BM185/wt細(xì)胞制備來的。腫瘤細(xì)胞被幾次重復(fù)性結(jié)冰(液氮)-解凍(37C熱水浴)的周期處理。腫瘤細(xì)胞裂解物進(jìn)一步被超聲波處理4℃30分鐘。細(xì)胞殘骸用2500rpm，10分鐘，4℃離心法去掉。收集可溶性蛋白并且由Bradford方法確定蛋白質(zhì)含量(Protein Assay，Bio-Rad，CA，U.S.A)。
用腫瘤抗原或腫瘤抗原肽來脈沖DCsDCs和腫瘤細(xì)胞裂解物(100μg/106 cells)在37℃，7％二氧化碳中預(yù)先孵育過夜。用PBS/5mM EDTA將DCs是從培養(yǎng)瓶分開并在注入小鼠之前仔細(xì)地洗滌。在肽脈沖實(shí)驗(yàn)中，106細(xì)胞與10μM肽在未含F(xiàn)CS培養(yǎng)液，37℃，5％二氧化碳中脈沖2小時(shí)。
用疫苗組分免疫雌性BALB/c小鼠(H-2d)，年齡6-8星期，購自M&B(丹麥)，并且養(yǎng)在Uppsala大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)條件的動物所內(nèi)。所有動物實(shí)驗(yàn)按照動物護(hù)養(yǎng)委員會的要求執(zhí)行(ref.nr.C63/97，C36/1)。
在致瘤性研究上，免疫活性的同源小鼠可實(shí)行皮下注射(s.c)增長劑量的BM185/wt細(xì)胞。在6-8星期老年小鼠上注射500個(gè)腫瘤細(xì)胞，在3-4星期內(nèi)導(dǎo)致100％死亡(參見上面的圖14)。注射用致死量(800個(gè)腫瘤細(xì)胞/小鼠)通常為目前的研究所采用。
尋找有效的消除腫瘤派生所需基因修飾的DCs最小劑量。在免疫前用腫瘤細(xì)胞裂解物隔夜裝載DCs。用106D2SC/CD40L細(xì)胞單一接種發(fā)現(xiàn)有效治療長有腫瘤的小鼠，見圖12.A。
長有腫瘤的小鼠被治療一次(在腫瘤點(diǎn)或在一個(gè)遠(yuǎn)位置)用腫瘤細(xì)胞裂解物脈沖D2SC/CD40L(p＜0.001)或D2SC/GM-CSF細(xì)胞(p＜0.001)。用CD40L或GM-CSF基因修飾的DCs免疫誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在圖12B顯示，單一接種已能充分根除已存在腫瘤細(xì)胞并且所有被治療的小鼠腫瘤消除(100％)。本結(jié)果代表四個(gè)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中一個(gè)。
誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)與在體內(nèi)同產(chǎn)生腫瘤特異性細(xì)胞毒素的T細(xì)胞(CTLs)聯(lián)系在一起的。在體外增生的CTLs專殺親代BM185腫瘤細(xì)胞(圖13A)，但不殺同源的A20腫瘤細(xì)胞系(圖13B)。
這些研究表明，在長有腫瘤小鼠上，遺傳修飾的DCs、D2SC/CD40L細(xì)胞具有刺激有效的治療免疫反應(yīng)的能力。
圖14中說明本發(fā)明使用的用于治療和預(yù)防接種的長有腫瘤小鼠模型例子。
質(zhì)粒DNA和DCs的預(yù)孵育為了提高質(zhì)粒對DCs的結(jié)合和促進(jìn)質(zhì)粒DNA內(nèi)吞入DCs，發(fā)展了共離心法。簡言之，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶里，基因修飾的DCs生長在適合的密度，用PBS/5mM EDTA解離37℃20分鐘。收集DCs和用PBS(未含Ca+，Mg+)洗滌并且懸浮在PBS中。質(zhì)粒DNA(1mg/ml)加到107DCs/ml。它們被共離心，10000rpm，室溫30分鐘。在離心后注射小鼠之前，質(zhì)粒DNA/DCs混合物被孵育額外的3小時(shí)，在37℃、7％二氧化碳中。
CTL分析在接種治療后，為了調(diào)查細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTLs)在體內(nèi)的發(fā)展，從正?；蚪臃N的小鼠中分離脾臟和淋巴結(jié)(LN)。純化T細(xì)胞由Percoll梯度方法或根據(jù)制造廠說明書的磁性活化細(xì)胞分選法(Miltenyi Biotec，Germany)用MACS CD4或CD8 MicroBeads來分離。在加有rhIL-2(10ng/ml)下用BM185/wt(200Gy，137Csγ--輻射)或BM185/CD40L(200Gy)再刺激T細(xì)胞5-7天。在常規(guī)4小時(shí)51Cr釋發(fā)細(xì)胞毒分析，死細(xì)胞被去除而活細(xì)胞被用為效應(yīng)器。簡言之，靶細(xì)胞先被51Cr標(biāo)明(25μCi/106細(xì)胞)在37℃為2小時(shí)。活效應(yīng)細(xì)胞與預(yù)先標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞在不同的效應(yīng)細(xì)胞-目標(biāo)細(xì)胞(effector-to-target)比率下孵育了4個(gè)小時(shí)。由51Cr釋放入培養(yǎng)液來測量細(xì)胞溶解，該結(jié)果代表三份重復(fù)樣品。
根據(jù)以下公式計(jì)算特異性溶解的百分比
伴刀豆凝集素A(Con A)激活的T胚細(xì)胞在對照實(shí)驗(yàn)中，從正常小鼠分離的脾臟細(xì)胞以2×106細(xì)胞/ml孵育48小時(shí)，在RPMI1640培養(yǎng)基中含有青霉素/鏈霉素，10％FCS，10mM Hepes，3×10-5M 2-巰基乙醇和3μg/ml ConA(Sigma)。Con A激活的T胚細(xì)胞用為抗腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞(負(fù)對照)。
統(tǒng)計(jì)分析所有動物實(shí)驗(yàn)以每組至少有五個(gè)或十個(gè)動物。所有的研究被重復(fù)了至少三次得以近似結(jié)果。分析生存區(qū)別是以卡方檢驗(yàn)(Chi-square test)來解釋實(shí)驗(yàn)小組之間區(qū)別的意義。
DNA和DCs接種效率的調(diào)查在0天，各只小鼠右側(cè)面(5小鼠/組)皮膚下注入有致死劑量的親代BM185/wt腫瘤細(xì)胞。在7、14和21天，在小鼠腫瘤點(diǎn)免疫接種了(1)PBS；(2)空的pVAX-1載體(100μg/小鼠)；(3)pVAX-e1a2(100μg/小鼠)；(4)D2SC/CD40L單獨(dú)沒有抗原；(5)經(jīng)預(yù)先孵育的pVAX-e1a2質(zhì)粒DNA和D2SC/CD40L細(xì)胞(106細(xì)胞/100μg質(zhì)粒DNA/小鼠)。腫瘤大小每星期檢測兩次。當(dāng)腫瘤檢測到時(shí)，認(rèn)為小鼠是在生存終點(diǎn)和被犧牲了。
盡管在質(zhì)粒載體的骨架里含有可能免疫刺激的CpG基序，單獨(dú)用空的pVAX-1載體或pVAX-e1a2載體治療長有腫瘤的小鼠，結(jié)果沒有消除已存在的腫瘤。在沒有腫瘤抗原的情況下，用D2SC/CD40L細(xì)胞治療長有腫瘤的小鼠，結(jié)果沒有消除腫瘤。相反，共同送遞pVAX-e1a2載體和D2SC/CD40L細(xì)胞表現(xiàn)出優(yōu)越的抗腫瘤效果。以pVAX-e1a2和D2SC/CD40L細(xì)胞接種導(dǎo)致100％高效率消除在所有被治療的小鼠原有的腫瘤細(xì)胞(p＜0.01)。
進(jìn)一步調(diào)查所誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答保護(hù)小鼠免受親代腫瘤細(xì)胞再挑戰(zhàn)的能力。最后接種以后的一個(gè)星期，在一個(gè)遠(yuǎn)點(diǎn)位置將致死劑量的親代腫瘤細(xì)胞注入腫瘤已消除的小鼠。圖15顯示，用pVAX-e1a2載體和D2SC/CD40L細(xì)胞多次性的治療長有腫瘤的小鼠，結(jié)果發(fā)展了高效率的抗腫瘤免疫應(yīng)答足以保護(hù)小鼠免受腫瘤細(xì)胞再挑戰(zhàn)，大約80％小鼠被保護(hù)了并且保持無腫瘤存在(結(jié)果代表三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中的一個(gè))。
用本發(fā)明疫苗免疫接種、pVAX-e1a2和DC/CD40L引起在體內(nèi)產(chǎn)生可殺死腫瘤細(xì)胞的腫瘤特異性的T細(xì)胞。分析從腫瘤已消除的小鼠上分離的T細(xì)胞。體外培養(yǎng)的CTLs特異地殺死親代BM185腫瘤細(xì)胞。這些腫瘤特異性的CTLs只識別e1a2肽，但不識別裝載RAM-s細(xì)胞的與MHC低親合力結(jié)合的肽8，(圖16)。
比較不同接種的組成本發(fā)明的疫苗組分的效力將與其它接種方法比較，治療長有bcr/abl陽性腫瘤的小鼠并且保護(hù)小鼠對抗親代腫瘤細(xì)胞的再挑戰(zhàn)。在0天，小鼠右側(cè)面(5小鼠/組)皮膚下注入有致死劑量的親代活BM185/wt腫瘤細(xì)胞。在7、14和21天，在腫瘤位置為小鼠免疫接種(a)PBS；(b)pVAX-e1a2(100μg/小鼠)；(c)e1a2肽(AFHGDAEAL，10mM/小鼠，SEQ ID NO5)；(d)D2SC/wt細(xì)胞與e1a2肽脈沖(106細(xì)胞/10μM/小鼠)；(e)D2SC/CD40L細(xì)胞與e1a2肽脈沖(106細(xì)胞/10μM/小鼠)；(f)D2SC/CD40L細(xì)胞與低結(jié)合的MHC肽脈沖(HGDAEALQR，106細(xì)胞/10μM/小鼠)；(g)D2SC/CD40L細(xì)胞與從BM185細(xì)胞獲得的腫瘤溶解物脈沖；(h)預(yù)先孵育的D2SC/CD40L細(xì)胞和pVAX-e1a2質(zhì)粒DNA(106細(xì)胞/100μg/小鼠)。在免疫保護(hù)研究上，在最后接種以后的一個(gè)星期，用有致死劑量的親代的活BM185wt腫瘤細(xì)胞在腫瘤已消除的小鼠的左側(cè)面再挑戰(zhàn)。腫瘤大小每星期檢測兩次。當(dāng)腫瘤可檢測到時(shí)，認(rèn)為小鼠是在生存終點(diǎn)和被犧牲了。實(shí)驗(yàn)被重復(fù)了三次并且結(jié)果代表這些實(shí)驗(yàn)當(dāng)中的一個(gè)。
本發(fā)明的疫苗組分(預(yù)先孵育的D2SC/CD40L細(xì)胞和pVAX-e1a2質(zhì)粒DNA，填裝圓點(diǎn))是最有效的消除原有的腫瘤治療方法(p＜0.01)，所有被治療的小鼠不存在腫瘤(100％)。調(diào)查了由接種引起的保護(hù)宿主免受腫瘤攻擊的免疫應(yīng)答的效力和容量。在一個(gè)遠(yuǎn)點(diǎn)位置將有致死劑量的親代活腫瘤細(xì)胞注入腫瘤已消除的小鼠。用pVAX-e1a2載體和D2SC/CD40L細(xì)胞多次性的治療長有腫瘤的小鼠，結(jié)果發(fā)展了高效率的抗腫瘤免疫應(yīng)答足以保護(hù)小鼠免受腫瘤，約80％小鼠被保護(hù)了并且在腫瘤細(xì)胞再挑戰(zhàn)之后保持幾個(gè)月無腫瘤存在(p＜0.01)，參見圖17。
與以前的研究一致，接種用pVAX-e1a2，或e1a2肽，或D2SC/CD40L細(xì)胞，與肽脈沖，對MHC-I有低親合力，不能根除小鼠的腫瘤。
D2SC/CD40L細(xì)胞與MHC-I類結(jié)合肽脈沖明顯地提高了腫瘤抗原呈遞。用裝載了e1a2肽的D2SC/CD40L治療長有腫瘤的小鼠結(jié)果引導(dǎo)了抗腫瘤免疫，但是，這個(gè)方法與用本發(fā)明的疫苗治療長腫瘤的小鼠的方法比較有低于2倍的效率。
本疫苗組分pVAX-e1a2和DC/CD40L的優(yōu)越效力，也強(qiáng)調(diào)了本疫苗組分的關(guān)鍵元素。除抗原之外，pVAX-e1a2質(zhì)粒DNA包含CpG基序。CpG基序已知可通過TLR9途徑刺激和激活DCs，結(jié)果產(chǎn)生I型干擾素。D2SC/wt和D2SC/CD40L細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)含有TLR9。而且早期的研究表示，在受病毒和細(xì)菌刺激以后，D2SC/wt細(xì)胞釋放I型干擾素-α和干擾素-β。
因此，與用注入D2SC/CD40L細(xì)胞與腫瘤抗原肽脈沖方法比較，用本疫苗組分治療長有腫瘤的小鼠，有體內(nèi)有產(chǎn)生I型干擾素以及質(zhì)粒骨架里的CpG-基序刺激免疫反應(yīng)的可能性，貢獻(xiàn)出優(yōu)越效應(yīng)(圖17)。
在用不同接種方案之后引發(fā)腫瘤特異性的和腫瘤抗原肽特異性的CTLs用本發(fā)明疫苗免疫接種在體內(nèi)引起可殺死腫瘤細(xì)胞的腫瘤特異性的和e1a2肽特異性的T細(xì)胞。為T細(xì)胞的體外刺激，Cs或腫瘤細(xì)胞先與e1a2肽脈沖然后幅射而作為刺激者。T細(xì)胞從腫瘤挑戰(zhàn)后無腫瘤小鼠上分離出來，T細(xì)胞與這些DCs或腫瘤細(xì)胞共刺激七到十天。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并存放于-80℃，用于分析細(xì)胞因子的分泌?；罴?xì)胞(80％CD8+T細(xì)胞)用作CTL檢測中的效應(yīng)細(xì)胞。
測試在體外形成的CTLs溶解腫瘤細(xì)胞的能力。治療長腫瘤的小鼠(a)PBs；(b)e1a2肽；(c)pVAX-e1a2；(d)D2SC/CD40L細(xì)胞與e1a2肽脈沖；(e)D2SC/CD40L細(xì)胞與腫瘤溶解物脈沖；(f)預(yù)先孵育了的D2SC/CD40L細(xì)胞和pVAX-e1a2質(zhì)粒DNA。然后從親代腫瘤細(xì)胞攻擊后的小鼠分離T細(xì)胞。用被腫瘤抗原(裂解物或e1a2肽)裝載的DC/CD40L或預(yù)先孵育了的D2SC/CD40L細(xì)胞和pVAX-e1a2質(zhì)粒治療后，在腫瘤已消除的小鼠激發(fā)抗腫瘤免疫(圖18.A)。另外，在CTLs培養(yǎng)上清液(在6天)查出了IFN-的分泌，見表II。
表II

用腫瘤肽和含腫瘤肽的質(zhì)粒治療小鼠，未導(dǎo)致腫瘤特異的CTLs產(chǎn)生。相反，用pVAX-e1a2質(zhì)粒DNA載體和DC/CD40L重復(fù)接種，導(dǎo)致一個(gè)強(qiáng)烈的腫瘤特異的CTL反應(yīng)，同時(shí)導(dǎo)致一個(gè)治療效應(yīng)。
腫瘤特異性的CTLs識別由本發(fā)明的疫苗組分呈遞的腫瘤肽調(diào)查腫瘤特異性的CTLs殺死肽脈沖的靶細(xì)胞的能力。將e1a2肽裝載上TAP缺陷的RMA-S細(xì)胞。因RMA-S細(xì)胞缺乏裝載它們自己的MHC-I類的能力。因此RAM-S細(xì)胞與e1a2肽脈沖后，e1a2肽是存在于細(xì)胞表面唯一的肽。用腫瘤抗原(腫瘤溶解物或e1a2肽)裝載DC/CD40L和孵育了的D2SC/CD40L細(xì)胞和pVAX-e1a2接種之后，在無腫瘤小鼠上產(chǎn)生的CTLs識別RAM-S細(xì)胞呈遞的e1a2肽(圖18B)。腫瘤肽特異性的CTLs不殺死親代RMA-S細(xì)胞(沒有裝載肽，數(shù)據(jù)沒顯示)。結(jié)論是，由接種而在體內(nèi)引起的抗腫瘤免疫是腫瘤抗原特異性的，并且直接對抗親代BM185腫瘤細(xì)胞。
接種后引發(fā)的e1a2肽特異性的CTLs頻率在rhIL-2(25ng/ml，R&D，UK)存在的情況下擴(kuò)展e1a2肽特異性的CTLs，通過將純化的T細(xì)胞(含90％CD8+細(xì)胞和10％CD4+細(xì)胞)與e1a2肽脈沖過的D2SC/CD40L細(xì)胞(50Gy)共刺激。在七天刺激以后，約85％T細(xì)胞是CD8+T細(xì)胞(圖19)。
運(yùn)用DimerX肽呈遞方法(BD Bioscience，U.S.A)去研究體外腫瘤肽，e1a2肽特異性的CTLs頻率。簡言之，H-2Ld:Ig與肽(e1a2肽或肽8)混合在160摩爾過量在37℃隔夜培養(yǎng)。CD8+T細(xì)胞懸浮在106細(xì)胞/50μl中。從肽裝載H-2Ld:Ig蛋白復(fù)合物中取2μg加入到T細(xì)胞中，在4℃孵育60分鐘。使用PE共軛的大鼠抗小鼠IgG1抗體和用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)合的蛋白復(fù)合物。
識別腫瘤細(xì)胞和e1a2肽脈沖的目標(biāo)細(xì)胞的e1a2肽特異性的CD8+T細(xì)胞顯示與e1a2肽裝載的H-2Ld:Ig復(fù)合體的結(jié)合(圖20)。與CTL測定分析相一致，與單獨(dú)用pVAX-e1a2接種相比，用DC/CD40L和pVAX-e1a2疫苗治療小鼠引發(fā)8倍以上e1a2肽特異性的CTLs產(chǎn)生。與用e1a2肽裝載的DC/CD40L接種相比，用DC/CD40L和pVAX-e1a2疫苗治療小鼠引發(fā)2倍以上e1a2肽特異性的CTLs產(chǎn)生。
總之，這里提出一個(gè)新穎的提高抵抗已存在的bcr/abl腫瘤的抗腫瘤免疫疫苗組成和接種方法。
在這個(gè)方案中使用DCs遺傳性修飾DCs子類，pDCs/IPCs，和含有編碼e1a2腫瘤特異肽基因和CpG的質(zhì)粒載體。用DC/CD40L和含CpG基序的pVAX-e1a2質(zhì)粒重復(fù)的接種去治療長腫瘤的小鼠引發(fā)出腫瘤特異性的和e1a2肽特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。
它進(jìn)一步展示，通過CTL檢測和在這些T細(xì)胞表面間接性免疫熒光染色e1a2肽鑒別。e1a2肽特異性的CTLs在體內(nèi)被誘導(dǎo)了。明顯地接種誘導(dǎo)了能識別瘤細(xì)胞和在原位殺死它們的e1a2肽特異性的T細(xì)胞。新引發(fā)的e1a2肽特異性的T細(xì)胞，可在保護(hù)宿主對抗親代腫瘤再挑戰(zhàn)扮演重要角色。本發(fā)明的疫苗組分有效的消除原有的bcr/abl陽性腫瘤和保護(hù)動物抵抗親代腫瘤的攻擊。因此，本發(fā)明的疫苗組分很好應(yīng)用于對費(fèi)城染色體陽性腫瘤的治療和藥物組成。
為疫苗組分建議的機(jī)理根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和由其他人在腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域的研究，下面和圖21顯示貢獻(xiàn)于本發(fā)明成功的可能性機(jī)理和關(guān)鍵因素提出的假設(shè)。
在強(qiáng)迫以后，編碼腫瘤肽(CpG-DNA-e1a2)的質(zhì)粒DNA與DCs結(jié)合。大多數(shù)CpG-DNA-e1a2質(zhì)粒DNA被內(nèi)吞和隨后肽呈遞在MHC分子上。在質(zhì)粒DNA上的CpG基序結(jié)合到TLR9和激活DCs內(nèi)的toll-like受體途徑。
TLR9途徑的激活可導(dǎo)致I型干擾素-α和干擾素-β的分泌。這事件可發(fā)生在CpG-DNA-e1a2與DCs的孵育期間。因此，在預(yù)先孵育時(shí)，提前、同時(shí)和/或之后，更好由共離心的方法來提高質(zhì)粒DNA對DCs的結(jié)合。DCs細(xì)胞經(jīng)遺傳修改后表達(dá)CD40L。因此DCs表達(dá)B7和CD40L，兩個(gè)最重要的T細(xì)胞活化信號。在CD40L、B7和I型干擾素的存在下，基因修飾的DCs對免疫細(xì)胞，比如幼稚T細(xì)胞呈遞腫瘤肽并且通過CD40-CD40L互作用，激活幼稚DCs。在體內(nèi)，DCs可攝入未結(jié)合的抗原/或CpG-DNA-e1a2的產(chǎn)物。
兩類型樹突狀細(xì)胞、pDCs/IPCs/CD40L/B7和被激活的DCs裝載腫瘤抗原遷移到淋巴組織并且激活免疫細(xì)胞包括幼稚T細(xì)胞、B細(xì)胞和DCs.交叉敏化和直接引發(fā)宿主的免疫系統(tǒng)可在同樣的組織同時(shí)發(fā)生?？僧a(chǎn)生細(xì)胞因子，比如IL12，IL15，IFN-γ，I型TNF-α和其它Th1細(xì)胞因子。CD40L修飾pDCs，表達(dá)B7分子，可能直接對幼稚CD8+T細(xì)胞呈遞腫瘤肽和激活腫瘤特異性的CTLs，因此獲得一個(gè)更快速、增強(qiáng)的和更高效率的治療和保護(hù)性免疫應(yīng)答。用本發(fā)明免疫接種最后的結(jié)果是引發(fā)e1a2特異性的CTLs和消除已存在的腫瘤。在體內(nèi)誘發(fā)的抗腫瘤的免疫性保護(hù)宿主對抗免腫瘤攻擊。
因此，我們新穎的疫苗戰(zhàn)略強(qiáng)調(diào)激活先天免疫和適應(yīng)性免疫的獨(dú)特組合。這個(gè)新穎的疫苗組分適用于為了治療或防治人和動物的疾病而設(shè)計(jì)藥物疫苗組分用。它將由本領(lǐng)域人士了解，對本發(fā)明所作的各種各樣的修改和變動沒有超出所附加的權(quán)利要求的定義范圍。
序列表<110>黃冉陽<120>核酸和細(xì)胞疫苗的組分<130>P366PC00<150>SE 0301109-5<151>2003-04-14<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>67<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>1tgctagcatg atctggccca acgacggcga gggcgccttc cacggcgacg ccgaggccct60gcagcgc 67<210>2<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物
<400>2aatcgatcac aggccctggg gctcgaagtc gctggccacg gggcgctgca gggc 54<210>3<211>96<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(96)<223>
<400>3atg atc tgg ccc aac gac ggc gag ggc gcc ttc cac ggc gac gcc gag48Met Ile Trp Pro Asn Asp Gly Glu Gly Ala Phe His Gly Asp Ala Glu1 5 10 15gcc ctg cag cgc ccc gtg gcc agc gac ttc gag ccc cag ggc ctg tga96Ala Leu Gln Arg Pro Val Ala Ser Asp Phe Glu Pro Gln Gly Leu20 25 30<210>4<211>31<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Met Ile Trp Pro Asn Asp Gly Glu Gly Ala Phe His Gly Asp Ala Glu1 5 10 15Ala Leu Gln Arg Pro Val Ala Ser Asp Phe Glu Pro Gln Gly Leu20 25 30
<210>5<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Ala Phe His Gly Asp Ala Glu Ala Leu1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對鼠MHC-I型抗原(H-2Kd)低結(jié)合的合成多肽<400>6His Gly Asp Ala Glu Ala Leu Gln Arg1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>對鼠MHC-I型抗原(H-2Kd)不結(jié)合的合成多肽<400>7Ala Thr Gly Phe Lys Gln Ser Ser Lys1 權(quán)利要求
1.核酸疫苗組分，包含-編碼抗原的核苷酸序列；和-修飾的表達(dá)免疫應(yīng)答調(diào)控分子的抗原呈遞細(xì)胞。
2.核酸疫苗組分包含-編碼抗原的核苷酸序列；和-修飾的表達(dá)細(xì)胞生存調(diào)控分子的抗原呈遞細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組分，其特征在于所述的細(xì)胞生存調(diào)控分子是凋亡誘導(dǎo)分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之一所述的疫苗組分，其特征在于所述的疫苗組分為所述的核苷酸序列與所述的修飾的抗原呈遞細(xì)胞的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組分，其特征在于所述的疫苗組分為所述的核苷酸序列與所述的修飾的抗原呈遞細(xì)胞的一個(gè)預(yù)先孵育的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的疫苗組分，其特征在于所述的抗原呈遞細(xì)胞是專職性抗原呈遞細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求所述的疫苗組分，其特征在于所述的專職性抗原呈遞細(xì)胞是樹突狀細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗組分，其特征在于所述的樹突狀細(xì)胞是高效率的抗原處理和抗原呈遞細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的疫苗組分，其特征在于所述的樹突狀細(xì)胞是血漿細(xì)胞狀樹突狀細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9之一所述的疫苗組分，其特征在于所述的抗原呈遞細(xì)胞是與表達(dá)CD8α、B220、CD11C和B7分子的小鼠樹突狀細(xì)胞子類相當(dāng)?shù)娜藰渫粻罴?xì)胞子類。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到10之一所述的疫苗組分，其特征在于所述的抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)Toll-like受體9。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11之一所述的疫苗組分，其特征在于所述的抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)P2X7。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到12之一所述的疫苗組分，其特征在于所述的抗原呈遞細(xì)胞可誘導(dǎo)產(chǎn)生I型α干擾素和/或β干擾素。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的疫苗組分，其特征在于當(dāng)與微生物相互作用時(shí)，誘導(dǎo)所述的抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生I型α干擾素和/或β干擾素。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到14之一所述的疫苗組分，其特征在于所述的抗原呈遞細(xì)胞作為對象的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的連接。
16.根據(jù)權(quán)利要求1到5之一所述的疫苗組分，其特征在于所述的抗原呈遞細(xì)胞至少選自以下之一-樹突狀細(xì)胞；-血漿細(xì)胞狀樹突狀細(xì)胞；-干擾素生產(chǎn)細(xì)胞；-天然干擾素產(chǎn)生細(xì)胞；-單核細(xì)胞；-巨噬細(xì)胞；-骨髓細(xì)胞；-干細(xì)胞分化的細(xì)胞-B細(xì)胞；-T細(xì)胞；和-肥大細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組分，其特征在于所述的免疫應(yīng)答調(diào)控分子由轉(zhuǎn)入所述的抗原呈遞細(xì)胞的核苷酸序列編碼，該基因序列至少選自下列之一-細(xì)胞因子基因；-白介素基因；-粘附分子基因；-干擾素基因；-趨化因子基因和趨化因子受體基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的疫苗組分，其特征在于所述的免疫反應(yīng)調(diào)控分子選自CD40配體和GM-CSF。
19.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的疫苗組分，其特征在于所述的細(xì)胞生存調(diào)控分子由轉(zhuǎn)入所述的抗原呈遞細(xì)胞的核苷酸序列編碼，該基因序列至少選自下列之一-抗凋亡基因；和-凋亡誘導(dǎo)基因。
20.根據(jù)權(quán)利要求1到19之一所述的疫苗組分，其特征在于含所述的核苷酸序列的載體至少選自下列之一-病毒載體；-非病毒載體；-質(zhì)粒；-微生物載體；-脂質(zhì)體；-小分子載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的疫苗組分，其特征在于所述的載體包含免疫應(yīng)答調(diào)控核苷酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的疫苗組分，其特征在于所述的免疫應(yīng)答調(diào)控核苷酸序列是未甲基化的胞苷磷酸鳥苷(CpG)序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求1到22之一所述的疫苗組分，其特征在于所述的抗原包含氨基酸序列為SEQ ID NO5的e1a2融合多肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求1到22之一所述的疫苗組分，其特征在于所述的核苷酸序列包含微型e1a2融合基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO3。
25.根據(jù)權(quán)利要求1到22之一所述的疫苗組分，其特征在于所述的核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO4的微型e1a2融合蛋白的核苷酸序列。
26.生產(chǎn)核苷酸和細(xì)胞疫苗組分的方法，包含以下步驟-提供編碼抗原的核苷酸序列；-提供修飾的表達(dá)免疫應(yīng)答調(diào)控分子的抗原呈遞細(xì)胞；以及-混合所述的編碼抗原的核苷酸序列和所述的修飾的抗原呈遞細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于還包含孵育所述的核苷酸序列和所述的修飾的抗原呈遞細(xì)胞以增強(qiáng)其結(jié)合的步驟。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的方法，其特征在于所述的提供核苷酸序列的步驟包括-提供MHC結(jié)合的抗原蛋白或多肽；-克隆編碼所述的抗原蛋白或抗原多肽的核苷酸序列進(jìn)人所述的載體；以及-在擴(kuò)增系統(tǒng)中擴(kuò)增所述的載體。
29.根據(jù)權(quán)利要求26至28之一所述的方法，其特征在于所述的提供抗原呈遞細(xì)胞的步驟包括-從對象分離所述的抗原呈遞細(xì)胞；以及-改造抗原呈遞細(xì)胞至可表達(dá)所述的免疫應(yīng)答調(diào)控分子。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于所述的分離步驟包括分離表達(dá)Toll-like受體9和能生產(chǎn)α干擾素和/或β干擾素的樹突狀細(xì)胞子類。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于所述的樹突狀細(xì)胞子類在對象中充當(dāng)先天性和獲得性免疫應(yīng)答的重要角色。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的方法，其特征在于所述的樹突狀細(xì)胞子類是血漿細(xì)胞狀樹突狀細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求1或2的疫苗組分作為藥物的用途。
34.根據(jù)權(quán)利要求1或2的疫苗組分用于制備治療或防治傳染病的藥物的用途，其特征在于所述的核苷酸序列編碼在所述疾病中的與傳染物質(zhì)相關(guān)的抗原。
35.根據(jù)權(quán)利要求1或2的疫苗組分用于制備治療或防治癌癥的藥物的用途，其特征在于所述的核苷酸序列編碼在癌癥中表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原。
36.誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括對對象引入根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗組分的步驟。
37.對對象治療或防治疾病的方法，包括對對象引入根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗組分的步驟，所述的抗原是與所述疾病的致病物質(zhì)相關(guān)的抗原。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的方法，其特征在于所述的抗原呈遞細(xì)胞適合于呈遞至少一個(gè)所述抗原的片段到對象的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。
39.根據(jù)權(quán)利要求36到38之一所述的方法，其特征在于所述的對象是哺乳動物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于所述的哺乳動物是人類。
41.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述的疾病至少選自下列之一-傳染?。?癌癥；-白血病；-淋巴瘤；-自身免疫疾病/紊亂-炎癥；-血液疾??；-過敏；-遺傳性疾病；-移植所需疾??；和-糖尿病。
42.試劑盒，包括-編碼抗原的核苷酸序列；與-修飾的表達(dá)免疫應(yīng)答調(diào)控分子的抗原呈遞細(xì)胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的試劑盒，其特征在于所述的核苷酸序列和所述的修飾的抗原呈遞細(xì)胞為混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸和細(xì)胞的疫苗組分和藥物組分的一個(gè)新穎的組合以及其用于治療和/或防治包括傳染病、癌癥、自身免疫性疾病、過敏、糖尿病和血液病等疾病的用途。疫苗組分包含編碼抗原分子的核酸序列和基因修飾的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，更好的方式為相互混合物。APCs被修飾為可表達(dá)免疫調(diào)控分子。用本發(fā)明的疫苗組分對對象免疫接種，導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)應(yīng)答和引發(fā)起高效率的免疫性對抗已存在的疾病或保護(hù)宿主對抗疾病。
文檔編號A61K39/00GK1805758SQ200480016461
公開日2006年7月19日 申請日期2004年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月14日
發(fā)明者黃冉陽 申請人:黃冉陽