蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生方法
【專利摘要】開發(fā)了一種改善棒狀桿菌型細(xì)菌對(duì)異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生的新技術(shù)，從而提供了一種異源蛋白質(zhì)分泌產(chǎn)生的方法。培養(yǎng)這樣的棒狀桿菌型細(xì)菌來分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)，該細(xì)菌具有基因構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含：在該棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子序列；連接在該啟動(dòng)子序列下游的、在該棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的、編碼信號(hào)肽的核酸序列；和連接在該編碼信號(hào)肽的核酸序列下游的、編碼包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列與所述異源蛋白質(zhì)所成的融合蛋白質(zhì)的核酸序列。
【專利說明】蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生方法。
【背景技術(shù)】
[0002]作為利用微生物的異源蛋白質(zhì)分泌產(chǎn)生，迄今為止已經(jīng)有用芽孢桿菌屬細(xì)菌(非專利文獻(xiàn)I)、金屬同化性酵母、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(非專利文獻(xiàn)2)、曲霉屬絲狀真菌(非專利文獻(xiàn)3和4)等分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的報(bào)道。
[0003]也已經(jīng)有用棒狀桿菌型細(xì)菌(coryneform bacteria)分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的嘗試。關(guān)于用棒狀桿菌型細(xì)菌分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)，已經(jīng)報(bào)道了谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)(下面也縮寫為C.glutamicum)分泌核酸酶和脂肪酶(專利文獻(xiàn)1，非專利文獻(xiàn)5)，枯草桿菌蛋白酶等蛋白酶的分泌(非專利文獻(xiàn)6)，利用棒狀桿菌型細(xì)菌的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)PSl和PS2(也稱CspB)的信號(hào)肽的蛋白質(zhì)分泌(專利文獻(xiàn)2)，利用PS2(CspB)的信號(hào)肽的纖連蛋白結(jié)合蛋白的分泌(非專利文獻(xiàn)7)、使用PS2 (CspB)和SlpA (又稱C spA)的信號(hào)肽的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的分泌(專利文獻(xiàn)3)，使用變異型分泌系統(tǒng)的蛋白質(zhì)分泌(專利文獻(xiàn)4)，利用突變株的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的分泌(專利文獻(xiàn)5)，使用Tat依賴性信號(hào)肽的蛋白質(zhì)分泌(專利文獻(xiàn)6)等等。
[0004]還已知在通過將異源蛋白質(zhì)與信號(hào)肽連接來分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法中，在信號(hào)肽與異源蛋白質(zhì)之間插入由來自芽孢桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的N端序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的序列，由此分泌產(chǎn)生該異源蛋白質(zhì)(專利文獻(xiàn)7和8)。
[0005]CspB (PS2)是一種見于谷氨酸棒狀桿菌的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)(非專利文獻(xiàn)8)。棒桿菌屬細(xì)菌中既有存在細(xì)胞表層蛋白質(zhì)CspB的同源物的菌株，也有不存在此類同源物的菌株，而且關(guān)于28個(gè)谷氨酸棒狀桿菌菌株已經(jīng)報(bào)道了 CspB同源物的氨基酸序列(非專利文獻(xiàn)9)。對(duì)來自這28個(gè)菌株的CspB同源物的N末端氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，信號(hào)肽的30個(gè)氨基酸殘基以及成熟蛋白質(zhì)的N端3個(gè)氨基酸殘基(Gln-Glu-Thr)是完全保守的(非專利文獻(xiàn)9) ο
[0006]如前文所述，通過將異源蛋白質(zhì)與CspB (PS2)的信號(hào)肽連接來分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法是已知的(例如專利文獻(xiàn)2和3，非專利文獻(xiàn)7)。此外，還有報(bào)道稱，在一項(xiàng)通過將異源蛋白與CspB(PS2)的信號(hào)肽連接來分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法中，將谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的成熟CspB蛋白(SEQ ID NO:96)的N端1、14或38個(gè)氨基酸殘基插入信號(hào)肽與異源蛋白(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原)之間，以通過分泌產(chǎn)生來產(chǎn)生該異源蛋白質(zhì)，并且當(dāng)插入38個(gè)氨基酸殘基時(shí)，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原的分泌產(chǎn)生量得到增加(專利文獻(xiàn)3)。然而，除了專利文獻(xiàn)3中描述的發(fā)現(xiàn)之外，尚不知曉在通過連接異源蛋白質(zhì)與信號(hào)肽來分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法中將包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列插入信號(hào)肽與異源蛋白質(zhì)之間來表達(dá)該異源蛋白質(zhì)。
[0007]已經(jīng)有人報(bào)道，谷氨酸棒狀桿菌的細(xì)胞表層蛋白CspB的成熟蛋白的N端氨基酸殘基對(duì)于Edman降解是封閉的，因此有人提出該原本的N端氨基酸殘基，即谷氨酰胺殘基，被轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸殘基(非專利文獻(xiàn)8)。然而，尚不知曉通過將Gln-Glu-Thr的氨基酸序列插入信號(hào)肽與異源蛋白質(zhì)之間而表達(dá)的異源蛋白質(zhì)的N端谷氨酰胺殘基被轉(zhuǎn)化為焦谷氨
酸殘基。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)
[0010]專利文獻(xiàn)1:美國(guó)專利號(hào)4，965，197
[0011]專利文獻(xiàn)2:日本專利申請(qǐng)?zhí)乇砥?-502548
[0012]專利文獻(xiàn)3:日本特許4320769
[0013]專利文獻(xiàn)4:日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平11-169182
[0014]專利文獻(xiàn)5:日本特許4362651
[0015]專利文獻(xiàn)6:日本特許4730302
[0016]專利文獻(xiàn)7:日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平11-341991
[0017]專利文獻(xiàn)8:日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_2000-316579
[0018]非專利文獻(xiàn)
[0019]非專利文獻(xiàn)l:Microbiol.Rev.，57，109-137(1993)
[0020]非專利文獻(xiàn)2:Biotechnol.，11, 905-910(1993)
[0021]非專利文獻(xiàn)3:Biotechnol.，6，1419-1422(1988)
[0022]非專利文獻(xiàn)4:Biotechnol.，9，976-981 (1991)
[0023]非專利文獻(xiàn)5: J.Bacteriol.，174，1854-1861 (1992)
[0024]非專利文獻(xiàn)6: Appl.Environ.Microbiol., 61, 1610-1613 (1995)
[0025]非專利文獻(xiàn)7: Appl.Environ.Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)
[0026]非專利文獻(xiàn)8:Mol.Microbiol.,9,97-109(1993)
[0027]非專利文獻(xiàn)9: J.Biotechnol., 112, 177-193 (2004)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0028]本發(fā)明要解決的問題
[0029]本發(fā)明的一個(gè)目的是開發(fā)改進(jìn)棒狀桿菌型細(xì)菌的異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生的新技術(shù)，從而提供一種利用棒狀桿菌型細(xì)菌來分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法。
[0030]用于解決問題的手段
[0031]本發(fā)明的
【發(fā)明者】為了實(shí)現(xiàn)上述目的進(jìn)行了多方研究。最后他們發(fā)現(xiàn)，在通過將異源蛋白質(zhì)與信號(hào)肽連接來分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法中，通過將包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列插入信號(hào)肽與異源蛋白質(zhì)之間，增加了異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量，從而完成了本發(fā)明。
[0032]因此，本發(fā)明涉及下述。
[0033][I] 一種產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，包括:
[0034]培養(yǎng)具有用于分泌表達(dá)異源蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建體的棒狀桿菌型細(xì)菌；和
[0035]收集分泌產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)，
[0036]其中所述基因構(gòu)建體包含:在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子序列，連接在所述啟動(dòng)子序列下游的、編碼在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的信號(hào)肽的核酸序列，以及連接在所述編碼信號(hào)肽的核酸序列下游的、編碼包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列與所述異源蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的核酸序列，
[0037]條件是所述包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列不是由SEQ ID NO:96的1_14位或1-38位的氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
[0038][2]如上所述的方法，其中所述包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列是選自下述氨基酸序列(A)-(H)的氨基酸序列:
[0039](A)Gln-Glu-Thr
[0040](B)Gln-Glu-Thr-Xaal(SEQ ID NO:102)
[0041](C)Gln-Glu-Thr-Xaal-Xaa2(SEQ ID NO:103)
[0042](D)Gln-Glu-Thr-Xaal-Xaa2-Xaa3(SEQ ID NO:104)
[0043](E)由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4_7位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列，
[0044](F)由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4_8位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列，
[0045](G)由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4_17位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列，
[0046](H)由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4_50位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列，
[0047]其中Xaal 是 Asn、Gly、Thr、Pro 或 Ala,Xaa2 是 Pro、Thr 或 Val,且 Xaa3 是 Thr 或Tyr0
[0048][3]如上所述的方法，其中所述包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列選自下組的氨基酸序列:Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr(SEQ ID NO:97), Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr (SEQ IDNO:98), Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr (SEQ ID NO:99), Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr (SEQ IDNO: 100)、和 Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr (SEQ ID NO: 101)。
[0049][4]如上所述的方法，其中所述基因構(gòu)建體在所述編碼包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列的核酸序列與所述編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列之間還包含編碼用于酶消化的氨基酸序列的核酸序列。
[0050][5]如上所述的方法，其中所述用于酶消化的氨基酸序列是因子Xa蛋白酶的識(shí)別序列，或者ProTEV蛋白酶的識(shí)別序列。
[0051][6]如上所述的方法，其中蛋白酶的識(shí)別序列是SEQ ID NO: 105或106中所示的氨
基酸序列。
[0052][7]如上所述的方法，其中所述在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的信號(hào)肽是來源于棒狀桿菌型細(xì)菌的CspB的信號(hào)肽。
[0053][8]如上所述的方法，其中所述CspB的信號(hào)肽具有SEQ ID N0:92中所示的氨基酸序列。
[0054][9]如上所述的方法，其中要培養(yǎng)的棒狀桿菌型細(xì)菌是屬于棒狀桿菌屬或短桿菌屬的細(xì)菌。
[0055][10]如上所述的方法，其中要培養(yǎng)的棒狀桿菌型細(xì)菌是谷氨酸棒狀桿菌或Corynebacterium stationis。[0056]附圖簡(jiǎn)要說明
[0057]圖1是顯示在谷氨酸棒狀桿菌YDK010株中表達(dá)的、與谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的CspB的信號(hào)序列以及谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的成熟CspB的N端序列融合的胰島素原的SDS-PAGE的結(jié)果的照片。
[0058]圖2是顯示在谷氨酸棒狀桿菌YDK010株中表達(dá)的、與谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的CspB的信號(hào)序列、谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的成熟CspB的N端序列、以及蛋白酶識(shí)別序列融合的人生長(zhǎng)激素(hGH)的SDS-PAGE結(jié)果的照片。
[0059]圖3是顯示在谷氨酸棒狀桿菌YDK010株中表達(dá)的、與產(chǎn)氨棒狀桿菌(C.ammoniagenes) (C.stationis) ATCC6872 的信號(hào)序列、谷氛酸棒狀桿菌 ATCC13869 的成熟CspB的N端序列、以及蛋白酶識(shí)別序列融合的人生長(zhǎng)激素(hGH)的SDS-PAGE結(jié)果的照片。
[0060]圖4是顯示在谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032或谷氨酸棒狀桿菌ATCC6872中表達(dá)的、與谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的CspB的信號(hào)序列、谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的成熟CspB的N端序列、以及蛋白酶識(shí)別序列融合的人生長(zhǎng)激素(hGH)的SDS-PAGE結(jié)果的照片。
[0061]圖5是顯示在谷氨酸棒狀桿菌YDK010株中表達(dá)的、與谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的CspB的信號(hào)序列、 谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的成熟CspB的N端序列、以及蛋白酶識(shí)別序列融合的生理活性肽特立帕肽(Teriparatide)的SDS-PAGE結(jié)果的照片。
[0062]發(fā)明的實(shí)施方式
[0063]本發(fā)明提供一種產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)具有用于分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建體的棒狀桿菌型細(xì)菌，和收集通過分泌產(chǎn)生而產(chǎn)生的所述異源蛋白質(zhì)，其中所述基因構(gòu)建體包含:在所述棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子序列；連接在該啟動(dòng)子下游的、編碼在所述棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的信號(hào)肽的核酸序列；以及連接在該編碼信號(hào)肽的核酸序列下游的、編碼包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列與所述異源蛋白質(zhì)的融合蛋白的核酸序列(下文中又稱“本發(fā)明的方法”或“本發(fā)明的產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法”)。
[0064]用于本發(fā)明的方法的棒狀桿菌型細(xì)菌具有所述用于分泌表達(dá)異源蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建體，因此具有分泌產(chǎn)生該異源蛋白質(zhì)的能力。
[0065]用于本發(fā)明的方法的棒狀桿菌型細(xì)菌又稱“本發(fā)明的細(xì)菌”或“本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌”。此外，本發(fā)明的細(xì)菌所攜帶的用于異源蛋白質(zhì)分泌表達(dá)的基因構(gòu)建體又稱“用于本發(fā)明的基因構(gòu)建體”。此外，包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列與異源蛋白質(zhì)的融合蛋白又稱“本發(fā)明的融合蛋白”。
[0066]在本發(fā)明中，蛋白質(zhì)被“分泌”的表述意指蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌細(xì)胞之外(胞外轉(zhuǎn)運(yùn))。蛋白質(zhì)被“分泌”的表述當(dāng)然包括該蛋白質(zhì)的所有分子最終以完全游離的形式存在于培養(yǎng)基中的情況，還包括該蛋白質(zhì)的全部分子都存在于細(xì)胞表面層中的情況，以及該蛋白質(zhì)一部分分子存在于培養(yǎng)基中、其余的分子存在于細(xì)胞表面層中的情況。
[0067]因此，在本發(fā)明中“分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的能力”是指在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌時(shí)，該細(xì)菌將異源蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中或細(xì)胞表層，并將異源蛋白質(zhì)積累到能夠從培養(yǎng)基或細(xì)胞表層回收的程度的能力。積累量可為，例如，以培養(yǎng)基中積累的量計(jì)，優(yōu)選10 μ g/L或更高,更優(yōu)選lmg/L或更高,優(yōu)選100mg/L或更高,更優(yōu)選lg/L或更高。此外，例如，積累量以細(xì)胞表層中的積累量計(jì)可以是這樣的量，如果收集細(xì)胞表層中的異源蛋白質(zhì)并將其重懸于與培養(yǎng)基體積相同的液體中，異源蛋白質(zhì)在該懸液中的濃度優(yōu)選為IOyg/L或更高，更優(yōu)選lmg/L或更高，特別優(yōu)選100mg/L或更高。此外，在本發(fā)明中，術(shù)語被分泌產(chǎn)生的“蛋白質(zhì)(蛋白)”是還包括稱為肽或者多肽等實(shí)施方案的概念。
[0068]在本發(fā)明中，“異源蛋白質(zhì)”指相對(duì)于表達(dá)或分泌該蛋白質(zhì)的棒狀桿菌型細(xì)菌而言是外來的(exogenous)的蛋白質(zhì)。異源蛋白質(zhì)可以是，例如，來源于微生物的蛋白質(zhì)、來源于植物的蛋白質(zhì)、來源于動(dòng)物的蛋白質(zhì)、來源于病毒的蛋白質(zhì)、或甚至人工設(shè)計(jì)序列的蛋白質(zhì)。異源蛋白質(zhì)可以是單體蛋白質(zhì)或多聚體蛋白質(zhì)。多聚體蛋白質(zhì)指可作為由兩個(gè)或更多個(gè)亞單位組成的多聚體存在的蛋白質(zhì)。在所述多聚體中，多個(gè)亞單位可以通過共價(jià)鍵如二硫鍵連接、通過非共價(jià)鍵例如氫鍵和疏水相互作用連接、或者通過共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的組合連接。所述多聚體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)分子間二硫鍵。所述多聚體可以是由單一一種亞單位組成的同多聚體，或者可以是由兩種或更多種亞單位組成的異多聚體。在多聚體蛋白為異多聚體的情況下，只要在選自構(gòu)成該多聚體的亞單位中有至少一個(gè)亞單位是異源蛋白質(zhì)即可。也就是說，可以是所有的亞單位都是異源的，或者只有一部分亞單位是異源的。雖然異源蛋白質(zhì)可以是天然的分泌性蛋白質(zhì)，或者也可以是天然中的非分泌性蛋白質(zhì)，但優(yōu)選其是天然的分泌性蛋白質(zhì)?！爱愒吹鞍踪|(zhì)”的具體實(shí)例將會(huì)在下文中提及。
[0069]要生產(chǎn)的異源蛋白質(zhì)可以由單一一種蛋白質(zhì)組成，或者由兩種或更多中蛋白質(zhì)組成。此外，當(dāng)異源蛋白質(zhì)是異多聚體時(shí)，可以只生產(chǎn)其中一種亞單位，也可以產(chǎn)生兩種或更多種亞單位。換言之，“異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生”包括組成目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的所有亞單位的分泌產(chǎn)生，以及組成目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的一部分亞單位的分泌產(chǎn)生。
[0070]在本發(fā)明中，棒狀桿菌型細(xì)菌是需氧性革蘭氏陽性桿菌(bacilli)，包括棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細(xì)菌、短桿菌屬(Brevibacterium)細(xì)菌、微桿菌屬(Microbacterium)細(xì)菌等等。棒狀桿菌型細(xì)菌包括先前被歸類于短桿菌屬(Brevibacterium)但目前被整合到棒狀桿菌屬的細(xì)菌(Int.J.Syst.Bacteriol., 41, 255(1991))使用棒狀桿菌屬細(xì)菌細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)包括:與常規(guī)用于蛋白質(zhì)分泌產(chǎn)生的真菌、酵母、芽孢桿菌屬細(xì)菌等等相比，它們固有分泌的蛋白質(zhì)的量極低，因此可以預(yù)期能夠簡(jiǎn)化或省略對(duì)通過分泌產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)的純化過程；它們可以利用含有糖、氨、礦物鹽等的簡(jiǎn)單培養(yǎng)基良好生長(zhǎng)，因此從培養(yǎng)基成本、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)生產(chǎn)率等方面考慮是非常優(yōu)秀的。棒狀桿菌型細(xì)菌的具體實(shí)例包括下列物種:
[0071]嗜乙酸乙酸棒狀桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)
[0072]醋谷棒狀桿菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)
[0073]解燒棒狀桿菌(Corynebacteriumalkanolyticum)
[0074]頸棒狀桿菌(CorynebacteriumcalIunae)
[0075]谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)
[0076]百合棒狀桿菌(CorynebacteriumIilium)
[0077]棲糖蜜棒狀桿菌(Corynebacteriummelassecola)
[0078]嗜熱產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacteriumthermoaminogenes (Corynebacteriumefficiens)
[0079]力士棒狀桿菌(Corynebacteriumherculis)
[0080]叉分短桿菌(Brevibacterium divaricatum)[0081]黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)
[0082]Brevibacterium immariophilum
[0083]乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒狀桿菌)
[0084]玫瑰色短桿菌(Brevibacteriumroseum)
[0085]解糖短桿菌(BrevibacteriumsaccharoIyticum)
[0086]生硫短桿菌(Brevibacteriumthiogenitalis)
[0087]產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacteriumammoniagenes) (Corynebacterium stationis)
[0088]白色短桿菌(Brevibacteriumalbum)
[0089]多角短桿菌(Brevibacteriumcerinum) [0090]嗜氨微桿菌(Microbacteriumammoniaphilum)
[0091]棒狀桿菌型細(xì)菌的具體實(shí)例包括下列菌株:
[0092]嗜乙酰乙酸棒狀桿菌ATCC13870
[0093]醋谷棒狀桿菌ATCC15806
[0094]解烷棒狀桿菌ATCC21511
[0095]頸棒狀桿菌ATCC15991
[0096]谷氨酸棒狀桿菌ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060, ATCC13869, FERM BP-734
[0097]百合棒狀桿菌ATCC15990
[0098]棲糖蜜棒狀桿菌ATCC17965
[0099]嗜熱產(chǎn)氨棒狀桿菌AJ12340(FERM BP-1539)
[0100]力士棒狀桿菌ATCC13868
[0101]叉分短桿菌ATCC14020
[0102]黃色短桿菌ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)
[0103]Brevibacterium immariophilum ATCC14068
[0104]乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869
[0105]玫瑰色短桿菌ATCC13825
[0106]解糖短桿菌ATCC14066
[0107]生硫短桿菌ATCC19240
[0108]產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacteriumstationis) ATCC6871, ATCC6872
[0109]白色短桿菌ATCC15111
[0110]多角短桿菌ATCC15112
[0111]嗜氛微桿菌ATCC15354
[0112]這些菌株可獲自，例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection (地址:12301Parklawn Drive, Rockville, Maryland20852, P.0.Boxl549, Manassas, VA20108, United States of America)。具體地說，每個(gè)菌株都被給予登錄號(hào)，可以利用這些登錄號(hào)(參見http://www.atcc.0rg/)訂購(gòu)這些菌株。這些菌株的登錄號(hào)列于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中。
[0113]尤其是，谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum) AJ12036株(FERM BP-734)，其原先是從野生型株谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869作為鏈霉素(Sm)抗性突變株分離的，被預(yù)測(cè)在負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)分泌的功能基因中具有突變，并且顯示極高的異源蛋白質(zhì)分泌產(chǎn)生能力，以最適條件下的積累量計(jì)與親本株(野生株)相比約為2-3倍，因此它是優(yōu)選的宿主細(xì)菌。AJ12036株最初于1984年3月26日作為國(guó)際保藏物保藏于日本通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，Tsukuba Central6,1-1, Higashil-Chome, Tsukuba-shi, Ibarak1-ken, 305-8566，Japan),并給予保藏號(hào) FERMBP-734ο
[0114]此外，可以使用誘變方法或基因重組方法從作為親本株的如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌選擇增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分泌產(chǎn)生能力的菌株，并用作宿主。例如，用紫外線照射或化學(xué)誘變劑如N-甲基-N’ -亞硝基胍處理親本株后，可以選擇蛋白質(zhì)分泌產(chǎn)生能力得到了增強(qiáng)的菌株。
[0115]此外，如果使用通過修飾上述菌株使其不產(chǎn)生細(xì)胞表層蛋白質(zhì)而得到的菌株作為宿主，分泌到培養(yǎng)基中或細(xì)胞表層上的異源蛋白質(zhì)的純化會(huì)變得容易，因此它是特別優(yōu)選的。這樣的修飾可以這樣實(shí)施:通過誘變或基因重組向染色體上的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域或其表達(dá)調(diào)控區(qū)域?qū)胪蛔儭＝?jīng)過修飾而不產(chǎn)生細(xì)胞表層蛋白的棒狀桿菌型細(xì)菌的例子包括谷氨酸棒狀桿菌YDKOlO株(W02004/029254)，它是谷氨酸棒狀桿菌AJ12036株(FERMBP-734)的細(xì)胞表層蛋白PS2缺陷的菌株。
[0116]即，本發(fā)明的細(xì)菌可以是其細(xì)胞表層蛋白質(zhì)活性降低了的細(xì)菌。所述細(xì)胞表層蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)菌或古細(xì)菌的細(xì)胞表層(S層)的蛋白質(zhì)。棒狀桿菌型細(xì)菌的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的例子包括谷氨酸棒狀桿菌的PSl和PS2 (又稱CspB)，以及C.stationis的SlpA (又稱CspA)。在這些之 中，降低PS2蛋白的活性是優(yōu)選的。谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的cspB基因的核苷酸序列以及該基因編碼的PS2蛋白的氨基酸序列分別示于SEQ ID N0:94和95。其他谷氨酸棒狀桿菌菌株中cspB基因的同源物的例子將在下文提到。
[0117]由于編碼細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的基因的核苷酸序列可能隨棒狀桿菌型細(xì)菌所屬的種或株而不同，編碼細(xì)胞表層蛋白的基因可以是前述的核苷酸序列的變異體，只要該基因編碼維持原始功能的蛋白質(zhì)。表述“維持原始功能”可以意指蛋白質(zhì)具有當(dāng)該蛋白質(zhì)在棒狀桿菌型細(xì)菌中的活性被降低時(shí)，異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生相比于非修飾株所見的量增加的性質(zhì)。此外，表述“維持原始功能”還可以意指，在CspB的情況下，例如，異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量的增加可以通過如后文所述的本發(fā)明的插入序列來實(shí)現(xiàn)。后述的涉及CspB變異體及其編碼基因的描述也可以適用于其他細(xì)胞表層蛋白質(zhì)及其編碼基因。
[0118]“當(dāng)該蛋白質(zhì)棒狀桿菌型細(xì)菌中的活性被降低時(shí)，異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生相比于非修飾株中所見的量增加的性質(zhì)”是指這樣的性質(zhì):在棒狀桿菌型細(xì)菌中活性被降低時(shí)，賦予該棒狀桿菌型細(xì)菌相比于非修飾菌株(例如野生株或親本株)中所見的量分泌產(chǎn)生更多量的異源蛋白質(zhì)的能力。對(duì)于表述“相比于非修飾菌株中所見的量分泌產(chǎn)生更多量的異源蛋白質(zhì)”，只要異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量相比于非修飾株增加就沒有特別限制，可以表示，例如，以培養(yǎng)基中和/或細(xì)胞表層中的積累量計(jì)，異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量相比于非修飾株增加優(yōu)選10%以上，更優(yōu)選20%以上，特別優(yōu)選30%以上，更優(yōu)選100%以上。此外，表述“相比于非修飾菌株分泌產(chǎn)生更多量的異源蛋白質(zhì)”還可以指:將未經(jīng)濃縮的非修飾株的培養(yǎng)上清液進(jìn)行SDS-PAGE并用CBB染色后不能檢出異源蛋白質(zhì)，而將未經(jīng)濃縮的修飾株的培養(yǎng)上清液進(jìn)行SDS-PAGE并用CBB染色后能檢出異源蛋白質(zhì)。
[0119]某種蛋白質(zhì)是否具有當(dāng)其在棒狀桿菌型細(xì)菌中的活性降低時(shí)異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量相比于非修飾株中所見的量增加的性質(zhì)可以這樣來確認(rèn):從屬于棒狀桿菌型細(xì)菌的菌株通過修飾使得該蛋白質(zhì)的活性降低而制備菌株，對(duì)將該修飾菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)觀察到的異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量進(jìn)行定量，并將該確定的量與修飾之前的該菌株(未修飾株)在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)觀察到的異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量進(jìn)行比較。
[0120]在本發(fā)明中，表述“細(xì)胞表層蛋白的活性降低”包括棒狀桿菌型細(xì)菌已經(jīng)過修飾從而降低了細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的活性的情況，以及棒狀桿菌型細(xì)菌中細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的活性已經(jīng)固有地降低的情況。“棒狀桿菌型細(xì)菌中細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的活性已經(jīng)固有地降低的情況”包括了棒狀桿菌型細(xì)菌固有地缺乏細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的情況。即，已降低了細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的活性的棒狀桿菌型細(xì)菌包括固有地缺乏細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的棒狀桿菌型細(xì)菌。“固有地缺乏細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的棒狀桿菌型細(xì)菌”的例子包括棒狀桿菌型細(xì)菌固有地缺乏編碼細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的基因的情況。表述“棒狀桿菌型細(xì)菌固有地缺乏細(xì)胞表層蛋白質(zhì)”可意指棒狀桿菌型細(xì)菌固有地缺乏選自該棒狀桿菌型細(xì)菌所屬物種的其他菌株中出現(xiàn)的一種或多種細(xì)胞表層蛋白質(zhì)。例如，“谷氨酸棒狀桿菌固有地缺乏細(xì)胞表層蛋白質(zhì)”可以表示谷氨酸棒狀桿菌菌株固有地缺乏選自在其他谷氨酸棒狀桿菌菌株中出現(xiàn)的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的一種或多種蛋白質(zhì)，例如，缺乏PSl和/或PS2 (CspB)。固有地缺乏細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032，其固有地缺乏cspB基因。
[0121]以下，說明用于降低蛋白質(zhì)活性的手段。
[0122]表述“蛋白質(zhì)的活性降低”表示目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性相比于非修飾菌株，例如野生型菌株和親本菌株有所減少，包括活性完全消失的情況。具體地，“蛋白質(zhì)的活性降低”意指與非修飾菌株相比每個(gè)細(xì)胞的該蛋白質(zhì)的分子數(shù)降低，和/或該蛋白質(zhì)的每個(gè)分子的功能降低。即，與表述“蛋白質(zhì)的活性降低”相關(guān)的術(shù)語“活性”可以表示編碼該蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄量(mRNA的量)或該蛋白質(zhì)的量，以及該蛋白質(zhì)的催化活性。此外“每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)分子數(shù)降低”的情況包括該蛋白質(zhì)完全不存在的情況。此外，“蛋白質(zhì)的每個(gè)分子的功能降低”的情況包括該蛋白質(zhì)的每個(gè)分子的功能完全消失的情況。
[0123]為了降低蛋白質(zhì)的活性的修飾可以通過例如降低編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。“降低基因表達(dá)”又稱“弱化基因表達(dá)”。降低基因表達(dá)可以通過，例如，降低轉(zhuǎn)錄效率、降低翻譯效率、或它們的組合來誘導(dǎo)。降低基因的表達(dá)可以通過修飾基因的表達(dá)調(diào)控序列，諸如啟動(dòng)子和Shine-Dalgarno(SD)序列來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)修飾表達(dá)調(diào)控序列時(shí)，優(yōu)選修飾表達(dá)調(diào)控序列的一個(gè)核苷酸或更多，更優(yōu)選兩個(gè)核苷酸或更多，尤其優(yōu)選3個(gè)核苷酸或更多。此外，可以缺失表達(dá)調(diào)控序列的一部分或全部?；虮磉_(dá)的降低可以通過例如對(duì)負(fù)責(zé)表達(dá)調(diào)控的因子進(jìn)行操控來實(shí)現(xiàn)。負(fù)責(zé)表達(dá)調(diào)控的因子的例子包括負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控的低分子(誘導(dǎo)劑、抑制劑，等等)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控的蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄因子等等)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控的核酸(siRNA等)，諸如此類。
[0124]為了降低蛋白質(zhì)活性的修飾可以通過，例如，破壞編碼該蛋白的基因來實(shí)現(xiàn)。破壞基因可通過，例如，將染色體上該基因的編碼區(qū)的一部分或全部缺失來實(shí)現(xiàn)。此外，可以缺失染色體上的整個(gè)基因，包括基因的上游和下游序列在內(nèi)。作為缺失對(duì)象的區(qū)域可為任何區(qū)域，諸如N末端區(qū)域，內(nèi)部區(qū)域，或C末端區(qū)域，只要能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)活性的降低。一般而言缺失的區(qū)域越長(zhǎng)能夠越切實(shí)地使基因失活。此外，優(yōu)選作為缺失對(duì)象的區(qū)域的上游和下游序列的閱讀框不同。[0125]基因的破壞還可以通過，例如，向染色體上的基因的編碼區(qū)中導(dǎo)入取代氨基酸的突變(錯(cuò)義突變)、終止密碼子(無義突變)、添加或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的移框突變，等等(Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997) ；Proceedings of theNational Academy of Sciences,USA, 955511-5515(1998) ；Journal of Biological Chemistry, 26116, 20833-20839(1991))。
[0126]基因的破壞還可以通過，例如，向染色體上的基因的編碼區(qū)域中插入其他序列來實(shí)現(xiàn)。插入的位點(diǎn)可以是基因的任何區(qū)域，且插入的區(qū)域越長(zhǎng)通?？梢栽角袑?shí)地使基因失活。優(yōu)選插入位點(diǎn)的上游和下游序列的閱讀框不同。所述其他序列沒有特別限定，只要是選擇可降低或消除被編碼蛋白的活性的序列即可，實(shí)例包括，例如，標(biāo)志物基因例如抗生素抗性基因、對(duì)異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)有用的基因，等等。
[0127]對(duì)染色體上的基因進(jìn)行如上所述的修飾可以通過例如這樣來實(shí)現(xiàn):制備缺陷型基因，其中缺失該基因的部分序列，使得其不能表達(dá)正常發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)，并用含有該缺陷型基因的重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌，導(dǎo)致該缺陷型基因與染色體上的基因之間發(fā)生同源重組，從而用缺陷型基因替代染色體上的基因。在此情況下，如果在重組DNA中包含根據(jù)宿主的特性(如營(yíng)養(yǎng)缺陷型等)選擇的標(biāo)志物基因，則操作變得容易。由缺陷型基因編碼的蛋白質(zhì)即使產(chǎn)生，也具有不同于野生型蛋白質(zhì)的構(gòu)象，因此其功能降低或消除。此類基于利用同源重組的基因取代的基因破壞是確立的方法，有所謂“Red驅(qū)動(dòng)的整合”(Datsenko，K.A, and Wanner, B.L.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 97:6640-6645 (2000))、使用線性 DNA 的方法，例如利用Red驅(qū)動(dòng)整合與λ噬菌體來源的切出系統(tǒng)的方法(Cho，E.H.，Gumport, R.1., Gardner, J.F., J.Bacteriol.，184:5200-5203 (2002))，使用含溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法，使用能夠接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的方法，使用不具有在宿主中有功能的復(fù)制起點(diǎn)的自殺載體的方法(美國(guó)專利號(hào)6，303，383，日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平05-007491)，等等。
[0128]為了降低蛋白質(zhì)活性的修飾也可以通過例如誘變處理來實(shí)現(xiàn)。誘變處理的例子包括常規(guī)誘變處理例如X射線輻照或紫外線照射，以及誘變劑處理例如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)、和甲磺酸甲酯(MMS)處理。
[0129]目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性的降低可以通過測(cè)量該蛋白質(zhì)的活性來確認(rèn)。具體地，該蛋白質(zhì)的活性減少到例如非修飾株中所見的活性的例如50%或更低，優(yōu)選20%或更低，更優(yōu)選10%或更低,更優(yōu)選5%或更低,或特別優(yōu)選0%。
[0130]目標(biāo)基因的表達(dá)的降低可以通過確認(rèn)基因轉(zhuǎn)錄量的降低或從該基因表達(dá)的目標(biāo)蛋白量的降低來確認(rèn)。
[0131]目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄量的降低可以通過將從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量與非修飾株中所見的量比較來加以確認(rèn)。用于測(cè)量mRNA的量的方法的實(shí)例包括Northern雜交、RT-PCR、等等(Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor (USA) ,2001)。mRNA的量?jī)?yōu)選減少到，例如，非修飾株中所見的量的50%或更低，20%或更低，10%或更低，5%或更低，或0%。
[0132]目標(biāo)蛋白的量的減少可以使用抗體通過Western印跡(Molecular Cloning, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA) 2001)來確認(rèn)。蛋白質(zhì)的量?jī)?yōu)選減少至，例如，非修飾株中所見的量的50%以下、20%以下、10%以下、5%以下、或0%。
[0133]取決于破壞所用的手段，靶基因的破壞可以通過測(cè)定該基因的部分或全部的核苷酸序列、限制酶圖譜、或基因全長(zhǎng)等來確認(rèn)。
[0134]具有分泌產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)能力的棒狀桿菌型細(xì)菌可以通過向如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌中導(dǎo)入本發(fā)明使用的基因構(gòu)建體，使該細(xì)菌攜帶該構(gòu)建體而獲得。
[0135]已知分泌性蛋白質(zhì)一般被翻譯為前蛋白質(zhì)(又稱前肽)或者前原蛋白質(zhì)(又稱前原肽)，然后通過加工變?yōu)槌墒斓鞍踪|(zhì)。具體地，分泌性蛋白質(zhì)一般被翻譯為前蛋白質(zhì)或前原蛋白質(zhì)，然后作為前體部分(pre-moiety)的信號(hào)肽被蛋白酶(一般稱為信號(hào)肽酶)所切斷，從而將該分泌性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為成熟蛋白質(zhì)或原蛋白質(zhì)(proprotein)。對(duì)于原蛋白質(zhì),其原部分被蛋白酶進(jìn)一步切斷，從而使原蛋白質(zhì)變?yōu)槌墒斓鞍踪|(zhì)。因此，在本發(fā)明的方法中，利用信號(hào)肽進(jìn)行異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生。在本發(fā)明中，可以將分泌性蛋白質(zhì)的前蛋白質(zhì)和原蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為“分泌性蛋白質(zhì)前體”。在本發(fā)明中，“信號(hào)肽”(又稱“信號(hào)序列”)是指存在于分泌性蛋白質(zhì)前體的N末端、而通常不存在于天然成熟蛋白質(zhì)中的氨基酸序列。
[0136]用于本發(fā)明的基因構(gòu)建體包含:在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子序列，連接在該啟動(dòng)子序列下游的、編碼在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的信號(hào)肽的核酸序列，以及連接在該編碼信號(hào)肽的核酸序列下游的、編碼包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列與異源蛋白質(zhì)所成的融合蛋白的核酸序列。所述編碼信號(hào)肽的核酸序列可以連接在所述啟動(dòng)子序列的下游，使得信號(hào)肽在該啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。所述編碼融合蛋白的核酸序列可以連接在所述編碼信號(hào)肽的核酸序列下游，使得所述融合蛋白作為進(jìn)一步與所述信號(hào)肽融合的融合蛋白表達(dá)。用于本發(fā)明的基因構(gòu)建體還可以包含對(duì)于在棒狀桿菌型細(xì)菌中表達(dá)異源蛋白質(zhì)有效的調(diào)控序列(操縱基因、終止子，等等)，位于其可發(fā)揮作用的合適位置。 [0137]本發(fā)明中使用的啟動(dòng)子沒有特殊限定，只要是選用在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子即可，且其可以是來源于棒狀桿菌型細(xì)菌的啟動(dòng)子，或者是異源啟動(dòng)子?！霸诎魻顥U菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子”是指在棒狀桿菌型細(xì)菌中具有啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子。異源啟動(dòng)子的具體實(shí)例包括，例如，源自大腸桿菌的啟動(dòng)子，例如tac啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子和araBAD啟動(dòng)子。在這些之中，優(yōu)選強(qiáng)啟動(dòng)子諸如tac啟動(dòng)子,也優(yōu)選誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如araBAD啟動(dòng)子。
[0138]源自棒狀桿菌型細(xì)菌的啟動(dòng)子的例子包括，例如，細(xì)胞表層蛋白質(zhì)PS1、PS2(又稱CspB)、以及SlpA(又稱CspA)的基因的啟動(dòng)子，以及各種氨基酸生物合成系統(tǒng)基因的啟動(dòng)子。各種氨基酸生物合成系統(tǒng)基因的啟動(dòng)子的具體實(shí)例包括，例如，下列基因的啟動(dòng)子:谷氨酸生物合成系統(tǒng)的谷氨酸脫氫酶基因，谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)的谷氨酰胺合酶基因、賴氨酸生物合成系統(tǒng)的天冬氨酸激酶基因、蘇氨酸生物合成系統(tǒng)的高絲氨酸脫氫酶基因、異亮氨酸和纈氨酸生物合成系統(tǒng)的乙酰羥酸合成酶基因、亮氨酸生物合成系統(tǒng)的2-異丙基蘋果酸合成酶基因、脯氨酸和精氨酸生物合成系統(tǒng)的谷氨酸激酶基因、組氨酸生物合成系統(tǒng)的磷酸核糖基-ATP焦磷酸化酶基因、以及芳香族氨基酸生物合成系統(tǒng)例如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成系統(tǒng)的脫氧阿拉伯糖庚酮酸磷酸(DAHP)合成酶基因，核酸生物合成系統(tǒng)如肌苷酸和鳥苷酸生物合成系統(tǒng)的磷酸核糖基焦磷酸(PRPP)氨基轉(zhuǎn)移酶基因、以及鳥苷酸合成酶基因。
[0139]作為啟動(dòng)子，可以利用各種報(bào)道基因獲得現(xiàn)有啟動(dòng)子的高活性型并加以使用。例如，可以通過使啟動(dòng)子區(qū)域中的-35和-10區(qū)更接近共有序列，可以提高啟動(dòng)子的活性(國(guó)際專利申請(qǐng)公布W000/18935)。用于評(píng)價(jià)啟動(dòng)子的強(qiáng)度的方法以及強(qiáng)啟動(dòng)子在Goldstein 等人的論文(Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol.Annu.Rev.，I, 105-128(1995))等中有記載。此外，已知核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)與起始密碼子之間的間隔區(qū)域中、尤其是起始密碼子直接上游的序列(5，-UTR)中幾個(gè)核苷酸的取代、插入或缺失會(huì)顯著影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，也可以修飾這些序列。
[0140]本發(fā)明使用的信號(hào)肽沒有特別限制，只要選用在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的信號(hào)肽即可，其可以是源自棒狀桿菌型細(xì)菌的信號(hào)肽，或者其可以是異源信號(hào)肽?！霸诎魻顥U菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的信號(hào)肽”是指這樣的肽，當(dāng)它與目標(biāo)蛋白質(zhì)的N末端連接時(shí)，容許棒狀桿菌型細(xì)菌分泌該蛋白質(zhì)。信號(hào)肽優(yōu)選是作為宿主的棒狀桿菌型細(xì)菌的分泌性蛋白質(zhì)的信號(hào)肽，更優(yōu)選是棒狀桿菌型細(xì)菌的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的信號(hào)肽。棒狀桿菌型細(xì)菌的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的例子包括來源于谷氨酸棒狀桿菌的PSl和PS2 (CspB)(日本專利申請(qǐng)?zhí)乇砥?-502548)和來源于產(chǎn)氨棒狀桿菌(C.stationis)的SlpA(CspA)(日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平10-108675)。PSl的信號(hào)肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 91 ；PS2 (CspB)的信號(hào)肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO:92 ；SlpA(CspA)的信號(hào)肽的氨基酸序列示于SEQ ID N0:93。此外，美國(guó)專利號(hào)4，965，197記載了由來源于棒狀桿菌型細(xì)菌的DNA酶的信號(hào)肽，這樣的信號(hào)肽也可以用于本發(fā)明。雖然信號(hào)肽具有跨越生物物種的一定的共同序列特征，但是在某種生物物種中表現(xiàn)分泌功能的信號(hào)肽并不一定在另一種生物物種中表現(xiàn)分泌功能。因此，當(dāng)使用異源信號(hào)肽時(shí)，可以合適地選擇在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的信號(hào)肽。某種信號(hào)肽是否在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能可以通過，例如，將目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)為與該信號(hào)肽的融合蛋白，再確定該蛋白是否分泌來加以確認(rèn)。
[0141]當(dāng)翻譯產(chǎn)物被分泌到細(xì)胞外時(shí)，信號(hào)序列通常被信號(hào)肽酶切斷。作為編碼信號(hào)肽的基因，雖然直接使用天然形態(tài)的基因，但可以根據(jù)要使用的宿主的密碼子頻度對(duì)其進(jìn)行修飾以使其具有最優(yōu)的密碼子。
[0142]在本發(fā)明使用的基因構(gòu)建體中，在編碼信號(hào)肽的核酸序列與編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列之間插入編碼包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列的核酸序列。在本發(fā)明中，包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列又稱“本發(fā)明使用的插入序列”。
[0143]本發(fā)明使用的插入序列沒有特別限制，只要其包含Gln-Glu-Thr即可。此外，然后本發(fā)明使用的插入序列中的Gln-Glu-Thr的位置沒有特別限制，優(yōu)選插入序列的N端第I至第3個(gè)氨基酸是Gln-Glu-Thr。即，優(yōu)選的是，在表達(dá)出的異源蛋白質(zhì)中，Gln-Glu-Thr在信號(hào)肽的緊鄰下游存在。
[0144]本發(fā)明使用的插入序列優(yōu)選為由棒狀桿菌型細(xì)菌的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)CspB的成熟蛋白質(zhì)(下文也稱“成熟CspB”或“CspB成熟蛋白質(zhì)”)的自N端起的3個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基組成的序列。“自N端起的3個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基”指從N端第I位的氨基酸殘基到第3位及更遠(yuǎn)位置的氨基酸殘基的氨基酸序列。
[0145]CspB的具體實(shí)例包括，例如，谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的CspB。CspB與PS2同義。谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的cspB基因的核苷酸序列示于SEQ ID N0:94，而CspB蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID N0:95o在SEQ ID N0:95所示的氨基酸序列中，位置1_30的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于信號(hào)肽，而位置31-469的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于CspB成熟蛋白質(zhì)。谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的CspB成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列，除了作為信號(hào)肽部分的30個(gè)氨基酸殘基之外，示于SEQ ID N0:96。CspB成熟蛋白質(zhì)的N端是指CspB成熟蛋白質(zhì)上除C端側(cè)的29個(gè)氨基酸殘基的疏水區(qū)之外的其余部分。在棒狀桿菌型細(xì)菌ATCC13869的成熟CspB中,N端1-3位的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于Gln-Glu-Thr。在本發(fā)明中,可以使用在cspB基因的核苷酸序列的如下所述的部分:該部分編碼成熟CspB的氨基酸序列中包含于本發(fā)明插入序列中的部分。
[0146]由于cspB基因的核苷酸序列可根據(jù)棒狀桿菌型細(xì)菌所屬的物種或菌株而不同，本發(fā)明中使用的cspB基因可以是前述的核苷酸序列的變異體，只要用本發(fā)明的插入序列能增加異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量。cspB基因的變異體包括該基因的同源物。cspB基因的同源物可以通過使用，例如，前述的谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的cspB基因(SEQ ID NO: 94)作為查詢序列進(jìn)行BLAST檢索或FASTA檢索從公共數(shù)據(jù)庫(kù)容易地獲得，還可以利用棒狀桿菌型細(xì)菌的染色體作為模板、以及基于已知的基因序列(例如如上所述的那些)的寡核苷酸作為引物，通過PCR來獲得。
[0147]例如，已經(jīng)報(bào)道了 28種谷氨酸棒狀桿菌菌株的CspB同源物的氨基酸序列(J.Biotechnol., 112, 177-193 (2004))。與來源于這28種菌株的CspB同源物的N端氨基酸序列相t匕，可見成熟蛋白質(zhì)的信號(hào)序列30個(gè)氨基酸殘基和N端3個(gè)氨基酸殘基(Gln-Glu-Thr)是完全保守的。此外，通過對(duì)CspB同源物的成熟蛋白質(zhì)的N端到6個(gè)氨基酸為止進(jìn)行比較，這些氨基酸序列分為5個(gè)模式，即=Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr (以下亦表示為QETNPT (SEQ IDNO:97)), Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr (以下亦表示為 QETGTY (SEQ ID NO:98)), Gln-Glu-Thr-Thr-Val-ThH 以下亦表示為 QETTVT (SEQ ID NO:99) )，Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr (以下亦表示為 QETPVT (SEQ ID NO: 100))，和Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr (以下亦表示為 QETAVT (SEQID NO: 101))。這28個(gè)谷氨酸棒狀桿菌菌株和cspB基因同源物在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的GenBank登錄號(hào)例示如下(GenBank登錄號(hào)示于括號(hào)內(nèi))。
[0148]谷氨酸棒狀桿菌ATCC13058 (AY524990)
[0149]谷氨酸棒狀桿菌ATCC13744(AY524991)
[0150]谷氨酸棒狀桿菌ATCC13745 (AY524992)
[0151 ]谷氨酸棒狀桿菌 ATCC14017 (AY524993)
[0152]谷氨酸棒狀桿菌ATCC14020 (AY525009)
[0153]谷氨酸棒狀桿菌ATCC14067 (AY524994)
[0154]谷氨酸棒狀桿菌ATCC14068 (AY525010)
[0155]谷氨酸棒狀桿菌ATCC14747 (AY525011)
[0156]谷氨酸棒狀桿菌ATCC14751 (AY524995)
[0157]谷氨酸棒狀桿菌ATCC14752 (AY524996)
[0158]谷氨酸棒狀桿菌ATCC14915 (AY524997)
[0159]谷氨酸棒狀桿菌ATCC15243 (AY524998)
[0160]谷氨酸棒狀桿菌ATCC15354 (AY524999)
[0161 ]谷氨酸棒狀桿菌 ATCC17965 (AY525000)
[0162]谷氨酸棒狀桿菌ATCCl7966 (AY525001)
[0163]谷氨酸棒狀桿菌ATCC19223 (AY525002)
[0164]谷氨酸棒狀桿菌ATCC19240 (AY525012)
[0165]谷氨酸棒狀桿菌ATCC21341 (AY525003)[0166]谷氨酸棒狀桿菌ATCC21645 (AY525004)
[0167]谷氨酸棒狀桿菌ATCC31808 (AY525013)
[0168]谷氨酸棒狀桿菌ATCC31830 (AY525007)
[0169]谷氨酸棒狀桿菌ATCC31832 (AY525008)
[0170]谷氨酸棒狀桿菌LP-6 (AY525014)
[0171]谷氨酸棒狀桿菌DSM20137(AY525015)
[0172]谷氨酸棒狀桿菌DSM20598 (AY525016)
[0173]谷氨酸棒狀桿菌DSIM63O7 (AY525017)
[0174]谷氨酸棒狀桿菌22220 (AY525005)
[0175]谷氨酸棒狀桿菌22243 (AY525006)
[0176]cspB基因可以是編碼具有在上述的氨基酸序列中的一個(gè)或幾個(gè)位置上取代、缺失、插入或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，只要通過本發(fā)明的插入序列異源蛋 白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量能夠增加即可。雖然“一個(gè)或幾個(gè)”的數(shù)目可根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)或氨基酸殘基的類型而不同，具體而言，其優(yōu)選為1-20個(gè)，優(yōu)選1-10個(gè)，更優(yōu)選1-5個(gè)。
[0177]上述的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加是維持蛋白質(zhì)的正常功能的保守突變。保守突變的典型實(shí)例是保守取代。保守取代是這樣的突變，其中，如果取代位點(diǎn)是芳香族氨基酸，則取代發(fā)生在Phe、Trp和Tyr之間；如果是疏水氨基酸，則發(fā)生在Leu、Ile和Val之間；如果其是極性氨基酸，則發(fā)生在Gln和Asn之間；如果其是堿性氨基酸，則發(fā)生在Lys、Arg和His之間；如果其是酸性氨基酸，則發(fā)生在Asp和Glu之間；如果其是具有羥基的氨基酸，則發(fā)生在Ser和Thr之間。被視為保守取代的取代實(shí)例包括，具體而言，以 Ser 或 Thr 取代 Ala ；以 Gin、His,或 Lys 取代 Arg ；以 Glu、Gin、Lys> His,或 Asp 取代 Asn ；以 Asn、Glu,或 Gln 取代 Asp ；以 Ser 或 Ala 取代 Cys ；以 Asn、Glu、Lys> His、Asp,或 Arg 取代 Gln ；以 Gly、Asn、Gin、Lys,或 Asp 取代 Glu ；以 Pro 取代 Gly ；以 Asn、Lys>Gln> Arg,或 Tyr 取代 His ;以 Leu、Met、Val,或 Phe 取代 lie ;以 lie、Met、Val,或 Phe 取代 Leu ；以 Asn、Glu、Gin、His,或 Arg 取代 Lys ；以 lie、Leu、Val,或 Phe 取代 Met ；以 Trp>Tyr> Met、He,或 Leu 取代 Phe ；以 Thr 或 Ala 取代 Ser ；以 Ser 或 Ala 取代 Thr ；以 Phe 或Tyr取代Trp ;以His、Phe,或Trp取代Tyr ;和以Met、lie,或Leu取代Val。此外，如上所述的此類氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加、倒位等等包括由于個(gè)體差異或基因來源的細(xì)菌的物種差異而天然發(fā)生的突變(突變異體或變異體)。
[0178]此外，具有上述的保守突變的基因可以是編碼與總編碼氨基酸序列顯示80%以上，優(yōu)選90 %以上，更優(yōu)選95 %以上，還更優(yōu)選97 %以上，特別優(yōu)選99 %以上的同源性的蛋白質(zhì)的基因，只要通過本發(fā)明的插入序列能夠增加異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量。此外，在本說明書中，“同源性”可以意指“同一性”。
[0179]此外，cspB基因可以是能夠與這樣的探針在嚴(yán)格條件下雜交的DNA，只要通過本發(fā)明的插入序列能夠增加異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量:所述探針能夠從已知的基因序列，例如與前述的核苷酸序列的一部分或者全部互補(bǔ)的序列制備。術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指這樣的條件，在該條件下形成所謂的特異性雜交體，而不形成非特異性雜交體。嚴(yán)格條件的實(shí)例包括這樣的條件，在該條件下高度同源的DNA，例如不少于80%同源，優(yōu)選不少于90%同源，更優(yōu)選不少于95%同源，還更優(yōu)選不少于97%同源，特別優(yōu)選不少于99%的DNA同源彼此雜交，而同源性低于上述的DNA彼此不雜交；或者指在與典型的Southern雜交的洗漆條件(即 Ix SSC、0.1% SDS、60°C，優(yōu)選 0.1x SSC、0.1 % SDS、60°C，更優(yōu)選 0.1x SSC、0.1%SDS、68°C )相當(dāng)?shù)柠}濃度或溫度下，洗滌I次，優(yōu)選2-3次。
[0180]用于上述雜交的探針可以是與如上所述的基因互補(bǔ)的序列的一部分。這樣的探針可以使用基于已知的基因序列制備的寡核苷酸作為探針、含有所述核苷酸序列的DNA片段作為模板，通過PCR來制備。例如，當(dāng)使用長(zhǎng)度大約300bp的DNA片段作為探針時(shí)，雜交的洗滌條件可為，例如，50°C，2xSSC和0.1% SDS。
[0181 ] 此外，雖然可以直接使用天然存在的cspB基因，但也可以使用任意密碼子被替換為等效密碼子的cspB基因。例如，可以使用根據(jù)要使用的宿主中的密碼子頻度進(jìn)行了修飾，從而具有最優(yōu)密碼子的cspB基因。
[0182]上文關(guān)于基因和蛋白質(zhì)的變異體的描述也可以在適當(dāng)變化后適用于任意蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞表層蛋白質(zhì)和本發(fā)明中作為分泌 產(chǎn)生的對(duì)象的異源蛋白質(zhì)，以及它們的編碼基因。
[0183]術(shù)語“通過本發(fā)明的插入序列異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量能夠增加”可以表示，但不特別限于(只要與沒有插入序列相比異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量增加即可)，例如，異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量以培養(yǎng)基中和/或細(xì)胞表層中的積累量計(jì)比非修飾菌株中所見的量高優(yōu)選10%以上，更優(yōu)選20%以上，尤其優(yōu)選30%以上，進(jìn)一步更優(yōu)選100%以上，或甚至100%以上、300%以上、500%以上、或1000%以上。此外，表述“通過本發(fā)明的插入序列異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量能夠增加”還可以表示，當(dāng)將導(dǎo)入了不含本發(fā)明的插入序列的異源蛋白質(zhì)表達(dá)基因構(gòu)建體的菌株的非濃縮培養(yǎng)上清液施加到SDS-PAGE并用CBB染色時(shí)無法檢測(cè)到異源蛋白質(zhì)，而當(dāng)將導(dǎo)入了具有本發(fā)明的插入序列的異源蛋白質(zhì)表達(dá)基因構(gòu)建體的菌株的非濃縮培養(yǎng)上清液施加到SDS-PAGE并用CBB染色時(shí)能夠檢測(cè)到異源蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，通過本發(fā)明的插入序列是否能增加異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量可以這樣確認(rèn):將具有本發(fā)明的插入序列的異源蛋白質(zhì)表達(dá)基因構(gòu)建體導(dǎo)入屬于棒狀桿菌型細(xì)菌的菌株，對(duì)將該導(dǎo)入了基因構(gòu)建體的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)觀察到的異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量進(jìn)行定量，并將該測(cè)定的量與將該導(dǎo)入了不含本發(fā)明的插入序列的異源蛋白質(zhì)基因構(gòu)建體的菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)觀察到的異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生量進(jìn)行比較。
[0184]在本發(fā)明中，“成熟CspB的X位的氨基酸殘基”表示對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:96中的位置X的氨基酸殘基。氨基酸序列中的“X位”表示從氨基酸序列的N端起的第X個(gè)位置，且位于N端的氨基酸殘基是I位的氨基酸殘基。即，上面所說的氨基酸殘基的位置表示相對(duì)位置，且位置可能由于氨基酸殘基的缺失、插入、添加等等而移動(dòng)。例如“成熟CspB的50位的氨基酸殘基”表示對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 96的50位的氨基酸殘基，而當(dāng)50位的N端一側(cè)缺失了一個(gè)氨基酸殘基時(shí)，則從N端起的第49個(gè)氨基酸殘基是“成熟CspB的50位的氨基酸殘基”。此外，當(dāng)50位的N端一側(cè)插入了一個(gè)氨基酸殘基時(shí)，則從N端起的第51個(gè)氨基酸殘基是“成熟CspB的50位的氨基酸殘基”。即，例如，“由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4_50位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列”表示由Gln-Glu-Thr與對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:96的4-50位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列。
[0185]本發(fā)明使用的插入序列優(yōu)選是從成熟CspB的I位的氨基酸殘基起、到3-50位的任意氨基酸殘基止的氨基酸序列。本發(fā)明使用的插入序列更優(yōu)選是從成熟CspB的I位的氨基酸殘基起、到3-8、17和50位中的任意氨基酸殘基止的氨基酸序列。本發(fā)明使用的插入序列特別優(yōu)選是從成熟CspB的I位的氨基酸殘基起、到4、6、17和50位中的任意氨基酸殘基止的氨基酸序列。
[0186]本發(fā)明使用的插入序列的長(zhǎng)度優(yōu)選為3-50個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選3-8、17或50個(gè)氨基酸殘基，特別優(yōu)選4、6、17或50個(gè)氨基酸殘基。
[0187]當(dāng)本發(fā)明使用的插入序列的N端起第I至第3個(gè)氨基酸殘基是Gln-Glu-Thr時(shí)，本發(fā)明使用的插入序列長(zhǎng)度為4、5或6個(gè)氨基酸殘基，本發(fā)明使用的插入序列的N端起第4個(gè)氨基酸殘基優(yōu)選為Asn, Gly, Thr, Pro或Ala,第5個(gè)氨基酸殘基優(yōu)選為Pro, Thr或Val,而第6個(gè)氨基酸殘基優(yōu)選為Thr或Tyr。當(dāng)本發(fā)明使用的插入序列中Gln-Glu-Thr的N端一側(cè)存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基時(shí)，上面所說的第4個(gè)氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)為與Gln-Glu-Thr的氨基酸殘基Thr相鄰的氨基酸殘基，上述的第5和第6個(gè)氨基酸殘基也類似地定義。
[0188]本發(fā)明使用的插入序列優(yōu)選是選自下列氨基酸序列(A)至(H)的氨基酸序列:
[0189](A) Gln-Glu-Thr
[0190](B)Gln-Glu-Thr-Xaal(SEQ ID NO:102)
[0191](C)Gln-Glu-Thr-Xaal-Xaa2(SEQ ID NO:103)
[0192](D)Gln-Glu-Thr-Xaal-Xaa2-Xaa3(SEQ ID NO:104)
[0193](E)由Gln-Glu-Thr 與成熟CspB的4-7位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列，
[0194](F)由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4-8位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列，
[0195](G)由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4_17位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列，
[0196](H)由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4_50位的氨基酸序列融合而構(gòu)成的氨基酸序列。
[0197]在氨基酸序列(A)- (H)中，Xaal 為 Asn, Gly, Thr, Pro 或 Ala ；Xaa2 為 Pro, Thr 或Val ;而Xaa3為Thr或Tyr。對(duì)于氨基酸序列(A)-(H), "Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4-X位的氨基酸殘基融合〃表示成熟CspB的N端的4-X位的氨基酸殘基融合于Gln-Glu-Thr的Thr。成熟CspB的N端的第一至第三個(gè)氨基酸殘基通常是Gln-Glu-Thr,在此情況下，〃由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4-X位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列〃與由成熟CspB的1-X位氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列同義。
[0198]此外，具體而言，本發(fā)明使用的插入序列優(yōu)選是選自下組的氨基酸序列:Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr(SEQ ID NO:97), Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr(SEQ ID NO:98), Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr(SEQ ID NO:99), Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr(SEQ ID NO:100)，和Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr(SEQ ID NO:101)。
[0199]如上所述，作為依照本發(fā)明的方法分泌產(chǎn)生的對(duì)象的異源蛋白質(zhì)包括，但不限于全部范圍的蛋白質(zhì)，例如來源于微生物、植物、動(dòng)物和病毒的蛋白質(zhì)，以及人工設(shè)計(jì)氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
[0200]要依照本發(fā)明的方法分泌產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)的例子包括，例如，生理學(xué)活性蛋白質(zhì)、受體蛋白質(zhì)、要作為疫苗使用的抗原性蛋白質(zhì)、以及酶。酶的例子包括，例如，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、蛋白酶、內(nèi)肽酶、外肽酶、氨肽酶、羧肽酶、膠原酶、殼多糖酶，等等。
[0201]生理學(xué)活性蛋白質(zhì)的例子包括，例如，生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子和抗體相關(guān)分子。
[0202]生長(zhǎng)因子的具體實(shí)例包括，例如，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，源自腦的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、源自血小板的生長(zhǎng)因子(TOGF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)，促血小板生成素(TPO)，酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF或FGF1)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF或FGF2)，角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF-1或FGF7，以及KGF-2或FGF10)，和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。
[0203]激素的具體實(shí)例包括，例如，胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)激素抑制素、人生長(zhǎng)激素(hGH)、甲狀旁腺素(PTH)和降鈣素。
[0204]細(xì)胞因子的實(shí)例包括,例如，白介素、干擾素、和腫瘤壞死因子(TNF)。
[0205]生長(zhǎng)激素、激素和細(xì)胞因子可能相互沒有嚴(yán)格區(qū)分。例如，生理活性蛋白質(zhì)可能是屬于選自生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞因子中的單一類型的蛋白質(zhì)，或者可以是屬于選自它們中多種類型的蛋白質(zhì)。
[0206]此外，生理 活性蛋白質(zhì)可以是完整的蛋白質(zhì)，或者可以是蛋白質(zhì)的一部分。蛋白質(zhì)的一部分的例子包括，例如，具有生理活性的部分。具有生理活性的部分的具體實(shí)例包括，例如，特立帕肽，一種由甲狀旁腺素(PTH)的N端34個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的生理學(xué)活性肽。
[0207]抗體相關(guān)分子的具體實(shí)例包括，例如，完整抗體、Fab、F(ab’)，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)e,由重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)組成的二聚體，F(xiàn)e-融合蛋白質(zhì)，重鏈(H鏈)、和輕鏈(L鏈)。
[0208]受體蛋白質(zhì)沒有特別限制。受體蛋白質(zhì)可以是，例如，任何生理活性蛋白質(zhì)和其他生理活性物質(zhì)的受體蛋白質(zhì)。其他生理活性物質(zhì)的例子包括，例如，神經(jīng)遞質(zhì)諸如多巴胺。此外，受體蛋白質(zhì)可以是相關(guān)配體未知的孤」L受體。
[0209]要用作疫苗的抗原蛋白質(zhì)沒有特別限制，只要它們是能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)即可?？乖鞍踪|(zhì)可以根據(jù)意圖的免疫應(yīng)答對(duì)象加以適當(dāng)選擇。
[0210]編碼這些蛋白質(zhì)的基因可以根據(jù)要使用的宿主、以及為了獲得期望的活性而加以修飾。例如，可修飾編碼這些蛋白質(zhì)的基因，使得這些蛋白質(zhì)包含一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失、取代等等。上述關(guān)于CspB蛋白質(zhì)和cspB基因的變異體的變異體的記載還可以調(diào)整適用于通過本發(fā)明的方法分泌產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)及其編碼基因。此外，在編碼這些蛋白質(zhì)的基因中，可以將任意的密碼子替換為其等價(jià)的密碼子。例如，在編碼這些蛋白質(zhì)的基因中，根據(jù)需要可以根據(jù)宿主中所見的密碼子使用頻率來優(yōu)化密碼子。
[0211]本發(fā)明的基因構(gòu)建體在編碼包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列的核酸序列與編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列之間還可以包含編碼用于酶促切割的氨基酸序列的核酸序列。通過在本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)中插入用于酶促切割的氨基酸序列，可以酶促切割表達(dá)出的融合蛋白，獲得目標(biāo)異源蛋白質(zhì)。
[0212]用于酶促切割的氨基酸序列沒有特別限制，只要其是能夠被水解肽鍵的酶識(shí)別并消化的序列即可，可以根據(jù)目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的氨基酸序列合適地選擇可使用的序列。編碼用于酶促切割的氨基酸序列的核酸序列可以根據(jù)該氨基酸序列來設(shè)計(jì)，例如，可使用宿主中觀察到的密碼子頻率來使用最優(yōu)的密碼子。[0213]用于酶促切割的氨基酸序列優(yōu)選是顯示高底物特異性的蛋白酶的識(shí)別序列。這樣的氨基酸序列的具體實(shí)例包括，例如，因子Xa蛋白酶的識(shí)別序列和proTEV蛋白酶的識(shí)別序列。Xa蛋白酶和proTEV蛋白酶分別識(shí)別蛋白質(zhì)中的氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg(=IEGR, SEQ ID NO: 105)和氨基酸序列 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln( = ENLYFQ, SEQ IDNO: 106)，在各自識(shí)別序列的C端側(cè)特異性消化該蛋白質(zhì)。
[0214]通過本發(fā)明的方法最終得到的異源蛋白質(zhì)的N端區(qū)域可以與天然蛋白質(zhì)的N端區(qū)域相同，或者不與天然蛋白質(zhì)的N端區(qū)域相同。例如，最終得到的異源蛋白質(zhì)的N端區(qū)域可具有包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列，或包含Gln-Glu-Thr和前述的用于酶促消化的氨基酸序列的氨基酸序列，或者可以不含有這些序列中的任何序列。此外，例如，最終獲得的異源蛋白質(zhì)的N端區(qū)域可以是在天然蛋白質(zhì)的N端區(qū)域中額外添加或缺失了I個(gè)或幾個(gè)氨基酸。雖然根據(jù)目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)或結(jié)構(gòu)“一個(gè)或幾個(gè)”氨基酸殘基的數(shù)目可能不同，但具體而言其優(yōu)選為1-20，更優(yōu)選1-10，更優(yōu)選1-5個(gè)。
[0215]此外，要分泌產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)可以是包含原-結(jié)構(gòu)(pro-structre)的蛋白質(zhì)(原蛋白質(zhì))。當(dāng)要分泌產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)是原蛋白質(zhì)時(shí)，最終獲得的異源蛋白質(zhì)可以是原蛋白質(zhì)或者可以不是原蛋白質(zhì)。即，原蛋白質(zhì)可以通過切斷原結(jié)構(gòu)部分而被加工為成熟蛋白質(zhì)。切斷可以通過例如蛋白酶來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)使用蛋白酶時(shí)，從最終獲得的蛋白質(zhì)的活性的觀點(diǎn)看，一般而言，原蛋白質(zhì)優(yōu)選在與天然蛋白質(zhì)基本相同的位置被切斷，或者更優(yōu)選在與天然蛋白質(zhì)完全相同的位置被切斷，以便獲得與天然成熟蛋白質(zhì)相同的成熟蛋白質(zhì)。因此，一般而言，最優(yōu)選這樣的特異性蛋白酶，其切割原蛋白質(zhì)的位置使得產(chǎn)生與天然出現(xiàn)的成熟蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)。然而，如上所述，最終獲得的異源蛋白質(zhì)的N端區(qū)域與天然蛋白質(zhì)的N端區(qū)域可能不相同。例如，根據(jù)要生產(chǎn)的異源蛋白質(zhì)的類型、使用目的等，有時(shí)相比于天然蛋白質(zhì)N端長(zhǎng)或短一個(gè)到幾個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)可能具有更適宜的活性。本發(fā)明中能夠使用的蛋白酶包括，例如，可商購(gòu)的蛋白酶諸如Dispase (Boehringer Mannheim生產(chǎn))，以及能夠從微生物的培養(yǎng)液中獲得的，例如放線菌的培養(yǎng)液。這樣的蛋白酶可以在非純化狀態(tài)下使用，或者可以根據(jù)需要可以在純化到一定純度后使用。當(dāng)原結(jié)構(gòu)被切斷而獲得成熟蛋白質(zhì)時(shí)，插入的包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列與原結(jié)構(gòu)部分一起被去除，因此無需在包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列的下游提供用于酶促消化的氨基酸序列，就可以獲得目標(biāo)蛋白。
[0216]將本發(fā)明使用的基因構(gòu)建體導(dǎo)入棒狀桿菌型細(xì)菌的方法沒有特別限制。在本發(fā)明的細(xì)菌中，本發(fā)明使用的基因構(gòu)建體作為在染色體外自主復(fù)制的載體(如質(zhì)粒)存在，或者可以組入染色體內(nèi)。此外，為了構(gòu)建本發(fā)明的細(xì)菌，可以按照任意的順序?qū)嵤┯糜诒景l(fā)明的基因結(jié)構(gòu)的導(dǎo)入、分泌產(chǎn)生蛋白質(zhì)的能力的賦予或增強(qiáng)、以及其他修飾。
[0217]本發(fā)明使用的基因構(gòu)建體可以通過例如使用包含該基因構(gòu)建體的載體導(dǎo)入宿主中。載體沒有特別限制，只要選用能夠在棒狀桿菌型細(xì)菌中自主復(fù)制的載體即可，可以是，例如,來源于細(xì)菌質(zhì)粒的載體、來源于酵母質(zhì)粒的載體、來源于細(xì)菌噬菌體的載體、粘粒、噬菌粒等等。作為載體，例如，優(yōu)選來源于棒狀桿菌型細(xì)菌的質(zhì)粒。在棒狀桿菌型細(xì)菌中能夠自主復(fù)制的載體的具體實(shí)例包括pHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984));在日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平 3-210184 中所述的通過改進(jìn)這些而獲得的、具有藥物抗性基因的質(zhì)粒；在日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平2-72876和美國(guó)專利號(hào) 5，185，262 中所述的質(zhì)粒 pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、和PCRY3KX ;日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平1-191686中描述的質(zhì)粒pCRY2和pCRY3 ;日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_昭58-192900中描述的pAJ655、pAJ611、和pAJ1844 ;日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_昭57-134500中描述的pCGl ;日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_昭58-35197中描述的pCG2 ;日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_昭57-183799中描述的PCG4和pCGll，等等。
[0218]此外，還可以使用人工轉(zhuǎn)座子等。當(dāng)使用轉(zhuǎn)座子時(shí)，通過同源重組或轉(zhuǎn)座子自身的轉(zhuǎn)位能力將異源蛋白質(zhì)基因?qū)牖蚪M。利用同源重組的導(dǎo)入方法的其他例子包括，例如:利用線性DNA、具有溫度敏感復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒，能夠進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒、沒有在宿主中發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)的自殺載體等等的方法。此外，當(dāng)異源蛋白質(zhì)基因被導(dǎo)入染色體時(shí)，只要本發(fā)明使用的基因構(gòu)建體能被構(gòu)建到染色體上，該基因構(gòu)建體中所含的下列一者或多者可以是原本存在于宿主染色體上的:啟動(dòng)子序列、編碼信號(hào)肽的序列、和編碼包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列的核酸序列。具體而言，例如，通過直接使用啟動(dòng)子序列、以及宿主染色體上原本存在的、連接于所述啟動(dòng)子序列下游的編碼信號(hào)肽的核酸序列，并僅將連接于該編碼信號(hào)肽的核酸序列下游的基因替換為編碼包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列與異源蛋白質(zhì)的融合蛋白的核酸序列，也能夠在染色體上構(gòu)建成本發(fā)明使用的基因構(gòu)建體，從而也能構(gòu)建本發(fā)明的細(xì)菌。
[0219]此外，當(dāng)表達(dá)兩種或更多種蛋白質(zhì)時(shí)，只需本發(fā)明的細(xì)菌中攜帶各蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生用基因構(gòu)建體，使得目的異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生得以實(shí)現(xiàn)即可。具體地，例如，所有分泌產(chǎn)生用基因構(gòu)建體可以攜帶在一個(gè)表達(dá)載體上，或者攜帶在染色體上?；蛘?，分泌產(chǎn)生用基因構(gòu)建體可以分別被多個(gè)表達(dá)載體分別攜帶，或者可以由一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體以及染色體分別攜帶?！氨?達(dá)兩種或更多種蛋白質(zhì)時(shí)”是指，例如，分泌產(chǎn)生兩種或更多種異源蛋白質(zhì)的情況，或者分泌產(chǎn)生異源多聚體蛋白質(zhì)的情況。
[0220]用于將本發(fā)明使用的基因構(gòu)建體導(dǎo)入棒狀桿菌型細(xì)菌的方法沒有特別限制，可以使用通常使用的方法，例如，原生質(zhì)體方法(Gene，39，281-286 (1985))，電穿孔法(Bio/Technology, 7，1067-1070(1989))等等。
[0221]通過培養(yǎng)如上所述獲得的本發(fā)明的細(xì)菌以表達(dá)異源蛋白質(zhì)，獲得分泌到細(xì)胞外的大量的該異源蛋白質(zhì)。
[0222]本發(fā)明的細(xì)菌可以使用通常使用的方法和條件來培養(yǎng)。例如，本發(fā)明的細(xì)菌可以使用含有碳源、氮源、和無機(jī)離子的通常培養(yǎng)基培養(yǎng)。為了獲得更高的擴(kuò)增，可以視需要加入有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物例如維生素和氨基酸。
[0223]作為碳源，可以使用碳水化合物如葡萄糖和蔗糖、有機(jī)酸如乙酸、醇類和其他碳源。作為碳源，可以使用氨氣、氨水、銨鹽和其他氮源。作為無機(jī)離子，可以視需要合適地使用鈣離子、鎂離子、磷酸根離子、鉀離子和鐵離子等。培養(yǎng)在PH5.0到8.5的適合范圍內(nèi)、在15到37°C、在好氧條件下進(jìn)行I到7天。此外，可以使用棒狀桿菌型細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)的培養(yǎng)條件、使用其他Sec型、Tat型的信號(hào)肽的蛋白質(zhì)制造方法中記載的其他條件(參見W001/23591和W02005/103278)。此外，當(dāng)使用誘導(dǎo)性啟動(dòng)子表達(dá)異源蛋白質(zhì)時(shí)，還可以向培養(yǎng)基中加入啟動(dòng)子誘導(dǎo)劑來進(jìn)行培養(yǎng)。通過在此類條件下培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，生成大量的目標(biāo)蛋白質(zhì)并將其高效地分泌到細(xì)胞外。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)被分泌到細(xì)胞外，因此某些在一般情況下如果在微生物細(xì)胞中大量積累有致死性的蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，也可以連續(xù)生產(chǎn)而不造成致死效應(yīng)。
[0224]根據(jù)本發(fā)明的方法分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)可以在通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法培養(yǎng)后從培養(yǎng)基中分離純化。例如，在通過離心等分離細(xì)胞之后，可以通過已知的合適方法，例如鹽析、乙醇沉淀、超離心、凝膠過濾層析、離子交換柱層析、親和層析、中壓或高壓液相層析、反相層析和疏水層析，或它們的組合來分離并純化蛋白質(zhì)。此外，在特定情況下，可直接使用培養(yǎng)物或培養(yǎng)上清液。根據(jù)本發(fā)明的方法分泌到細(xì)胞表層中的蛋白質(zhì)，在用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(例如增加鹽濃度和使用表面活性劑)使其溶解之后，也可以通過和蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中的情況一樣的方式將其分離和純化。此外，在某些情況下，分泌到細(xì)胞表層中的蛋白質(zhì)可以不經(jīng)溶解而作為固定化酶使用。
[0225]目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生可以通過以培養(yǎng)上清液和/或含有細(xì)胞表層的級(jí)分作為樣品進(jìn)行SDS-PAGE，確定分離的蛋白質(zhì)條帶的分子量來加以確認(rèn)。目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生還可以通過以培養(yǎng)上清液和/或含有細(xì)胞表層的級(jí)分作為樣品，使用抗體進(jìn)行Western 印跡(Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor(USA), 2001)來加以確認(rèn)。目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生還可以通過使用蛋白質(zhì)測(cè)序儀測(cè)定目標(biāo)蛋白質(zhì)的N端氨基酸序列來加以確認(rèn)。此外，目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生還可以通過使用蛋質(zhì)譜儀測(cè)定目標(biāo)蛋白質(zhì)的質(zhì)量來加以確認(rèn)。此外，當(dāng)目標(biāo)異源蛋白質(zhì)是酶或具有特定的可測(cè)量的生理活性的蛋白質(zhì)時(shí)，目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生可以通過測(cè)量作為樣品的培養(yǎng)上清液和/或含有細(xì)胞表層的級(jí)分中的目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的酶活性和/或生理活性來加以確認(rèn)。
[0226]當(dāng)本發(fā)明使用的基因構(gòu)建體表達(dá)的蛋白質(zhì)中緊鄰信號(hào)肽之后的殘基是谷氨酰胺殘基時(shí)，通過切割信號(hào)肽而獲得的蛋白質(zhì)的N端氨基酸殘基是由原本的谷氨酰胺殘基脫水縮合而形成的焦谷氨酸殘基。即，例如，通過本發(fā)明的方法分泌到培養(yǎng)基中的異源蛋白質(zhì)的N端氣基酸殘基可以是焦谷氣酸殘基。目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的N端氣基酸殘基是焦谷氣酸殘基可以通過用質(zhì)譜儀測(cè)定目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的質(zhì)量，并確認(rèn)測(cè)得的質(zhì)量與理論原質(zhì)量減去水分子質(zhì)量(=18)所算得的質(zhì)量相對(duì)應(yīng)來加以確認(rèn)。此外，當(dāng)該蛋白質(zhì)的N端氨基酸殘基是焦谷氨酸殘基時(shí)，Edman降解反應(yīng)被封閉，因此N端氨基酸序列無法用蛋白質(zhì)測(cè)序儀測(cè)定。因此，還可以基于目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的N端氨基酸序列即使使用蛋白質(zhì)測(cè)序儀也無法直接測(cè)定、而讓焦谷氨酸氨肽酶作用于目標(biāo)異源蛋白質(zhì)之后，可以使用蛋白質(zhì)測(cè)序儀測(cè)定原先的N端氨基酸序列中的第二個(gè)及以后的氨基酸殘基這一事實(shí)，來確認(rèn)目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的N端氨基酸殘基是焦谷氨酸殘基。此外，作為簡(jiǎn)化的方法，可以基于目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的N端氨基酸序列即使用蛋白質(zhì)測(cè)序儀也無法直接測(cè)定這一事實(shí)來確認(rèn)目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的N端氨基酸殘基是焦谷氨酸殘基。
實(shí)施例
[0227]下面將援引下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的解釋。但這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0228]實(shí)施例1:胰島素原與谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的成熟細(xì)胞表層蛋白質(zhì)CspB的N 端 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，300，350，400
或440個(gè)氨基酸殘基的融合物的分泌表達(dá)。[0229](I)胰島素原基因的全合成和使用谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)CspB的信號(hào)肽序列的胰島素原分泌表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
[0230]胰島素原(下面縮寫為PIns)的氨基酸序列已經(jīng)得到確定(Genbank AccessionN0.NP_000198.1)。考慮該序列以及谷氨酸棒狀桿菌中的密碼子頻率，合成了 SEQ IDNO: 1-8中所示的DNA。使用這些DNA作為模板，SEQ ID N0:9和10中所示的DNA作為引物，通過PCR擴(kuò)增了編碼PIns的基因，獲得如SEQ ID NO: 11中所示的大約0.3kbp的DNA片段。將該DNA片段插入克隆質(zhì)粒pHSG398 (Takara Bio)的SmaI位點(diǎn)而獲得pHSG-Pins。使用上述pHSG-PIns作為模板，SEQ ID N0:9和10中所示的DNA作為引物，通過PCR擴(kuò)增PIns基因區(qū)，獲得大約0.3kbp的PIns基因片段。
[0231]CspB(—種谷氨酸棒狀桿菌的細(xì)胞表層蛋白質(zhì))的核苷酸序列已經(jīng)得到確定(非專利文獻(xiàn)8 ；Mol.Microbiol.，9，97-109 (1993))。參考該序列，使用W001/23591中所述的pPKPTGl作為模板，SEQ ID N0:12和SEQ ID NO: 13中所示的引物，通過PCR擴(kuò)增了來源于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的CspB的啟動(dòng)子區(qū)域和信號(hào)肽序列編碼區(qū)域，得到大約0.7kbp的DNA片段。pPKPTGl是一種用于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原(具有原-結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)分泌表達(dá)的載體，包含來源于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869菌株的CspB基因的啟動(dòng)子、可表達(dá)地連接于該啟動(dòng)子下游的、編碼來源于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869菌株的信號(hào)肽的30個(gè)氨基酸殘基的DNA、以及連接于該信號(hào)肽編碼DNA下游的、來源于放線菌茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因，使得該轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因作為與信號(hào)肽的融合蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0232]此外，使用擴(kuò)增的兩種DNA片段(即PIns基因片段和啟動(dòng)子區(qū)和信號(hào)肽編碼區(qū)的片段)作為模板，SEQ ID NO: 12和10所示的DNA作為引物，獲得了大約0.9kbp的DNA片段，其由上述兩個(gè)DNA片段融合而成。在引物SEQ ID N0:12和10中設(shè)計(jì)有限制酶KpnI的識(shí)別序列。為了 PCR,使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio),反應(yīng)條件依照制造商推薦的規(guī)程。用限制酶KpnI處理該DNA片段，然后將其插入日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平9-322774中描述的PPK4的KpnI位點(diǎn)，獲得pPKPIns。通過對(duì)插入片段的核苷酸測(cè)序，確認(rèn)了預(yù)期的融合基因的構(gòu)建。核苷酸測(cè)序使用BigDye (注冊(cè)商標(biāo))Terminator v3.1Cycle SequencingKit (Applied Biosystems)和 3130Genetic Analyzer (Applied Biosystems)進(jìn)行。
[0233](2)用于胰島素原與谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的成熟細(xì)胞表層蛋白質(zhì)CspB的N端 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，300，350，400 或440個(gè)氨基酸殘基的融合物的分泌表達(dá)的質(zhì)粒的構(gòu)建
[0234]如上所述，谷氨酸棒狀桿菌的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)CspB的編碼基因的核苷酸序列已經(jīng)被測(cè)定(非專利文獻(xiàn)8 ;Mol.Microbiol.,9,97-109(1993))。在谷氨酸棒狀桿菌中，CspB定位于細(xì)胞表層，形成一個(gè)稱為S-層的層，而且還知道位于C端側(cè)的一個(gè)高度疏水氨基酸殘基的區(qū)域參與定位(非專利文獻(xiàn)8 ;Mol.Microbiol.,9,97-109(1993))。通過參考該序列，合成了SEQ ID N0:12和14所示的引物，并使用以常規(guī)方式(Saito和Miura的方法[Biochem.Biophys.Act.，72，619(1963)])制備的谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869 的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增了包括CspB編碼基因的啟動(dòng)子的5’-上游區(qū)域(以下也稱為CspB啟動(dòng)子區(qū)域)，以及編碼CspB N端信號(hào)肽的30個(gè)氨基酸殘基和CspB成熟蛋白質(zhì)的N端440個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域。CspB成熟蛋白質(zhì)的N端440個(gè)氨基酸殘基是指谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的CspB成熟蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)469個(gè)氨基酸殘基(SEQ ID NO:96)中除去組成疏水區(qū)的C端29個(gè)氨基酸殘基的部分。PCR使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)，反應(yīng)條件依照制造商推薦的規(guī)程。
[0235]然后，為了構(gòu)建用于胰島素原與谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的成熟細(xì)胞表層蛋白質(zhì) CspB 的 N 端 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，300，350，400或440個(gè)氨基酸殘基的融合物的分泌表達(dá)的質(zhì)粒，使用如上所述擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作為模板，合成 DNA SEQ ID NO: 12 與 15，SEQ ID NO: 12 與 16，SEQ ID NO: 12 與 17，SEQ IDNO: 12 與 18，SEQ ID NO: 12 與 19，SEQ ID NO: 12 與 20，SEQ ID NO: 12 與 21，SEQ ID NO: 12 與22，SEQ ID NO:12 與 23，SEQ ID NO:12 與 24，SEQ ID NO:12 與 25，SEQ ID NO:12 與 26，SEQID NO: 12 與 27，SEQ ID NO: 12 與 28，SEQ ID NO: 12 與 29，SEQ ID NO: 12 與 20，SEQ ID NO: 12與31，SEQ ID NO: 12與32，SEQ ID NO: 12與33，SEQ ID NO: 12與34，SEQ ID NO: 12與35，SEQID NO:12 與 36，SEQ ID NO:12 與 37，SEQ ID NO:12 與 38，SEQ ID NO:12 與 39，或 SEQ IDNO: 12與40作為引物進(jìn)行PCR，以分別擴(kuò)增CspB啟動(dòng)子區(qū)、編碼CspB的N端信號(hào)肽的30個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域、以及CspB成熟蛋白質(zhì)N端的I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，300，350，400，或440個(gè)氨基酸殘基。此外，通過使用實(shí)施例I (I)中構(gòu)建的質(zhì)粒pPKPIns作為模板、SEQ ID N0:9和41中所示的合成DNA作為引物，擴(kuò)增了 PIns基因區(qū)域而獲得 PIns基因片段。
[0236]此外，使用上述兩個(gè)擴(kuò)增DNA片段(即，CspB啟動(dòng)子區(qū)域及編碼CspB信號(hào)肽和成熟 CspB 的 N 端 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，30O, 350，400,或440個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域的片段；以及PIns基因片段)作為模板、SEQ IDNO: 12和41中所示的DNA作為引物進(jìn)行PCR，獲得了由這兩個(gè)DNA片段融合到一起而構(gòu)成的DNA片段。在引物SEQ ID NO: 12和41中，設(shè)計(jì)有限制酶KpnI的識(shí)別序列。引物SEQID NO: 15-40包含編碼位于PIns的N端一側(cè)的氨基酸序列的序列，用于構(gòu)建編碼CspB成熟蛋白質(zhì)的N端的區(qū)域和PIns基因的融合基因。PCR使用Pyrobest DNA聚合酶(TakaraBio)，反應(yīng)條件依照制造商推薦的規(guī)程。用限制酶KpnI處理這些DNA片段，然后將它們插入日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_平9-322774中描述的pPK4中的KpnI位點(diǎn)，以分別獲得pPKKlPIns，pPKK2PIns, pPKK3PIns, pPKK4PIns, pPKK5PIns, pPKK6PIns, pPKK7PIns, pPKK8PIns, pPKK9PIns, pPKKlOPIns, pPKKllPIns, pPKK12PIns, pPKK13PIns, pPKK14PIns, pPKK15PIns, pPKK17PIns, pPKK20PIns, pPKK50PIns, pPKKlOOPIns, pPKK150PIns, pPKK200PIns, pPKK250PIns, pPKK300PIns, pPKK350PIns, pPKK400PIns,和pPKK440PIns。通過對(duì)插入片段的核苷酸測(cè)序，確認(rèn)了期望的融合基因的構(gòu)建。核苷酸測(cè)序使用BigDye (注冊(cè)商標(biāo))Terminator v3.1CycleSequencing Kit (Applied Biosystems)和 3130Genetic Analyzer(Applied Biosystems)進(jìn)行。
[0237](3)胰島素原與谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的成熟細(xì)胞表層蛋白質(zhì)CspB的N端I，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，300，350，400 或 440個(gè)氨基酸殘基的融合物在谷氨酸棒狀桿菌YDK010株中的分泌表達(dá)
[0238]將W02004/029254中描述的谷氨酸棒狀桿菌YDK010株用實(shí)施例1(1)中構(gòu)建的pPKPIns轉(zhuǎn)化,它是用于分泌表達(dá)未與成熟CspB的N端氨基酸殘基融合的胰島素原的質(zhì)粒；以及用實(shí)施例1 (2)中構(gòu)建的 pPKKlPIns, pPKK2PIns, pPKK3PIns, pPKK4PIns, pPKK5PIns, pPKK6PIns, pPKK7PIns, pPKK8PIns, pPKK9PIns, pPKKlOPIns,pPKKllPIns, pPKK12PIns,pPKK13PIns, pPKK14PIns, pPKK15PIns, pPKK17PIns, pPKK20PIns, pPKK50PIns, pPKKlOOPIns,pPKK150PIns, pPKK200PIns, pPKK250PIns, pPKK300PIns, pPKK350PIns, pPKK400PIns,和pPKK440PIns，它們是用于分泌表達(dá)胰島素原與谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的細(xì)胞表層蛋白質(zhì) CspB 的成熟蛋 白 N 端 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，17，20，50，100，150，200，250，300, 350，400,或440個(gè)氨基酸殘基的融合物的質(zhì)粒。谷氨酸棒狀桿菌YDK010株是谷氨酸棒狀桿菌AJ12036(FERM BP-734) (W02004/029254)的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)PS2 (CspB)缺陷株。將所得的每個(gè)轉(zhuǎn)化體在含有25mg/ml卡那霉素的麗液體培養(yǎng)基(120g葡萄糖、3g七水合硫酸鎂、30g硫酸銨、1.5g磷酸二氫鉀、0.03g七水合硫酸鐵、0.03g四水合硫酸猛、0.45mg鹽酸硫胺素、0.45mg生物素、0.15g DL-甲硫胺素、和50g碳酸韓，用水制成IL體積，調(diào)整到PH7.0)中30°C培養(yǎng)72小時(shí)。在培養(yǎng)完成之后，對(duì)通過將每個(gè)培養(yǎng)液離心而獲得的培養(yǎng)上清液進(jìn)行還原型SDS-PAGE，然后使用CBB R-250 (Bio-Rad)進(jìn)行染色。結(jié)果，對(duì)于導(dǎo)入了質(zhì)粒pPKPIns(該質(zhì)粒表達(dá)未與CspB的成熟蛋白質(zhì)的N端氨基酸融合的PIns)的菌株而言，用肉眼僅能確認(rèn)一條非常微弱的代表具有預(yù)期的分子量的蛋白質(zhì)的條帶。相比之下，對(duì)于導(dǎo)入了表達(dá)PIns與CspB的成熟蛋白質(zhì)的N端氨基酸的融合物的各種質(zhì)粒的菌株，檢測(cè)到一條代表具有預(yù)期的分子量的蛋白質(zhì)的強(qiáng)條帶，因此確認(rèn)了通過與CspB成熟蛋白質(zhì)的N端氨基酸序列融合顯著增加了分泌量。對(duì)于與CspB N端3-8、17和50個(gè)氨基酸的融合物而言分泌量改進(jìn)的效果特別明顯(圖1)。此外，針對(duì)在SDS-PAGE中檢測(cè)到的目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶，使用密度計(jì)進(jìn)行了分泌量的定量。結(jié)果，與導(dǎo)入了表達(dá)未與CspB的成熟蛋白質(zhì)的N端氨基酸融合的PIns的質(zhì)粒pPKPIns相比，幾乎所有的導(dǎo)入了表達(dá)PIns與CspB的成熟蛋白質(zhì)的N端氨基酸的融合物的質(zhì)粒的菌株的分泌量都增加了 1.5倍或更多。尤其是，對(duì)于導(dǎo)入了與成熟CspB的N末端的4、6、17和50個(gè)氨基酸殘基的融合物的pPKK4PIns, pPKK6PIns, pPKK17PIns,和 pPKK50PIns 的菌株，分泌量增加了 10 倍以上(表I中的“分泌量(％ ) ”)。此外，對(duì)于與成熟CspB的N端的3-8個(gè)氨基酸殘基融合的情況，PIns的分泌量增加了 5倍以上(表1中“分泌量(％ )”)。此外，基于目標(biāo)融合蛋白質(zhì)的分子量計(jì)算了被分泌的分子數(shù)的相對(duì)值。結(jié)果，再次確認(rèn)了 PIns的分泌量，尤其是在與成熟CspB的N端3-8、17、或50個(gè)氨基酸殘基殘基融合的情況下顯著增加(表1中“分泌量(% ) ”)。同時(shí)，當(dāng)嘗試使用蛋白質(zhì)測(cè)序儀PPSQ-21A(Shimadzu)測(cè)定這些確認(rèn)了分泌量提聞的各融合蛋白質(zhì)的N端氣基酸序列時(shí)，這些融合蛋白質(zhì)的N端氣基酸殘基無法測(cè)定，考慮到后述的結(jié)果，確認(rèn)了這些融合蛋白質(zhì)的N端氨基酸已轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸。
[0239][表 I]
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，包括: 培養(yǎng)具有用于分泌表達(dá)異源蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建體的棒狀桿菌型細(xì)菌；和 收集分泌產(chǎn)生的異源蛋白質(zhì)， 其中所述基因構(gòu)建體包含:在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子序列，連接在該啟動(dòng)子序列下游的編碼在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的信號(hào)肽的核酸序列，以及連接在該編碼信號(hào)肽的核酸序列下游的編碼包含Gln-GlU-Thr的氨基酸序列與所述異源蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的核酸序列， 條件是所述包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列不是由SEQ ID NO:96的1_14位或1_38位的氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列是選自下述氨基酸序列(A)-(H)的氨基酸序列:
(A)Gln-Glu-Thr
(B)Gln-Glu-Thr-Xaal(SEQID NO:102)
(C)Gln-Glu-Thr-Xaal-Xaa2(SEQID NO:103)
(D)Gln-Glu-Thr-Xaal-Xaa2-Xaa3(SEQID NO:104) (E)由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4_7位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列， (F)由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4_8位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列， (G)由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4_17位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列， (H)由Gln-Glu-Thr與成熟CspB的4_50位的氨基酸殘基融合而構(gòu)成的氨基酸序列，
其中 Xaal 是 Asn、Gly、Thr、Pro 或 Ala,Xaa2 是 Pro>Thr 或 Val,且 Xaa3 是 Thr 或 Tyr。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列選自下組的氨基酸序列:Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr (SEQ ID NO: 97), Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr (SEQ IDNO:98), Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr (SEQ ID NO:99), Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr (SEQ IDNO: 100)、和 Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr (SEQ ID NO: 101)。
4.權(quán)利要求1-3 中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因構(gòu)建體在所述編碼包含Gln-Glu-Thr的氨基酸序列的核酸序列和所述編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列之間還包含編碼用于酶消化的氨基酸序列的核酸序列。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述用于酶消化的氨基酸序列是因子Xa蛋白酶的識(shí)別序列，或者ProTEV蛋白酶的識(shí)別序列。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述蛋白酶的識(shí)別序列是SEQID NO: 105或106中所示的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的信號(hào)肽是來源于棒狀桿菌型細(xì)菌的CspB的信號(hào)肽。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述CspB的信號(hào)肽具有SEQID NO:92中所示的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中作為培養(yǎng)對(duì)象的棒狀桿菌型細(xì)菌是屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)或短桿菌屬(Brevibacterium)的細(xì)菌。
10.權(quán)利要求1-9中所述的方法，其中作為培養(yǎng)對(duì)象的棒狀桿菌型細(xì)菌是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)或 Corynebacterium stationis。
【文檔編號(hào)】C12N15/09GK103917656SQ201280052867
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月25日
【發(fā)明者】鶴井典子, 板屋寬, 菊池慶實(shí) 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社