專利名稱：超活性的生長(zhǎng)激素釋放因子類似物的制作方法
生長(zhǎng)激素是一種對(duì)有機(jī)體的發(fā)育有廣泛影響的，由動(dòng)物的垂體分泌的分泌蛋白質(zhì)。已經(jīng)證明人工控制的生長(zhǎng)激素水平有著顯著的治療學(xué)效用。已經(jīng)表明補(bǔ)充人生長(zhǎng)激素對(duì)于治療人的生長(zhǎng)激素缺乏和其相關(guān)疾病是有效的。除了這種應(yīng)用，研究已經(jīng)揭示出生長(zhǎng)激素的新的重要特性，即進(jìn)一步提供控制生長(zhǎng)激素水平的能力。例如最近的臨床研究表明，補(bǔ)充生長(zhǎng)激素可有效地延緩人的衰老。已經(jīng)表明升高動(dòng)物體中的生長(zhǎng)激素水平導(dǎo)致增加肌肉群。這種近期研究結(jié)果的應(yīng)用表明，能夠得到高產(chǎn)量的瘦肉產(chǎn)品或得到更大和/或更強(qiáng)的動(dòng)物。
當(dāng)生長(zhǎng)激素由垂體自然產(chǎn)生時(shí)，由第二種蛋白，生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)控制生長(zhǎng)激素向血液中分泌。這種激素也就是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的體激泌素，生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)，和生長(zhǎng)釋放激素(GRH)。因而有兩種解決提高生長(zhǎng)激素的循環(huán)水平這一問(wèn)題的方法(1)直接增加人生長(zhǎng)激素在有機(jī)體中的水平或(2)增進(jìn)有機(jī)體產(chǎn)生生長(zhǎng)激素的自然傾向。第二種方案通過(guò)補(bǔ)充GRF而實(shí)現(xiàn)目的，已經(jīng)證明GRF可以提高生長(zhǎng)激素在體內(nèi)的循環(huán)水平。Rivier，等人(1982)Nature300276。已經(jīng)廣泛地研究了GRF(和其各種結(jié)構(gòu)類似物)對(duì)生長(zhǎng)激素生產(chǎn)的影響。直接補(bǔ)充GRF的第一障礙是其在體內(nèi)的壽命短。Frohman，L.A.，等人(1986)J.Clin.Invest.78906。更有效和/或更長(zhǎng)效的GRF分子對(duì)于發(fā)展有效的人類治療藥品或畜牧業(yè)試劑才是令人滿意的。
用多種方法修飾GRF的結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生長(zhǎng)效的和/或更有效的GRF類似物。已經(jīng)證明，從N-末端起的前29個(gè)氨基酸足夠保持整個(gè)GRF的活性。Speiss，等人，(1982)Biochemistry21，6037。一個(gè)對(duì)策是在GRF分子的各個(gè)區(qū)域摻入新的D-氨基酸殘基。Lance，V.A.，等人.(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.119265;Coy，D.H.，等人(1986)Peptides8(suppl.1)，49.另一方案是通過(guò)在N-末端區(qū)摻入肽鍵isoteres，修飾GRF的主肽鏈。Tourwe，D.(1985)Janssen.Chim.Acta.3，3，Hocart，S.J.，等人，(1990)J.Med.Chem.33 1954-58。
本發(fā)明提供具有增加了有效性和具有能提供技術(shù)上優(yōu)于以前報(bào)道的GRF類似物的其它特性的GRF類似物。本發(fā)明的化合物較佳的是獸醫(yī)用，特別是用于牛、豬、羊，家禽和魚(yú)。
為了說(shuō)明本文所公開(kāi)和要求的本發(fā)明的目的，現(xiàn)將下列術(shù)語(yǔ)定義如下。
Ala-丙氨酸，類似物-與另一種結(jié)構(gòu)相似的一種化合物。當(dāng)用于指多肽時(shí)，它涉及一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)。
Arg-精氨酸Asn-天冬酰胺Asp-天冬氨酸堿基對(duì)(bp)-涉及DNA或RNA。當(dāng)存在于DNA分子上時(shí)，縮寫(xiě)A，C，G和T分別對(duì)應(yīng)(脫氧)腺嘌呤核苷酸，(脫氧)胞嘧啶核苷酸，(脫氧)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸和(脫氧)胸腺嘧啶核苷酸的5′-單磷酸形式。當(dāng)在RNA分子上時(shí)，縮寫(xiě)U，C，G和T分別對(duì)應(yīng)尿嘧啶，胞嘧啶，鳥(niǎo)嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的5′-單磷酸形式。在雙鏈DNA中，堿基對(duì)是指A與T或C與G的對(duì)應(yīng)關(guān)系。在DNA/RNA，這種異源雙鏈核酸分子上，堿基對(duì)的對(duì)應(yīng)關(guān)系是T與U或C與G。
Cys-半胱氨酸或通過(guò)二硫鍵與另外半個(gè)胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合的半個(gè)胱氨酸殘基。
DNA-脫氧核糖核酸EDTA-乙二胺四乙酸的縮寫(xiě)。
ED50-半數(shù)有效劑量的縮寫(xiě)。
功能類似物-是指與該分子或化合物的天然存在的結(jié)構(gòu)形式相比具有相似的功能特性但其結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)修飾的一種分子。一種功能類似物包括與親代分子具有相似的功能特性和反應(yīng)活性的親代分子片段(或附加物)Gln-谷氨酰胺。
Glu-氨基酸谷氨酸Gly-甘氨酸GRF PEPTIDE-一種由27到76氨基酸殘基組成的，能啟動(dòng)生長(zhǎng)激素從垂體釋放及合成的多肽。GRF PEPTIDEs包括公開(kāi)在US Patent Nos.4，517，181，4，518，586，4，528，190，4，529，595，4，563，352，4，585，756，4，595，676，4，605，643，4，620，976，4，626，523，4，628，043和4，689，318中的天然的或合成的其功能類似物;全部學(xué)說(shuō)作為對(duì)比文獻(xiàn)引入。術(shù)語(yǔ)GRF PEPTIDE包括其非毒性鹽。
His-組氨酸Hse-高絲氨酸Ile-異亮氨酸Leu-亮氨酸Lys-賴氨酸Met-甲硫氨酸或它的脫甲基化類似物mRNA-信使RNAMWCO-截止分子量的縮寫(xiě)Orn-鳥(niǎo)氨酸Phe-苯基丙氨酸質(zhì)粒-一種染色體外自我復(fù)制的遺傳因子PMSF-氟化苯甲基硫酰基的簡(jiǎn)寫(xiě)。
Pro-脯氨酸閱讀框架-核苷酸序列，由轉(zhuǎn)譯機(jī)構(gòu)tRNA和核糖體以及相關(guān)的因子以三聯(lián)體密碼形式進(jìn)行閱讀而轉(zhuǎn)譯該序列。每個(gè)三聯(lián)體密碼對(duì)應(yīng)一個(gè)特定的氨基酸。由于每個(gè)三聯(lián)體密碼是分離的并且長(zhǎng)度相同，因此，編碼序列一定是3的倍數(shù)，一個(gè)堿基對(duì)的插入或缺失(叫做移碼突變)可以導(dǎo)致由同樣的DNA片段編碼不同的兩種蛋白質(zhì)。為了防止這種情況，對(duì)應(yīng)特定多肽的三聯(lián)體一定是從起始密碼開(kāi)始就以3的倍數(shù)排列，即保持正確的“閱讀框架”。
重組DNA克隆載體-任何自主復(fù)制因子，包括，但不限于，質(zhì)粒和噬菌體，由能夠或已經(jīng)加上一個(gè)或多個(gè)其他DNA片段的一個(gè)DNA分子組成。
重組DNA表達(dá)載體-任何插入了啟動(dòng)子的重組DNA克隆載體。
復(fù)制子-控制并允許質(zhì)?；蚱渌d體自主復(fù)制的DNA序列。
RNA-核糖核酸RP-HPLC-反相高效液體色譜法的簡(jiǎn)寫(xiě)。
Ser-絲氨酸Thr-蘇氨酸轉(zhuǎn)錄-將包含在DNA序列中的信息轉(zhuǎn)移到互補(bǔ)RNA序列的過(guò)程。
轉(zhuǎn)譯-將信使RNA中的遺傳信息用于指定和指導(dǎo)多肽鏈合成的過(guò)程。
Tris-三羥甲基氨基甲烷的縮寫(xiě)。
Trp-色氨酸Tyr-酪氨酸Val-纈氨酸載體-一種在基因操作中用于細(xì)胞轉(zhuǎn)化的復(fù)制子，該復(fù)制子攜帶與合適的蛋白質(zhì)分子對(duì)應(yīng)的多核苷酸序列，該多核苷酸序列與適當(dāng)?shù)目刂菩蛄薪Y(jié)合時(shí)，便使被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞具有特定的性質(zhì)。由于質(zhì)粒、病毒、和噬菌體本身就是復(fù)制子，因此，它們都是合適的載體。使用限制酶和連接酶，通過(guò)切割和連接來(lái)源不同的DNA分子即可構(gòu)建人工載體。本文中使用的“載體”這一術(shù)語(yǔ)包括重組DNA克隆載體和重組DNA表達(dá)載體。
附圖中標(biāo)明的限制位點(diǎn)和功能圖譜是本文所述重組DNA載體的合適代表例。限制位點(diǎn)的資料是不完全的;因此，在載體上存在的給定類型的限制性位點(diǎn)數(shù)目比附圖中標(biāo)明的更多。


圖1質(zhì)粒PHS190的限制位點(diǎn)和功能圖譜。
圖2質(zhì)粒PHS500的限制位點(diǎn)和功能圖譜。
圖3質(zhì)粒PHS452的限制位點(diǎn)和功能圖譜。
圖4表明用對(duì)-甲基馬尿酰PGRF(2-76)OH給藥，在閹豬中的生長(zhǎng)激素水平升高。
圖5表示用對(duì)-甲基馬尿酰PGRF(2-76)OH給藥后對(duì)泌尿排泄的脲氮水平的影響本發(fā)明提供由下式代表的合成的GRF肽類似物(GRF PEPTIDES)X1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-A9-Tyr-Arg-A12Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A21-A22-LeuGln-A25-Ile-A27-A28-Arg-Y-Z-T其中A9＝Ser，Ala，Leu，Thr或AsnA12＝Arg或LysA15＝Gly，Ala，Thr或LeuA21＝Arg或LysA22＝Ala或LeuA25＝Asp或GluA27＝Met，Ser，Arg，Leu，或正亮氨酸，
A28＝Ser或Asn，Y＝0，或1到15個(gè)氨基酸的氨基酸序列，Z＝0或1到32個(gè)氨基酸的氨基酸序列，及T＝由分子式-COORa，-CRaO，-CONHNHRa，-CON(Ra)(Rb)或CH2ORa，表示的羧基末端基團(tuán)，其中，Ra和Rb單獨(dú)地是低級(jí)烷、氫，Hse(內(nèi)酯)，HseOH或HseN(Rc)(Rd)其中，Rc和Rd單獨(dú)地是氫或低級(jí)烷，X1是由分子式
代表的酰基，其中R1＝氫，甲基，乙基，羥乙基，苯基，或者取代的苯基，是由鹵，低烷，低烷氧基，羥基、硝基，氨基取代的，乙酰氨基，三氟甲基，-CH2-OH或磺氨，或者一個(gè)含一個(gè)或多個(gè)N，O，或S的5或6員雜環(huán)，a＝0，1，2，或3，b＝0或1c＝0或1
d＝0到12A＝0，O或SB＝羰基、磺?；蛠喕酋；?
R2＝H，CH3，CH2OH，對(duì)-羥芐基或
e＝0到5，R3＝甲基、乙基、羥乙基、氨基、羥基、苯基，或者用鹵、烷基、烷氧基、羥基、硝基、氨基取代的苯基，乙酰氨基，或磺氨，或一個(gè)包含一個(gè)或多個(gè)N，O，或S的5或6員雜環(huán)取代，及其藥物學(xué)上可接受的非毒性鹽。
在式1的說(shuō)明中，術(shù)語(yǔ)“低烷基”涉及如甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，仲丁基，異丁基和叔-丁基這樣的C1-C4烷基，“低烷氧基”涉及甲氧基，乙氧基，正-丙氧基，叔-丁氧基等等基團(tuán);“鹵基”涉及氟、氯、溴、碘基團(tuán)?！叭〈交鄙婕氨交灰粋€(gè)或兩個(gè)相同或不同的選自鹵、低烷基、低烷氧基、羥基、硝基、氨基、乙酰氨基或亞磺酰氨基取代后的基團(tuán)，這樣的基團(tuán)如4-氯苯基，3-碘苯基，2-氟苯基，4-甲基苯基，3-氯-4-甲基苯基，3-溴苯基，4-乙基苯基，3-乙氧基苯基，2-甲氧基苯基，4-異丙氧基苯基，4-羥苯基，3，4-二羥苯基，2，4-二羥苯基，4-硝基苯基，3-氨基苯基，3-氯-4-羥苯基，2-乙酰氨基苯基，4-亞磺酰氨基苯基，3，4-二甲氧基苯基，2-氟-4-氨苯基等;“含一個(gè)或多個(gè)N，O或S的5或6員雜環(huán)”涉及的5員雜環(huán)如吡咯，噻吩，呋喃，咪唑，噁唑，噁二唑，噻唑，1，3，4-噻二唑， asoxazole等等;6員雜環(huán)如吡啶，嘧吩，吡喃，二氫吡喃，噻嗪，噻喃，三嗪和類似的6員雜環(huán)。這種5-和6-員雜環(huán)可以帶如低烷基、低烷氧基、羥基、氨基或鹵這樣的取代基團(tuán)。
式1中X1代表的?；睦影▽?duì)-氯馬尿?；瑢?duì)-甲基馬尿?；?，對(duì)-硝基馬尿?；?，馬尿酰基，對(duì)-羥馬尿?；?-苯甲?；；?，正-鄰二甲酰甘氨酰基，N-苯基丙二酰胺基，對(duì)-甲基-N-苯基丙二酰胺基，或，對(duì)-氟馬尿?；?。
正如上文提到的，本發(fā)明優(yōu)選的化合物是動(dòng)物GRF肽的衍生物和變型。
與式1化合物的氨基酸殘基有關(guān)的“A20”，“A21”等符號(hào)，表示以天然形式及在文獻(xiàn)中出現(xiàn)時(shí)，從蛋白質(zhì)的氨基末端依次編號(hào)時(shí)相應(yīng)的特定氨基酸號(hào)碼。對(duì)已進(jìn)行充分定性的蛋白質(zhì)氨基酸殘基進(jìn)行這樣的統(tǒng)一編碼是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。符合“des-Tyrl-GRF”意味著天然GRF分子缺失N-末端的酪氨酸殘基，這種表示方法對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員也是廣泛熟知的。給余下的氨基酸殘基編碼不是必要的，并且可能導(dǎo)致混亂。在上述例子中，顯然，在自然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中第二位上的氨基酸就是氨基末端殘基，但它的符號(hào)是以例如Ala2表示。下面將列出不同種GRF的通用的氨基酸符號(hào)。
本發(fā)明優(yōu)選的肽包括一種由式1代表的豬GRF(PGRF)變型體，其中A9＝Asn，A12＝Arg，A15＝Thr，A21＝Arg，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Leu，和A28＝Ser。
本發(fā)明另一優(yōu)選的肽包括一種由式1代表的牛GRF(bGRF)的變型體，其中，A9＝Asn，A12＝Arg，A15＝Thr，A21＝Arg，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Leu，A28＝Asn。
本發(fā)明再一優(yōu)選的肽包括一種由式1代表的人GRF(hGRF)的變型體，其中，A9＝Ser，A12＝Lys，A15＝Gly，A21＝Lys，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Met，和A28＝Ser。
本發(fā)明優(yōu)選的肽包括式1的化合物，其中，Y是成熟GRF PEPTIDE的30-43氨基酸序列。本發(fā)明優(yōu)選的化合物包括式1的化合物，其中，Y是天然存在的需要分析的特定GRF種類即PGRF，bGRF，hGRF等的30-43氨基酸序列。特別優(yōu)選的Y肽包括下列氨基酸序列Gln-Gln-Gly-Glu-A34-A35-Gln-Glu-A38-A39-A40-Arg-A42-Arg-Leu其中A34＝Asp或SerA38＝Arg或GlnA39＝Gly或ArgA40＝Ala或SerA42＝Ala，Val或Phe如果上述GRF的特定形式是牛GRF，Glu Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu ArgGly Ala Arg Ala Arg Leu
則一種特別優(yōu)選的Y肽包括上述氨基酸序列。
如果上述GRF的特定形式是豬GRF，Gln Gln Gly Glu ·Arg Asn Gln Glu GlnGly Ala Arg Val Arg Leu則一種特別優(yōu)選的Y肽包括上述氨基酸序列。
如果上述GRF的特定形式是人GRF，Glu Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg GlyAla Arg Ala Arg Leu則一種特別優(yōu)選的Y肽包括上述氨基酸序列，如果Z包括GRF前體PEPTIDES的44-76氨基酸序列，則是本發(fā)明的優(yōu)選肽。來(lái)自正在研究中的特殊種的天然GRF的44-76氨基酸序列是特別優(yōu)選的。
由Z代表的最優(yōu)選形式的肽成分包括特殊種的天然GRF的44-76氨基酸序列，其中，該序列中，由精氨酸殘基取代賴氨酸殘基，且亮氨酸取代甲硫氨酸。例如如果Z包括氨基酸序列，Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly，該序列是豬的GRF的一種變型體，且如果分析的GRF是豬的時(shí)，該序列是優(yōu)選的，即為一個(gè)GRF PEPTIDE的最佳氨基酸序列。
如果Z含有氨基酸序列Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly，該序列是上述牛GRF的一種變型體，且如果上述的GRF是來(lái)自牛時(shí)，則是優(yōu)選的。該序列即是一個(gè)GRF PEPTIDE的最佳氨基酸序列。
如果分析的GRF來(lái)自人時(shí)，則式1最優(yōu)選的Z序列為零時(shí)是優(yōu)選的。
本發(fā)明優(yōu)選的化合物是含有式1的化合物，其中Y和/或Z肽足夠長(zhǎng)以便在E.coli中進(jìn)行高水平表達(dá)。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的化合物包括GRF PEPTIDES，該GRF PEPTIDES中的無(wú)，一個(gè)或不僅一個(gè)有游離氨基的氨基酸用化學(xué)方法修飾。根據(jù)本發(fā)明目的，“用化學(xué)方法修飾”的定義是氨基酸的游離氨基與烷基或羥烷基的衍生作用。修飾的程度由反應(yīng)長(zhǎng)度或試劑量控制。所有有一個(gè)游離氨基的氨基酸都用化學(xué)方法修飾則是優(yōu)選的。只有一個(gè)游離氨基用化學(xué)方法修飾的GRF PEPTIDE是特別優(yōu)選的。上述化合物無(wú)賴氨酸或甲硫氨酸殘基。通過(guò)用精氨酸取代賴氨酸和用亮氨酸取代甲硫氨酸，將含賴氨酸和/或甲硫氨酸的化合物轉(zhuǎn)變?yōu)閮H在N-末端有一游離氨基的化合物。
首先合成在N-末端有一游離氨基的GRF PEPTIDES，然后，用合適的X1酸或其活性衍生物酰化N-末端，從而構(gòu)建本發(fā)明的GRF化合物?？梢杂霉滔嚯暮铣煞ɑ蛑亟M方法制造GRF PEPTIDES。兩種方法均在美國(guó)專利4，617，149中進(jìn)行了描述，全部引入本文作為參考。如果高產(chǎn)率是令人滿意的，則重組方法是優(yōu)選方法。固相化學(xué)合成多肽的原理是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的并且可以從本領(lǐng)域的普通課本中找到，如Dugas，H.和Penney，C.，Bioorganic Chemistry(1981)Springerverlag，New York，Pgs 54-92。GRF類似物的固相合成方法的描述可以從歐洲專利，申請(qǐng)No.85302975.9，公開(kāi)號(hào)為0161852，
公開(kāi)日1985，11月21日中找到，全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，通過(guò)重組DNA技術(shù)可以合成GRF PEPTIDE。如何構(gòu)建一個(gè)編碼給定氨基酸序列的全合成或半合成的DNA序列，對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員是熟知的。Brown，等人，Methods in Enzymology 68109(1979)。為了轉(zhuǎn)譯得到需要的多肽，通過(guò)使用合適的限制性內(nèi)切酶，將遺傳工程法合成的DNA序列插入到任何適當(dāng)?shù)闹亟MDNA表達(dá)載體中。由所用的母本表達(dá)載體的限制性內(nèi)切酶裂解圖決定所用的特殊內(nèi)切酶。必須將GRF PEPTIDE編碼序列與表達(dá)載體啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)一起進(jìn)行定位以形成正確的閱讀框架，其中的兩者在要表達(dá)GRF PEPTIDE的宿主細(xì)胞中具有功能。用于在特定重組環(huán)境中實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)的特定密碼子也是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)W.Fiers，等人.(1976)Nature 260500，和美國(guó)專利No.4，356，270。
用于在E.coli宿主細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)選載體是來(lái)源于E.coli質(zhì)粒PHS190，它含有TcR基團(tuán)，λcI857阻遏物和λpL啟動(dòng)子。PHS190的限制位點(diǎn)和功能圖譜參見(jiàn)附圖的圖1。質(zhì)粒PHS190寄存在Northern RegionalResearch Laboratories，登記號(hào)為NRRL B-18410(保存日期1988年9月9日)。
本發(fā)明的合成基因序列編碼結(jié)構(gòu)為Met1-Ala2-PGRF(3-76)OH，Met1-Ala2-bGRF(3-76)OH和Met1-Ala2-hGRF(3-76)OH的豬、牛和人的GRF類似物。對(duì)其他各種如馬、鴨、鼠、豚鼠，豬，毛絲鼠，雞和其它動(dòng)物有效的GRF類似物可用合成基因得到，該合成基因編碼與這些分子的已知氨基酸序列相適應(yīng)的GRF肽并且用與本文例舉的牛和豬GRF肽相類似的方法將這些肽進(jìn)行修飾。
E.coli固有的甲二磺酰氨肽酶(MAP)的作用是除去上述化合物本身的N-末端甲硫氨酸，以生產(chǎn)所需的PGRF(2-76)OH，bGRF(2-76)OH和hGRF(2-76)OH肽。通過(guò)用X1酸或一種其活性衍生物?；被┒税被?，從而將這些(2-76)OH GRF PEPTIDES轉(zhuǎn)變成本發(fā)明的化合物(式1)。但是，表達(dá)出的肽是融合蛋白形式在分子生物學(xué)中是經(jīng)常的。在這種情況下，生產(chǎn)的GRF PEPTIDE是融合蛋白并且然后從該結(jié)構(gòu)中切割出GRF PEPTIDE，為此，人們必須設(shè)計(jì)一種編碼序列，以便在所產(chǎn)生的融合結(jié)構(gòu)中，GRF PEPTIDE和異源肽之間產(chǎn)生蛋白酶的(如羧肽酶)或化學(xué)(如，溴化氰)斷裂位點(diǎn)。將外源異源肽從融合蛋白結(jié)構(gòu)中斷裂出的生產(chǎn)融合旦白的技術(shù)是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。參見(jiàn)，如美國(guó)專利No.4，366，246和4，425，437。在確定一種適當(dāng)?shù)牡鞍姿饷笗r(shí)，優(yōu)選的是將融合蛋白的氨基酸主鏈設(shè)計(jì)成除在所需肽和外源肽之間的界面外，在所需的多肽(即GRF PEPTIDE)中沒(méi)有任何附加的斷裂位點(diǎn)。這樣可以避免所需GRF PEPTIDE可能的降解。各種化學(xué)和酶試劑的氨基酸序列特異性是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。參見(jiàn)，如Proteolytic EnzymesA Practical Approach，Benyon，R，J，和Bond，J.S.eds(1989)Oxford University Press，Oxford，England，UK.
如本文舉例的本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)例中，為了在編碼鏈的5′末端有一個(gè)XbaI位點(diǎn)并在編碼鏈的3′末端有一個(gè)Bam HI位點(diǎn)，而構(gòu)建一個(gè)編碼所研究GRF PEPTIDE的合成的DNA序列。為了得到載體DNA，除去PHS190的EcoRI位點(diǎn)。用EcoRI消化PHS190載體，將延伸出的末端填平，并重新連接質(zhì)粒。隨后，用BamHI和XbaI消化，產(chǎn)生載體DNA。再將合成的GRF PEPTIDE編碼序列插入到載體DNA中并將載體重新連接。
將連接好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到細(xì)菌(如E.coli)或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，所述的宿主細(xì)胞適于所使用的特定的表達(dá)載體，而得到能表達(dá)對(duì)本發(fā)明適用的GRF PEPTIDE重組細(xì)胞。適用于細(xì)菌和哺乳動(dòng)物表達(dá)條件的合適的表達(dá)載體可在本領(lǐng)域內(nèi)熟知的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到。如Current Protocols in Molecular Biology，(1989年和補(bǔ)充版)Ausubel，等人.，eds.，John Wiley和Sons，NY。
在此舉例說(shuō)明的本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，按照以上描述的方法，通過(guò)插入Met1-Ala2-PGRF(3-76)OH GRF肽的編碼序列來(lái)制備PHS452質(zhì)粒。在此提供了Met1-Ala2-PGRF(3-76)OH GRF肽的DNA編碼序列和相應(yīng)的氨基酸序列是ATG GCT GAT GCT ATT TTT ACT AATMet Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn
AAT TAT CGA CGC GTT CTG ACT CAG CTG TCTAsn Tyr Arg Arg Val Leu Thr Gln Leu Ser
GCT CGT CGT CTG CTG CAG GAT ATT CTG TCTAla Arg Arg Leu Leu Gln Asp Ile Leu Ser
CGT CAG CAG GGT GAA CGT AAC CAG GAA CAAArg Gln Gln Gly Glu Arg Asn Gln Glu Gln
GGA GCC CGT GTT CGT CTT GGT CGT CAG GTTGly Ala Arg Val Arg Leu Gly Arg Gln Val
GAT TCT CTG TGG GCT GAT CAA CGT CAG CTTAsp Ser Leu Trp Ala Asp Gln Arg Gln Leu
GCT CTC GAG TCT ATC CTG GCT ACT CTG CTGAla Leu Glu Ser Ile Leu Ala Thr Leu Leu
CAG GAA CAT CGT AAT TCT CAG GGT TAA TAGGln Glu His Arg Asn Ser Gln Gly StopStop如果所插入的DNA序列編碼Met1-Ala2-bGRF(3-76)OH GRF時(shí)，將該質(zhì)粒命名為PHS500。編碼Met1-Ala2-bGRF(3-76)OH GRF肽的DNA序列和相應(yīng)的氨基酸順序是ATG GCT GAT GCT ATT TTT ACT AAT TCT TATMet Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr
CGT CGT GTC CTT ACT CAG CTG TCT GCG CGCArg Arg Val Leu Thr Gln Leu Ser Ala Arg
CGT CTG CTG CAG GAT ATC CTG AAT CGT CAGArg Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln
CAA GGT GAA CGT AAT CAG GAA CAA GGT GCTGln Gly Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
CGT GTA CGT CTG GGT CGC CAA GTT GAT GGTArg Val Arg Leu Gly Arg Gln Val Asp Gly
GGT TGG ACT GAT CAA CAG CAG CTT GCT CTCVal Trp Thr Asp Gln Gln Gln Leu Ala Leu
GAG TCT ACA CTA GTT TCT CTG CTG CAG GAAGlu Ser Thr Leu Val Ser Leu Leu Gln Glu
CTG CGG AAT TCT CAA GGT TAA TAGArg Arg Asn Ser Gln Gly StopStop被插入的DNA序列編碼Met1-Ala2-hGRF(3-44)OH GRF肽。編碼Met1-Ala2-hGRF(3-44)OH GRF肽的DNA序列和相應(yīng)的氨基酸序列是ATG GCT GAC GCT ATC TTC ACT AAC TCT TAC CGTMet Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg
AAA GTT CTG GGT CAG CTG TCT GCT CGT AAA CTGLys Val Leu Gly Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu
CAG GAC ATC ATG TCT CGT GAG CAG GGT GAA TCTGln Asp Ile Met Ser Arg Glu Gln Gly Glu Ser
AAC CAG GAA CGT GGT GCT CGT GCT CGT CTG TAAAsn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu StopCravador，A，et al.(1985)Biochimie 67829-834.
在此舉例的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例中，如果使用PHS190骨架作為表達(dá)載體，將宿主細(xì)胞在32℃條件下生長(zhǎng)，直到預(yù)期表達(dá)出多肽化合物。當(dāng)改變生長(zhǎng)溫度至接近42℃時(shí)，CI857抑制物被滅活，而pL啟動(dòng)子解除抑制。大量有GRF活性的多肽以高至約為總細(xì)胞蛋白的15%的水平被生產(chǎn)出來(lái)。本專業(yè)技術(shù)人員熟知的和下述的例子提出的方法能將此活性多肽純化。如以前說(shuō)明的，MAP特有的作用可移去N端蛋氨酸殘基而產(chǎn)生GRF(2-76)OH GRF多肽，然而，在蛋白純化后，任何遺留N端蛋氨酸殘基均可通過(guò)常規(guī)的酶促方法被移去，如通過(guò)適當(dāng)?shù)陌被拿?，或者其它化學(xué)方法如通過(guò)溴化氰的作用。
本發(fā)明所要求的化合物是通過(guò)使用所需要的X1羧酸的活性酯而使(2-76)OH GRF肽的氨基末端N-?；频玫?，較好的是，(2-76)OH GRF肽氨基端氮的?；饔檬峭ㄟ^(guò)X1酸的琥珀酰亞胺酯來(lái)完成的。?；饔檬怯?2-76)OH GRF肽的氨基末端氮對(duì)琥珀酰亞胺酯的酯鍵的羰基碳進(jìn)行親核進(jìn)攻而產(chǎn)生的。下面的反應(yīng)圖說(shuō)明?；饔?，其結(jié)果合成了馬尿酰-GRF(2-76)OH
其它X1羧酸活性酯也可用于?；磻?yīng)。例如由氯甲酸酯如氯甲酸乙酯和氯甲酸異丁酯或由N-羥基雜環(huán)如HOBT(羥基苯并三唑hydroxybenzotriazole)形成的活性酯也能使用。常用于氨基酸的酰化或者配對(duì)的其它活性衍生物也可使用。它們包括對(duì)稱的或N-羧酸酐。
?；磻?yīng)是在PH約7.5-9.5，溫度約15-35℃的水介質(zhì)中進(jìn)行的。或者選用非質(zhì)子傳遞溶劑如DMSO。
如果對(duì)(2-29，44，或76)GRF肽進(jìn)行酰化，用于制備結(jié)構(gòu)式1的GRF化合物的X1酸的例子包括馬尿酸、對(duì)-甲基馬尿酸、對(duì)-氯馬尿酸、對(duì)-硝基馬尿酸、對(duì)-羥基馬尿酸、苯氨基碳酸、4-羥基苯丙酮酸、對(duì)-氟馬尿酸、N-苯丙二酸酰胺、對(duì)-甲基-N-苯基丙二酸酰胺、N-(2-噻吩并)甘氨酸、N-(2-呋喃甲?；?甘氨酸、N-(2-呋喃甲酰基)-b-氨基丙酸、N-(3-噻吩并)-a-氨基丙酸、N-(3-吡啶并)甘氨酸、N-(4-吡啶基)丙二酰胺酸(N-(4-Pyridinyl)malonamide acid)、N-(1，3噻嗪基)丙二酰胺酸(N-(1，3thiazinyl)malonamide acid)、N-(1，3噻嗪基)琥珀酰胺、N-苯基戊二酰胺酸(N-Phenyl glutaramide acid)、N-〔(2-甲氧基乙基)氨磺?；掣拾彼岷蛠喕酋！-〔(2-乙硫乙基)氨磺?；掣拾彼岷蛠喕酋＜癗-(2-羥基乙基)丙二酰胺酸(N-(2-hydroxyethyl)malonamide acid)。
對(duì)于本專業(yè)普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)。從游離的或粘附到一種類似的N-末端受阻隔的多肽或被取代的羧酸衍生物載體上(3-29，44，或76)GRF肽，GRF(4-29，44或70)GRF肽等開(kāi)始制備本發(fā)明的化合物是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明的化合物中包含?；腉RF肽的其藥物學(xué)上可接受的非毒性鹽，“藥物學(xué)上可接受的無(wú)毒性鹽”術(shù)語(yǔ)包括有機(jī)或無(wú)機(jī)酸加成鹽例如，從如鹽酸、氫氟酸、硫酸、磺酸、酒石酸、富馬酸、氫溴酸、乙醇酸(glycolic)、檸檬酸、馬來(lái)酸、磷酸、琥珀酸、乙酸、硝酸、苯甲酸、抗壞血酸、對(duì)-甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、丙酸等酸制備的鹽。酸加成鹽較好地從鹽酸、乙酸或琥珀酸制備，上述所有的鹽可通過(guò)常規(guī)的方法制得。該術(shù)語(yǔ)也包括“羧酸鹽”，比如胺、銨、季胺、堿金屬和堿土金屬的鹽如鈣、鎂、鈉、鉀、鋰的鹽等。與現(xiàn)有的羧基構(gòu)成鹽。
下面表1、2和3說(shuō)明本發(fā)明化合物的增強(qiáng)活性。
表1 對(duì)Tyr-1＊進(jìn)行取代后加強(qiáng)了bGRF(1-77)OH生長(zhǎng)激素釋放活性肽 Ec50(nM)**bGRF(1-77)OH 0.59馬尿酰－1bGRF(2-77)OH 0.86對(duì)－羥基馬尿酰bGRF(2-77)OH 0.33對(duì)－氯馬尿酰bGRF(2-77)OH 0.19對(duì)－氟馬尿酰bGRF(2-77)OH 0.14對(duì)－硝基馬尿酰bGRF(2-77)OH 0.51對(duì)－甲基馬尿酰bGRF(2-77)OH 0.05n－苯丙二酰胺酰bGRF(2-77)OH 0.19
表2 通過(guò)取代Tyr-1而增強(qiáng)bGRF(1-77)OH生長(zhǎng)激素釋放活性肽 Ec50(nM)**脫Tyr-1pGRT(2-76)OH 95.0馬尿酰－1 pGRF(2-76)OH 0.28對(duì)－甲基馬尿酰pGRF(2-76)OH 0.06對(duì)－甲基苯丙二酰胺酰pGRF(2-76)OH 0.06表3 不同長(zhǎng)度的對(duì)-甲基馬尿酰-1 PGRF類似物在體外的作用能力＊肽 Ec50(nM)**對(duì)－甲基馬尿酰pGRF(2-29)NH20.02對(duì)－甲基馬尿酰pGRF(2-44)OH 0.07對(duì)－甲基馬尿酰pGRF(2-76)OH 0.06＊給予7劑促分泌素3小時(shí)后，測(cè)定生長(zhǎng)激素從老鼠原垂體細(xì)胞釋放進(jìn)介質(zhì)中的量。
＊＊EC50是計(jì)算得半數(shù)有效劑量。
本發(fā)明也提供了一種藥用組合物包括由結(jié)構(gòu)式1所示的多肽化合物或其藥物學(xué)上可接受的無(wú)毒性的鹽作為活性劑和藥學(xué)上可接受的固體或液體載體。
非腸道使用本發(fā)明多肽化合物時(shí)，適用于注射的藥物制劑包括無(wú)菌水溶液或用于重新構(gòu)成無(wú)菌注射液或分散體系的分散劑和無(wú)菌粉劑。載體可以是一種溶劑或含有，例如水、乙醇、多元醇(如乙二醇、丙二醇、液體聚乙烯乙二醇等等)的分散介質(zhì)，其合適的混合物和植物油。例如，通過(guò)使用一種包衣如卵磷脂，通過(guò)維持分散體系中所需顆粒大小和通過(guò)使用表面活性劑而保持正確的流動(dòng)性。利用各種抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯類，氯丁醇，苯酚，山梨酸等，可確保防止微生物的作用。在許多情況下，含有等滲劑是可取的，例如糖、氯化鈉等。通過(guò)使用延緩吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，能使該注射藥劑的吸收延長(zhǎng)。
將本發(fā)明的化合物溶于所需量的合適溶劑，如果需要，再與各種其它組分相混合，制得無(wú)菌注射液。如果需要和為了更有效的分布，可將化合物與緩慢釋放或靶向釋放體系如聚合物基質(zhì)，脂粒和微球相混合。這些化合物通過(guò)機(jī)械釋放裝置，滲透泵或任何其它釋放裝置或提供連續(xù)或博動(dòng)的釋放系統(tǒng)進(jìn)行釋放。
為了通過(guò)靜脈(Ⅳ)應(yīng)用，將水溶性形式的化合物溶于通常使用的一種靜脈液中并通過(guò)輸注給藥。可以使用的這樣的靜脈液例如生理鹽水，林格溶液或5%葡萄糖溶液。也可以制備該化合物的合適的不溶性形式，并用水基質(zhì)或藥物學(xué)上可接受的油基如一種長(zhǎng)鏈脂肪酸酯如油酸乙酯一起使用。
單位劑量形式的化合物是一種存在于合適的無(wú)菌稀釋劑中的化合物溶液，優(yōu)選的是其鹽形式，將其密封于安瓿管中。根據(jù)化合物的特定劑型，溶解性以及使用時(shí)所需的劑量，化合物的濃度可從約1%到約50%之間變化。
本發(fā)明也提供了誘導(dǎo)生長(zhǎng)激素釋放的方法，該方法包括將有效量的通式1表示的多肽化合物或其藥物學(xué)上可接受的非毒性鹽和一種藥物學(xué)上可接受的固體或液體載體一起施用。
將本發(fā)明的化合物藥劑施用給受體一段時(shí)間，該期間期望刺激生長(zhǎng)激素的釋放。受體的重量和用藥方式將影響到誘導(dǎo)特定應(yīng)答必需的劑量大小。對(duì)于羊優(yōu)選的劑量約為0。0.1-3.0mg/Kg/1天;最優(yōu)選的劑量是約0.5mg/Kg/天。對(duì)于豬優(yōu)選的劑量是約3μg/Kg/天到10μg/Kg/天，最優(yōu)選的劑量是約3μg/Kg/天。對(duì)于牛優(yōu)選的劑量是約0.5-12mg/Kg/天。尤其優(yōu)選的是3mg/Kg/天。對(duì)于人優(yōu)選的劑量是約0.03mg/Kg/天到1.0mg/Kg/天。最優(yōu)選的是約0.3mg/Kg/天。
配制單位劑量形式的本發(fā)明的化合物特別有利，易于給藥和劑量準(zhǔn)確。這里所說(shuō)的單位劑量形式是指作為單一劑量適用于需治療的患者的機(jī)械分離單位。每單位含有計(jì)算得的化合物的預(yù)定量，與藥物學(xué)上可接受的載體聯(lián)合產(chǎn)生所需的治療效果。特定的單位劑量形式直接依賴于并受(a)特定組合物的獨(dú)特性質(zhì)和(b)所獲得的特定治療效果的支配。
經(jīng)過(guò)證實(shí)，如果以藥物學(xué)上可接受的形式適當(dāng)?shù)厥┯帽景l(fā)明的GRF和優(yōu)選的GRF化合物，結(jié)果使哺乳動(dòng)物中生長(zhǎng)激素的產(chǎn)量增加。因此，通過(guò)使用本發(fā)明的化合物同樣可以將哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素應(yīng)用于醫(yī)療和農(nóng)業(yè)中。常需使用生長(zhǎng)激素治療的病癥的例子包括侏儒癥和骨質(zhì)疏松癥。通過(guò)使用本發(fā)明的化合物也可以獲得生長(zhǎng)激素的其他有利效果，如增加瘦肉產(chǎn)量，促進(jìn)傷口愈合以及抵抗衰老。
可在許多系統(tǒng)中分析本發(fā)明的多肽化合物。在戊巴比妥鈉-麻醉的老鼠上進(jìn)行體內(nèi)分析。Wehrenberg et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.109382(1982)。用老鼠垂體前葉細(xì)胞體外測(cè)量生長(zhǎng)激素的釋放(Heiman et al.，Endocrinol.116410(1985))。
下面的實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本文描述的發(fā)明但不是為了以此限制本發(fā)明。
實(shí)施例1固相制備bGRF(2-77)OH利用應(yīng)用生物系統(tǒng)430A肽合成儀(可從Applied Biosystems購(gòu)買，F(xiàn)oster City California)通過(guò)固相方法合成GRF肽并且由應(yīng)用生物系統(tǒng)提供合成循環(huán)。Boc氨基酸和其他試劑由應(yīng)用生物系統(tǒng)和其他商業(yè)部門提供。利用雙偶聯(lián)(double couple)方案將連續(xù)的Boc化學(xué)過(guò)程應(yīng)用于啟動(dòng)對(duì)-甲基-苯羥胺樹(shù)脂以生產(chǎn)C-末端酰胺。為了生產(chǎn)C末端酸，使用相應(yīng)的PAM樹(shù)脂。用預(yù)先合成的羥苯并三唑酯將天門冬酰胺，谷氨酰胺，精氨酸，〔α-(對(duì)-羥苯基)乙酸〕、〔β-(對(duì)-羥苯基)丙酸〕、對(duì)-羥基苯甲酸、對(duì)-羥基肉桂酸、對(duì)-羥苯氧基乙酸進(jìn)行配對(duì)。利用固相合成法，以及HOBT活化氨基酸制備所有N-末端附加物。
使用下列單側(cè)鏈保護(hù)精氨酸，甲苯磺?；扉T冬酰胺，環(huán)己基谷氨酰胺，環(huán)己基絲氨酸，芐基蘇氨酸，芐基酪氨酸，4-溴芐酯基用存在于三氯甲烷中的三氟醋酸(TFA)來(lái)解除Boc的保護(hù)。在完成合成后，將肽脫保護(hù)并用含有10%間-甲基苯酚的脫水氟化氫將其從樹(shù)脂上脫離。切除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并從樹(shù)脂上切下肽均是在0℃或低于0℃下完成的。優(yōu)選的是在-20℃下保持30分鐘，然后在0℃保持30分鐘。移去HF后，用乙醚洗滌肽/樹(shù)脂，并用冰醋酸提取肽而后冷凍干燥，在10%醋酸中的交聯(lián)葡聚糖凝膠G-10(Pharmacia)柱上，通過(guò)大小篩析柱色譜法純化。
實(shí)施例2 GRF肽的重組生產(chǎn)2.A.GRF(2-76)OH的重組表達(dá)2.A.1編碼Met1-PGRF(2-76)OH的質(zhì)粒PHS452的合成質(zhì)粒PHS452是一種重組DNA表達(dá)載體，當(dāng)宿主細(xì)胞在合適條件下培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生大量本發(fā)明優(yōu)選的PGRF(2-76)OH多肽化合物。
從北方區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室(NRRL)得到一種E.coli K12RV308/PHS190的冷凍保藏物，Peoria，IL61604，登記號(hào)NRRL B-18410(保藏日期1988.9.9)且直接用作下面方法中的“培養(yǎng)物”。質(zhì)粒PHS190的限制位點(diǎn)和功能圖可見(jiàn)附圖的圖1中。在含有5mg/ml四環(huán)素的10毫升TY肉湯(每升含10g胰化胨，5克氯化鈉和5克酵母提取物)中接種E.coli K12RV308/PHS190培養(yǎng)物并在30℃時(shí)通氣培養(yǎng)過(guò)夜(15-18小時(shí))。得到的培養(yǎng)物作為質(zhì)粒PHS190的來(lái)源。
在1升含有5mg/ml四環(huán)素的TY肉湯中接種E.coli K12RV308/PHS190培養(yǎng)物，并在32℃通氣培養(yǎng)過(guò)夜(15-18小時(shí))，然后將培養(yǎng)物以轉(zhuǎn)速為5200rpm用sorvall(Dupont.Co.，Instrument Products，Biomedical Division，Newtown，CT06470)GSA轉(zhuǎn)頭在4℃離心10分鐘，使細(xì)胞形成沉淀，棄去上清液，將細(xì)胞團(tuán)重新懸浮于28毫升含有25%糖和50nM EDTA(乙二胺四乙酸)的溶液中，將溶于0.25M Tris-HCl(三(羥甲基)銨基甲烷鹽酸)的1ml溶菌酶(20mg/ml)溶液，PH＝8.0以及約1.5ml的0.5M EDTA，PH＝8.0加入上述懸液與細(xì)胞懸浮液一起混合。然后將得到的混合物在冰上保存15分鐘，將3毫升溶解液(由3毫升10%Triton X-100(Rohm & Heas)，75毫升0.25M EDTA PH＝8.0和7毫升水混合制得)加入已用溶菌酶處理的細(xì)胞的混懸液中并緩慢混合，然后將所得溶液在冰上再保存15分鐘。
4℃溫度下，用Sorvall SS34轉(zhuǎn)頭，以17，000rpm轉(zhuǎn)速離心約45分鐘，將細(xì)胞碎片從溶液中移走。將Cscl約28.6克和5mg/ml溴化乙錠溶液約1毫升加到約30毫升的上清液中。用水將溶液體積調(diào)至40毫升，并將其轉(zhuǎn)移到超速離心管中，密封，并用Ti70轉(zhuǎn)頭(Beckman，7360N、Lincoln Avenue，Lincolnwood，IL60646)以49，500rpm的轉(zhuǎn)速離心約18小時(shí)，在紫外燈下可見(jiàn)，分離出的質(zhì)粒譜帶用CsCl飽和的異丙醇提取將溴化乙錠移走，并與三次更換的約20倍體積的緩沖液(10mM Tris-HCl，PH＝7.5和1mM EDTA)進(jìn)行滲析，收集滲析液，然后加入兩倍體積的乙醇和0.05倍體積的3M醋酸鈉溶液。將此乙醇混合液冷卻到-20℃并在-10℃溫度下用SS34轉(zhuǎn)頭以10，000rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘使質(zhì)粒DNA沉淀。所得團(tuán)塊再次混懸在約1毫升的TE緩沖液中，然后用等體積的苯酚與氯仿混合液(1∶1，V/V)提取。通過(guò)加入0.1倍體積的3M醋酸鈉和2倍體積的乙醇，然后在-20℃下保存約30分鐘并用SS34轉(zhuǎn)頭以15，000rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，回收水相中的DNA，所得DNA沉淀先用70%乙醇，然后用100%乙醇進(jìn)行洗滌并干燥。
由上述獲得的約1.0毫克質(zhì)粒PHS190DNA懸浮于1.5毫升的0.1×TE緩沖液中并在-20℃下貯藏。在一個(gè)含有DNA的EcoRI緩沖液(100mM Tris-HCl，PH＝7.5 5mM MgCl，50mM NaCl)的反應(yīng)中用EcoRI(約10單位)限制性酶消化，約10毫克質(zhì)粒PHS190 DNA該反應(yīng)在37℃下保持2小時(shí)。
為了將5′突出末端轉(zhuǎn)變?yōu)槠烬R末端，將0.5mM的各種dNTP(dATP，dCTP，dGTP，和dTTP)與1-5單位的Klenow片段(Boehringer Mannheim Biochemicals，7941 Castleway Dr.，P.O.Box 50816，Indianapolis，IN 46250)一起加入。此反應(yīng)在30℃下保持15分鐘，然后在75℃處理10分鐘而使酶失活。用苯酚，苯酚/氯仿，氯仿提取反應(yīng)混合物然后用乙醇沉淀。
將質(zhì)粒再次混懸于50毫升含有40mM Tris-HCl，PH＝7.5，10mM MgCl，10mM二硫蘇糖醇(DTT)，0.5mM三磷酸腺苷和1單位T4DNA連接酶(Boehringer-Mannheim Biochemicals，7941 Castleway Drive，Indianapolis，IN46250)的溶液中，此反應(yīng)在14℃保存過(guò)夜。
通過(guò)下列過(guò)程(見(jiàn)Maniatis et al.，Molecular Cloning，pg，250-251(Cold Spring Harbor Press，1982))將此連結(jié)混合物轉(zhuǎn)化E.coli K12RV 308(從NRRL購(gòu)得NRRL15624)。在500毫升燒瓶中，在100毫升TY肉湯培養(yǎng)基中接種1毫升的RV308過(guò)夜培養(yǎng)物。將該細(xì)胞在37℃激烈振蕩培養(yǎng)至密度為約5×10個(gè)細(xì)胞/ml。將培養(yǎng)物在冰上放置10分鐘，然后在4℃、4000×g下離心5分鐘。將細(xì)胞混懸在50毫升冰冷的含有50mM CaCl2的10mM Tris-HCl，PH＝8.0的緩沖液中。將細(xì)胞再次放置在冰上15分鐘并再次離心，然后將細(xì)胞混懸于3.3毫升氯化鈣溶液中。將連結(jié)混合物加到200毫升細(xì)胞液中并在冰上保存30分鐘。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到42℃的水浴中放置2分鐘，在試管中加入1毫升TY肉湯并將細(xì)胞在30℃培養(yǎng)1小時(shí)，然后將200ul等分試樣培養(yǎng)在含有5mg/ml四環(huán)素的TY瓊脂(TY肉湯+1.5%瓊脂)平板上并在30℃生長(zhǎng)過(guò)夜。
將質(zhì)粒再次混懸于10毫升的水中，用Xba I和Bam HI消化質(zhì)粒而產(chǎn)生載體。將約1毫升Xba I(約10個(gè)單位)加到10毫升質(zhì)粒DNA(約10mg)和5毫升10X Xba I的緩沖液中(500mM Tris-HCl，PH＝8.0，100mM MgCl，和500mM NaCl)。在37℃下培養(yǎng)90分鐘后，加入5M NaCl 0.5ml和BamHI 1ml(10單位)并在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)90分鐘。將反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并通過(guò)電解洗脫后再用乙醇沉淀，分離出約5.75Kb XbaI-Bam HI載體片段。
采用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員共知的應(yīng)用生物系統(tǒng)模型380B合成儀合成下列DNA序列，將該序列分割成低聚核苷酸而完成合成基團(tuán)的構(gòu)建過(guò)程，隨后基本上按照Brown等(酶學(xué)方法68109(1979))的方法連結(jié)這些低聚核苷酸。下列DNA序列編譯一個(gè)本發(fā)明優(yōu)選的多肽，其中A9＝Asn，A12＝Arg，A15＝Thr，A21＝Arg，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Leu，A28＝Ser，A38＝Gln，A39＝Gly，A40＝Ala，A42＝Val，and Z＝Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly，所說(shuō)序列的正鏈包括ATG GCT GAT GCT ATT TTT ACT AAT AAT TAT CGA CGC GTTCTT ACT CAG CTG TCT GCT CGT CGT CTG CTG CAG GAT ATTCTG TCT CGT CAG CAG GGT GAA CGT AAC CAG GAA CAA GGAGCT CGT GTT CGT CTT GGT CGT CAG GTT GAT TCT CTG TGG
GCT GAT CAA CGT CAG CTT GCT CTC GAG TCT ATC CTG GCTACT CTG CTG CAG GAA CAT CGT AAT TCT CAG GGT TAA TAG將含有編碼序列的DNA隨后與上述構(gòu)建的Xba I-Bam HI載體片段混合并連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化上述的E.coli K12 RV308，由限制性內(nèi)切酶消化，分析具四環(huán)素抗性的轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA以證實(shí)該質(zhì)粒是PHS452。
2.A.2 編碼Met1-bGRF(2-76)OH的質(zhì)粒PHS500的合成來(lái)源于牛的重組GRF肽可基本上按照上述2.A.1例的方法進(jìn)行生產(chǎn)，但是在生產(chǎn)重組牛GRF肽時(shí)，該DNA序列編碼本發(fā)明的優(yōu)選肽，其中A9＝Ser，A12＝Arg，A15＝Thr，A21＝Arg，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Leu，A28＝Asn，A38＝Gln，A39＝Gly，A40＝Ala，A42＝Val，and Z＝Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly，該DNA序列所對(duì)的鏈?zhǔn)茿TG GCT GAT GCT ATT TTT ACT AAT TCT TAT CGT CGT GTCCTT ACT CAG CTG TCT GCG CGC CGT CTG CTG CAG GAT ATCCTG AAT CGT CAG CAA GGT GAA CGT AAT CAG GAA CAA GGTGCT CGT GTA CGT CTG GGT CGC CAA GTT GAT GGT GTT TGG
ACT GAT CAA CAG CAG CTT GCT CTC GAG TCT ATA CTA GTTTCT CTG CTG CAG GAA CGT CGG AAT TCT CAA GGT TAA TAG將含有該編碼序列的DNA與在例2.A.1中所描述的Xba I-Bam HI載體片段相混合并連結(jié)。用連結(jié)混合物轉(zhuǎn)化上述所描述的E.coli K12RV308。將編碼bGRF序列的質(zhì)粒命名為PHS500。通過(guò)限制性酶消化對(duì)具四環(huán)素抗性的轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析以證實(shí)該質(zhì)粒是PHS500。
2.A.3編碼Met1-hGRF(2-46)OH的DNA的合成來(lái)源于人的重組GRF肽基本上采用實(shí)施例2.A.1所述方法制備。但是，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，制備人的重組GRF肽時(shí)，采用經(jīng)修飾的hGRF肽，其中A9為Ser，A12為L(zhǎng)ys，A15為Gly，A21為L(zhǎng)ys，A22為L(zhǎng)eu，A25為Asp，A27為Met，和A28為Ser，y含有下列氨基酸序列Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-LeuZ為0，編碼這種肽的DNA正鏈序列包含以下序列ATG GCT GAC GCT ATC TTC ACT AAC TCT TAC CGT AAAGTT CTG GGT CAG CTG TCT GCT CGT AAA CTG CTG CAGGAC ATC ATG TCT CGT GAG CAG GGT GAA TCT AAC CAGGAA CGT GGT GCT CGT GCT CGT CTG TAA含有這種編碼序列的DNA，采用實(shí)施例2.A.1所述的方法與Xba I-Bam HI載體片段混合并連接，連接混合物再采用前面所述的方法轉(zhuǎn)化到E.coli K12RV308中。
實(shí)施例2.B.重組GRF肽的分離2.B.1 GRF類似物在E.coli中的表達(dá)將E.coli K12RV308/PHS451在溫度為32℃，含有5mg/ml四環(huán)素的TY肉湯中培養(yǎng)至細(xì)胞的半對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后將混合物的溫度升至42℃，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)以上。將定位于由PHS451質(zhì)粒表達(dá)的GRF類似物上的λPL啟動(dòng)子的cI857溫度敏感性阻遏物在42℃滅活，以允許GRF類似物的表達(dá)。bGRF肽的表達(dá)基本上按照上面所描述的表達(dá)PGRF的方法進(jìn)行，所不同的是用PHS500質(zhì)粒以代替PHS452質(zhì)粒。
2.B.2 含有GRF類似物的顆粒的分離如果利用本文中例舉的高水平E.coli表達(dá)系統(tǒng)，旦白質(zhì)產(chǎn)物存在于內(nèi)含體或顆粒體中而與其他物質(zhì)隔開(kāi)。分離出含有該GRF類似物的顆粒，溶解以分離所需的GRF肽。首先，將所有細(xì)胞離心，然后重新懸浮于10℃水中。將細(xì)胞漿在Gaulin勻化器中以8000psig進(jìn)行勻漿化處理。得到的勻漿用水稀釋，攪拌10分鐘，隨后用10%氫氧化鈉調(diào)PH至8.4-8.6。然后離心混和物。所得固體物為含有GRF類似物的顆粒，將其冷藏于-70℃下備用。
2.B.3 GRF類似物的最后純化將上述實(shí)施例2.B.2制備的顆粒在溫度為2-5℃的條件下解凍，加入10倍體積的0.05N乙酸-7M脲溶液溶解，然后勻漿5-8分鐘。加10%HCl將PH值調(diào)至2.5-2.6。將混合物在2-5℃攪拌12-15小時(shí)，溶液用覆蓋DicaliteSpeedex過(guò)濾助劑(Grefco，Torrance，CA)的Sparker過(guò)濾器凈化。用乙酸-脲溶液稀釋使細(xì)胞溶液的導(dǎo)電率，降至4000mohms以下。
采用S Sepharose (Pharmacia，800 Centennial Ave，Piscataway，NJ08854)樹(shù)脂制備陽(yáng)離子交換柱。該柱子含有1升樹(shù)脂/50克樣品。將樣品以0.1升/cm/小時(shí)的流速加到柱上并用2倍柱體積的溶于乙酸-脲溶液中的0.1M NaCl洗滌。用含有0.25-1.6M線性梯度濃度的NaCl的乙酸-脲溶液洗脫GRF類似物，每次用3個(gè)柱體積的洗脫液可收集0.1倍柱體積的分餾物。含GRF類似物的餾份可利用其導(dǎo)電率，O.D.276，高壓液相色譜(HPLC)和聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定。然后將得到的餾分集中。
在收集到的餾分中加入等體積的乙酸-脲溶液。然后將樣品上樣至已用乙酸-脲進(jìn)行排序的含S Sepharose 樹(shù)脂的柱子上，每升樹(shù)脂裝載50克旦白質(zhì)。流速是0.02升/cm2/小時(shí)。用含有0.25M至1.2M NaCl線性梯度的乙酸-脲洗脫GRF類似物餾分。收集0.1倍柱體積的餾分。按照以前的方法分析餾分，并且收集含有GRF類似物的餾分。
用PH為2.5的0.02M甘氨酸制備柱體積為前面收集的餾分的體積的5倍的葡聚糖G-15柱。分離出含有O.D.276峰的餾份。
然后用10%乙腈-0.02M甘氨酸，PH＝2.5制備含有SP20SS樹(shù)脂(Sephabeads ，Mitsnbishi Chemical，Tokyo)的柱子。用乙腈將含收集的GRF類似物的溶液濃度調(diào)至10%然后將其以1.5-2柱體積/每小時(shí)的流速加到柱上。用2倍體積的乙腈-甘氨酸緩沖液洗滌柱子。用由3倍柱體積的10%乙腈-0.02M甘氨酸與三倍柱體積的50%乙腈-0.02M甘氨酸混合而形成的梯度洗脫GRF類似物。收集0.1倍柱體積的餾分，用于分析GRF類似物。
然后將含有GRF類似物的樣品在用0.25M乙酸平衡過(guò)的Sephadex G15柱上進(jìn)行色譜分析。然后分離出O.D.276峰，冷凍干燥備用。
實(shí)施例3 馬尿酰-1-PGRF(2-76)OH的制備將3.58克苯甲酰甘氨酸(購(gòu)自Transworld Chemicals)振蕩溶解于約20ml DMF中并在一個(gè)冰浴中冷卻。將2.5克N-羥基琥珀酰亞胺加入該溶液中，然后再加入4.5克二環(huán)己羰酰亞胺(DCC)。反應(yīng)在室溫下攪拌過(guò)夜。
通過(guò)過(guò)濾移走反應(yīng)所生成的不溶性二環(huán)己脲(DCU)，真空濃縮DMF濾液。用CH2Cl2稀釋殘留物。形成的沉淀通過(guò)過(guò)濾，真空干燥后得到3.79克的琥珀酰亞胺基馬尿酸酯。
將基本上按照上述實(shí)施例2.A.制備的約72mg的PGRF(2-76)OH在室溫下通過(guò)攪拌溶解于3ml 0.1M Tris-HCl，PH7.8，30%丙醇溶液中。在該反應(yīng)中加入57mg琥珀酰亞胺基n-苯甲酰甘氨酸酯，在室溫下攪拌反應(yīng)，在加入琥珀酰亞氨基n-苯甲酰甘氨酸酯后，在15分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)時(shí)分別取出5μl樣品以跟蹤反應(yīng)進(jìn)展。用0.1%TFA(0.15-0.2mg/ml)將每一個(gè)樣品稀釋至500μl然后注射到0.46×15cm Vydac C18柱上以進(jìn)行RP-HPLC分析并與起始樣品進(jìn)行比較。
在2.5小時(shí)后，用約1ml冰醋酸酸化反應(yīng)混合物，將其上樣到2.2×28.5cm Sephadex G-10柱上。用10%醋酸洗脫柱子并收集7.5ml餾分。測(cè)定每一餾分的ABS280以表明肽的存在。將表明有肽存在的7-10餾分合在一起，冷凍，并且冷凍干燥得到70mg的凍干粉。
將約9mg的樣品溶于1.0ml的0.1%TFA中。將該溶液分成十個(gè)0.1ml的等分試樣，將這些樣品冷凍并且凍干。將一份樣品用作快原子轟去質(zhì)譜分析(FAB-MS)。將第二份樣品進(jìn)行氨基酸序列分析。
實(shí)施例4 對(duì)甲基馬尿酰PGRF(2-76)OH的制備A部分對(duì)-甲基苯甲酰甘氨酸的合成在0.5℃，采用機(jī)械攪拌將約7.5克甘氨酸溶于含有105ml的2N NaOH和50ml的二噁烷的溶液中。用二噁烷將大約14.9ml的對(duì)-甲苯酰氯稀釋至50ml體積并在15-20分鐘期間將其滴加到反應(yīng)中。25℃(即室溫)將反應(yīng)混和物攪拌過(guò)夜。
用NaOH水溶液使反應(yīng)物呈堿性，用二乙基醚萃取。用6N HCl將水相酸化至PH3.0。用乙酸乙酯萃取水相，用水沖洗乙酸乙酯并用MgSO4干燥，過(guò)濾，將濾液真空干燥至近干燥。將固體懸浮于乙醚中，過(guò)濾，真空干燥以產(chǎn)生14.25克后來(lái)證明是對(duì)-甲基馬尿酸。通過(guò)熔點(diǎn)和其元素燃燒分析，將其與對(duì)-甲基馬尿酸的，理論值進(jìn)行比較而證實(shí)鑒別到的產(chǎn)物。上述得到的化合物的熔點(diǎn)是151-154℃。下表1中顯示了元素燃燒分析資料。
B部分 對(duì)甲基馬尿酰PGRF(2-76)OH的合成將基本上按照實(shí)施例4A部分描述的方法制備的約1.65克對(duì)-甲基馬尿酸邊振蕩溶解于15ml二甲基甲胺(DMF)中并在冰浴中冷卻。將約1克N-羥基琥珀酰亞胺加入該溶液中，然后加入1.9克DCC。在室溫(25℃)下振蕩反應(yīng)過(guò)夜。
通過(guò)過(guò)濾分離出DCU沉淀物，真空濃縮濾液。用乙醚稀釋殘留的油，析出晶體。通過(guò)過(guò)濾分離出固體，用乙醚沖洗，真空干燥，產(chǎn)生具熔點(diǎn)為167-170℃的3.28克產(chǎn)物。將樣品進(jìn)行元素燃燒分析，其結(jié)果與對(duì)-甲基馬尿酸的琥珀酰二亞胺酯(C14H14N2O5)的預(yù)期的理論值進(jìn)行比較。
將基本上按照實(shí)施例2.A制備的大約72mg的PGRF(2-76)OH在室溫下通過(guò)振蕩溶于3ml的0.1M Tris-HCl，PH7.8，30%丙醇中。將57mg對(duì)-甲基馬尿酸的琥珀酰二亞胺酯加入反應(yīng)中，并在室溫下振蕩反應(yīng)，在加入琥珀酰亞胺基N-(對(duì)-甲基)馬尿酸后15分鐘，1小時(shí)和2小時(shí)各取5μl樣品以便跟蹤反應(yīng)進(jìn)展。用0.1%TFA將每一個(gè)樣品稀釋到500ml并且注射到0.46×15cm Vydac C18柱上以進(jìn)行RP-HPLC分析，并與起始材料進(jìn)行比較。
在2.5小時(shí)后，用約1ml冰醋酸將反應(yīng)混合物酸化，并且上樣到2.2×28.5cm.Sephadex G-10柱。用10%醋酸洗脫柱子并收集7.5ml餾分。測(cè)定每一個(gè)餾分的ABS280以表明存在多肽化合物。將表明有多肽存在的7-10餾分合在一起，冰凍，并冷凍干燥至70mg的冷凍干燥物。
實(shí)施例5 對(duì)氯馬尿酰bGRF(2-77)OH的制備基本上采用上述實(shí)施例4所述方法制備對(duì)-氯馬尿酰GRF衍生物，所不同的是在A部分中用對(duì)-氯苯甲酰氯代替對(duì)甲苯酰氯并且基本上按照實(shí)施例1(固相)的方法制備bGRF(2-77)OH GRF肽。
實(shí)施例6 對(duì)-硝基馬尿酰bGRF(2-77)OH的制備基本上按照上述實(shí)施例4所述方法制備對(duì)-硝基馬尿酰GRF衍生物，所不同的是在A部分中用對(duì)-硝基苯甲酰氯代替對(duì)甲苯酰氯，并且基本上按照實(shí)施例1(固相)的方法制備bGRF(2-77)OH GRF肽。
實(shí)施例7 對(duì)羥基馬尿酰bGRF(2-77)OH的制備采用基本上按照上述實(shí)施例4的方法制備對(duì)羥基馬尿酰GRF衍生物，所不同的是在A部分中用對(duì)-羥基苯甲酰氯代替對(duì)苯甲酰氯，bGRF(2-77)OH GRF衍生物采用基本上按照實(shí)施例1(固相)的方法制備。
實(shí)施例8 對(duì)氟馬尿酰bGRF(2-77)OH的制備基本上采用上述實(shí)施例4所述方法制備對(duì)-氟馬尿酰GRF衍生物，所不同的是在A部分中用對(duì)-氟苯甲酰氯代替對(duì)苯甲酰氯，并且基本上采用實(shí)施例1(固相)所述方法制備bGRF(2-77)OH GRF肽。
實(shí)施例9 N-苯基丙二酰胺基-1-bGRF(2-77)OH的制備在25℃，機(jī)械攪拌條件下將約9.1ml(0.1摩爾)苯胺溶解于100ml的CH2Cl2中。在該溶液中加入15.1克K2CO3，然后滴加入含有14ml乙基丙二酰氯的20ml CH2Cl2。將反應(yīng)在25℃振蕩3-4小時(shí)，讓反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行約72小時(shí)。
用約500ml的H2O/CH2Cl2稀釋該反應(yīng)。振蕩該混合物并將CH2Cl2相分離開(kāi)，先用HCl水溶液洗滌，然后用水洗，用MgSO4干燥，過(guò)濾，蒸發(fā)濾液得14.5克油。
將上面制備的約14克乙基N-苯基丙二酰胺溶于25ml二噁烷和75ml的1N NaOH中。反應(yīng)在25℃振蕩約3小時(shí)。
在仍是堿性時(shí)用乙醚萃取反應(yīng)物。用6N HCl酸化水相，再用乙酸乙酯提取并用MgSO4干燥。將乙酸乙酯濾液蒸發(fā)至固體。將此固體在乙醚中研磨，過(guò)濾并真空干燥得到5.1克產(chǎn)物。利用元素燃燒分析法和1H-NMR分析該產(chǎn)物。所得結(jié)果顯示產(chǎn)物是N-苯基丙二酰胺酸或N-苯基丙二酸一胺。
將N-苯基丙二酰胺酸通過(guò)HOBT酯與bGRF(2-77)樹(shù)脂交聯(lián)。
實(shí)施例10 N-苯基丙二酰胺基-1-PGRF(2-77)OH的制備將基本上按照上述實(shí)施例的方法制備的3.58克N-苯基丙二酰胺酸通過(guò)攪拌溶于約20ml的DMF中，在冰浴中冷卻。將2.5克N-羥基琥珀酰亞胺加入該溶液中，隨后加入4.5克二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。在室溫下攪拌反應(yīng)過(guò)夜。
過(guò)濾除去DCU，真空濃縮DMF濾液。用乙醚稀釋殘留物。過(guò)濾所形成的沉淀，將其真空干燥，得到3.79克N-苯基丙二酰胺酸的琥珀酰亞胺酯。
在室溫下通過(guò)攪拌將基本上按照上述實(shí)施例2.A的方法制備的約72克PGRF(2-76)OH溶于3ml的0.1M Tris-HCl，PH7.8，30%丙醇溶液中。在該反應(yīng)中加入57mg上面制備的N-苯丙二酰胺酸琥珀酰亞胺酯，在室溫下攪拌反應(yīng)，在加入N-苯丙二酰胺酸的琥珀酰亞胺酯后在15分鐘，1小時(shí)和2小時(shí)時(shí)各取5μl樣品以跟蹤反應(yīng)進(jìn)展。用0.1%TFA(0.15-0.2mg/ml)將每個(gè)樣品稀釋到500μl，將其注射到0.46×15cm Vydac C18柱上進(jìn)行RP-HPLC分析，并與起始樣品進(jìn)行比較。
在2.5小時(shí)后，反應(yīng)物用約1ml冰醋酸酸化，將其上樣到2.2×28.5cm Sephadex G-10柱上。該柱用10%醋酸洗脫，收集7.5ml餾分。測(cè)定每一餾分的ABS280，顯示有多肽化合物存在。將顯示有多肽存在的7-10餾分合在一起，冷凍，并冷凍干燥，得到70mg凍干物。
實(shí)施例11 對(duì)-甲基馬尿酰PGRF(2-76)OH的配制用無(wú)熱原的水溶解1.38克Na2HPO4和1.0克PSA，定容至1升，PH約為5.1，制成載體溶液。將基本上按照實(shí)施例4.B.的方法制備的27.4mg的對(duì)-甲基馬尿酰PGRF(2-76)OH加入該載體溶液，終濃度為360毫當(dāng)量/毫升。
實(shí)施例12.通過(guò)每日三次皮下或靜脈注射公豬觀察對(duì)甲基馬尿酰PGRF(2-76)OH的體內(nèi)作用將20頭已用手術(shù)在股靜脈中插入了埋藏導(dǎo)管的平均體重約72Kg的雜交公豬，用于測(cè)定對(duì)-甲基馬尿酰PGRF(2-76)OH的作用。按照上述實(shí)施例11的方法制備對(duì)-甲基馬尿酰PGRF(2-76)OH制劑，將該制劑以10.0μg/Kg/inj.的劑量每天靜脈(I.V.)或皮下(S.Q.)注射三次。每天給公豬喂食2000克含18.5%粗蛋白的玉米-黃豆飼料，均分成兩次在上午800和下午400喂食。在上午800，下午400和下午1200給公豬注射。在15天的控制期，43天處理期，以及停止處理后23天期間收集公豬的尿氮排泄量數(shù)據(jù)。在處理的第12天，24小時(shí)期間內(nèi)采集30個(gè)血清樣品。測(cè)定血清樣品中的生長(zhǎng)激素(GH)，血脲氮(BUN)，葡萄糖，胰島素，游離脂肪酸(FFA)，和三甘油酯的含量。測(cè)定結(jié)果顯示于下面表4中。
處理＝對(duì)-甲基馬尿酰PGRF(2-76)OH，通過(guò)相應(yīng)的給藥途徑每日注射三次。
對(duì)照＝通過(guò)相應(yīng)的給藥途徑用載體溶液(磷酸緩沖液)每日給對(duì)照豬注射3次。
(a，b)＝同一柱子的平均值具相同字母時(shí)不具差異P＜0.05，Student-Newman-Keuls。
GH＝生長(zhǎng)激素含量上述資料表明，如果以30.0μg/Kg/天的劑量每天注射3次，表現(xiàn)出公豬的尿氮排泄減少(41%)以及血清中血脲氮含量減少(54%)的現(xiàn)象表明對(duì)-甲基馬尿酰PGRF(2-76)OH參與代謝。注射對(duì)-甲基馬尿酰PGRF(2-76)OH使血清中GH含量增加4倍(見(jiàn)圖4)，同時(shí)血清中葡萄糖，胰島素，游離脂肪酸和三甘油酯的含量也提高。除了皮下注射豬比靜脈注射豬血清中胰島素含量提高外，不同的給藥方法沒(méi)有在血清中產(chǎn)生不同的應(yīng)答。并且皮下注射公豬停止后，對(duì)尿中脲氮排泄(見(jiàn)圖5)要延長(zhǎng)2-3天。
權(quán)利要求
1.制備GRF類似物的方法，該方法包括a)利用化學(xué)或重組DNA技術(shù)制備des-Tyr1-GRF肽以及b)用化學(xué)方法修飾其氨基末端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)方法，其特征在于制備下式化合物X1-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-A9-Tyr-Arg-A12-Val-Leu-Al5-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A21-A22-Leu-Gln-A25-Ile-A27-A28-Arg-Y-Z-T其中A9 = Ser, Ala, Leu, Thr or Asn,A12 = Arg or Lys,A15 = Gly, Ala, Thr or Leu,A21 = Arg or Lys,A22 = Ala or Leu,A25 = Asp or Glu,A27 = Met, Ser, Arg, Leu, or Norleucine,A28 = Ser or Asn,Y為0，或含1-15個(gè)氨基酸的肽，Z為0或含1-32個(gè)氨基酸的肽，T為由式-COORa，-CRaO，-CONHNHRa，-CON(Ra)(R)或CH2ORa表示的羰基末端基團(tuán)，其中Ra和Rb為相互獨(dú)立的低級(jí)烷基，氫，Hse(內(nèi)酯)，HseOH或HseN(Rc)(Rd)，其中Rc和Rd各自分別是氫和低級(jí)烷基，X1為由下式代表的?；鶊F(tuán)
其中R1＝氫，甲基，乙基，羥乙基，苯基，或由鹵素，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基，硝基或氨基取代的苯基，酰胺基，三氟甲基，-CH2-OH，或硫酰胺，或?yàn)楹?個(gè)或多個(gè)N，O或S的5員或6員雜環(huán)，a為0，1，2或3，b為0或1，c為0或1，d為0-12，A為0，O或S，B為羰基，磺?；騺喕酋?R2為H，CH3，CH2OH，對(duì)-羥基芐基或
e＝0-5，R3為甲基，乙基，羥乙基，氨基，羥基，苯基，或用鹵素，烷基，烷氧基，羥基，硝基，氨基取代的苯基，酰胺基，或硫酰胺，或含1個(gè)或多個(gè)N，O或S的5或6員雜環(huán)，及其藥物學(xué)上可接受的非一毒性鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的方法，其中a＝0，b＝1，B是羰基，C＝0，d＝0和A＝0。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所說(shuō)的方法，其中R1為選自甲基，苯基，對(duì)-硝基苯基，對(duì)-氯苯基，對(duì)氯苯基，對(duì)-羥基苯基，對(duì)-甲基苯基，N-芐基(異煙酰基)的基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中R2是選自H，CH3或CH2OH的基團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中R2包括H。
7.根據(jù)權(quán)利要求2至6的任一種方法，其中A9＝Asn，A12＝Arg，A15＝Thr，A21＝Arg，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Leu和A28＝Ser。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所說(shuō)的方法，其中Y包括下列氨基酸的肽Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu，或其功能衍生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所說(shuō)的方法，其中Z含有下列氨基酸序列Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-lle-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly，或其功能衍生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所說(shuō)的方法，其中A9＝Ser，A12＝Arg，A15＝Thr，A21＝Arg，A22＝Leu，A25＝Asp以及A28＝Asn。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所說(shuō)的方法，其中Y包含下列氨基酸序列Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-Arg-Leu，及其功能衍生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所說(shuō)的方法，其中Z包含下列氨基酸序列Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Gly-Val-Trp-Thr-Asp-Gln-Gln-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Thr-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Glu-Arg-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly.
13.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所說(shuō)的方法其中A9＝Ser，A12＝Lys，A15＝Gly，A21＝Lys，A22＝Leu，A25＝Asp，A27＝Met，和A28＝Ser。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所說(shuō)的方法，其中Y含有下列氨基酸序列Glu-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其功能衍生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所說(shuō)的方法，其中Z是O。
16.一種制備藥用制劑的方法，該方法包括將一種GRF類似物與一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑混合。
全文摘要
本發(fā)明提供了與天然的GRF或以前描述的GRF類似物相比具有更好的活性和效力的氨基半端修飾過(guò)的生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)類似物。本發(fā)明也提供了含有結(jié)合了選自天然形式的GRF肽的氨基酸修飾物的GRF肽的氨基末端經(jīng)修飾的GRF類似物。描述了牛、豬、人和其它種的GRF的優(yōu)選類似物。本發(fā)明也提供了利用本發(fā)明的化合物促進(jìn)生長(zhǎng)激素釋放的方法。本發(fā)明也提供了本發(fā)明化合物的藥用制劑。本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明化合物制治療因生長(zhǎng)激素含量不足引起的各種疫病的方法。本發(fā)明還提供了施用本發(fā)明化合物增加哺乳動(dòng)物瘦肉質(zhì)量的方法。
文檔編號(hào)A61P15/00GK1068123SQ9210421
公開(kāi)日1993年1月20日 申請(qǐng)日期1992年4月24日 優(yōu)先權(quán)日1991年4月26日
發(fā)明者R·D·迪馬奇, M·L·海曼, J·E·希爾茲, D·L·施邁利, D·I·威基澤 申請(qǐng)人:伊萊利利公司