用于體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及造血細(xì)胞，并且更具體地涉及用于長(zhǎng)期體外培養(yǎng)及體外擴(kuò)增造血細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了有用于培養(yǎng)細(xì)胞的組合物，例如用于培養(yǎng)造血細(xì)胞特別是造血干細(xì)胞(HSC)和造血祖細(xì)胞(HPC)的培養(yǎng)基。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括生長(zhǎng)因子組合的組合物以及利用改變的生長(zhǎng)和環(huán)境條件的方法，所述組合物和方法適用于體外培養(yǎng)及體外擴(kuò)增HSC和/或HPC。
【專利說(shuō)明】用于體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及造血細(xì)胞，并且更具體地涉及用于長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和體外擴(kuò)增造血細(xì)胞 的方法。本發(fā)明還提供了有用于培養(yǎng)細(xì)胞的組合物，例如用于培養(yǎng)造血細(xì)胞的培養(yǎng)基，特別 是造血干細(xì)胞（HSC)和造血祖細(xì)胞（HPC)。

【背景技術(shù)】
[0002] 循環(huán)的血細(xì)胞（例如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和淋巴細(xì)胞）是源自于造血祖細(xì)胞 (HPC)和造血干細(xì)胞（HSC)的可識(shí)別的前體細(xì)胞的終末分化的產(chǎn)物。
[0003] 血液病和免疫疾病及癌癥的治療中，造血細(xì)胞的移植能力在解決許多疾病的發(fā)病 機(jī)制中提供了巨大的益處和進(jìn)步。用于骨髓移植的HPC的擴(kuò)增是人類長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)物在用 于疾病治療中的潛在應(yīng)用的一個(gè)此類實(shí)例。
[0004] 目前利用人類自體和異體骨髓移植作為疾?。ㄈ绨籽　⒘馨土鲆约捌渌＜吧?命的疾?。┑寞煼ā５菍?duì)于這些程序，必須移取大量的供體骨髓以確保有足夠的細(xì)胞用 于治療程序的移植。通過(guò)擴(kuò)增來(lái)增加造血細(xì)胞（例如HSC和HPC)的數(shù)量的能力可以減少 對(duì)大量骨髓捐贈(zèng)的需要，并且可以使得有可能獲得小量骨髓捐贈(zèng)后再在注射給接受者之前 在體外擴(kuò)大祖細(xì)胞的數(shù)量的能力。
[0005] 已被證明，人類骨髓培養(yǎng)物呈現(xiàn)有限的造血潛能，其生產(chǎn)的造血祖細(xì)胞和成熟的 血細(xì)胞的數(shù)目不斷減少，并且在六至八周細(xì)胞生產(chǎn)停止。這在很大程度上歸因于HPC對(duì)各 種環(huán)境影響的依賴性，例如體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的必需生長(zhǎng)因子（造血生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子）。除了這 些因子之外，與細(xì)胞表面分子和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用對(duì)于造血祖細(xì)胞的存活和增殖可能 是重要的。但是，盡管為使用外源性生長(zhǎng)因子以推進(jìn)體外擴(kuò)增做出了許多努力，僅僅成功地 實(shí)現(xiàn)了多能細(xì)胞的數(shù)量的有限增加。
[0006] 臍帶血提供了可以操縱和利用以有效的移植治療兒童疾病的HSC和HPC的源。這 些細(xì)胞已經(jīng)顯示出了許多優(yōu)于后來(lái)在生活中采集的祖細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，包括移植物抗宿主病 (GvHD)的發(fā)病率較低以及供體和受體之間的免疫不相容的更大的寬容度。
[0007] 與骨髓和動(dòng)員的外周血相比，使用臍帶血作為HSC源還提供了相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)，由 于這些細(xì)胞的相對(duì)免疫學(xué)和復(fù)制型不成熟，由此導(dǎo)致更低的GvHD發(fā)病率、更大的人類白細(xì) 胞抗原不匹配的容許度以及在移值后增加的增殖潛能。但是存在缺陷，因?yàn)槭褂媚殠аM(jìn) 行移植部分地受限于每單位獲得的細(xì)胞數(shù)量低以及中性粒細(xì)胞和血小板的延遲重建。另 夕卜，各個(gè)臍帶血樣本中低數(shù)量的HSC和HPC通常限制了臍帶血移植在完全長(zhǎng)大成年的接受 者中的唯一用處。
[0008] 目前存在兩種主要選擇以增加可以用于移植的HSC和HPC的細(xì)胞劑量：多個(gè)臍帶 血輸血或者體外擴(kuò)增。在成人移值中已經(jīng)成功的使用了雙臍帶血，由此減少了舊病復(fù)發(fā)并 增加了改善生存的潛力。但是，利用了多種臍帶血雙移植要求更高的人類白細(xì)胞抗原（HLA) 匹配的嚴(yán)格性，并且其還與GvHD的發(fā)病率增加相關(guān)聯(lián)。另外由于多個(gè)臍帶血移植不影響細(xì) 胞組成，此選項(xiàng)提供減輕重建延遲的能力有限。由于這些因素，為產(chǎn)生充足的用于長(zhǎng)期植入 的HSC和/或HPC并且為了增加能夠產(chǎn)生短期重建的造血細(xì)胞和多能細(xì)胞的數(shù)量，對(duì)體外 擴(kuò)增的興趣有所增加。所擴(kuò)增的細(xì)胞可單獨(dú)移植、或與來(lái)自相同或不同的單位的未操縱細(xì) 胞一起移植，以增加長(zhǎng)期植入并同時(shí)盡量減少重建延遲。
[0009] 臨床試驗(yàn)表明體外擴(kuò)增是增加細(xì)胞劑量的安全且可行的方法，盡管其最初被看到 只產(chǎn)生溫和的擴(kuò)增且伴有高程度的細(xì)胞分化。最近，已經(jīng)證明顯著擴(kuò)增能夠復(fù)育的HSC和 HPC是可能的，但對(duì)于最佳擴(kuò)增條件并沒(méi)有明確的共識(shí)。因此，用于擴(kuò)增造血祖細(xì)胞的方法 可以提高臍帶血移植的有效性并且還可以使得造血細(xì)胞源（如臍帶血）成為用于在成人中 移植的HPC的可行來(lái)源。
[0010] 更加容易地?cái)U(kuò)增HSC和HPC的群體的能力還可以在形成化療的補(bǔ)充治療中提供益 處，或者在治療涉及造血細(xì)胞的改變的其它病狀中提供援助，并且還可以為人類長(zhǎng)期骨髓 培養(yǎng)物提供了進(jìn)一步的應(yīng)用。可以提供HSC和HPC擴(kuò)增的成功的方法可以極大地促進(jìn)生 產(chǎn)大量的特定譜系的進(jìn)一步分化的前體細(xì)胞，并且反過(guò)來(lái)提供大量具有各種應(yīng)用（包括輸 血）的分化的造血細(xì)胞。這將極大地改善治療特性并且提高治療（如化療）的效果。
[0011] 因此，需要提供用于改進(jìn)造血細(xì)胞（如HSC和HPC)的培養(yǎng)和維護(hù)的體系、增強(qiáng)的 條件、組合物和方法，從而增加可用于移植的細(xì)胞劑量并且在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)下有利地影響 造血細(xì)胞的成活力和多能性。還需要此類改進(jìn)以提供改進(jìn)的體外擴(kuò)增，從而導(dǎo)向產(chǎn)生出充 足的用于長(zhǎng)期植入的造血細(xì)胞，并由此增加能夠產(chǎn)生短期重建的HPC和其它多能細(xì)胞的數(shù) 量，并且在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)下有利地影響造血祖細(xì)胞的成活力和多能性。
[0012] 包括由本說(shuō)明書(shū)中的對(duì)文獻(xiàn)、行為、材料、裝置、物品等的論述只是為了為本發(fā)明 提供背景。這并非暗示或表示任何或所有這些事項(xiàng)構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或因?yàn)槠?存在于本申請(qǐng)的各個(gè)權(quán)利要求的 優(yōu)先權(quán)日:之前而為與本申請(qǐng)相關(guān)領(lǐng)域中的公知常識(shí)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] HSC操縱作為化療或放療的補(bǔ)充治療是有用的。例如，將HSC本地化為外周血中， 然后從將接受化療的受試者中分離出來(lái)并且在治療后將所述細(xì)胞返回。骨髓是體內(nèi)最豐富 的組織之一，并且因此經(jīng)常是由化療藥物和放射首先損傷的器官。其結(jié)果是，血細(xì)胞的生產(chǎn) 在化療或放射治療過(guò)程中迅速被破壞，并且在患者重新接受化療之前，必須終止化療或輻 射以使造血系統(tǒng)補(bǔ)充血細(xì)胞供應(yīng)。
[0014] 因此，通過(guò)使用HSC和/或HPC移植來(lái)治療血液病和癌癥，如多發(fā)性骨髓瘤和白血 病。HSC和HPC通常源自于自體骨髓或匹配的供體，然而，供體和接受者之間的相容性往往 是限制。通常很難找出合適且相容的供體，在白種人患者中找到匹配的供體的成功機(jī)率只 有50%。另外，在少數(shù)名族（ethnic group)中找到適合的供體的概率顯著降低。因此，目 前需要提供HSC和/或HPC的替代來(lái)源以協(xié)助那些目前需要治療。
[0015] 本發(fā)明提供了用于延長(zhǎng)造血細(xì)胞的體外成活力的方法和組合物，從而增加它們的 數(shù)量并同時(shí)維持自我更新和多能性的屬性。經(jīng)確定，通過(guò)在fic 〇lin-l、fiC〇lin-2、fic〇lin-3 或它們的片段或功能性等價(jià)物中的任何一種的存在下培養(yǎng)HPC和/或HSC的群體，可以延 長(zhǎng)HPC和/或HSC群體的體外成活力或者HPC和/或HSC群體的培養(yǎng)或擴(kuò)增。
[0016] 本文所描述的是用于在體外富化和擴(kuò)增HSC和HPC的方法和組合物，其通過(guò)在在 特定的組合物的存在下并且在特定的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)細(xì)胞。在完成基于細(xì)胞培養(yǎng)的HSC和 HPC的擴(kuò)增后，可以將所述細(xì)胞分離以供進(jìn)一步使用（例如在移植中），由此通過(guò)增加所移 植的HSC和HPC的數(shù)量來(lái)減少潛在的炎癥反應(yīng)。
[0017] 認(rèn)為本發(fā)明還可以提供新穎的組合物，其利用了如前所述的新穎的生長(zhǎng)因子組 合的效應(yīng)以及與各種培養(yǎng)條件的組合，所述培養(yǎng)條件如可獲自許多來(lái)源（例如來(lái)自臍帶 血）的HSC和/或HPC上的氧水平，從而在體外增加培養(yǎng)物的壽命以及這些細(xì)胞的多能性 (pluripotency)、多潛能性（multipotency)、維持和/或擴(kuò)增。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了方法 以及源自于使用這些方法得到的產(chǎn)物，這些方法在氧濃度低于正常環(huán)境氧濃度的環(huán)境中進(jìn) 一步培養(yǎng)HSC和/或HPC的群體，其為培養(yǎng)物和所得的細(xì)胞群體提供了有益影響。
[0018] 對(duì)各種目標(biāo)群體使用各種條件和新穎化合物，能夠?yàn)橛伤玫降臄U(kuò)增的細(xì)胞類型 以及在收獲前所培養(yǎng)和/或擴(kuò)增的細(xì)胞數(shù)量所定義的特定終點(diǎn)選擇適合的培養(yǎng)條件。因 此，已經(jīng)為所有目標(biāo)群體的增強(qiáng)的倍擴(kuò)增鑒定出優(yōu)化的條件，具有直接臨床翻譯以增加可 移植細(xì)胞劑量并最小化重建延遲的潛力。
[0019] 另外，本發(fā)明提供了方法、擴(kuò)增的細(xì)胞群體、能夠移植給有需求的接受者的細(xì)胞群 體、用于控制生產(chǎn)大量特定譜系的祖細(xì)胞以及它們的更分化的造血細(xì)胞的裝置和組合物。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了使用各因素單獨(dú)和組合的影響的優(yōu)化，控制產(chǎn)生并維 持由讓人聯(lián)想起造血利基方面的條件所致的自我更新，多能性和分化的特性。
[0020] 本說(shuō)明書(shū)（包括權(quán)利要求）中使用的術(shù)語(yǔ)"包含（comprise) "、"包含 (comprises) "、"包含（comprised) "或"包含（comprising) "應(yīng)當(dāng)被解釋為指定所述特征、 整數(shù)、步驟或組分的存在，但不排除一個(gè)或多個(gè)其它特征、整數(shù)、步驟或組分或它們的群組 的存在。
[0021] 在審閱了以下描述的本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】之后，本發(fā)明的其它方面對(duì)本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員而言將是為而易見(jiàn)的。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明的方面和優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)參考以下詳細(xì)說(shuō)明并且結(jié)合附圖一起 考慮。
[0023] 圖1顯示了基于細(xì)胞表面標(biāo)志物或集落形成單位所確定的目標(biāo)群體的純度。在生 長(zhǎng)因子血小板生成素（T，50ng/ml)、干細(xì)胞因子（S，50ng/ml)、Flt-3配體（F，80ng/ml)和 白細(xì)胞介素-6(1，100叩/1111)(1\1535?35?1)的組合的存在下，在一系列的氧含量（2.5 (% ?19mmHg、5%? 38mmHg、10%? 75mmHg 且 20%? 150mmHg)下培育富集了 CD34+的細(xì)胞， 與血小板生成素、干細(xì)胞因子和粒細(xì)胞集落刺激因子（TSG，各100ng/ml)進(jìn)行比較。利用細(xì) 胞表面標(biāo)志物通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)來(lái)鑒定目標(biāo)群體，并且通過(guò)在'完全'甲基纖維素培養(yǎng)基中生 成以對(duì)爆式集落形成單位-紅細(xì)胞（BFU-E)、集落形成單位-粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（CFU-GM)、 集落形成單位-粒細(xì)胞/紅細(xì)胞/單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（CFU-GEMM)、和總爆式/集落形成 單位進(jìn)行計(jì)數(shù)。N = 4個(gè)獨(dú)立的臍帶血單位，每個(gè)各進(jìn)行一式三份。結(jié)果表示為平均值土 該平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。字母a - d標(biāo)示統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同的組，p值如圖所示。
[0024] 圖2顯示了表型和功能評(píng)估的HSC、HPC和多能細(xì)胞的倍擴(kuò)增。通過(guò)手動(dòng)計(jì)數(shù)、流 式細(xì)胞計(jì)和細(xì)胞集落形成單位計(jì)數(shù)來(lái)確定生長(zhǎng)因子的組合與氧水平對(duì)目標(biāo)群體的倍擴(kuò)增 的影響。倍擴(kuò)增描繪了目標(biāo)群體數(shù)量相對(duì)于培養(yǎng)前的數(shù)值的增加。生長(zhǎng)因子的組合是血 小板生成素（T，50ng/ml)、干細(xì)胞因子（S，50ng/ml)、Flt-3配體（F，80ng/ml)和白細(xì)胞介 素-6 (I，lOOng/ml) (T，TS，TSF，TSFI)，與血小板生成素、干細(xì)胞因子和粒細(xì)胞集落刺激因子 (TSG，各100ng/ml)進(jìn)行比較。測(cè)試的氧水平為2.5%、5%、10%和20%。N = 4個(gè)獨(dú)立的 臍帶血單位，每個(gè)進(jìn)行一式三份。結(jié)果表示為平均值土該平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。字母a-c 標(biāo)示統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同的組，P值如圖所示。
[0025] 圖3顯示了目標(biāo)群體的累積倍擴(kuò)增以及在串行擴(kuò)增過(guò)程中的相對(duì)基因表達(dá)水平。 使用生長(zhǎng)因子組合TSFI在5%和10%氧中確定了造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞和多能的靶細(xì)胞的累 積倍擴(kuò)增，與TSG在20%氧中進(jìn)行比較?；谑謩?dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)、檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物和菌落 形成單位計(jì)數(shù)評(píng)估了目標(biāo)群體細(xì)胞數(shù)量的變化。相對(duì)于在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在一種條件（TSFI在 10%氧中）下的表達(dá)，確定了相對(duì)于管家基因的定量的基因表達(dá)水平。N = 4個(gè)獨(dú)立的臍帶 血單位，每個(gè)進(jìn)行一式三份。結(jié)果表示為平均值土該平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。顯示了跨越3周 (W0-W3)的串行擴(kuò)增。字母a-c標(biāo)示統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同的組，p值如圖如示。
[0026] 圖4顯示了利用三種評(píng)估的方法可能區(qū)分的造血細(xì)胞類型。1)分化的分子（⑶） 的表面標(biāo)志物簇的表達(dá)模式，用于表型鑒定干細(xì)胞、祖細(xì)胞和多能細(xì)胞，如右手側(cè)所示，且 對(duì)于譜系定型細(xì)胞如下圖所示。2)使用集落/爆式形成單位（CFU/BFU)測(cè)定對(duì)粒細(xì)胞（G)、 紅細(xì)胞（E)、單核細(xì)胞（M)和巨噬細(xì)胞（M)進(jìn)行多能細(xì)胞的功能評(píng)價(jià)，如（*)所示。3)自我 更新的造血干細(xì)胞的基因表達(dá)模式，且對(duì)于祖細(xì)胞和多能細(xì)胞標(biāo)示在左手側(cè)。（細(xì)胞圖像改 編自 A. Rad, 2007.)。
[0027] 圖5顯示在⑶34+富集后，只有具有成活力且⑶34+純度為80%以上的樣品才用 于體外擴(kuò)增。在單步及串行擴(kuò)增培養(yǎng)之前和之后都對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了評(píng)估。使用臺(tái)盼藍(lán)排除法 通過(guò)手動(dòng)計(jì)數(shù)確定成活細(xì)胞數(shù)量。目標(biāo)群體的純度為通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)確定的表達(dá)表面標(biāo)志 物組合的細(xì)胞的百分比，且集落生成為通過(guò)CFU測(cè)定的每1000個(gè)接種的細(xì)胞的爆式或集落 形成單位的數(shù)量。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，使用存活的細(xì)胞數(shù)量以及目標(biāo)群體的純度或集落生成來(lái) 計(jì)算相對(duì)于培養(yǎng)前的數(shù)的倍擴(kuò)增和累積倍擴(kuò)增的終點(diǎn)。目標(biāo)群體純度和集落生成也被用來(lái) 作為終點(diǎn)。相對(duì)于兩個(gè)管家基因的平均值量化了基因表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR，并且相對(duì)于用TSFI 在10%氧中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)進(jìn)行了確定。
[0028] 圖6顯示了在不同生長(zhǎng)因子的組合（在文本中所指示的濃度下）的存在下且在不 同的氧氣濃度（2%、5%、10%和室內(nèi)空氣（20% 02))下的總細(xì)胞的倍擴(kuò)增和由表型標(biāo)志物 (⑶34+⑶45+7AAD-)定義的HSC亞群的倍擴(kuò)增。數(shù)據(jù)是10個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值，并且所有 的數(shù)值都計(jì)算為相比于接種的群體的倍擴(kuò)增。（無(wú)-未添加生長(zhǎng)因子；TF-血小板生成素、 Flt-3配體；TFI -血小板生成素、Flt-3配體、白細(xì)胞介素-6 ;TFS -血小板生成素、Flt-3 配體、SCF ;TFSI-血小板生成素、Flt-3配體、SCF、白細(xì)胞介素-6 ;TSG-血小板生成素、SCF、 G-CSF)。
[0029] 圖7顯示了在圖6中所述的每個(gè)培養(yǎng)條件中每1000個(gè)細(xì)胞的總集落。
[0030] 圖8顯示了總細(xì)胞的倍擴(kuò)增和由表型標(biāo)志物-⑶34+，⑶34+⑶133+和 ⑶34+⑶38-定義的HSC亞群的倍擴(kuò)增。所有分析都只選通（gate)為存活的細(xì)胞（7AAD-)。 在以50ng/ml或100ng/ml添加或未添加 ficolins-1、ficolin-2或ficolin-3的條件下，在 10%氧中，在TFSI生長(zhǎng)因子的存在下培養(yǎng)細(xì)胞。
[0031] 圖 9 顯不了在 TFSI+/-50 或 100ng/ml 的 ficolins-1、ficolin-2 或 ficolin-3 的存在下在10% 〇2中培養(yǎng)的細(xì)胞的總集落數(shù)量和集落形態(tài)。在這些生長(zhǎng)因子中培養(yǎng) 8天之后，將來(lái)自各條件的1000個(gè)細(xì)胞接種至半固態(tài)培養(yǎng)基（Methocult，Stem Cell Technologies, Vancouver)中，每個(gè)條件一式三份并且進(jìn)一步培養(yǎng)12?14天。然后在倒置 顯微鏡下計(jì)數(shù)集落的數(shù)量和類型。
[0032] 圖10顯示了總細(xì)胞的倍擴(kuò)增和由表型標(biāo)志物-⑶34+，⑶34+⑶133+和 ⑶34+⑶38-定義的HSC亞群的倍擴(kuò)增。所有分析都只選通為存活的細(xì)胞（7AAD-)。在以 50ng/ml 或 100ng/ml 添加或者未添加 ficolins-1、ficolin-2 或 ficolin-3 的條件下，在 5% 氧中，在TFSI生長(zhǎng)因子的存在下培養(yǎng)細(xì)胞。
[0033] 圖 11 顯示了在 TFSI+/-50 或 100ng/ml 的 ficolins-1、ficolin-2 或 ficolin-3 的存在下在5 % 02中培養(yǎng)的細(xì)胞的總集落數(shù)和集落形態(tài)。在這些生長(zhǎng)因子中培養(yǎng)8 天后，將來(lái)自每個(gè)條件的1000個(gè)細(xì)胞接種至半固態(tài)培養(yǎng)基（Methocult, Stem Cell Technologies, Vancouver)中，每個(gè)條件一式三份并且進(jìn)一步培養(yǎng)12?14天。然后在倒置 顯微鏡下計(jì)數(shù)集落的數(shù)量和類型。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 人類自體和異體骨髓移植方法被用作許多疾病的療法，如白血病、多發(fā)性骨髓瘤、 淋巴瘤以及其他危及生命的疾病。因此，在血液病、免疫疾病和癌癥的治療中，HSC和HPC被 轉(zhuǎn)向?yàn)槿找娓軞g迎且確立形式的藥物治療。
[0035] 在用于移植目的的相容性骨髓供體不可用時(shí)，臍帶血常常被作為尋求收獲HSC和 HPC的源。在體外進(jìn)行的研究已經(jīng)證明，從臍帶血獲得的HSC比獲自骨髓的那些具有更好的 增殖和移植能力。因此，認(rèn)為使用臍帶血相比于造血干細(xì)胞的其它來(lái)源提供若干優(yōu)勢(shì)，例如 存在在臍帶血中比在骨髓中更不那么嚴(yán)格要求匹配HLA的事實(shí)?？上У氖牵殠а写嬖?且可用的造血細(xì)胞的數(shù)量通常少于總的有核細(xì)胞的〇. 1%。低群體的這些細(xì)胞以及將它們 成功地?cái)U(kuò)增為適合用于移植的密度的有限傾向性，經(jīng)常給它們的應(yīng)用帶來(lái)限制和問(wèn)題，因 為未能達(dá)到閾細(xì)胞劑量限值（在一些情況下至少為1.7x10 s⑶34+個(gè)細(xì)胞/kg)已經(jīng)被視為 與較低的移植成功率相關(guān)。
[0036] 增加干細(xì)胞數(shù)量的方法可以進(jìn)一步減少與骨髓/外周血干細(xì)胞采收相關(guān)的時(shí)間 和不適并隨后增加干細(xì)胞供體的庫(kù)。增加干細(xì)胞數(shù)量的方法還允許將臍帶血用于成人患 者，從而擴(kuò)大了異體移植的應(yīng)用。
[0037] 因此，本發(fā)明的方法和組合物為造血細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增和維護(hù)提供了改進(jìn)的體系 和工序。本發(fā)明的方法為可以從HPC或HSC樣品獲得的子代的數(shù)量提供了改進(jìn)，并且同時(shí) 保持或增加這些細(xì)胞的再增能力和多能性。
[0038] 1.定義
[0039] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"造血干細(xì)胞"或"HSC"是指未成熟的血細(xì)胞，其具有自我更新和 分化成更成熟的血細(xì)胞的能力，所述更成熟的血細(xì)胞包含粒細(xì)胞（例如，早幼粒細(xì)胞、中性 粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞）、紅細(xì)胞（例如，網(wǎng)織紅細(xì)胞、紅血球）、血小板（例 如，成巨核細(xì)胞、產(chǎn)生血小板的巨核細(xì)胞、血小板）和單核細(xì)胞（例如，單核細(xì)胞、巨噬細(xì) 胞）。本領(lǐng)域已知此類細(xì)胞可以包括或不包括⑶34+細(xì)胞。⑶34+細(xì)胞是表達(dá)⑶34細(xì)胞表 面標(biāo)志物的不成熟的細(xì)胞。認(rèn)為CD34+細(xì)胞包括具有上述干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群。
[0040] 本領(lǐng)域還眾所周知，造血干細(xì)胞可以包括多能干細(xì)胞、多潛能干細(xì)胞（例如，淋巴 干細(xì)胞）和/或致力于特定造血譜系的干細(xì)胞。所述致力于特定造血譜系的干細(xì)胞可以是T 細(xì)胞譜系、B細(xì)胞譜系、樹(shù)突狀細(xì)胞譜系、朗格漢斯細(xì)胞譜系、紅系的、巨核細(xì)胞的、脊髓的和 /或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞譜系。此外，HSC也指長(zhǎng)期HSC(LT-HSC)和短期HSC(ST-HSC)。LT-HSC 和ST-HSC是例如基于它們的細(xì)胞表示標(biāo)記物的表達(dá)來(lái)區(qū)分化的。LT-HSC是⑶34-、SCA-1+、 11^1.1+/1〇、(：-1^七+、1111-、0)135-、51&11^1/0)150+，而51'-批(：是0)34+、5〇六-1+、11^1.1+/ lo、C-kit+、lin-、CD135-、Slamfl/CD150+、Mac-l(CDllb)lo( "1〇" 指的是低表達(dá)）。另外， ST-HSC與LT-HSC相比較少的靜態(tài)（S卩，更加活躍）且更具增殖性。但是，LT-HSC有無(wú)限的 自我更新（即，它們存活在整個(gè)成年期），而ST-HSC具有有限的自我更新（即，它們只在有 限的時(shí)間段內(nèi)存活）。
[0041] 任何這些HSC都可以用于任何本文所述的方法中。任選地，ST-HSC是有用的，因 為它們是高度增殖性并由此迅速增加 HPS的數(shù)量和它們的子代。類似地，本領(lǐng)域已知此類 細(xì)胞可以包括或不包括⑶133+細(xì)胞，其也可以在"血液制品"中發(fā)現(xiàn)，并且還已知包括具有 如上所定義的"祖細(xì)胞"特性的細(xì)胞亞群。另外，HSC任選地獲自于血液制品。
[0042] 如在本發(fā)明中所考慮的，所擴(kuò)增的HSC保留了至少一些初始干細(xì)胞或HSC的多能 性。多能性包括干細(xì)胞活性或潛力，如分化成其它血細(xì)胞類型的能力或不分化而繁殖的能 力。
[0043] 本文所考慮的"血液制品"包括從身體獲得的產(chǎn)物或含有造血起源的細(xì)胞的身體 器官。此類來(lái)源包括未分級(jí)的骨髓、臍帶、外周血、肝臟、胸腺、淋巴和脾臟。所有上述粗制 的或未分級(jí)的血液制品都可以通過(guò)許多途徑用來(lái)富集具有造血干細(xì)胞特性的細(xì)胞。例如， 可以利用它們表達(dá)的細(xì)胞表面分子來(lái)選擇更成熟的分化的細(xì)胞。任選地，通過(guò)選擇CD34+ 細(xì)胞對(duì)血液制品進(jìn)行分級(jí)。CD34+細(xì)胞包括能夠自我更新和多能性的細(xì)胞的亞群。此類選 擇是使用例如市售的磁性抗-CD34珠來(lái)完成的。未分級(jí)的血液制品任選地直接獲自于供體 或從冷凍保護(hù)的儲(chǔ)存中獲取。使用特定的干細(xì)胞標(biāo)志物來(lái)分離HSC的能力為本領(lǐng)域技術(shù)人 員所熟知。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明，認(rèn)為所有上述粗制的或未分級(jí)的血液制品都可以通過(guò)許多途徑用來(lái) 富集具有造血祖細(xì)胞或"HSC"特性的細(xì)胞。
[0045] 本文中使用的術(shù)語(yǔ)"HPC"是指在循環(huán)血液中稀少的并且可以分化為各種專門的細(xì) 胞類型并產(chǎn)生血細(xì)胞類型的造血祖細(xì)胞。通常理解的是，它們?cè)谔幵诓煌墒祀A段的血液 中存在。
[0046] 作為非限制性的實(shí)施方式，所述血液制品可以由更分化的子代耗盡?？梢葬槍?duì)它 們具有的和表達(dá)的細(xì)胞表面分子來(lái)選擇更成熟的分化的細(xì)胞。還可以采用特異性配體和受 體并且在進(jìn)一步操縱之前富集所述HPC。
[0047] 在本發(fā)明中，認(rèn)為術(shù)語(yǔ)"環(huán)境的（ambient)"是指完全包圍或圍繞本發(fā)明的培養(yǎng)基 區(qū)域的區(qū)域。認(rèn)為本說(shuō)明書(shū)在上下文中使用的術(shù)語(yǔ)"環(huán)境的"可以由本領(lǐng)域中最小量技術(shù) 的人員所理解并且該術(shù)語(yǔ)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所眾所周知。
[0048] 本文中使用的術(shù)語(yǔ)"環(huán)境氧濃度"應(yīng)理解為是指不同的環(huán)境介質(zhì)中或在周圍的環(huán) 境中每單位體積中發(fā)現(xiàn)的環(huán)境可用的氧氣量，并且認(rèn)為其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的術(shù) 語(yǔ)。
[0049] 本文中使用的術(shù)語(yǔ)"基質(zhì)細(xì)胞"被認(rèn)為包含成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，具有或不具 有其他細(xì)胞和元素，并且可以在造血祖細(xì)胞之前或與其基本同時(shí)接種，由此確立有利于后 續(xù)的HSC和/或HPC的附著和生長(zhǎng)的條件。成纖維細(xì)胞可以通過(guò)活組織檢查從任何組織或 器官獲得，并且包括胎兒成纖維細(xì)胞。這些成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞可以使用編碼例如所 述造血生長(zhǎng)因子之一的外源DNA來(lái)轉(zhuǎn)染。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明，認(rèn)為術(shù)語(yǔ)"質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基"是指其中已經(jīng)培育有前述基質(zhì)細(xì)胞 的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的方法中，所述培育進(jìn)行一段時(shí)間以充分使所述基質(zhì)細(xì)胞向培養(yǎng)基中 分泌因子。然后可以使用此類"基質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基"來(lái)補(bǔ)充HPC的培養(yǎng)以促進(jìn)它們的 增殖和/或分化。因此，當(dāng)在不含任何前述試劑下培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，在本文中是指除了可能存在 于血清、普通的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或存在于含有造血祖細(xì)胞的血液制品分離物（未分級(jí)的或分級(jí) 的）中的此類試劑之外，在未添加此類試劑的情況下來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。
[0051] 如本發(fā)明中所考慮的，術(shù)語(yǔ)"接種的基質(zhì)細(xì)胞"或"基質(zhì)細(xì)胞接種的培養(yǎng)基"是指 向不含基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)容器中引入基質(zhì)細(xì)胞以作為促進(jìn)HPC的存活、增殖或分化的接 種物，但是排除天然存在于分離的血液制品中的基質(zhì)細(xì)胞。
[0052] 本文中所提及的"受試者"是例如骨髓供體或者患有或有風(fēng)險(xiǎn)患有耗盡或有限的 血細(xì)胞水平的個(gè)體。任選地，所述受試者是骨髓采收之前的骨髓供體或是骨髓采收之后的 骨髓供體。所述受試者任選地是骨髓移植的接受者。本文所述的方法在具有有限的骨髓儲(chǔ) 備的受試者（例如老齡受試者）或先前已經(jīng)接受免疫耗減治療（如化療）的受試者中是特 別有用的。所述受試者，任選地與對(duì)照血細(xì)胞水平相比，具有降低的血細(xì)胞水平或具有發(fā)展 降低的血細(xì)胞水平的風(fēng)險(xiǎn)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"對(duì)照血細(xì)胞水平"是指在改變受試者中血 細(xì)胞水平的事件之前或基本上不存在該事件的受試者中的血細(xì)胞平均水平。改變受試者中 的血細(xì)胞水平的事件包括例如貧血、創(chuàng)傷、化療、骨髓移植和放射治療。例如，所述受試者患 有由例如創(chuàng)傷所致的貧血或失血。
[0053] 如本發(fā)明中所考慮的，術(shù)語(yǔ)"采收造血干細(xì)胞"、"采收造血祖細(xì)胞"、"采收HSC"或 "采收HPC"被認(rèn)為是指細(xì)胞的取出和分離，并且被認(rèn)為是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識(shí)到的技 術(shù)。在一個(gè)例子中，"采收"可以通過(guò)使用多種方法來(lái)完成，例如基于酶、非酶、離心、電氣或 尺寸的方法，或者優(yōu)選地通過(guò)使用培養(yǎng)基（例如，用來(lái)培育細(xì)胞的培養(yǎng)基）或緩沖液來(lái)沖洗 所述細(xì)胞。任選地收集、分離所述細(xì)胞并且進(jìn)一步地?cái)U(kuò)增以生成甚至更大群體的HSC或HPC 和分化的子代。
[0054] 如本發(fā)明所考慮的，術(shù)語(yǔ)"控制曲線"被認(rèn)為是指通過(guò)測(cè)量不同體積的可以在相同 條件下培養(yǎng)的血液制品的生長(zhǎng)特性所產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)與數(shù)學(xué)相關(guān)曲線，并且其中所述細(xì)胞可以 被采收并在規(guī)則時(shí)間間隔上計(jì)數(shù)。本發(fā)明中所考慮的這些"控制曲線"可以在隨后的場(chǎng)合 中用作估算細(xì)胞數(shù)量的一種方法。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的方法，認(rèn)為任何適合擴(kuò)增的容器、瓶或適合的管（如12、24或96孔 板，12. 5cm2T燒瓶或氣體可滲透袋）都可以用于任何本發(fā)明的培養(yǎng)方法。
[0056] 如本發(fā)明所考慮的，術(shù)語(yǔ)"造血生長(zhǎng)因子"被認(rèn)為是指影響造血細(xì)胞的存活、增殖 或分化的至少一種因子。這些生長(zhǎng)因子可通過(guò)純化方式獲得、通過(guò)重組方法獲得，或者可以 是衍生的或合成的。因此，與本發(fā)明的方法和組合物有關(guān)的特別令人感興趣的生長(zhǎng)因子是 造血生長(zhǎng)因子。
[0057] 如本發(fā)明所考慮的，術(shù)語(yǔ)"ficolin"被認(rèn)為涉及存在于ficolin家族中的若干種變 體蛋白質(zhì)，主要包括ficolin-1 (M-ficolin)、ficolin_2和ficolin-3。這些都是分泌模式-識(shí) 別凝集素，其有助于病原體的先天免疫識(shí)別。Ficolin具有一個(gè)纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè) 膠原蛋白樣結(jié)構(gòu)域，并且作為二硫鍵連接的均聚-寡聚體循環(huán)。在配體結(jié)合后，ficolin與 MASP絲氨酸蛋白酶聯(lián)合以觸發(fā)凝集素補(bǔ)體級(jí)聯(lián)。人類中的Ficolin-Ι是由FCN1基因 （SEQ ID:1)編碼的，ficolin-2是由FCN2基因 （SEQ ID:3)編碼的，且ficolin-3是由FCN3基因 (SEQ ID:5)編碼的。翻譯自FCN1、FCN2和FCN3的蛋白質(zhì)產(chǎn)物分別提供為SEQ ID:2、SEQ ID:4和 SEQ ID:6。
[0058] Ficolin是結(jié)構(gòu)上與血管生成素樣蛋白相關(guān)的蛋白質(zhì)，并且具有相似的結(jié)構(gòu)域結(jié) 構(gòu)，特別是單纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。在氨基酸水平上檢查ficolin與血管生成素樣蛋白的同 源性，但是只看出僅約20?25%水平的同源性。該ficolin家族的蛋白質(zhì)的特征在于存在 前導(dǎo)肽、短的N-末端片段、隨后為膠原蛋白樣區(qū)和C-末端纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。還在其它 蛋白質(zhì)（如補(bǔ)體蛋白Clq、稱為聚集蛋白的C型凝集素、和肌腱蛋白）中單獨(dú)地發(fā)現(xiàn)了膠原 蛋白樣結(jié)構(gòu)和纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。然而，所有這些蛋白質(zhì)都識(shí)別不同的對(duì)象，并且在功能 上是不同的。
[0059] 在所有本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法中，除另有規(guī)定外，所使用的培養(yǎng)基可以是常規(guī)適 合于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。本領(lǐng)域中已知的并且能夠用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的例子包括 RPMI、DMEM、ISC0VES。典型地，這些培養(yǎng)基補(bǔ)充有人類或動(dòng)物的血漿或血清。此類血漿或血 清可以含有少量的造血生長(zhǎng)因子。在本發(fā)明的優(yōu)選的條件下，所采用的培養(yǎng)基未添加血清。
[0060] 2.用 ficolin 培養(yǎng) HSC 和 / 或 HPC
[0061] 擴(kuò)增來(lái)源于適合來(lái)源（例如臍帶血或骨髓）的HPC或HSC的群體的能力可以給醫(yī) 學(xué)界提供可觀的益處，并且改善成功地進(jìn)行治療、移植手術(shù)或用于血液病和腫瘤疾病的需 要高細(xì)胞劑量的其它療法的前景。
[0062] 在本發(fā)明中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用或組合使用特定的試劑（如ficolin)可以增強(qiáng)HSC 和HPC群體的擴(kuò)增。Ficolin是在結(jié)構(gòu)上與血管生成素樣蛋白相關(guān)的蛋白質(zhì)，并且具有相似 的結(jié)構(gòu)域，特別是單纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。它們?cè)诖艘郧耙汛_認(rèn)為免疫功能的調(diào)節(jié)劑，但是 沒(méi)有研究它們對(duì)造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞的影響。
[0063] 已經(jīng)看出這些試劑為造血細(xì)胞的自我更新和擴(kuò)增提供了增強(qiáng)作用。如本發(fā)明人所 發(fā)現(xiàn)的（參見(jiàn)實(shí)施例），發(fā)現(xiàn)在存在（但不是不存在）ficolin的條件下能夠?qū)崿F(xiàn)最原始類的 集落形成細(xì)胞CFU-GEMM的維持，表明這些試劑在有選擇地保留原始HSC群體中是最可能活 躍的。
[0064] 因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了對(duì)適合于生長(zhǎng)HSC和/或HPC的培養(yǎng)基的補(bǔ)充 物，其中所提供的該補(bǔ)充物是試劑ficolin-l、ficolin-2或ficolin-3或它們的片段或功能等 價(jià)物或組合中的一種或多種。
[0065] 如本發(fā)明中所考慮的，ficolin的片段和功能等價(jià)物應(yīng)理解為包括含有纖維蛋白原 樣結(jié)構(gòu)域的片段（在ficolinl的情況下，例如氨基酸115?325)、或者含有凝集素結(jié)合活性 的較小的片段（作為非限制性的例子，在ficolinl的情況下，氨基酸200?300)。
[0066] 在一個(gè)實(shí)施方式中，用于培養(yǎng)或擴(kuò)增的造血細(xì)胞的群體可以采收自例如獲自于適 合受試者的骨髓樣品、先前確立的培養(yǎng)物或臍帶血。任選地，所述HSC可以獲自于從包含未 分級(jí)的骨髓、臍帶、外周血、肝臟、胸腺、淋巴和脾臟的群組中選出的血液制品。
[0067] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，從本發(fā)明的方法或組合物的使用和應(yīng)用中獲得的造血細(xì) 胞群體可以包括HSC和/或HPC，該HSC和/或HPC由于在移植接受者中具有增強(qiáng)的恢復(fù)血 細(xì)胞和免疫細(xì)胞的能力而包含提高的治療潛力。在又另一個(gè)實(shí)施方式中，認(rèn)為根據(jù)本發(fā)明 的方法培養(yǎng)的細(xì)胞群體能夠保留進(jìn)行分化以生成用于其它組織（如，例如腦細(xì)胞、肌肉細(xì) 胞和肝細(xì)胞）的細(xì)胞的潛能。
[0068] 可以認(rèn)為，未分級(jí)的血液制品可以直接獲自于供體或者從冷凍保護(hù)的儲(chǔ)存中獲 取，但是認(rèn)為這些僅僅是能夠得到此類血液制品的非限制性例子，從而為在本發(fā)明的方法 中使用的造血細(xì)胞提供來(lái)源。根據(jù)本發(fā)明，認(rèn)為造血細(xì)胞可來(lái)源于任何適合的動(dòng)物，例如人 類、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬或鼠。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述造血細(xì)胞是人類細(xì)胞。
[0069] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，如本發(fā)明中使用的用于培養(yǎng)HSC和/或HPC的方法 可以采用任何本文所述的生長(zhǎng)因子并且可以補(bǔ)充有ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它 們的片段或功能等價(jià)物或組合中的一種或多種。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，向所述培養(yǎng)體系中 加入ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、它們的片段或功能等價(jià)物或組合以便其在所述培養(yǎng)基 中占約 50ng/mL ?200ng/mL。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、 它們的片段或功能等價(jià)物或組合在所述培養(yǎng)體系中的濃度為約50ng/mL?100ng/mL。
[0070] 3.在低氣（0J環(huán)塏中培養(yǎng)HPC和/或HSC
[0071] 在本發(fā)明中，發(fā)明人還已確定當(dāng)以低于環(huán)境氧濃度的水平向細(xì)胞培養(yǎng)物中提供氧 量時(shí)，可以提供增強(qiáng)的生長(zhǎng)特性，如提高純度的目標(biāo)群體，且對(duì)集落生成沒(méi)有影響或影響非 常有限。
[0072] 低濃度的氧對(duì)細(xì)胞（如HPC和/或HSC)生長(zhǎng)的影響可以通過(guò)添加試劑（如ficolin 或其功能等價(jià)物）來(lái)進(jìn)一步減弱，由此以對(duì)集落生成的最小影響提供了提高純度的目標(biāo)群 體。
[0073] 因此，在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于在體外延長(zhǎng)HPC和/或HSC群體的成活 力的方法、或用于培養(yǎng)或擴(kuò)增HPC和/或HSC群體的方法，其中所述方法包含在ficolin-1、 ficolin-2或ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物或組合的存在下并且在與正常的環(huán)境氧 濃度相比降低了氧濃度的環(huán)境中培養(yǎng)所述HPC和/或HSC群體。
[0074] 所述造血細(xì)胞的培養(yǎng)優(yōu)選在增加此類細(xì)胞的數(shù)量和/或此類細(xì)胞的集落形成潛 力的條件下來(lái)進(jìn)行。所使用的條件是指本領(lǐng)域中眾所周知的條件的組合（例如溫度、〇) 2含 量、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基等）。但是特別地，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)環(huán)境中的氧濃度對(duì)于造血祖細(xì)胞的 擴(kuò)增是至關(guān)重要的。
[0075] 在本發(fā)明的實(shí)施方式中，本發(fā)明的HSC和/或HPC的群體可以在低氧環(huán)境中培養(yǎng) 以增強(qiáng)它們自我更新的概率并且降低分化的概率，并且是在試劑（如ficolin-1、ficolin-2 或ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物或組合）的存在下來(lái)這樣進(jìn)行的。
[0076] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供了用于改變?cè)隗w外延長(zhǎng)HPC和/或HSC群體的成 活力的能力的方法、或用于培養(yǎng)或擴(kuò)增HPC和/或HSC群體的方法，其在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò) 適當(dāng)選擇的氧濃度，并且已經(jīng)向所述培養(yǎng)體系中添加了試劑，如ficolin-1、ficolin-2或 ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物或組合。
[0077] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)體系中的氧濃度構(gòu)成低于大氣中存在的環(huán)境氧濃 度水平。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，氧的濃度低于培養(yǎng)氣氛的約20%，更優(yōu)選地，氧氣占培養(yǎng) 氣氛的約1 %?約12%。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，氧氣構(gòu)成培養(yǎng)氣氛的約10%。
[0078] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞是在試劑（如ficolin-1、ficolin-2或 ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物）的存在下、在氧氣的濃度低于環(huán)境中存在的環(huán)境氧 水平的環(huán)境中培養(yǎng)的，并且其中所述細(xì)胞是在約1 %?約12%氧氣的氧濃度下培養(yǎng)的。 [0079] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞是在任何一種或多種試劑（如ficolin-1、 ficolin-2或ficolin-3或片段或功能等價(jià)物）的存在下、在其中氧氣的濃度為至少0. 5%、 或至少1. 0%、或至少1. 5%、或至少2. 0%、或至少2. 5%、或至少3. 0%、或至少3. 5%、或 至少4. 0%、或至少4. 5%、或至少5. 0%、或至少5. 5%、或至少6. 0%、或至少6. 5%、或至 少7. 0%、或至少7. 5%、或至少8. 0%、或至少8. 5%、或至少9. 0%、或至少9. 5%、或至少 10.0%、或至少10.5%、或至少11.0%、或至少11.5%、或至少12.0%、或至少12.5%、或至 少13. 0%、或至少13. 5%、或至少14. 0%、或至少14. 5%、或至少15. 0%、或至少15. 5%、 或至少16. 0 %、或至少16. 5 %、或至少17. 0 %、或至少17. 5 %、或至少18. 0 %、或至少 18. 5%、或至少19. 0%、或至少19. 5%、或至少20. 0%的環(huán)境中來(lái)培養(yǎng)的。
[0080] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以使用5?10%范圍的氧濃度，在試劑（如ficolin-1、 ficolin-2或ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物或組合中的任何一種或多種）的存在下 來(lái)培養(yǎng)臍帶血HSC和/或HPC。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，在HSC和/或HPC的培養(yǎng)中可以 使用約5%的氧濃度。
[0081] 根據(jù)本發(fā)明的方法，認(rèn)為根據(jù)所述方法并且使用本發(fā)明的組合物并且在降低的氧 的條件下培養(yǎng)和擴(kuò)增HSC和/或HPC群體所必要的時(shí)間為可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)確定的 時(shí)間。這可以理解為其可根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程中接種的細(xì)胞的原始數(shù)量而變化。作為非限制性的 例子，可以將培養(yǎng)基的褪色用作鋪滿（confluency)的指標(biāo)。
[0082] 還認(rèn)為，在本發(fā)明的實(shí)施方式的應(yīng)用中，可在相同的條件下培養(yǎng)不同體積的血液 制品，從而生成在后續(xù)的場(chǎng)合可以用來(lái)評(píng)估細(xì)胞數(shù)量的"控制曲線"。認(rèn)為本領(lǐng)域并由此本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員充滿了用來(lái)確定適當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間的技術(shù)，該培養(yǎng)使用了修改的氧濃度條 件和本發(fā)明的方法。但是如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以設(shè)想的，各種因素可能影響在細(xì)胞培 養(yǎng)中遇到的測(cè)量或時(shí)間間隔。如培養(yǎng)時(shí)的初始接種密度可能影響培養(yǎng)時(shí)間的考慮。例如， 如果初始接種更多的細(xì)胞，那么相對(duì)于如果初始提供較少數(shù)量細(xì)胞進(jìn)行接種而言，用于培 養(yǎng)的最佳時(shí)間可以縮短。
[0083] 但是可以認(rèn)為，如監(jiān)控細(xì)胞數(shù)量的變化等技術(shù)的應(yīng)用（例如通過(guò)測(cè)定光密度或直 接計(jì)數(shù)）、通過(guò)監(jiān)控培養(yǎng)基的pH的變化或檢查生長(zhǎng)速率的放緩（例如，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞的倍增 時(shí)間）都代表了確定合適的培養(yǎng)時(shí)間的有效且適當(dāng)?shù)姆椒ā?br> [0084] 在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，除了適合于生長(zhǎng)HPC和/或HSC的培養(yǎng)基之外，還 提供了 ficolin-l、ficolin-2或ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物或組合，其中培養(yǎng)條件 包括低于環(huán)境水平的氧濃度，并且更優(yōu)選的氧濃度低于約15%、低于約14%、低于約13%、 低于約12%、低于約11%、低于約10%、低于約9%、低于約8%、低于約7%、低于約6%或 低于約5%。
[0085] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，向培養(yǎng)基中提供ficolin-l、ficolin_2或ficolin-3或它們的 片段或功能等價(jià)物或組合，其中氧濃度為約5%。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，除了培養(yǎng)基之 夕卜，還提供了 ficolin-1或其片段或功能等價(jià)物，其中氧濃度為約5%。
[0086] 4. #用改奪的培養(yǎng)備件俥用ficolin培養(yǎng)HSC和/或HPC
[0087] 造血細(xì)胞群體如HSC和/或HPC的體內(nèi)擴(kuò)增取決于通常發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞的骨髓環(huán)境 中的多重因素的綜合影響。這個(gè)區(qū)域相當(dāng)普遍地稱為"造血利基"。
[0088] 最原始且多能的干細(xì)胞通常位于骨髓中的骨小梁空間內(nèi)骨內(nèi)膜面的緊鄰處。因 此，這種利基由干細(xì)胞和鄰近的基質(zhì)細(xì)胞（包括成骨細(xì)胞）之間的細(xì)胞相互作用、以及與細(xì) 胞外基質(zhì)成分的相互作用、不同細(xì)胞類型之間的三維相互關(guān)系、以及生長(zhǎng)因子和其他可溶 性信號(hào)分子在骨髓腔內(nèi)的擴(kuò)散所構(gòu)成。
[0089] 因此，在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于在試劑的存在下并且額外地在本文所 述的生長(zhǎng)因子的存在下培養(yǎng)HSC和/或HPC的方法，所述試劑如ficolin-1、ficolin-2或 ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物或組合，所述生長(zhǎng)因子可以為細(xì)胞的培養(yǎng)提供附加益 處，如提高HSC和/或HPC細(xì)胞的更新和多能性的屬性。
[0090] 在利用本發(fā)明的方法中，可以取出HSC和/或HPC的富集群體，并且使用試劑和/ 或生長(zhǎng)因子來(lái)對(duì)它們進(jìn)行刺激從而在體外產(chǎn)出更成熟的血細(xì)胞，所述試劑和/或生長(zhǎng)因子 可以促進(jìn)造血細(xì)胞的維持或促進(jìn)擴(kuò)增和/或分化。此類擴(kuò)增群體的血細(xì)胞可以在體內(nèi)應(yīng) 用，例如補(bǔ)充患者的造血細(xì)胞群，或者可以實(shí)驗(yàn)使用。此類分化的細(xì)胞包括上述那些以及 T細(xì)胞、漿細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸 性粒細(xì)胞和血小板。
[0091] 與本發(fā)明的方法和組合物有關(guān)的特別令人感興趣的生長(zhǎng)因子是造血生長(zhǎng)因子。這 些生長(zhǎng)因子可以通過(guò)純化獲得、通過(guò)重組方法獲得，或者可以是衍生的或合成的。
[0092] 在本發(fā)明的實(shí)施方式中，提供了在常規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在ficolin-1、ficolin-2或 ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物或組合的存在下，通過(guò)添加選自于包含白細(xì)胞介素 3、白細(xì)胞介素6和白細(xì)胞介素11 (I)、干細(xì)胞因子（S)、血小板生成素（T)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子和FLT-3配體（F)的群組中的生長(zhǎng)因子，從而培養(yǎng)或擴(kuò)增HSC和/ 或HPC群體的方法。
[0093] 如由本發(fā)明的發(fā)明人所確定的，且如實(shí)施例中所討論的，單獨(dú)的血小板生成素只 產(chǎn)生了 60%的細(xì)胞存活率，這低于優(yōu)選的移植標(biāo)準(zhǔn)且不適合于維持研究用的細(xì)胞培養(yǎng)物。 當(dāng)向所述培養(yǎng)基中提供生長(zhǎng)因子的組合TS時(shí)，看到了提高了擴(kuò)增細(xì)胞的存活率。另外，TS 將最原始的HSC(CD34+CD381的百分比提高至高于培養(yǎng)前所觀察到的水平，并且大幅提高 了倍擴(kuò)增。
[0094] 因此，在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，向包含HPC和/或HSC以及ficolin-1、 ficolin-2或ficolin-3或其片段或功能等價(jià)物的培養(yǎng)基中提供生長(zhǎng)因子TS，從而提高所擴(kuò) 增的培養(yǎng)物的成活力。
[0095] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，可以使用生長(zhǎng)因子的組合來(lái)培養(yǎng)HPC和/或HSC的群體， 其中所述培養(yǎng)在培養(yǎng)基中包含血小板生成素（T)、干細(xì)胞因子（S)、FLT-3配體（F)和白細(xì) 胞介素-6(1)。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，除了生長(zhǎng)因子組合TSFI之外，還提供了試劑 ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物或組合。
[0096] 在本發(fā)明的又進(jìn)一步實(shí)施方式中，可以以約50ng/mL?100ng/mL范圍的濃度提供 各個(gè)生長(zhǎng)因子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方法或組合物的應(yīng)用中，以約50ng/mL提 供T，以約50ng/mL提供S，以約80ng/mL提供F，并且以約lOOng/mL提供I。
[0097] 也如本發(fā)明人所確定的，向組合TS中添加 Flt-3配體（F)對(duì)大多數(shù)目標(biāo)群體的純 度和倍擴(kuò)增具有最小的加性效應(yīng)，但是已經(jīng)確定其顯著減少BFU-E和CFU-GEMM的集落生 成。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供了生長(zhǎng)因子F與TS的組合在HSC和/或HPC的存 在下培養(yǎng)前述細(xì)胞。
[0098] 在本發(fā)明的方法的應(yīng)用中，觀察至添加白細(xì)胞介素-6(1)降低了使用TSFI (當(dāng)與 使用TS或TSF相比時(shí)）的目標(biāo)群體的整體純度和集落生成，但是這個(gè)組合還顯示出活細(xì)胞 倍擴(kuò)增的顯著增加以及臨床上預(yù)測(cè)的⑶45+CD34+群體和⑶133+群體的相應(yīng)增加，并且更多 原始的CD34+CD38-群體。
[0099] 與⑶34+CD38__#增的增加一起，本發(fā)明人還確定白細(xì)胞介素-6與其它生長(zhǎng)因子 的組合可能影響臍帶血HSC的命運(yùn)。組合TSFI顯著增加了 CFU-GM、CFU-GEMM和總爆式/ 集落形成單位的倍擴(kuò)增，指示出更好的短期再植能力。相反，生長(zhǎng)因子組合TS和粒細(xì)胞集 落刺激因子（G)(即TSG)導(dǎo)致了類似的活細(xì)胞的倍擴(kuò)增，但分化細(xì)胞的比例較高。這種以 其它干細(xì)胞和祖細(xì)胞群體的擴(kuò)增為代價(jià)的向粒系分化的移動(dòng)，可能以移植后更少的有益效 果導(dǎo)致最原始的HSC的耗盡。
[0100] 認(rèn)為通過(guò)采用本發(fā)明的方法和組合物，能夠使HSC(如HPC)的培養(yǎng)進(jìn)行6、7或8 周，并且可以在這個(gè)時(shí)間間隔期間采收造血祖細(xì)胞以用于隨后與含有促進(jìn)造血細(xì)胞的維 持、擴(kuò)增和/或分化的造血生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)條件接觸。
[0101] 因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，向用于培養(yǎng)HSC和/或HPC的培養(yǎng)基中提供生長(zhǎng)因 子TSFI，從而將所述期間增加至前述細(xì)胞可以培養(yǎng)的期間。優(yōu)選地，它們可以培養(yǎng)6周的時(shí) 間，更優(yōu)選7周的時(shí)間，以及甚至更優(yōu)選8周的時(shí)間。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，除了 生長(zhǎng)因子組合TSFI之外，還提供了試劑如ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它們的片段 或功能等價(jià)物或組合。
[0102] 5.在詵定的培養(yǎng)某的備件下俥用ficolin和低氣來(lái)培養(yǎng)HSC和/或HPC
[0103] 在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了在低氧環(huán)境中并且在生長(zhǎng)因子和試劑（如 ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物或組合）的存在下以及與環(huán) 境水平相比在降低的氧濃度的存在下培養(yǎng)HSC和/或HPC的方法和組合物。
[0104] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在培養(yǎng)基中并且在ficolin-1、ficolin-2或ficolin-3或它們 的片段或功能等價(jià)物或組合中的任何一種的存在下，以及在氧濃度低于環(huán)境氧濃度的環(huán)境 中，以任何前述的濃度和組合提供生長(zhǎng)因子組合TSFI。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，氧的濃度低 于20%。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，在其中5%?10%的氧水平的存在下提供生長(zhǎng)因子組合 TSFI，這增強(qiáng)了所有目標(biāo)群體的倍擴(kuò)增。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，在10%的氧水平的存在 下提供生長(zhǎng)因子組合TSFI，這可以提供增強(qiáng)了倍擴(kuò)增的所有目標(biāo)HSC/HPC群體。
[0105] 通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的方法和組合物，已經(jīng)證明，生長(zhǎng)因子組合TSFI在5%和10%的 氧水平下增強(qiáng)了所有目標(biāo)群體的倍擴(kuò)增，因此其代表了用于增強(qiáng)來(lái)自臍帶血的可移植細(xì)胞 劑量的最所需的條件。
[0106] 本發(fā)明人還已經(jīng)確定，在使用上文所述的方法和組合物中，如果在生長(zhǎng)因子組合 如TS±F的存在下培養(yǎng)HSC和/或HPC，那么效果是提高了這些細(xì)胞的自我更新的概率并且 由此降低了分化的概率。
[0107] 在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，可以在生長(zhǎng)因子組合TS±F的存在下并且在環(huán)境 氧水平的存在下培養(yǎng)本發(fā)明的造血細(xì)胞，從而提供最大化的純度。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中， 在生長(zhǎng)因子組合TS±F的存在下，氧構(gòu)成所述培養(yǎng)氣氛的約20%。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方 式中，在約20%的氧水平下提供生長(zhǎng)因子組合TS±F，從而提供擴(kuò)增的同時(shí)最大化純度以 提高原始的⑶34+⑶38+HSC群體的純度。
[0108] 在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了培養(yǎng)HSC和/或HPC的方法，其中可以在低氧環(huán)境 中并組合試劑（如ficolin)與優(yōu)化的生長(zhǎng)因子TSFI培養(yǎng)所述HSC和/或HPC，從而提高它們 自我更新的概率并且降低分化的概率。在一個(gè)實(shí)施方式中，在生長(zhǎng)因子TSFI的存在下，培 養(yǎng)體系中的氧構(gòu)成所述培養(yǎng)氣氛的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、 12%、13%、14%和15%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在生長(zhǎng)因子TSFI的存在下，氧濃度構(gòu)成培 養(yǎng)氣氛的約10%。在又另一個(gè)實(shí)施方式中，在生長(zhǎng)因子TSFI的存在下，氧濃度構(gòu)成培養(yǎng)氣 氛的約10%。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，氧濃度構(gòu)成約5%。
[0109] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，除了生長(zhǎng)因子組合TSFI之外，還提供了 ficolin-1、 ficolin-2或ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物，其中氧濃度低于環(huán)境水平，并且更優(yōu)選 地低于約10%、低于約9%、低于約8%、低于約7%、低于約6%或低于約5%。
[0110] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，除了生長(zhǎng)因子組合TSFI之外，還提供了 ficolin-1、 ficolin-2或ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物，其中氧濃度為約5%。
[0111] 在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，除了生長(zhǎng)因子組合TSFI之外，還提供了 ficolin-ι或其 片段或功能等價(jià)物，其中氧濃度為約5%。
[0112] 6.以詵定的培養(yǎng)某用于培養(yǎng)HSC和/或HPC的鉬合物
[0113] 如前所討論的，與本發(fā)明的方法和組合物有關(guān)的特別領(lǐng)域感興趣的生長(zhǎng)因子是造 血生長(zhǎng)因子。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步方面，針對(duì)的是提供用于在體外延長(zhǎng)HPC和/或HSC群 體的成活力的培養(yǎng)組合物、或用于在常規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)或擴(kuò)增HSC和/或HPC群體的 培養(yǎng)組合物，所述培養(yǎng)組合物在本發(fā)明的方法中使用。
[0114] 在本發(fā)明的實(shí)施方式中，提供了組合物，其可以包括ficolin-1、ficolin-2或 ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物或組合。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將ficolin-1、 ficolin-2、ficolin-3、它們的片段或功能等價(jià)物或組合添加至培養(yǎng)體系中以便在培養(yǎng)基中 構(gòu)成 50ng/mL ?200ng/mL。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、它們的 片段或功能等價(jià)物或組合在培養(yǎng)體系中濃度為約50ng/mL?200ng/mL。在更優(yōu)選的實(shí)施方 式中，ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、它們的片段或功能等價(jià)物或組合在培養(yǎng)體系中的濃 度為約 50ng/mL ?100ng/mL。
[0115] 在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供在培養(yǎng)體系中的ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3、 它們的片段或功能等價(jià)物或組合的濃度為約50ng/mL、或約51ng/mL、或約52ng/mL、或 約 53ng/mL、或約 54ng/mL、或約 55ng/mL、或約 56ng/mL、或約 57ng/mL、或約 58ng/mL、或 約 59ng/mL、或約 60ng/mL、或約 61ng/mL、或約 62ng/mL、或約 63ng/mL、或約 64ng/mL、或 約 65ng/mL、或約 66ng/mL、或約 67ng/mL、或約 68ng/mL、或約 69ng/mL、或約 70ng/mL、或 約 71ng/mL、或約 72ng/mL、或約 73ng/mL、或約 74ng/mL、或約 75ng/mL、或約 76ng/mL、或 約 77ng/mL、或約 78ng/mL、或約 79ng/mL、或約 80ng/mL、或約 81ng/mL、或約 82ng/mL、或 約 83ng/mL、或約 84ng/mL、或約 85ng/mL、或約 86ng/mL、或約 87ng/mL、或約 88ng/mL、或 約 89ng/mL、或約 90ng/mL、或約 91ng/mL、或約 92ng/mL、或約 93ng/mL、或約 94ng/mL、或約 95ng/mL、或約 96ng/mL、或約 97ng/mL、或約 98ng/mL、或約 99ng/mL、或約 100ng/mL。
[0116] 在又一個(gè)實(shí)施方式中，可以額外的包括選自于包含白細(xì)胞介素3、白細(xì)胞介素6和 白細(xì)胞介素11(1)、干細(xì)胞因子（S)、血小板生成素（T)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生 長(zhǎng)因子和FLT-3配體（F)的群組中的生長(zhǎng)因子。
[0117] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，以50ng/mL?100ng/mL的濃度提供每種生長(zhǎng)因 子。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，以約50ng/mL提供T，以約50ng/mL提供S，以約80ng/mL提 供F，和以約100ng/mL提供I。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，當(dāng)培養(yǎng)在培養(yǎng)基中包含血小板生成素 (T)、干細(xì)胞因子（S)、FLT-3配體（F)和白細(xì)胞介素-6(1)時(shí)，使用生長(zhǎng)因子的組合與HPC 和/或HSC-起培養(yǎng)。
[0118] 7. #用詵定的培養(yǎng)某纟目成來(lái)HSC/HPC的方法
[0119] 在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了用于在體外培養(yǎng)HSC和/或HPC以生產(chǎn)造血源分 化細(xì)胞的方法，其中在第一培養(yǎng)步驟中，在條件環(huán)境下將第一量的造血祖細(xì)胞擴(kuò)增一段時(shí) 間，從而相對(duì)于所述第一量增加經(jīng)培養(yǎng)的造血祖細(xì)胞的數(shù)量或者增加造血祖細(xì)胞的數(shù)量， 由此產(chǎn)生第二量的造血祖細(xì)胞。增加經(jīng)培養(yǎng)的造血祖細(xì)胞的數(shù)量所需的時(shí)間可以由本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的測(cè)量方法來(lái)確定，例如測(cè)量培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量、光密度或PH，或通過(guò)計(jì)算細(xì) 胞的倍增時(shí)間。
[0120] 在第二培養(yǎng)步驟中，將所述第二量的經(jīng)培養(yǎng)的造血細(xì)胞（如造血祖細(xì)胞）的至少 一部分培養(yǎng)于包括從由上述造血生長(zhǎng)因子所構(gòu)成的群組中選出的至少一種試劑、接種的基 質(zhì)細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的環(huán)境中，從而生產(chǎn)造血源分化細(xì)胞，所述造血生長(zhǎng)因子促 進(jìn)造血細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化。
[0121] 在本發(fā)明的方法的應(yīng)用中，所述培養(yǎng)可以進(jìn)一步包含可以是多個(gè)第二培養(yǎng)步驟的 第二培養(yǎng)步驟，它們中的每一個(gè)包含僅培養(yǎng)第二量的造血細(xì)胞（如HPC)的一部分。
[0122] 在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，將造血祖細(xì)胞連續(xù)地培養(yǎng)延長(zhǎng)的一段時(shí)間，并且隔開(kāi)的 時(shí)間點(diǎn)或間歇性地采收培養(yǎng)細(xì)胞的等分試樣。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，將細(xì)胞懸浮于含有 生長(zhǎng)因子和本文所述的其它試劑的培養(yǎng)基中，并且通過(guò)攪拌和離心所述培養(yǎng)基來(lái)采收所述 細(xì)胞。因此，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可以擴(kuò)增造血祖細(xì)胞的數(shù)量，并且同時(shí)地采收正在擴(kuò) 增的這些細(xì)胞的一部分以用于治療，從而發(fā)育出甚至更大群體的分化細(xì)胞。
[0123] 認(rèn)為本發(fā)明集合了造血利基的許多不同方面，包括生長(zhǎng)因子的類型及濃度的優(yōu)化 以最大化造血自我更新、其它新穎和已知因子的添加和培養(yǎng)條件及體系的優(yōu)化。這些方面 的總和代表了一種新穎且有效的體系，其用于增加能夠再植組織和器官（如移植后的骨 髓）的HSC的數(shù)量。
[0124] 與天然產(chǎn)生的細(xì)胞群體相比，使用本發(fā)明的方法提供了分離的細(xì)胞群體具有富集 群體的細(xì)胞。典型地，所述細(xì)胞群體是HSC或HPC細(xì)胞群體，其選擇性地富集自生物源。所 述細(xì)胞群體可以包含富集群體的HSC和/或HPC⑶34+⑶38-或⑶133+⑶38-細(xì)胞。
[0125] 8. #用根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的HSC和/或HPC以用于移棺或治療
[0126] 在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的造血細(xì)胞可以用于受試者的骨 髓移植。
[0127] 根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)的造血細(xì)胞的潛在應(yīng)用，可以設(shè)想用于補(bǔ)充或替代目前用 作疾?。ㄈ绨籽　⒘馨土鲆约捌渌＜吧募膊。┑寞煼ǖ娜祟愖泽w和異體骨髓移植。
[0128] 在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了治療需要基于造血干細(xì)胞的治療的個(gè)體的方法， 其包含：從所述個(gè)體或從供體取出造血干細(xì)胞；在含有一定量本文所考慮的生長(zhǎng)因子組 合、有效于促進(jìn)造血干細(xì)胞的擴(kuò)增的蛋白質(zhì)（如任何前述的ficolin蛋白質(zhì)）的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)所述細(xì)胞；采收經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞；以及將該經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞移植至所述個(gè)體中。
[0129] 例如，在受試者接受化療、放射治療或骨髓移植之前、同時(shí)或之后將由本發(fā)明的方 法生產(chǎn)的HSC供給給該受試者。所述受試者任選地已耗盡骨髓，例如涉及以骨髓損失或貧 骨髓為特征的先天性、遺傳性或獲得性綜合癥。因此，所述受試者任選地為需要造血的受試 者。任選地，所述受試者是骨髓供體或是患有或具有耗盡骨髓風(fēng)險(xiǎn)的受試者。
[0130] 采用本發(fā)明的方法和條件，能夠增加培養(yǎng)HPC的時(shí)間段并且刺激HPC數(shù)量的擴(kuò)增 和/或菌落形成單位的潛能。在一個(gè)實(shí)施方式中，認(rèn)為一旦擴(kuò)增，即可將所述細(xì)胞例如返回 至體內(nèi)補(bǔ)充或增補(bǔ)患者的造血祖細(xì)胞群。在個(gè)體已經(jīng)經(jīng)歷化療一段時(shí)間之后的情況下，這 可能是有利的。另外，有一些遺傳性疾病如地中海貧血、鐮狀細(xì)胞性貧血、先天性角化不良、 Shwachman-Diamond綜合征和Diamond-Blackfan貧血癥，其中HPC數(shù)量被減少，那么本發(fā)明 的擴(kuò)增HSC和/或HPC數(shù)量的方法可能是有用的且適用的。
[0131] 現(xiàn)在將通過(guò)參考以下非限制性的實(shí)施例來(lái)更全面地說(shuō)明本發(fā)明。
[0132] 實(shí)施例
[0133] 實(shí)施例1
[0134] CD34+細(xì)胞富集
[0135] 根據(jù)巴望健康人類研究倫理委員會(huì)（Barwon Health Human Research Ethics Committee) (97/14和SJ0G139)和迪肯大學(xué)人類研究倫理委員會(huì)（Deakin University Human Research Ethic Committee) (EC72-2009)的批準(zhǔn)，在所有參與者都提供了書(shū)面知 情同意書(shū)的條件下，在 Barwon Health, Geelong Hospital 和 St. John of God Hospital Geelong, Australia采集了足月分娩的臍帶血。
[0136] 在采集的24小時(shí)內(nèi)，通過(guò)Ficoll-paque Plus (GE Healthcare)密度梯度離心獲 得了單核細(xì)胞，隨后使用直接抗體標(biāo)記的磁珠試劑盒和雙柱（Miltenyi Biotec)進(jìn)行CD34+ 細(xì)胞富集。使用細(xì)胞等分試樣進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，且剩余的冷凍保存在復(fù)蘇冷凍培養(yǎng)基 (Recovery Freezing Media) (Invitrogen)中。
[0137] 為了確定培養(yǎng)條件對(duì)HSC的影響，使用臍帶血富集⑶34+細(xì)胞，以得到最小> 80% CD34+的純度和成活力以進(jìn)行擴(kuò)增研究。以三種方式來(lái)評(píng)估培養(yǎng)的造血細(xì)胞群體的變體： 1)表型，通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)檢測(cè)表面標(biāo)志物；2)功能，使用CFU測(cè)定；和3)基因組，通過(guò)實(shí)時(shí) PCR(圖4)。將培養(yǎng)后的目標(biāo)群體的純度或集落生成、目標(biāo)群體數(shù)量的倍擴(kuò)增和相對(duì)基因表 達(dá)作為終點(diǎn)（圖5)。
[0138] 體外擴(kuò)增
[0139] 在37°C下將冷凍保存的細(xì)胞解凍，轉(zhuǎn)移滴加至10x體積的干細(xì)胞系II培養(yǎng) 基（Stemline II media) (Sigma Aldrich)中，在室溫下在400相對(duì)離心力（ref)下離 心10分鐘，并且重懸于杜氏磷酸緩沖鹽水（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) (D-PBS, Invitrogen)中以使用臺(tái)盼藍(lán)染色劑（Trypan Blue stain) (Sigma Aldrich)進(jìn)行 手動(dòng)活力細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0140] 在涂布有10 μ g/ml RetroNectin (重組人纖維連接蛋白片段，Scientifix)的組 織培養(yǎng)孔（Interpath)中培養(yǎng)CD34+富集的細(xì)胞，并且以0. 5xl04活細(xì)胞每1. lcm2接種在 lml干細(xì)胞系II培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基中補(bǔ)充有人重組生長(zhǎng)因子（Millipore):血小板生成 素（T，50ng/ml) 土干細(xì)胞因子（S，50ng/ml) 土Flt-3 配體（F，80ng/ml) 土白細(xì)胞介素-6(1， 100ng/ml) (T、TS、TSF、TSFI)，與血小板生成素+干細(xì)胞因子+粒細(xì)胞集落刺激因子（TSG) (各100ng/ml，干細(xì)胞系II制造商的建議）進(jìn)行比較。在與外周血（10%，?75mmHg)、臍 帶血（5 %,?38mmHg)和骨髓（2. 5 %,?19mmHg) (Galaxy R+incubators，HD Scientific) 一致的生理相關(guān)的氧水平下培養(yǎng)細(xì)胞，并且與環(huán)境氧水平（20%，?150mmHg) (Heraeus incubator, KI Scientific)進(jìn)行比較，得到總共20個(gè)獨(dú)立的條件。
[0141] 對(duì)于單步擴(kuò)增，在采收前將細(xì)胞培養(yǎng)8周，而對(duì)于串行擴(kuò)增，分別在培養(yǎng)1周和2 周后，以每1. Icm22xl04個(gè)活細(xì)胞、再以1. Icm23xl04個(gè)活細(xì)胞進(jìn)行重新接種。通過(guò)移液操作 和D-PBS洗滌來(lái)采收細(xì)胞，隨后使用臺(tái)盼藍(lán)染色劑進(jìn)行成活力計(jì)數(shù)。
[0142] 使用階梯式添加的生活因子T、TS、TSF、TSFI來(lái)培養(yǎng)富集的⑶34+細(xì)胞，并且與FDA 批準(zhǔn)的HSC擴(kuò)增培養(yǎng)基（干細(xì)胞系II)的制造商推薦的-TSG進(jìn)行比較，并且對(duì)于所有的 組合，在生理相關(guān)的氧水平2. 5%、5%和10%以及環(huán)境（20%)中培養(yǎng)細(xì)胞。
[0143] 通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)測(cè)定表型來(lái)確定目標(biāo)群體的純度。在本研究中，7AAD存活率 的平均培養(yǎng)前的數(shù)值為85±5%，且⑶45+⑶34+、⑶133+和⑶34+⑶38-的純度分別為 81±5%、61±8%和2.8±0. 1% (數(shù)據(jù)未示出）。對(duì)于培養(yǎng)后的群體，與所有其它生長(zhǎng)因 子組合（>81±3%，p < 0.01)相比，使用單獨(dú)的血小板生成素的整個(gè)氧氣組的存活率都 較低（T，60±6% )(圖1)。⑶45+⑶34+的純度為24±2%，且⑶34+⑶38-細(xì)胞的純度為 2. 2±0. 4%。但是，來(lái)自單獨(dú)的T條件的細(xì)胞不足以用于進(jìn)一步分析。添加的干細(xì)胞因子 (S)未導(dǎo)致⑶45+⑶34+純度的變化，但是將⑶34+⑶38-的百分比（4· 8±0· 6%，p彡0· 01) 提高到了高于培養(yǎng)前的水平。通過(guò)添加 Flt-3配體（F)未觀察到純度的顯著差異。添加 白細(xì)胞介素-6(1)對(duì)⑶133+純度沒(méi)有影響（12±1% )，但是與TS或TSF相比，導(dǎo)致了 ⑶45+⑶34+和⑶34+⑶38-細(xì)胞的純度的損失。使用了 TSG的所有目標(biāo)群體的純度是最低 的（p< 0.01)。有趣的是，觀察到了氧效應(yīng)，20%的氧在所有的目標(biāo)群體中得到了最大的純 度（P 彡 0.01)(圖 1)。
[0144] 倍擴(kuò)增的檢查顯示，在5%和10%氧中增加了活細(xì)胞的數(shù)量，并且當(dāng)在環(huán)境 (20% )氧中培養(yǎng)時(shí)擴(kuò)增最低。在5%氧中還增強(qiáng)了 CFU-GM的倍擴(kuò)增，并且在5%和10%氧 中增強(qiáng)了總爆式/集落形成單位的擴(kuò)增。另外，在該研究中，在2. 5%氧中觀察到的中等水 平的倍擴(kuò)增與體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)一致。
[0145] 通丄寸流,式細(xì)胞計(jì)的表型分析
[0146] 通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)（FACSCalibur, Becton Dickinson)測(cè)定了培養(yǎng)前和培養(yǎng) 后的目標(biāo)細(xì)胞純度，對(duì)于HSC、HPC和多能細(xì)胞（CD133-PE Miltenyi Biotec)采用 CD45-FITC+CD34-PE+7AAD、CD34-FITC+CD133-PE+7AAD 和 CD38-FITC+CD34-PE+7AAD ; 且對(duì)于譜系定型細(xì)胞采用：CD61-FITC+CD34-PE+7AAD、CDllb-FITC+CD14-PE+7AAD、 CD3-FITC+CD19+7AAD(CDllb-FITC Beckman Coulter ;其它為 BD Biosciences)(圖 4)。使 用Miltenyi Biotec改變的ISHAGE協(xié)議測(cè)定了活性CD45+CD34+群體，并且根據(jù)公布的建議 確定了⑶34+CD38?選通。用于擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的富集了⑶34+的樣品具有大于80% 7AAD成活力 和⑶34+純度。
[0147] 通討集落形成單位（CFU)測(cè)定講行功能分析
[0148] 按照制造商的說(shuō)明，將培養(yǎng)前和培養(yǎng)后的細(xì)胞接種于具有重組細(xì)胞因子（H4434 ; STEMCELL Technologies)的'完全'甲基纖維素培養(yǎng)基中，并且培育14天以用于爆式形成 單位-紅細(xì)胞（BFU-E)、集落形成單位-粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（CFU-GM)、集落形成單位-粒細(xì) 胞/紅細(xì)胞/單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（CFU-GEMM)和總爆式/集落形成單位的計(jì)數(shù)（圖4)。
[0149] 通過(guò)每1，000細(xì)胞的集落形成單位的數(shù)量來(lái)確定集落生成。BFU-E和CFU-GM的 培養(yǎng)前的數(shù)值為71±5和74±5, CFU-GEMM為13±2且總爆式/集落形成單位為158±5 每1，000細(xì)胞（數(shù)據(jù)未示出）。培養(yǎng)后評(píng)估顯示，TS產(chǎn)生了最高數(shù)量的BFU-E、CFU-GM、 CFU-GEMM和總爆式/集落形成單位（44 ± 5、31 ± 3、4. 8 ± 0. 5和80 ± 6集落每1，000細(xì)胞）。 TSF導(dǎo)致了較低集落生成的BFU-E、CFU-GEMM和總爆式/集落形成單位，使用TSFI進(jìn)一步降 低了 BFU-E和總爆式/集落形成單位。對(duì)于BFU-E和總爆式/集落形成單位，使用TSG的 培養(yǎng)得到了與TSFI相當(dāng)?shù)臄?shù)值，但是CFU-GEMM的數(shù)量甚至更低（p < 0. 01)(圖1)。
[0150] 在所有的群體中，使用TS±F獲得了最大的培養(yǎng)后純度和集落生成。特別令人感 興趣的是，使用TS將CD34+CD38-細(xì)胞的純度提高到了比培養(yǎng)前水平更高的水平。在表型 和功能上，在TSG的存在下，目標(biāo)群體的純度最低。另外，觀察到了氧效應(yīng)，在環(huán)境水平下提 1? 了目標(biāo)群體的純度，但是未提1?集落生成。
[0151] RNA、cDNA 和實(shí)時(shí)-PCR
[0152] 將培養(yǎng)前和培養(yǎng)后的樣品儲(chǔ)存在Trizol (Invitrogen)中直至使用RNAspin 微型RNA分離試劑盒（Illustra)分離RNA，并且使用NanoDrop分光光度計(jì)（Thermo Scientific)進(jìn)行定量分析。以Superscript III第一鏈合成試劑盒（Invitrogen)使用 隨機(jī)六聚體進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用7500FAST實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems)進(jìn)行實(shí) 時(shí) PCR。將 SybrGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems)用于對(duì)應(yīng)于 HoxB4(正 向：5, -CCTGGATGCGCAAAGTTCA-3，- SEQ ID:7，反向：5, -GCTTGGGCTCCCCGC-3，-SEQ ID:8)和 Nf-y α (正向：5' -GATGGTCATGATGGTTCCTG-3' - SEQ ID:9，反向： 5, -GGTATTGTTTGGCATTCACG-3' - SEQ ID:10)(Sigma Genosys)的引物對(duì)。 將 Taqman PCR Master Mix (Applied Biosystems)用于 CD34 預(yù)優(yōu)化的基因表達(dá)分 析（Hs00156373_ml ;Applied Biosystems),并用于管家基因 β肌動(dòng)蛋白（正向： 5，-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3' - SEQ ID:11， SEQID:12，探針：fam-ATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC-tamra-SEQID:13)和GAPDH(正 向：5，-CCACATCGCTCAGACACCAT-3， -SEQ ID:14，反向：5，-CCAGGCGCCCAATACG-3' -SEQ ID: 15,探針：fam-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTG-tamra - SEQ ID: 16) (Sigma Genosys)。
[0153] 在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，相對(duì)于所述兩種管家基因的平均值，對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量 (圖5)。相對(duì)于在10%氧中的TSFI，確定了串行擴(kuò)增過(guò)程中的基因表達(dá)。結(jié)果表示為平均 值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。采用軟件程序Minitab (版本15)圖基比較（Tukey' s comparison)進(jìn)行 了單向方差分析（one-way AN0VA)，顯著性水平p < 0· 05。
[0154] 鈍度和倍擴(kuò)增的測(cè)定
[0155] 對(duì)單步擴(kuò)增的培養(yǎng)前和培養(yǎng)后進(jìn)行了細(xì)胞評(píng)估，并且在串行擴(kuò)增過(guò)程中每周一 次。使用培養(yǎng)前和培養(yǎng)后的目標(biāo)群體純度和集落形成單位的集落生成來(lái)確定細(xì)胞群體比例 的整體變化（圖5)。
[0156] 倍擴(kuò)增反映了在培養(yǎng)后的目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量的增加。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將活細(xì)胞數(shù)乘以 特定目標(biāo)細(xì)胞群體的純度或集落生成，由此得出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量。將培養(yǎng)前和 培養(yǎng)后的這些數(shù)量進(jìn)行比較以確定這些細(xì)胞群體的倍擴(kuò)增。累積倍擴(kuò)增指示了目標(biāo)群體數(shù) 量在連接幾周的倍擴(kuò)增。
[0157] 結(jié)果表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。通過(guò)圖基的成對(duì)比較（Tukey' s pairwise comparison)采用一般線性模型的統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行了雙向方差分析（two-way ANOVA)，顯著性 水平 P < 05。
[0158] 臨床h有效的提高了倍擴(kuò)增的HSC、HPC和多能細(xì)朐
[0159] 主要的臨床興趣是倍擴(kuò)增的細(xì)胞群體，其代表了增加的移植細(xì)胞劑量。單獨(dú) 的血小板生成素⑴不足以確保臨床上有效的擴(kuò)增，其僅使活細(xì)胞數(shù)量增加了一倍 (2. 0±0. 3)，未改變⑶45+⑶34+細(xì)胞數(shù)量，并且僅使⑶34+⑶38-細(xì)胞數(shù)量增加了一倍 (2.6±0.8)(圖2)。沒(méi)有充足的細(xì)胞用于分析CD133+細(xì)胞或CFU分析。添加干細(xì)胞因子 ⑶將活細(xì)胞的擴(kuò)增提高至25±4倍，相應(yīng)地增加了所有的目標(biāo)群體。使用添加的Flt-3配 體（F)觀察到了最小的增強(qiáng)。但是，在培養(yǎng)基中包含白細(xì)胞介素-6(1)極大地提高了活細(xì) 胞的倍擴(kuò)增（99±7倍）和所有目標(biāo)群體（p < 0. 01)(圖2)。具體地，⑶45+⑶34+、⑶133+ 和⑶34+⑶38-細(xì)胞數(shù)量分別被擴(kuò)增了 21 ± 3、19 ± 2和78 ± 10倍。TSG導(dǎo)致了類似的活細(xì) 胞的擴(kuò)增，但是不是目標(biāo)HSC和HPC群體；表現(xiàn)出更大程度的分化，主要是沿向粒細(xì)胞譜系 (數(shù)據(jù)未示出）。觀察到了活細(xì)胞倍擴(kuò)增的溫和的氧效應(yīng)，在5%和10%氧中整體上增加， 且在20%氧中最低（p < 0. 04)。
[0160] 使用CFU分析功能性地測(cè)定了多能細(xì)胞的倍擴(kuò)增。生長(zhǎng)因子組合或氧水平對(duì) BFU-E的倍擴(kuò)增沒(méi)有影響（18±1. 2倍）（圖2)。但是，與所有生長(zhǎng)因子組合相比，TSFI 極大地增強(qiáng)了 CFU-GM和總爆式/集落形成單位的擴(kuò)增（27±3和22±3倍），并且與 TSG(7±l，p彡0. 01)相比，增強(qiáng)了 CFU-GEMM的擴(kuò)增（17±3)。另夕卜，5%氧增強(qiáng)了 CFU-GM 的倍擴(kuò)增（< 〇. 02)，并且在5%和10%氧中培養(yǎng)增強(qiáng)了總爆式/集落形成單位的擴(kuò)增，而 20%氧導(dǎo)致了這兩種集落類型的較低的擴(kuò)增（p< 0.01)。與純度數(shù)據(jù)對(duì)比起來(lái)，來(lái)自倍擴(kuò) 增的兩個(gè)表型和功能分析的結(jié)構(gòu)表明，TSFI得到了最佳擴(kuò)增的HSC、HPC和多能細(xì)胞，最佳 的氧水平為5 %和10%。
[0161] 通討多個(gè)臍帶血單位駘證一致的增強(qiáng)的擴(kuò)增
[0162] 為了確定的優(yōu)化條件的臨床有效性，在10個(gè)獨(dú)立的臍帶血單位中評(píng)估了倍擴(kuò)增， 在5%和10%氧中使用TSFI對(duì)每一個(gè)進(jìn)行培養(yǎng)。所有群體的平均值圖1和圖2中所列的 數(shù)據(jù)一致，87±13倍擴(kuò)增的活細(xì)胞，分別為19±3、17±5和73±15倍擴(kuò)增的⑶45+⑶34+、 CD133+和CD34+CD38-細(xì)胞。集落生成群體的平均擴(kuò)增（BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM、總爆式 /集落形成單位）在25±5至36±6之間（表1)。雖然通過(guò)多個(gè)目標(biāo)群體看到了一系列數(shù) 值，在5%和10%氧中的TSFI的優(yōu)化的條件在所有樣本中導(dǎo)致了所有群體的擴(kuò)增，由此在 多個(gè)臍帶血單位中表現(xiàn)出了穩(wěn)健的效果（表1)。
[0163]

【權(quán)利要求】
1. 一種延長(zhǎng)HPC和/或HSC群體的體外成活力、或者培養(yǎng)或擴(kuò)增HPC和/或HSC群體 的方法，所述方法包括在ficolin-1、ficolin-2、ficolin-3或它們的片段或功能等價(jià)物中的 至少一種的存在下培養(yǎng)所述HPC和/或HSC群體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述HPC和/或HSC的更新能力和/或多能性被 維持或提1?。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中進(jìn)一步在氧氣濃度低于正常環(huán)境氧 濃度的環(huán)境中培養(yǎng)所述HSC和/或HPC。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其中在約50ng/ml?200ng/ml范圍濃度 的至少一種ficolin-l、ficolin-2、ficolin-3及它們的片段或功能等價(jià)物的存在下培養(yǎng)所述 HSC 和 / 或 HPC。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在ficolin-Ι或其片段或功能等價(jià)物的存在下培養(yǎng) 所述HSC和/或HPC。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3?5中任一項(xiàng)所述的方法，其中氧的濃度低于約20%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3?6中任一項(xiàng)所述的方法，其中氧的濃度低于約12%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3?7中任一項(xiàng)所述的方法，其中氧的濃度為約5%?10%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3?8中任一項(xiàng)所述的方法，其中氧的濃度為約5%。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1?9中任一項(xiàng)所述的方法，其中在從包含白細(xì)胞介素3、白細(xì)胞介 素6和白細(xì)胞介素11、干細(xì)胞因子、干細(xì)胞配體、FLT-3配體和血小板生成素的群組中選出 的生長(zhǎng)因子的存在下培養(yǎng)所述HSC和/或HPC。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1?10中任一項(xiàng)所述的方法，其中在生長(zhǎng)因子血小板生成素、干細(xì)胞 因子、Flt-3配體和白細(xì)胞介素6的存在下培養(yǎng)所述HSC和/或HPC。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所的方法，其中以約50ng/mL?100ng/mL的濃度 提供所述生長(zhǎng)因子。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中以約50ng/mL提供血小板生成素，以約50ng/mL 提供干細(xì)胞因子，以約80ng/mL提供Flt-3配體且以約100ng/mL提供白細(xì)胞介素6。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1?13中任一項(xiàng)所述的方法，其中培養(yǎng)所述HPC以相對(duì)于初始的HPC 數(shù)量增加 HPC的數(shù)量以生產(chǎn)第二量的HPC。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中將所述第二量的HPC分離并且進(jìn)一步培養(yǎng)于單 獨(dú)的培養(yǎng)基中。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述單獨(dú)的培養(yǎng)基含有從包含白細(xì)胞介素3、白 細(xì)胞介素6和白細(xì)胞介素11、干細(xì)胞因子、干細(xì)胞配體、FLT-3配體和血小板生成素的群組 中選出的生長(zhǎng)因子，所述生長(zhǎng)因子促進(jìn)HPC的維持、擴(kuò)增和/或分化，從而生產(chǎn)造血源分化 細(xì)胞。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包括接種的基質(zhì)細(xì)胞和/或?yàn)榛|(zhì) 細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1?17中任一項(xiàng)所述的方法，其中在HPC和/或HSC的擴(kuò)增和/或 分化之前，將HPC培養(yǎng)6?8周的時(shí)間。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1?18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述HSC獲自于從包含未分級(jí)的 骨髓、臍帶、外周血、肝臟、胸腺、淋巴和脾臟的群組中選出的血液制品。
20. -種用于延長(zhǎng)培養(yǎng)物中的HSC和/或HPC的體外成活力的培養(yǎng)基，其包括從包含 白細(xì)胞介素3、白細(xì)胞介素6和白細(xì)胞介素11、干細(xì)胞因子、干細(xì)胞配體、FLT-3配體和血小 板生成素的群組中選出的造血生長(zhǎng)因子以及至少一種用于增強(qiáng)HSC或HPC的自我更新和/ 或抑制HSC或HPC的分化的試劑。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的培養(yǎng)基，其中所述試劑選自于由ficolin-1、ficolin-2、 ficolin-3、和它們的片段或功能等價(jià)物所構(gòu)成的群組。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的培養(yǎng)基，其中所述ficolin-l、ficolin-2、ficolin-3、或它們 的片段或功能等價(jià)物以約50ng/ml?200ng/ml范圍的濃度存在。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的培養(yǎng)基，其中所述至少一種試劑是ficolin-Ι或其片段或功 能等價(jià)物。
24. -種細(xì)胞群體，其衍生自根據(jù)權(quán)利要求1?19中任一項(xiàng)所述的方法培養(yǎng)的HSC和 / 或 HPC。
25. -種細(xì)胞群體，其衍生自使用權(quán)利要求20?23中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)的HSC 和/或HPC。
26. 衍生自使用權(quán)利要求20?23中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基并根據(jù)權(quán)利要求1?19中任 一項(xiàng)所述的方法培養(yǎng)的HSC和/或HPC的細(xì)胞群體。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24?26中任一項(xiàng)所述的衍生自HSC和/或HPC的細(xì)胞群體，其中所 述衍生的細(xì)胞是擴(kuò)增的HSC和/或HPC細(xì)胞。
28. 根據(jù)權(quán)利要求24?26中任一項(xiàng)所述的衍生自HSC和/或HPC的細(xì)胞群體，其中所 述細(xì)胞是⑶34+細(xì)胞、⑶34+⑶133+細(xì)胞和⑶34+⑶38-細(xì)胞。
29. 根據(jù)權(quán)利要求24?28中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群體，其中所述細(xì)胞可以配制用于臨床 造血干細(xì)胞移植或用于在有需求的受試者中增強(qiáng)造血功能。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的細(xì)胞群體，其中所述受試者是人類。
31. -種治療與缺乏造血功能相關(guān)的病癥的方法，包含向有需要的受試者給藥治療有 效量的根據(jù)權(quán)利24?28中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群體。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述受試者是哺乳動(dòng)物。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類。
34. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其基本上相同于上文參照任何實(shí)施例和/或附圖的描 述。
35. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的培養(yǎng)基，其基本上相同于上文參照任何實(shí)施例和/或附圖 的描述。
【文檔編號(hào)】C12N5/0789GK104114694SQ201280052478
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月22日
【發(fā)明者】梅琳達(dá)·L·圖斯凱, 馬克·A·柯克蘭 申請(qǐng)人:細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)私人有限公司