用于操作生物分子的方法
【專利摘要】在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了用于產(chǎn)生核酸片段群體的組合物、系統(tǒng)、方法和試劑盒。在一些實(shí)施方案中，群體中的至少一個(gè)核酸片段是未被標(biāo)記的。在一些實(shí)施方案中，可將核酸酶促片段化。例如，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括核酸切口產(chǎn)生反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可包括切口平移反應(yīng)。切口產(chǎn)生反應(yīng)可在雙鏈核酸的任一條鏈上的隨機(jī)位置處引入切口。切口平移反應(yīng)可將切口位置移至新的位置，以便兩個(gè)切口的新位置是對(duì)齊的，以產(chǎn)生雙鏈斷裂。切口平移反應(yīng)可利用未標(biāo)記的核苷酸來進(jìn)行，以產(chǎn)生未標(biāo)記的核酸片段群體。在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括，將片段化的核酸的至少一個(gè)末端連接至一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸接頭。在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括，將核酸與核酸結(jié)合蛋白結(jié)合。
【專利說明】用于操作生物分子的方法
[0001]本申請(qǐng)要求2011年5月27日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/490，982，2011年9月15日提交的61/535，281，2011年12月22日提交的61/579，109和2012年2月21日提交的61/601，148的申請(qǐng)日權(quán)益。
[0002]在整個(gè)本申請(qǐng)中，參考了各種出版物，專利和/或?qū)＠暾?qǐng)。這些出版物、專利和/或?qū)＠暾?qǐng)的公開內(nèi)容通過引用整體并入本申請(qǐng)，以更詳細(xì)地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)水平狀態(tài)。
[0003]領(lǐng)域
[0004]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了用于操作雙鏈核酸以產(chǎn)生核酸片段群體的方法。
[0005]引言
[0006]核酸操作通?？砂ㄆ位襟E。核酸片段可用于多種過程和方法，包括用于制備用于測序的核酸。核酸片段的測序常見于毛細(xì)管電泳的、基于雜交的、基于連接的以及邊合成堿基邊測序(sequence-by-synthesis-bases)的測序方法中。片段化樣品核酸可用于新一代測序方法，其中可同時(shí)平行地對(duì)大量相對(duì)小的核酸片段進(jìn)行測序。用于新一代測序法的許多樣品和文庫制備法包括片段化步驟作為流程的一部分。
[0007]概述
[0008]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了用于產(chǎn)生核酸片段群體的組合物、系統(tǒng)、方法及試劑盒。
[0009]在一些實(shí)施方案中 ，本公開內(nèi)容提供了用于將至少一個(gè)雙鏈斷裂引入樣品核酸的組合物、系統(tǒng)、方法和試劑盒。
[0010]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了用于產(chǎn)生雙鏈斷裂，從而導(dǎo)致形成至少兩個(gè)來源于原始雙鏈樣品核酸的核酸片段的組合物、系統(tǒng)、方法和試劑盒。
[0011]在一些實(shí)施方案中，樣品核酸可包括單鏈或雙鏈核酸。
[0012]任選地,所述方法包括,將樣品核酸經(jīng)歷產(chǎn)生切口(nicking)的條件。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生切口的條件包括，將一個(gè)或多個(gè)切口引入樣品核酸。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生切口的條件包括，向雙鏈樣品核酸的每一條鏈上引入至少一個(gè)切口。在一些實(shí)施方案中，將切口引入樣品核酸的隨機(jī)位置。
[0013]任選地,所述方法包括,將樣品核酸經(jīng)歷切口平移(nick translating)條件。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括平移至少一個(gè)切口。在一些實(shí)施方案中，切口遷移條件包括，在雙鏈樣品核酸的每一條鏈上平移至少一個(gè)切口。在一些實(shí)施方案中，切口平移條件包括彼此相向地平移位于相反核酸鏈上的至少兩個(gè)切口。在一些實(shí)施方案中，切口平移條件包括將一條鏈上的第一切口的位置平移至可與相反鏈中的第二切口、斷裂或其它缺口對(duì)齊的新位置。在一些實(shí)施方案中，切口、斷裂或缺口的對(duì)齊可在樣品核酸中導(dǎo)致雙鏈斷裂或片段化位點(diǎn)。
[0014]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:使核酸產(chǎn)生切口 ；和切口平移所述切口。[0015]任選地，切口平移條件可包括標(biāo)記或未標(biāo)記的核苷酸或兩者的混合物。在一些實(shí)施方案中，利用未標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行的切口平移條件產(chǎn)生未標(biāo)記的核酸片段群體。
[0016]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括將至少一個(gè)雙鏈斷裂引入樣品核酸以產(chǎn)生未標(biāo)記的核酸片段群體。
[0017]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:在每一條鏈上使核酸產(chǎn)生切口至少一次；和切口平移所述切口，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂，以產(chǎn)生核酸片段。
[0018]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:通過下列來在樣品核酸中引入雙鏈斷裂(裂口):在每一條鏈上使核酸樣品產(chǎn)生切口至少一次；和切口平移所述切口從而產(chǎn)生雙鏈斷裂，以產(chǎn)生核酸片段。
[0019]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:提供具有第一條鏈和第二條鏈的雙鏈核酸；使第一條鏈和第二條鏈產(chǎn)生切口。任選地可使第一條鏈產(chǎn)生切口至少一次以產(chǎn)生第一切口，可使第二條鏈產(chǎn)生切口至少一次以產(chǎn)生第二切口。任選地，所述方法還包括彼此相向地切口平移第一切口和第二切口，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂以產(chǎn)生核酸片段。
[0020]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:在雙鏈核酸的每一條鏈上引入一個(gè)或多個(gè)切口。任選地，所述方法包括，通過沿著它們各自的鏈移動(dòng)至少兩個(gè)切口的位置來產(chǎn)生至少一個(gè)雙鏈斷裂，從而將雙鏈核酸切割成至少兩個(gè)核酸片段。
[0021]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:將兩個(gè)或更多個(gè)不同的雙鏈核酸經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件，從而形成至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸。在一些實(shí)施方案中，至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸的每一個(gè)在每一條鏈中包括至少一個(gè)切口。任選地，所述方法包括平移每一條鏈中的至少一個(gè)切口以對(duì)齊相反鏈上的切口。在一些實(shí)施方案中，平移包括將至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸經(jīng)歷切口平移條件。
[0022]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片`段群體的方法包括:將兩個(gè)或更多個(gè)不同的雙鏈核酸經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件，從而形成至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸。在一些實(shí)施方案中，兩個(gè)或更多個(gè)不同的雙鏈核酸中的每一個(gè)在每一條鏈中包含至少一個(gè)切口。任選地，所述方法包括切割至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸，其中切割包括在至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸的每一個(gè)中產(chǎn)生至少一個(gè)雙鏈斷裂。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生包括切口平移每一條鏈中的至少一個(gè)切口，從而產(chǎn)生核酸片段群體。
[0023]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:將至少兩個(gè)不同的雙鏈核酸分子切割成核酸片段。在一些實(shí)施方案中，切割包括，通過將至少兩個(gè)不同的雙鏈核酸分子經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件，來將至少一個(gè)切口引入至少兩個(gè)不同的雙鏈核酸分子的每一條鏈，從而形成帶切口的雙鏈核酸分子。任選地，所述方法包括，通過切口平移帶切口的雙鏈核酸分子的第一條鏈中的一個(gè)或多個(gè)切口以及第二條鏈中的一個(gè)或多個(gè)切口直至相反鏈上的至少兩個(gè)切口對(duì)齊，來在帶切口的雙鏈核酸分子中產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)雙鏈斷裂。
[0024]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:將兩個(gè)或更多個(gè)不同的雙鏈核酸經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件，從而形成至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸，每一個(gè)雙鏈核酸在每一條鏈上包括至少一個(gè)切口 ；切割至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸，其中切割包括在至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸的每一個(gè)中產(chǎn)生至少一個(gè)雙鏈斷裂，其中產(chǎn)生包括切口平移每一條鏈中的至少一個(gè)切口，從而產(chǎn)生核酸片段群體。
[0025]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:將至少兩個(gè)不同的雙鏈核酸分子切割成核酸片段，其中切割包括通過將至少兩個(gè)不同的雙鏈核酸分子經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件來將至少一個(gè)切口引入至少兩個(gè)不同的雙鏈核酸分子的每一條鏈，從而形成帶切口的雙鏈核酸分子；和通過切口平移帶切口的雙鏈核酸分子的第一條鏈中的一個(gè)或多個(gè)切口以及第二條鏈中的一個(gè)或多個(gè)切口直至相反鏈上的至少兩個(gè)切口對(duì)齊，來在帶切口的雙鏈核酸分子中產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)雙鏈斷裂。
[0026]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括調(diào)整產(chǎn)生切口的條件，以調(diào)整核酸片段的平均大小。
[0027]在一些實(shí)施方案中，平移包括將一個(gè)或多個(gè)核苷酸聚合至至少一個(gè)切口的3’末端。在一些實(shí)施方案中，可將標(biāo)記或未標(biāo)記的核苷酸聚合至至少一個(gè)切口的3’末端。
[0028]在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)核酸片段是未被標(biāo)記的。
[0029]在一些實(shí)施方案中，基本上全部的核酸片段是未被標(biāo)記的。
[0030]在一些實(shí)施方案中,所述方法產(chǎn)生未標(biāo)記的核酸片段群體。
[0031]任選地，所述方法還包括:將至少一個(gè)寡核苷酸接頭連接至核酸片段群體中的一個(gè)或多個(gè)核酸片段的至少一個(gè)末端。
[0032]任選地，所述方法還包括:克隆一個(gè)或多個(gè)核酸片段。
[0033]在一些實(shí)施方案中，核酸片段群體包括大小基本上相似的片段。
[0034]在一些實(shí)施方案中，核酸片段群體包括大小基本上不相似的核酸片段。
[0035]在一些實(shí)施方案中，在核酸群體中，大小基本上相似的片段可彼此平均相異少于約50bp，或可彼此相異平均約50-100bp，或約100_200bp，或約200_300bp，或約300_400bp，或約 400-500bp，或約 500-600bp，或約 600_700bp。
[0036]在一些實(shí)施方案中，核酸群體包括約50_150bp、或約150_250bp、或約250_500bp、或約 500-750bp、或約 750-1000bp、或約 l_2kb、或約 2_5kb、或約 5_8kb、或約 8_10kb、或約10-20kb、或約20-40kb、或約40_60kb或更長的平均尺寸范圍。
[0037]在一些實(shí)施方案中，群體中的片段的至少一個(gè)末端包含平末端。
[0038]在一些實(shí)施方案中，群體中的片段的至少一個(gè)末端包含懸突末端。
[0039]在一些實(shí)施方案中，群體中的片段的至少一個(gè)末端包含或缺乏5’磷酸基團(tuán)。
[0040]在一些實(shí)施方案中，群體中的片段的至少一個(gè)末端包含或缺乏3’ OH基團(tuán)。
[0041]在一些實(shí)施方案中，切口產(chǎn)生包括酶促切口產(chǎn)生。
[0042]在一些實(shí)施方案中，切口平移包括5’至3’DNA聚合/降解反應(yīng)或5’至3’DNA聚
合/鏈置換反應(yīng)。
[0043]任選地，所述方法包括將至少一個(gè)寡核苷酸接頭連接至核酸片段群體的片段的至少一個(gè)末端。
[0044]在一些實(shí)施方案中，可將群體中的片段的至少一個(gè)末端的一條鏈連接至雙鏈寡核苷酸接頭的一條鏈，以產(chǎn)生在接頭與片段之間具有斷裂或切口的片段-接頭分子。
[0045]在一些實(shí)施方案中，可將群體中的片段的至少一個(gè)末端的兩條鏈連接至雙鏈寡核苷酸接頭的兩條鏈。
[0046]任選地，切口產(chǎn)生步驟包括至少一種核酸結(jié)合蛋白。任選地，切口平移步驟包括至少一種核酸結(jié)合蛋白。
[0047]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白包括單鏈結(jié)合蛋白。[0048]在一些實(shí)施方案中，單鏈結(jié)合蛋白包括噬菌體T4gp32蛋白、硫礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)單鏈結(jié)合蛋白、詹氏甲燒球菌(Methanococcus jannaschii)單鏈結(jié)合蛋白或大腸桿菌(E.coli)單鏈結(jié)合蛋白。
[0049]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白包含根據(jù)SEQ ID NOS: 1，2，3或4的任一項(xiàng)的氨基酸序列。
[0050]通過本文中提供的教導(dǎo)所產(chǎn)生的核酸片段群體。
[0051]附圖
[0052]圖1是描述核酸片段化方法的非限定性實(shí)施方案的示意圖。
[0053]圖2是描述核酸片段化方法的非限定性實(shí)施方案的示意圖。
[0054]圖3是描述核酸接頭-連接法的非限定性實(shí)施方案的示意圖。
[0055]圖4顯示噬菌體T4gp32蛋白的氨基酸序列的非限定性實(shí)施方案(SEQ ID NO:1)。
[0056]圖5顯示來自硫礦硫化葉菌的單鏈結(jié)合蛋白的氨基酸序列的非限定性實(shí)施方案(SEQ ID NO:2)ο
[0057]圖6顯示來自大腸桿菌的單鏈結(jié)合蛋白的氨基酸序列的非限定性實(shí)施方案(SEQID NO:3)。
[0058]圖7顯示來自詹氏甲烷球菌的單鏈結(jié)合蛋白的氨基酸序列的非限定性實(shí)施方案(SEQ ID NO:4)ο
`[0059]本文中使用的章節(jié)標(biāo)題僅用于組織目的并且不被解釋為以任何方式限定所描述的主題。本申請(qǐng)中引述的所有文獻(xiàn)和類似材料，包括但不限于專利、專利申請(qǐng)、論文、書、學(xué)術(shù)論文和國際互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)頁，明確地通過引用整體并入本文用于任何目的。當(dāng)并入的參考資料中的術(shù)語的定義與本公開內(nèi)容中提供的定義不同時(shí)，以本公開內(nèi)容中提供的定義為準(zhǔn)。除非另外定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。本文中(在上文中和下文中)提及的所有專利、專利申請(qǐng)、公開的申請(qǐng)、學(xué)術(shù)論文和其它出版物通過引用整體并入本文。如果本文中顯示的定義和/或描述與通過引用并入本文中的專利、專利申請(qǐng)、公開的申請(qǐng)以及其它出版物中所示的任何定義相反或不一致，則本文中所示的定義和/或描述優(yōu)于通過引用并入的定義。應(yīng)理解，在本公開內(nèi)容中論述的溫度、濃度、時(shí)間等之前隱含有“約”，從而微小和不顯著的偏差在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。在本申請(qǐng)中，除非另外明確地指出，否則單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)。同樣地，“包含”、“含有”和“包括”無意是限定性的。如本文中所用，術(shù)語“包含”、“含有”、“包括”、“具有”、“擁有”或其任何其它形式意欲涵蓋非排他性包含。例如，包括一系列特征的過程、方法、物品或裝置不必僅限于這些特征，而是可包括未明確列出的或?qū)τ诖祟愡^程、方法、物品或裝置是固有的其它特征。此外，除非明確地相反指出，否則"或"是指兼涵或(inclusive-or),而非異或(exclusive_or)。例如,下列任一項(xiàng)均滿足條件A或B:A為真(或存在)并且B為假(或不存在);A為假(或不存在)并且B為真(或存在);A和B都為真(或存在)。應(yīng)理解，前述一般描述和下列詳細(xì)描述僅是示例性和解釋性的，而不限制本發(fā)明。
[0060]定義
[0061]除非另外定義，否則與本文中描述的本公開內(nèi)容結(jié)合使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語將具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非上下文要求，否則單數(shù)術(shù)語將包括復(fù)數(shù)，并且復(fù)數(shù)術(shù)語將包括單數(shù)。一般地，本文中描述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)以及蛋白質(zhì)和寡核苷酸或多核苷酸化學(xué)和雜交的技術(shù)以及與其結(jié)合使用的命名法，是本領(lǐng)域公知且通常使用的那些。將標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于例如核酸純化和制備、化學(xué)分析、重組核酸、和寡核苷酸合成。按照制造商的說明書，或如本領(lǐng)域中通常實(shí)現(xiàn)的，或如本文中所述，進(jìn)行酶促反應(yīng)和純化技術(shù)。通常按照本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法，以及如整個(gè)本說明書中引用和論述的各種一般和更具體的參考資料中所描述的，進(jìn)行本文中描述的技術(shù)和方法。參見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第 3 版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y.2000)。本文中描述的實(shí)驗(yàn)室方法和技術(shù)以及與其結(jié)合使用的命名法是本領(lǐng)域公知且通常使用的那些。
[0062]如本文中提供的示例性實(shí)施方案所使用的，除非另外指出，否則下列術(shù)語將被理解為具有下列含義:
[0063]如本文中所用，當(dāng)用于形容核酸時(shí)，術(shù)語〃雙鏈的〃不要求核酸分子在其整個(gè)長度上是雙鏈的；相反地，一些單鏈區(qū)域(或未雜交的區(qū)域)也可以存在于雙鏈核酸中。通常地，雙鏈核酸內(nèi)的至少50%的核苷酸按照Watson Crick范式進(jìn)行堿基配對(duì)；在另一個(gè)常見實(shí)例中，至少一些核苷酸將按照不同的(即，非Watson-Crick)模型進(jìn)行堿基配對(duì)。在一些實(shí)施方案中，雙鏈核酸包括一對(duì)單鏈核酸，它們彼此相互作用，從而單鏈分子之一的至少一部分與另一條單鏈核酸的對(duì)應(yīng)部分雜交。
[0064]如本文中所用，當(dāng)用于形容核酸時(shí)，術(shù)語〃片段化〃，包括籍以將核酸物理分隔以形成至少兩個(gè)核酸片段的任何方法或操作。在一些實(shí)施方案中，待片段化的核酸可以是單鏈的或雙鏈的。在一些實(shí)施方案中，形成的核酸片段是單鏈或雙鏈的。在一些實(shí)施方案中，核酸片段包括單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸或核糖核酸的區(qū)段或部分。給定的核酸的片段化所衍生的核酸片段不必各別地或集體地包括給定的核酸的所有序列。在一些實(shí)施方案中，片段化可包括，通過雙鏈斷裂的形成而進(jìn)行的核酸的切割。
[0065]核酸分子的〃雙鏈斷裂〃包括，在第一條鏈中具有第一切口且在第二條鏈中具有第二切口的雙鏈核酸的任何實(shí)例，其中第`裂引入雙鏈核酸導(dǎo)致在斷裂位點(diǎn)形成兩個(gè)新末端(例如，上游和下游末端)。在一些實(shí)施方案中，斷裂的上游和下游末端可包括平末端、5’懸突末端和/或3’懸突末端的任意組合。在一些實(shí)施方案中，雙鏈核酸的一條鏈可以在相鄰核苷酸之間不存在磷酸二酯鍵，同時(shí)另一條鏈也可在該相同位置或在幾乎相同的位置上在相鄰核苷酸之間不存在磷酸二酯鍵，以便產(chǎn)生雙鏈斷裂。在一些實(shí)施方案中，單鏈核酸可以在相鄰核苷酸之間不存在磷酸二酯鍵，以便產(chǎn)生單鏈斷裂。在一些實(shí)施方案中，磷酸二酯鍵包括連接相鄰核苷酸(或連接核苷酸類似物)的類似連接。
[0066]如本文中所用，術(shù)語〃切口產(chǎn)生(nicking) 〃包括，籍以斷裂或中斷雙鏈核酸的一條核酸鏈中的兩個(gè)相鄰或連續(xù)核苷酸之間的連接，然而相反鏈中正對(duì)切口的兩個(gè)對(duì)應(yīng)核苷酸保持連接的任何適當(dāng)?shù)姆椒ɑ蛱幚?。在一些?shí)施方案中，雙鏈核酸包括在各自長度的至少一部分上基本上互補(bǔ)的兩條鏈，每一條鏈具有5’末端和3’末端(或其等同物)。將切口引入一條鏈(在本文中稱為“帶切口”的鏈)導(dǎo)致在切口的位置上形成新的5’末端和新的3’末端，以及來源于帶切口的鏈的兩條新鏈的形成。這兩條新鏈通常與相反鏈保持對(duì)齊并且通過堿基配對(duì)相互作用附著至相反鏈(相反鏈可不含任何切口，或可在其它位置包含一個(gè)或多個(gè)切口)。在一些實(shí)施方案中，在雙鏈核酸中，切口產(chǎn)生可包括斷裂一條核酸鏈的相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵，同時(shí)另一條鏈在正對(duì)斷裂的位置上具有通過磷酸二酯鍵連接的相鄰核苷酸。在一些實(shí)施方案中，切口產(chǎn)生試劑可在雙鏈分子的至少一條鏈上的隨機(jī)位置或位點(diǎn)特異性位置處斷裂磷酸二酯鍵(或在核酸分子包含核苷酸類似物的情況下任何其它等同鍵)。在一些實(shí)施方案中，磷酸二酯鍵包括連接相鄰核苷酸(或連接核苷酸類似物)的類似連接。在一些實(shí)施方案中，可酶促或化學(xué)地使雙鏈核酸產(chǎn)生切口。
[0067]如本文中所用，術(shù)語〃切口產(chǎn)生條件或產(chǎn)生切口的條件(nicking condition) 〃可包括，適合用于在核酸中產(chǎn)生切口的任何條件。在一些實(shí)施方案中，切口產(chǎn)生條件包括酶促或化學(xué)反應(yīng)條件，其中所導(dǎo)致的反應(yīng)斷裂或中斷核酸鏈中任意兩個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸之間的至少一個(gè)共價(jià)鍵。在一些常見實(shí)施方案中，可對(duì)具有兩條鏈的雙鏈核酸底物進(jìn)行切口產(chǎn)生條件，所述兩條鏈在它們的長度的至少一部分中彼此基本上互補(bǔ)，至少一條鏈包含通過磷酸二酯鍵(所述磷酸二酯鍵在切口產(chǎn)生過程中被破壞或斷裂)彼此連接的兩個(gè)連續(xù)核苷酸。通常地，相反鏈或互補(bǔ)鏈中的兩個(gè)對(duì)應(yīng)核苷酸保持彼此連接。例如，切口可在雙鏈分子的一條鏈上的相鄰核苷酸之間產(chǎn)生，同時(shí)另一條鏈在正對(duì)該斷裂的位置上具有通過磷酸二酯鍵連接的相鄰核苷酸。在一些實(shí)施方案中，核酸底物可包括未通過磷酸二酯鍵彼此連接、而相反地通過至少一個(gè)其它類型的鍵(所述鍵由于切口產(chǎn)生過程而被破壞或斷裂)彼此連接的合成核苷酸。在一些實(shí)施方案中，切口產(chǎn)生條件可包括，在雙鏈核酸的兩條鏈上都產(chǎn)生切口，其中至少一些切口位于相反或互補(bǔ)鏈中保持連接的相對(duì)的對(duì)應(yīng)核苷酸。在切口平移反應(yīng)中，如果一個(gè)或多個(gè)切口彼此相向平移，則當(dāng)兩個(gè)切口靠近或完全對(duì)齊時(shí)，可形成雙鏈斷裂。在一些實(shí)施方案中，切口產(chǎn)生條件包括，接觸產(chǎn)生切口的酶或與所述酶混合，所述酶可任選地具有內(nèi)切核酸酶活性。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生切口的酶可以是野生型或突變體形式。在一些實(shí)施方案中，切口產(chǎn)生條件可包括，與使核酸產(chǎn)生切口的化合物接觸、用所述化合物處理或與所述化合物混合，所述化合物包括:1，2，4-間苯三酚、沒食子酸、咖啡酸或棉酚(在銅存在的情況下)；或具有過氧化氫的鉻(VI)。
[0068]如本文中所用，術(shù)語〃切口平移"、"平移切口 〃及其變型可包括，籍以有效地將核酸鏈內(nèi)的切口的位置移至核酸鏈中的新位置的任何過程或處理。切口平移通常包括伴隨另一條新鏈的消化或侵蝕的一條新鏈的延伸。在一些實(shí)施方案中，切口平移包括核苷酸或核苷酸類似物至新的3’末端的 聚合以及核苷從新的5’末端的消化或侵蝕。通過至新的3’末端上的每一個(gè)連續(xù)核苷酸的聚合，使切口的位置沿著帶切口的鏈有效地移動(dòng)I個(gè)核苷酸位置。切口平移可任選地持續(xù)進(jìn)行直至切口平移至帶切口的鏈的末端，或直至平移的切口與相反鏈中的另一個(gè)切口完全對(duì)齊或充分靠近以形成雙鏈斷裂，從而導(dǎo)致產(chǎn)生來源于原始雙鏈核酸的兩個(gè)核酸片段。雙鏈斷裂可在所得的核酸片段中產(chǎn)生兩個(gè)新的平末端或兩個(gè)新的懸突(例如，“粘性”末端)。
[0069]如本文中所用，術(shù)語〃切口平移條件〃及其變型可包括，用于將雙鏈核酸的一條鏈中的切口的位置移至鏈內(nèi)的新位置的任何適當(dāng)條件。在一些實(shí)施方案中，常規(guī)切口平移條件使用兩種酶來產(chǎn)生末端標(biāo)記的核酸，所述兩種酶在用可檢測部分標(biāo)記的核苷酸(例如，放射性標(biāo)記核苷酸)存在的情況下偶聯(lián)核酸切口產(chǎn)生與切口平移活性。特別有益的是在未標(biāo)記的核苷酸存在的情況下包括切口產(chǎn)生和切口平移活性的切口平移反應(yīng)，其導(dǎo)致產(chǎn)生未標(biāo)記的核酸片段，其中將核酸樣品在相同反應(yīng)容器內(nèi)經(jīng)歷此類切口平移。在一些實(shí)施方案中，按照本公開內(nèi)容進(jìn)行的、用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括，使用一種或多種酶的切口平移條件，所述酶在不存在可檢測部分的核苷酸存在的情況下，或在標(biāo)記的核苷酸存在的情況下，偶聯(lián)核酸切口產(chǎn)生與切口平移活性。在一些實(shí)施方案中，按照本公開內(nèi)容進(jìn)行的切口平移條件產(chǎn)生未標(biāo)記的核酸片段。例如，本公開內(nèi)容可包括切口平移條件，其包括產(chǎn)生切口的酶(例如，DNA酶I)和具有5’ 一3’降解/聚合活性的聚合酶，或可包括產(chǎn)生切口的酶(例如，DNA酶I)和具有5’ 一 3’鏈置換活性的聚合酶(例如，Taq聚合酶)。根據(jù)本公開內(nèi)容的切口平移反應(yīng)還可包括一種或多種未標(biāo)記的核苷酸(例如，dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP或其類似物)。切口平移反應(yīng)可包括陽離子，例如鎂、錳或鈣。
[0070]各種實(shí)施方案的描述
[0071]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了用于產(chǎn)生核酸片段群體的組合物、系統(tǒng)、方法及試劑盒?？稍诤怂岬碾S機(jī)位置上進(jìn)行片段化。片段化可通過一個(gè)或多個(gè)酶來催化。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了片段化核酸，其包括兩個(gè)或更多個(gè)酶促反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括使核酸產(chǎn)生切口的反應(yīng)、切口平移反應(yīng)或兩者。切口產(chǎn)生反應(yīng)可在雙鏈核酸的任一條鏈上的一個(gè)或多個(gè)位置處引入切口。切口平移反應(yīng)可使一條鏈上的第一切口的位置移至可與另一條鏈上的第二切口、斷裂或其它缺口對(duì)齊的新位置。切口、斷裂或缺口的對(duì)齊可導(dǎo)致雙鏈斷裂或片段化位點(diǎn)。可對(duì)溶液中的核酸進(jìn)行切口產(chǎn)生和/或切口平移反應(yīng)。
[0072]在一些實(shí)施方案中，可對(duì)任何適當(dāng)?shù)暮怂針悠?，包括包含DNA、cDNA、RNA、RNA/DNA雜交體以及核酸類似物的樣品，實(shí)施公開的用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法。
[0073]可利用未標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法。
[0074]本文中公開的用于產(chǎn)生核酸片段群體的組合物、系統(tǒng)、方法及試劑盒可用于制備用于測序的核酸。對(duì)于本公開內(nèi)容是有用的核酸測序技術(shù)、平臺(tái)和系統(tǒng)特別地包括，邊合成邊測序、化學(xué)降解測序、基于連`接的測序、雜交測序、焦磷酸檢測測序、毛細(xì)管電泳、凝膠電泳、新一代、大規(guī)模平行測序平臺(tái)、檢測氫離子或其它測序副產(chǎn)品的測序平臺(tái)和單分子測序平臺(tái)。DNA片段可被產(chǎn)生以具有期望的大小或大小范圍，包括用于制備用于上述測序技術(shù)、平臺(tái)和/或系統(tǒng)的核酸的大小。
[0075]許多新一代或大規(guī)模平行測序系統(tǒng)涉及核酸文庫的產(chǎn)生，所述文庫通常包含待測序的更大核酸的眾多片段。例如，許多新一代測序系統(tǒng)使用片段文庫，所述文庫包括可用作測序模板的核酸片段的集合。用于新一代測序的其它類型的文庫包括配對(duì)文庫(mate pairlibrary)、RNA文庫(例如,mRNA文庫、RNA-Seq文庫、全轉(zhuǎn)錄組文庫、細(xì)胞特異性RNA文庫)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)文庫、外顯子組文庫和甲基化DNA文庫。
[0076]本文中公開的組合物、系統(tǒng)、方法及試劑盒可用于制備用于任何新一代測序系統(tǒng)的核酸文庫，所述測序系統(tǒng)包括:通過寡核苷酸探針連接和檢測進(jìn)行的測序(例如，來自Life Technologies 的 S0LiD?，W02006/084131)、探針-錨定分子連接測序(例如，CompleteGenomics? 或 Polonator?)、邊合成邊測序(例如，Genetic Analyzer and HiSeq?,來自Illumina)、焦憐酸測序(例如，Genome Sequencer FLX,來自 454Life Sciences)、離子敏感型測序(例如，Personal Genome Machine and Proton,來自 1n Torrent Systems, Inc.)以及單分子測序平臺(tái)(例如，HeliScope?，來自Helicos?)?？蛇x擇DNA的大小或大小范圍，以制備用于在任一上述測序技術(shù)和系統(tǒng)上進(jìn)行測序的核酸。[0077]在一些實(shí)施方案中，本文中公開的組合物、系統(tǒng)、方法和試劑盒可在工作流中用于構(gòu)建核酸文庫，所述核酸文庫用于在寡核苷酸探針連接和檢測系統(tǒng)(例如，來自LifeTechnologies的SOLiD?)中進(jìn)行測序或用于離子敏感型測序(例如，Personal GenomeMachine and Proton,來自1n Torrent Systems, Inc.)。核酸起始材料可以是任何核酸(例如，DNA、cDNA、RNA、RNA/DNA雜交體等)，可以是染色體的、基因組的、轉(zhuǎn)錄組的、細(xì)胞器的、甲基化的、染色質(zhì)連接的、克隆的、未擴(kuò)增的或擴(kuò)增的、天然的或合成的，并且可從任何來源(例如，從生物體、正?；蚧疾〖?xì)胞或組織、體液、存檔組織(例如，于福爾馬林中和/或石蠟中存檔的組織))分離。
[0078]可按照本文中公開的方法對(duì)核酸起始材料進(jìn)行隨機(jī)片段化，以產(chǎn)生可用于制備測序文庫的片段化DNA。
[0079]本文中公開的組合物、系統(tǒng)、方法和試劑盒可用于產(chǎn)生核酸片段群體，其經(jīng)選擇具有任何期望的大小或大小范圍，包括例如在長度上約100至約250bp，用于制備SOLiD?片段文庫，在長度上約100至約300bp，用于制備1n Torrent PGM?片段文庫，或在長度上約
0.Skb至約1.4kb，用于制備SOLiD?配對(duì)文庫。還可產(chǎn)生具有適合用于RNA文庫(例如，mRNA文庫、RNA-Seq文庫、全轉(zhuǎn)錄組文庫、細(xì)胞特異性RNA文庫)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)文庫和甲基化DNA文庫的大小或大小范圍的核酸片段。
[0080]可將核酸片段群體中的至少一個(gè)分子連接至寡核苷酸接頭。例如，可將片段化DNA連接至接頭以進(jìn)行引物延伸反應(yīng)、片段的擴(kuò)增或用于連接至顆粒(例如，珠粒)，或其任意組合。連接至片段化DNA的接頭可與連接至顆粒的寡核苷酸捕獲引物退火，并且可進(jìn)行引物延伸反應(yīng)來產(chǎn)生連接至顆?；虮砻娴钠位怂岬幕パa(bǔ)拷貝，從而將片段化的核酸連接至表面或顆粒。接頭可具有一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增引物雜交位點(diǎn)、測序引物雜交位點(diǎn)、條形碼序列或其任意組合。在一些實(shí)施方案中，可將DNA片段連接至一個(gè)或多個(gè)SOLiD?相容性或1nTorrent PGM?相容性 或1n Torrent Proton?相容性接頭來構(gòu)建片段文庫。
[0081]雙鏈核酸可通過下列來進(jìn)行片段化:在一個(gè)或多個(gè)位置上對(duì)任一條鏈酶促產(chǎn)生切口，并且切口平移一個(gè)或多個(gè)切口以移動(dòng)切口的位置來與相反鏈上的切口、斷裂或缺口對(duì)齊。一條鏈上的切口與另一條鏈上的切口、斷裂或缺口的對(duì)齊可產(chǎn)生雙鏈切口、斷裂或缺口，這可從來源核酸釋放雙鏈片段。將多個(gè)切口置于核酸的任一或兩條鏈中，隨后平移切口至與相反鏈中的切口、斷裂或缺口對(duì)齊的位置，可從來源核酸產(chǎn)生多個(gè)片段(例如，片段群體)。在一些實(shí)施方案中，雙鏈核酸可通過在一個(gè)或多個(gè)位置上對(duì)任一條鏈酶促產(chǎn)生切口以產(chǎn)生平末端核酸片段來進(jìn)行片段化。平末端片段可具有末端5’磷酸并且可將至少一個(gè)末端連接至接頭以形成接頭-雙鏈核酸分子。接頭-雙鏈核酸分子可在每一條核酸鏈中包括切口(與連接的5’磷酸相對(duì))。使接頭-雙鏈核酸分子變性可除去接頭的未連接部分，并且可使用切口修復(fù)酶，例如切口修復(fù)聚合酶來填充懸突，從而從核酸源產(chǎn)生雙鏈片段(圖3)。
[0082]在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本公開內(nèi)容的方法可包括:(a)使核酸產(chǎn)生切口 ；和(b)切口平移所述切口。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本公開內(nèi)容的方法可包括(a)在隨機(jī)位置上于任一條鏈上酶促地使雙鏈核酸產(chǎn)生切口 ；和(b)切口平移所述切口以使得相對(duì)鏈上的切口的位置移至對(duì)齊，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂。在一些實(shí)施方案中，酶促產(chǎn)生切口可利用具有內(nèi)切核酸酶的活性的酶來進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，切口平移可以是偶聯(lián)5’至3’DNA聚合/降解反應(yīng)的反應(yīng)，或偶聯(lián)5’至3’DNA聚合/鏈置換反應(yīng)的反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括，將片段化的核酸與非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶接觸(例如，加尾反應(yīng))。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將核酸與磷酸轉(zhuǎn)移酶接觸。在一些實(shí)施方案中，可對(duì)溶液中的核酸進(jìn)行反應(yīng)(包括切口產(chǎn)生、切口平移、加尾和/或磷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng))的任意組合。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將雙鏈缺口核酸與接頭接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將雙鏈缺口核酸與一種或多種切口修復(fù)酶接觸。在一些實(shí)施方案中，雙鏈核酸可以是雙鏈DNA、雙鏈RNA或雙鏈DNA/RNA雜交體。
[0083]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了用于隨機(jī)片段化雙鏈核酸以產(chǎn)生核酸片段群體的方法，包括步驟:(a)在隨機(jī)位置上酶促地使任一條鏈產(chǎn)生切口 ；和(b)切口平移所述切口以將相對(duì)鏈上的切口位置移至對(duì)齊，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂。在一些實(shí)施方案中，可利用具有內(nèi)切酶活性的酶進(jìn)行酶促切口產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，切口平移可以是偶聯(lián)5’至3’DNA聚合/降解反應(yīng)的反應(yīng)，或偶聯(lián)5’至3’DNA聚合/鏈置換反應(yīng)的反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將片段化的核酸與非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將核酸與磷酸轉(zhuǎn)移酶接觸。在一些實(shí)施方案中，對(duì)溶液中的核酸進(jìn)行反應(yīng)(包括切口產(chǎn)生、切口平移、加尾和/或磷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng))的任意組合。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將雙鏈核酸片段與寡核苷酸接頭接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將雙鏈核酸片段與一種或多種切口修復(fù)酶接觸。在一些實(shí)施方案中，雙鏈核酸可以是雙鏈DNA、雙鏈RNA或雙鏈DNA/RNA雜交體。
[0084]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法，包括步驟:(a)提供具有第一和第二核酸鏈的雙鏈核酸；(b)在第一位置上使第一核酸鏈產(chǎn)生切口以及在第二位置上使第二核酸鏈產(chǎn)生切口，其中第一和第二位置在雙鏈核酸的不同位置上；和(C)使第一切口的位置和第二切口的位置沿著雙鏈核酸移動(dòng)至對(duì)齊，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂。在一些實(shí)施方案中，切口產(chǎn)生可利用具內(nèi)切核酸酶活性的酶來進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，移動(dòng)第一切口的位置和第二切口的位置可通過切口平多反應(yīng)來進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)可以是偶聯(lián)5’至3’DNA聚合/降解反應(yīng)的反應(yīng)，或偶聯(lián)5’至3’DNA聚合/鏈置換反應(yīng)的反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將片段化的核酸與非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將核酸與磷酸轉(zhuǎn)移酶接觸。在一些實(shí)施方案中，可對(duì)溶液中的核酸`進(jìn)行反應(yīng)(包括切口產(chǎn)生、切口平移、加尾和/或磷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng))的任意組合。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將雙鏈核酸片段與寡核苷酸接頭接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將雙鏈核酸片段與一種或多種切口修復(fù)酶接觸。在一些實(shí)施方案中，雙鏈核酸可以是雙鏈DNA、雙鏈RNA或雙鏈DNA/RNA雜交體。
[0085]用于隨機(jī)片段化核酸的方法可用于產(chǎn)生核酸片段，所述核酸片段可用作工作流的部分，用于制備用于測序(例如，新一代測序)的核酸文庫。工作流可包括片段化、接頭連接、大小選擇、純化、擴(kuò)增和/或連接至表面。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很顯然的是，工作流可重復(fù)或省略上述步驟的任一個(gè)或多個(gè)步驟。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說也很顯然的是，可改變步驟的順序和組合以產(chǎn)生需要的雙鏈核酸片段，并從而不限定于所提供的示例性工作流。
[0086]例如，用于隨機(jī)片段化核酸的方法通常可包括將核酸與產(chǎn)生切口的酶、切口平移酶和輔因子反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，隨機(jī)片段化核酸還可包括，將核酸與非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶和/或磷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，隨機(jī)片段化核酸還可包括將核酸與接頭和切口修復(fù)酶反應(yīng)。可在反應(yīng)容器中實(shí)施用于隨機(jī)片段化核酸的反應(yīng)?？墒褂脽峥刂蒲b置實(shí)施用于隨機(jī)片段化核酸的反應(yīng)。
[0087]可將通過此類方法產(chǎn)生的核酸片段連接至一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸接頭以構(gòu)建可與新一代測序平臺(tái)相容的文庫。寡核苷酸接頭可用于將片段化核酸連接至表面以進(jìn)行測序。
[0088]在一些實(shí)施方案中，可對(duì)可從任何來源分離的核酸實(shí)施用于隨機(jī)片段化核酸的反應(yīng)，所述來源包括:生物體；正常或患病細(xì)胞或組織；體液；或存檔組織(例如，在福爾馬林和/或石蠟中存檔的組織)。核酸可以以任何形式存在，包括染色體的、基因組的、細(xì)胞器的、甲基化的、克隆的、擴(kuò)增的、DNA、cDNA、RNA、RNA/DNA或合成的。
[0089]在一些實(shí)施方案中，用于隨機(jī)片段化核酸的反應(yīng)可包括一種或多種產(chǎn)生切口的酶，其催化雙鏈的一條鏈產(chǎn)生切口。例如，產(chǎn)生切口的酶可具有內(nèi)切核酸酶活性。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生切口的酶可以是DNA酶1(圖1和2)。
[0090]在一些實(shí)施方案中，用于隨機(jī)片段化核酸的反應(yīng)可包括一種或多種可進(jìn)行切口平移反應(yīng)的酶，所述反應(yīng)偶聯(lián)5’ 一3’聚合/降解反應(yīng)，例如大腸桿菌DNA Pol 1(圖1)。在一些實(shí)施方案中，用于隨機(jī)片段化核酸的反應(yīng)可包括一種或多種可進(jìn)行切口平移反應(yīng)的酶，所述反應(yīng)偶聯(lián)5’ 一3’聚合/鏈置換反應(yīng),例如Taq聚合酶、Tfi聚合酶或phi29聚合酶。
[0091]在一些實(shí)施方案中，非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)可在多種核苷酸存在的情況下由一種或多種酶催化(圖2)。在一些實(shí)施方案中，非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)可由Taq聚合酶、Tfi DNA聚合酶、3’ 外切核酸酶minus-大(Klenow)片段或3’外切核酸酶minus_T4聚合酶催化。
[0092]在一些實(shí)施方案中，一種酶可催化切口平移反應(yīng)和非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)(圖 2)。
[0093]在一些實(shí)施方案中，可將一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸接頭連接至片段化的核酸以形成接頭_雙鏈核酸分子(圖3)。
[0094]在一些實(shí)施方案中，可使接頭-雙鏈核酸分子變性，以便除去接頭的非連接部分，并且一種或多種切口修復(fù)酶例如切口修復(fù)聚合酶例如Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Plat inum? Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen)、Tfi Exo(-)DNA 聚合酶(Invitrogen)或PhUS ion? Ifct Start High-Fidelity DNA 聚合酶(New England Biolabs)可用于進(jìn)行填充反應(yīng)(圖3)以產(chǎn)生雙鏈核酸分子。
[0095]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法還可包括將磷酸添加至5’末端和/或從帶切口的核酸的3’末端除去磷酸的酶反應(yīng)。這些反應(yīng)可利用一種或多種酶來進(jìn)行，所述酶催化磷酸基團(tuán)添加至單鏈或雙鏈核酸的5’末端(例如，不存在磷酸基團(tuán)的切口的5’側(cè))，和/或催化從核酸(例如，具有磷酸基團(tuán)的切口的3’側(cè))除去3’磷酸基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，磷酸基團(tuán)的添加或去除可通過多核苷酸激酶來催化。多核苷酸激酶可以是T4多核苷酸激酶，或可從其它來源(例如，人)分離。多核苷酸激酶反應(yīng)可在存在ATP的情況下進(jìn)行。
[0096]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可在一種或多種輔因子存在的情況下進(jìn)行。例如，核酸切口產(chǎn)生反應(yīng)可在陽離子存在的情況下進(jìn)行。陽離子可以是鎂、錳或鈣。
[0097]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可在任何類型的反應(yīng)容器中進(jìn)行。例如，反應(yīng)容器包括任何類型的管或孔(例如，96孔板)。
[0098]在一些實(shí)施方案中，可在任何類型的熱控制裝置中實(shí)施用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法。在一些實(shí)施方案中，熱控制裝置可維持期望的溫度，或可升高和降低溫度，或可升高和降低溫度多個(gè)循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，熱控制裝置可將溫度維持在約0°c -100°c的范圍內(nèi)，或可在約o°c -100°C的不同溫度范圍之間循環(huán)。熱控制裝置的實(shí)例包括:水浴和熱循環(huán)儀機(jī)器。許多熱循環(huán)儀機(jī)器是商購可得的，包括(但不限于)Applied Biosystems,Agilent、Eppendorf、Bio-Rad 和 Bibby Scientific。
[0099]在一些實(shí)施方案中，可將核酸片段的一個(gè)或兩個(gè)末端連接至至少一個(gè)寡核苷酸接頭來構(gòu)建核酸文庫。寡核苷酸接頭可包括擴(kuò)增引物序列、測序引物位點(diǎn)和/或條形碼。寡核苷酸接頭可具有任意結(jié)構(gòu)，包括線性、發(fā)夾、叉狀或莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。可將片段化的核酸連接至寡核苷酸接頭以允許連接至顆粒(例如，珠粒)或至表面。例如，寡核苷酸接頭可包括與連接至顆粒或表面的寡核苷酸捕獲引物互補(bǔ)的核苷酸序列。寡核苷酸捕獲引物可與連接至片段化核酸的接頭退火，且可進(jìn)行引物延伸反應(yīng)以產(chǎn)生連接至顆?；虮砻娴钠位怂岬幕パa(bǔ)拷貝，從而將片段化核酸連接至表面或顆粒。在一些實(shí)施方案中，可將片段化的核酸在兩個(gè)末端都連接至寡核苷酸接頭(所述接頭與連接至表面的不同寡核苷酸捕獲引物互補(bǔ))以進(jìn)行橋式擴(kuò)增。片段化核酸至顆?；虮砻娴倪B接可通過在含水條件下進(jìn)行引物延伸反應(yīng)或擴(kuò)增反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。引物延伸和擴(kuò)增反應(yīng)可在等溫或熱循環(huán)條件下進(jìn)行，或可在管、孔、油-水乳液微滴或瓊脂糖微滴(Yang2010Lab ChiplO (21):2841-2843)中進(jìn)行。
[0100]在一些實(shí)施方案中，可修飾核酸片段的一個(gè)或兩個(gè)末端以連接至表面或顆粒。例如，可修飾5’或3’末端以包含可結(jié)合至表面或顆粒上的羧酸化合物的氨基。5’末端可包含用于在碳二亞胺(例如，水溶性碳二亞胺)存在的情況下與氨基涂覆的表面(或顆粒)反應(yīng)的磷酸基團(tuán)?？稍谝粋€(gè)末端生物素化核酸，以結(jié)合連接至表面的抗生物素蛋白樣化合物(例如鏈霉抗生物素蛋白)。
[0101]在一些實(shí)施方案中，表面可以是平面、凸面、凹面或其任意組合。表面可以是多孔的、半多孔的或無孔的。表面可包含無機(jī)材料、天然聚合物、合成聚合物或非聚合材料。表面包括流動(dòng)池、孔、凹槽、通道、儲(chǔ)液池、濾器、凝膠或毛細(xì)管內(nèi)壁。表面可用丙烯酰胺化合物涂覆?？蓪⒑怂崞喂潭ㄖ帘砻嫔系谋０坊衔锿繉印?br> [0102]在一些實(shí)施方案中，顆粒具有球形、半球形、圓柱形、桶形、環(huán)形、桿狀、盤狀、錐形、三角形、立方形、多邊形、管狀、線狀或不規(guī)則的形狀。顆粒可具有鐵芯，或包含水凝膠或瓊脂糖(例如，Sepharose?)。顆?？梢允琼槾判缘?。顆粒可以是球形或不規(guī)則形狀。顆粒可具有空腔或孔，或可包括三維支架。顆?？捎敏人峄衔锘虬坊衔锿扛惨赃B接核酸片段?？捎每股锼氐鞍讟踊衔?例如，鏈霉抗生物素蛋白)涂覆顆粒以結(jié)合生物素化的核酸片段。在一些實(shí)施方案中，顆?？梢允?n Sphere?顆粒。可將顆粒沉積至測序儀的表面?？蓪y序試劑遞送至沉積的顆粒以進(jìn)行測序反應(yīng)。
[0103]組合物
[0104]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了通過核酸片段化法制備的核酸片段群體。在一些實(shí)施方案中，核酸片段群 體可包括大小基本上相似的片段或大小基本上不同的片段。在一些實(shí)施方案中，核酸片段群體可以是單鏈的或雙鏈的。在一些實(shí)施方案中，核酸片段群體可以是DNA、RNA或嵌合DNA/RNA。在一些實(shí)施方案中，核酸片段群體可具有第一和第二末端。在一些實(shí)施方案中，核酸片段群體可具有一個(gè)或多個(gè)平末端或懸突末端。在一些實(shí)施方案中，核酸片段群體可具有一個(gè)或多個(gè)加尾末端。在一些實(shí)施方案中，核酸片段群體可被化學(xué)修飾，或連接至一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸接頭。在一些實(shí)施方案中，可將核酸片段群體固定至顆?；虮砻妫蚱淇纱嬖谟谌芤褐?。
[0105]用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法
[0106]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了用于隨機(jī)片段化核酸以產(chǎn)生核酸片段群體的方法。在一些實(shí)施方案中，用于隨機(jī)片段化核酸的方法可產(chǎn)生未標(biāo)記的核酸片段群體。
[0107]用于產(chǎn)生核酸群體的方法提供了優(yōu)于常規(guī)片段化方法的有利方面。例如，由本公開內(nèi)容提供的方法使用酶促反應(yīng)，其相較于常規(guī)剪切法產(chǎn)生更少的氧化損傷。由本公開內(nèi)容提供的方法顯示，可用于進(jìn)一步操作(例如，核酸連接反應(yīng))的片段的產(chǎn)率的增加。其它有利方面包括，可隨機(jī)片段化核酸，顯示幾乎無序列偏愛性或無序列偏愛性，例如沒有或幾乎沒有對(duì)富含GC或GC較少的序列的偏愛性。用于產(chǎn)生核酸群體的方法可在一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行，可對(duì)極少量的起始材料進(jìn)行，可以小反應(yīng)體積進(jìn)行，和/或可產(chǎn)生可調(diào)整的大小范圍。這些方法還可人工地進(jìn)行或經(jīng)改造用于自動(dòng)化進(jìn)行。
[0108]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容一般地涉及用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法(和相關(guān)組合物、試劑盒、系統(tǒng)和裝置)，包括:將至少一個(gè)雙鏈斷裂引入核酸。
[0109]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容一般地涉及用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法(和相關(guān)組合物、試劑盒、系統(tǒng)和裝置)，包括:將第一雙鏈核酸經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件和切口平移條件。
[0110]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容一般地涉及用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法(和相關(guān)組合物、試劑盒、 系統(tǒng)和裝置)，包括:將第一雙鏈核酸經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件，從而產(chǎn)生在每一條鏈上具有至少一個(gè)切口的第一帶切口的雙鏈核酸；切口平移第一帶切口的雙鏈核酸的每一條鏈中的至少一個(gè)切口 ；和在第一帶切口的雙鏈核酸中產(chǎn)生至少一個(gè)雙鏈斷裂，從而形成至少兩個(gè)來源于第一雙鏈核酸的核酸片段。
[0111]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容一般地涉及用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法(和相關(guān)組合物、試劑盒、系統(tǒng)和裝置)，包括:(a)使核酸產(chǎn)生切口 ；和(b)切口平移所述切口。
[0112]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容一般地涉及用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法(和相關(guān)組合物、試劑盒、系統(tǒng)和裝置)，包括:(a)使核酸在每一條鏈上產(chǎn)生切口至少一次；和(b)切口平移所述切口，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂以產(chǎn)生至少一個(gè)核酸片段。
[0113]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容一般地涉及用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法(和相關(guān)組合物、試劑盒、系統(tǒng)和裝置)，包括:(a)使多個(gè)核酸在每一條鏈上產(chǎn)生切口至少一次；和(b)切口平移所述切口，從而在多個(gè)核酸中產(chǎn)生雙鏈斷裂，以產(chǎn)生核酸片段群體。
[0114]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容一般地涉及用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法(和相關(guān)組合物、試劑盒、系統(tǒng)和裝置)，包括:通過下列來切割核酸:(i)使核酸在第一條鏈上產(chǎn)生切口至少一次，和(ii)切口平移所述切口，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂以產(chǎn)生至少一個(gè)核酸片段。
[0115]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容一般地涉及用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法(和相關(guān)組合物、試劑盒、系統(tǒng)和裝置)，包括:(a)提供具有第一和第二條鏈的雙鏈核酸；(b)使第一條鏈產(chǎn)生切口至少一次來產(chǎn)生第一切口以及使第二條鏈產(chǎn)生切口至少一次來產(chǎn)生第二切口 ；和(C)切口平移第一切口和第二切口，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)核酸片段。
[0116]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容一般地涉及用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法(和相關(guān)組合物、試劑盒、系統(tǒng)和裝置)，包括:(a)將至少一個(gè)切口引入第一和第二雙鏈核酸的每一條鏈；(b)平移第一和第二雙鏈核酸的每一條鏈中的一個(gè)或多個(gè)切口 ；和(C)在第一和第二雙鏈核酸分子中產(chǎn)生至少一個(gè)雙鏈斷裂，從而形成多個(gè)核酸片段(核酸片段群體)?？稍谙嗤磻?yīng)容器中將第一和第二雙鏈核酸經(jīng)歷相同片段化反應(yīng)。通常地，第一和第二核酸包括不同的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，將樣品中的許多不同核酸分子片段化以形成核酸片段群體。
[0117]在一些實(shí)施方案中，可將一個(gè)或多個(gè)切口引入雙鏈核酸的任一條鏈上的隨機(jī)位置。
[0118]在一些實(shí)施方案中，可利用標(biāo)記或未標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行切口平移條件。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)所得的核酸片段是未經(jīng)標(biāo)記的。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)所得的核酸片段是經(jīng)標(biāo)記的。
[0119]在一些實(shí)施方案中，一個(gè)、一些、大多數(shù)或基本上所有的核酸片段在大小上基本上相似。所得的核酸片段的平均大小在長度上可以為約lOObp、約200bp、約300bp、約500bp、約 lOOObp、約 2500bp、約 5000bp、約 lOOOObp、約 50000bp、約 lOOOOObp、約 1Mb、約 5Mb、約IOMb或更多。
[0120]在一些實(shí)施方案中，核酸片段群體可包括大小基本上相似或大小基本上不同的核酸片段。例如，大小基本上相似`的片段可彼此相異平均約少于50bp，或彼此相異平均約50-75bp，或平均約75-100bp，或平均約100_125bp，或平均約125_150bp，或平均約150-175bp 或更多。
[0121]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括步驟:在適合于將一個(gè)或多個(gè)切口引入雙鏈核酸的任一條鏈上和/或適合于沿著雙鏈核酸將切口的位置移至新位置的條件下，(a)將一個(gè)或多個(gè)切口引入雙鏈核酸的任一條鏈上；和(b)將切口的位置沿著雙鏈核酸移至新的位置。
[0122]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:通過將包含多個(gè)核酸的樣品經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件將一個(gè)或多個(gè)切口引入核酸；和在至少一個(gè)核酸中產(chǎn)生至少一個(gè)雙鏈斷裂。
[0123]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:(a)將至少一個(gè)切口引入雙鏈核酸；和(b)通過平移至少一個(gè)切口在核酸中形成雙鏈斷裂。在一些實(shí)施方案中，弓丨入包括將至少一個(gè)切口引入雙鏈核酸的每一條鏈中。任選地，平移包括彼此相向地平移位于相反核酸鏈上的至少兩個(gè)切口。在一些實(shí)施方案中，所述方法可包括產(chǎn)生雙鏈斷裂，從而導(dǎo)致形成至少兩個(gè)來源于起始雙鏈核酸的核酸片段。
[0124]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:(a)使核酸在每一條鏈上產(chǎn)生切口至少一次；和(b)切口平移所述切口，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂以產(chǎn)生核酸片段。
[0125]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:通過下列來切割核酸:(i)使核酸在每一條鏈上產(chǎn)生切口至少一次，和(ii)切口平移所述切口，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂以產(chǎn)生核酸片段。
[0126]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:(a)提供具有第一和第二條鏈的雙鏈核酸；(b)使第一條鏈產(chǎn)生切口至少一次來產(chǎn)生第一切口以及使第二條鏈產(chǎn)生切口至少一次來產(chǎn)生第二切口 ；和(C)彼此相向地切口平移所述第一切口和第二切口，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂以產(chǎn)生核酸片段。
[0127]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:(a)將一個(gè)或多個(gè)切口引入雙鏈核酸的每一條鏈上；和(b)通過沿著它們各自的鏈移動(dòng)至少兩個(gè)切口的位置，產(chǎn)生至少一個(gè)雙鏈斷裂，從而將雙鏈核酸切割成至少兩個(gè)核酸片段。
[0128]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:將兩個(gè)或更多個(gè)不同的雙鏈核酸經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件，從而形成各自在每一條鏈中包含至少一個(gè)切口的至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸；和平移每一條鏈中的至少一個(gè)切口以對(duì)齊相反鏈上的切口，其中平移包括將至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸經(jīng)歷切口平移條件。
[0129]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:將兩個(gè)或更多個(gè)不同的雙鏈核酸經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件，從而形成各自在每一條鏈上包括至少一個(gè)切口的至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸；和切割至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸，其中切割包括在至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸的每一個(gè)中產(chǎn)生至少一個(gè)雙鏈斷裂，其中所述產(chǎn)生包括切口平移每一條鏈中的至少一個(gè)切口，從而產(chǎn)生核酸片段群體。
[0130]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:將至少兩個(gè)不同的雙鏈核酸分子切割成核酸片段，其中切割包括，通過將至少兩個(gè)不同的雙鏈核酸分子經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件來將至少一個(gè)切口引入至少兩個(gè)不同的雙鏈核酸分子的每一條鏈中，從而形成帶切口的雙鏈核酸分子；和，通過切口平移帶切口的雙鏈核酸分子的第一條鏈中的一個(gè)或多個(gè)切口以及第二條鏈中的一個(gè)或多個(gè)切口，直至相反鏈上的至少兩個(gè)切口對(duì)齊，來在帶切口的雙鏈核酸分子中產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)雙鏈`斷裂。
[0131]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:將兩個(gè)或更多個(gè)不同的雙鏈核酸經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件，從而形成至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸，其各自在每一條鏈上包含至少一個(gè)切口 ；切割至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸，其中切割包括在至少兩個(gè)不同的帶切口的雙鏈核酸的每一個(gè)中產(chǎn)生至少一個(gè)雙鏈斷，其中所述產(chǎn)生包括切口平移每一條鏈的至少一個(gè)切口，從而產(chǎn)生核酸片段群體。
[0132]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:將至少兩個(gè)不同的雙鏈核酸分子切割成核酸片段，其中切割包括，通過將至少兩個(gè)不同的雙鏈核酸分子經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件來將至少一個(gè)切口引入至少兩個(gè)不同的雙鏈核酸分子的每一條鏈，從而形成帶切口的雙鏈核酸分子；和通過切口平移帶切口的雙鏈核酸分子的第一條鏈中的一個(gè)或多個(gè)切口和第二條鏈中的一個(gè)或多個(gè)切口直至相反鏈上的至少兩個(gè)切口對(duì)齊，來在帶切口的雙鏈核酸分子中產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)雙鏈斷裂。
[0133]在一些實(shí)施方案中，切口是指雙鏈核酸上的這樣的位置，其在一條核酸鏈的相鄰核苷酸之間不存在磷酸二酯鍵，而另一條鏈在相同的位置上具有通過磷酸二酯鍵連接的相鄰核苷酸。在一些實(shí)施方案中，磷酸二酯鍵包括連接相鄰核苷酸(或核苷酸類似物)的類似連接。在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可產(chǎn)生多個(gè)具有至少一個(gè)平末端或懸突末端的片段。在一些實(shí)施方案中，雙鏈核酸片段的一個(gè)或兩個(gè)末端可以是包括彼此平齊的末端的平末端。平末端上的末端核苷酸可具有堿基配對(duì)或可不存在堿基配對(duì)。在一些實(shí)施方案中，雙鏈核酸片段的一個(gè)或兩個(gè)末端可包括5’或3’懸突末端,所述末端包含雙鏈部分和末端單鏈部分。
[0134]在一些實(shí)施方案中，引入一個(gè)或多個(gè)切口可通過一種或多種酶來催化。在一些實(shí)施方案中，催化核酸切口產(chǎn)生的酶包括具有內(nèi)切核酸酶活性的酶。在一些實(shí)施方案中，引入一個(gè)或多個(gè)切口可在陽離子存在的情況下由一種或多種酶來催化。在一些實(shí)施方案中，陽離子可包括鎂、錳或鈣。
[0135]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法還可包括一種或多種切口修復(fù)酶，例如切口修復(fù)聚合酶。在一些實(shí)施方案中，切口修復(fù)聚合酶可以是Taq DNA聚合酶、Bst DNA 聚合酶、Plat illUffl? PfX DNA 聚合酶(Invitrogen)、Tfi Exo(-)DNA 聚合
酶(Invitrogen)或 PhusiOll? Hot Start High-Fidelity DNA 聚合酶(New England
Biolabs)。例如，可在陽離子存在的情況下進(jìn)行切口修復(fù)反應(yīng)。陽離子可以是鎂、錳或鈣。
[0136]在一些實(shí)施方案中，移動(dòng)切口的位置可在多種核苷酸存在的情況下由一種或多種酶催化。在一些實(shí)施方案中，移動(dòng)切口的位置可在多種核苷酸存在的情況下利用一種或多種切口平移酶來催化。在一些實(shí)施方案中，催化切口平移的酶包括偶聯(lián)5’ 一3’聚合/降解反應(yīng)的酶，或偶聯(lián)5’ 一3’聚合/鏈置換反應(yīng)的酶。
[0137]在一些實(shí)施方案中，可對(duì)溶液中的核酸或連接至固體表面的核酸進(jìn)行切口產(chǎn)生和/或切口平移反應(yīng)。
[0138]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括，在任何步驟中將核酸與一種或多種核酸結(jié)合蛋白接觸，或可不存在核酸結(jié)合蛋白。在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可 包括，將核酸與一種或多種核酸結(jié)合蛋白(與使至少一條核酸鏈產(chǎn)生切口的酶和/或與切口平移酶任意組合)接觸。在一些實(shí)施方案中，切口產(chǎn)生和/或切口平移反應(yīng)可包含至少一種核酸結(jié)合蛋白。在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括，將核酸與一種或多種核酸結(jié)合蛋白(與使至少一條核酸鏈產(chǎn)生切口的酶和/或與切口平移酶任意組合的)相繼或同時(shí)(或基本上同時(shí))接觸。在一些實(shí)施方案中，切口產(chǎn)生步驟和/或切口平移步驟可在至少一種核酸結(jié)合蛋白存在的情況下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，切口產(chǎn)生步驟和/或切口平移步驟可在溶液中在至少一種核酸結(jié)合蛋白存在的情況下進(jìn)行。核酸結(jié)合蛋白的包含可提高片段化核酸的產(chǎn)率和/或可減少具有重排部分的核酸片段的形成。在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以是單鏈核酸結(jié)合蛋白。
[0139]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以是單鏈核酸結(jié)合蛋白。例如，單鏈核酸結(jié)合蛋白可以是曬菌體T4gp32蛋白質(zhì),或可來自硫礦硫化葉菌(例如,Sso SSB)或來自詹氏甲烷球菌(Mja SSB)或大腸桿菌SSB蛋白。
[0140]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)(例如，加尾反應(yīng))。在一些實(shí)施方案中，非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)可在多種核苷酸存在的情況下由一種或多種酶催化。在一些實(shí)施方案中，非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)可在一個(gè)或多個(gè)類型的核苷酸(例如，A、G、C或T/U)存在的情況下由一種或多種酶催化。[0141]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法還可包括將磷酸添加至5’末端和/或從3’末端除去磷酸的酶反應(yīng)。這些反應(yīng)可利用一種或多種酶來進(jìn)行，所述酶催化磷酸基團(tuán)添加至單鏈或雙鏈核酸的5’末端和/或催化從核酸除去3’磷酸基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，磷酸基團(tuán)的添加或去除可利用多核苷酸激酶來催化。多核苷酸激酶可以是T4多核苷酸激酶，或可從其它來源(例如，人)分離。多核苷酸激酶反應(yīng)可在ATP存在的情況下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將雙鏈缺口核酸與接頭接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將雙鏈缺口核酸與一種或多種切口修復(fù)酶接觸。
[0142]在一些實(shí)施方案中，可在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)，例如切口產(chǎn)生反應(yīng)和切口平移反應(yīng)，或例如切口產(chǎn)生反應(yīng)和切口平移反應(yīng)以及加尾反應(yīng)，或例如切口產(chǎn)生反應(yīng)和切口平移反應(yīng)以及加尾反應(yīng)和多核苷酸激酶反應(yīng)，或例如切口產(chǎn)生反應(yīng)和連接反應(yīng)以及切口平移反應(yīng)和切口修復(fù)反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，可在分開的反應(yīng)容器中進(jìn)行不同的反應(yīng)(例如，切口產(chǎn)生反應(yīng)、連接反應(yīng)、切口平移反應(yīng)、加尾反應(yīng)、切口修復(fù)反應(yīng)和/或多核苷酸激酶反應(yīng))，或可在相同反應(yīng)容器中在不同時(shí)間進(jìn)行這些不同的反應(yīng)。在切口產(chǎn)生和/或切口平移步驟中，核酸結(jié)合蛋白可存在于任何反應(yīng)容器中。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)容器可以是任何類型的管或孔(例如，96孔板)。在一些實(shí)施方案中，可在油-水乳液微滴或瓊脂糖微滴(Yang2010Lab ChiplO (21):2841-2843)中進(jìn)行不同反應(yīng)(例如，切口產(chǎn)生反應(yīng)、連接反應(yīng)、切口平移反應(yīng)、加尾反應(yīng)、切口修復(fù)反應(yīng)和/或多核苷酸激酶反應(yīng))。
[0143]在一些實(shí)施方案中，由進(jìn)行核酸片段化反應(yīng)產(chǎn)生的片段的大小范圍可以為約50-150bp、或約 150-250bp、或約 250_500bp、或約 500_750bp、或約 750_1000bp、或約 l_2kb、或約2-5kb、或約5-8kb、或約8_10kb、或約10_20kb、或約20_40kb、或約40_60kb或更長。在一些實(shí)施方案中，所得的平均片段大小(或核酸片段的平均大小范圍)可通過調(diào)整切口產(chǎn)生條件和/或切口平移條件來進(jìn)行調(diào)整。例如，切口產(chǎn)生條件和/或切口平移條件可通過增加或減小酶濃度(例如，切口產(chǎn)生或切口平移酶)；通過增加或減小陽離子濃度；通過增加或減小核苷酸濃度；通過增加或減小反應(yīng)溫度、時(shí)間和/或pH來調(diào)整。
`[0144]在一些實(shí)施方案中，所得的平均片段大小(或平均大小范圍)可通過下列來調(diào)整:增加或減小酶濃度(例如，切口產(chǎn)生或切口平移酶)；增加或減小陽離子濃度；增加或減小核苷酸濃度；增加或減小反應(yīng)溫度、時(shí)間和/或pH。
[0145]在一些實(shí)施方案中，在雙鏈核酸的任一條鏈上引入的切口的數(shù)目可通過下列來調(diào)整:增加或減小酶濃度；增加或減小陽離子濃度；增加或減小核苷酸濃度；增加或減小反應(yīng)溫度、時(shí)間和/或pH。在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)通過如下方面來調(diào)整:增加或減小酶濃度；增加或減小核苷酸濃度；增加或減小陽離子濃度；增加或減小反應(yīng)溫度、時(shí)間和/或pH。
[0146]在一些實(shí)施方案中，在雙鏈核酸的任一條鏈上引入不同核酸分子的混合群體內(nèi)的核酸分子的切口的平均數(shù)目，可通過如下方面來調(diào)整:增加或減小酶(例如，DNA酶I)濃度；增加或減小陽離子濃度(例如，鎂)；增加或減小核苷酸濃度；增加或減小反應(yīng)溫度、時(shí)間和/或pH。
[0147]在一些實(shí)施方案中，切口修復(fù)反應(yīng)可通過如下方面來調(diào)整:增加或減小切口修復(fù)酶濃度；增加或減小核苷酸濃度；增加或減小陽離子濃度；增加或減小反應(yīng)溫度、時(shí)間和/或pH。[0148]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括步驟:(a)提供具有第一和第二核酸鏈的雙鏈核酸；在適合于使第一核酸鏈產(chǎn)生切口，適合于使第二核酸鏈產(chǎn)生切口，適合于移動(dòng)第一切口的位置和/或適合于移動(dòng)第二切口的位置的條件下，(b)在第一位置使第一核酸鏈產(chǎn)生切口和在第二位置使第二核酸鏈產(chǎn)生切口 ；和(C)將第一切口的位置和第二切口的位置移至新的位置。
[0149]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括步驟:(a)提供具有第一和第二核酸鏈的雙鏈核酸；在適合于使第一核酸鏈產(chǎn)生切口，適合于使第二核酸鏈產(chǎn)生切口，適合于移動(dòng)第一切口的位置和/或適合于移動(dòng)第二切口的位置的條件下，(b)在第一位置使第一核酸鏈產(chǎn)生切口和在第二位置使第二核酸鏈產(chǎn)生切口，其中第一和第二位置位于雙鏈核酸的不同位置上；和(C)以彼此相向的方向移動(dòng)第一切口的位置和第二切口的位置，直至第一切口與第二切口的位置對(duì)齊，以產(chǎn)生雙鏈缺口，從而片段化核酸。在一些實(shí)施方案中，第一和第二切口的位置可彼此接近以引起核酸的片段化。
[0150]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括另外的酶步驟來提高用于進(jìn)一步操作的片段的產(chǎn)率。例如，帶切口的核酸的5’末端可以不存在磷酸基團(tuán)，所述磷酸基團(tuán)可抑制另一個(gè)核酸片段的連接。在另一個(gè)實(shí)例中，帶切口的核酸的3’末端可具有可抑制切口平移的磷酸基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，所述方法可包括將磷酸添加至5’末端和/或從帶切口的核酸的3’末端除去磷酸的酶反應(yīng)。這些反應(yīng)可利用一種或多種酶來進(jìn)行，所述酶催化磷酸基團(tuán)至單鏈或雙鏈核酸的5’末端的添加和/或催化3’磷酸基團(tuán)從核酸的去除。在一些實(shí)施方案中，磷酸基團(tuán)的添加或去除可由多核苷酸激酶來催化。多核苷酸激酶可以是T4多核苷酸激酶，或可從其它來源(例如人)分離?？稍贏TP存在的情況下進(jìn)行多核苷酸激酶反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，還可包括將雙鏈缺口核酸與接頭接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括將雙鏈缺口核酸與一種或多種切口修復(fù)酶接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法可包括步驟:(a)提供具有第一和第二核酸鏈的雙鏈核酸；在適合于使第一核酸鏈產(chǎn)生切口，適合于使第二核酸鏈產(chǎn)生切口，適合于移動(dòng)第一切口的位置，適合于移動(dòng)第二切口的位置和/或適合于將磷酸基團(tuán)添加至第一或第二切口的5’末端或從第一或第二切口的3’末端除去磷酸基團(tuán)的條件下，b)在第一位置使第一核酸鏈產(chǎn)生切口以產(chǎn)生第一切口，和在第二位置使第二核酸鏈產(chǎn)生切口以產(chǎn)生第二切口，其中第一和第二位置位于雙鏈核酸的不同位置上；(C)以彼此相向的方向移動(dòng)第一切口的位置和第二切口的位置，直至第一切口和第二切口的位置對(duì)齊，以產(chǎn)生雙鏈缺口，從而片段化核酸；和(d)將磷酸基團(tuán)添加至第一或第二切口的5’末端或從第一或第二切口的3’末端除去磷酸基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，第一和第二切口的位置可彼此靠近以引起核酸的片段化。
[0151]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可產(chǎn)生具有至少一個(gè)平末端的片段，或可產(chǎn)生具有兩個(gè)平末端的片段。在一些實(shí)施方案中，使第一核酸鏈產(chǎn)生切口可由一種或多種酶來催化。
[0152]在一些實(shí)施方案 中，催化核酸產(chǎn)生切口的酶包括具有內(nèi)切核酸酶活性的酶。在一些實(shí)施方案中，使第一核酸鏈產(chǎn)生切口可在陽離子存在的情況下利用一種或多種酶來催化。在一些實(shí)施方案中，使第二核酸鏈產(chǎn)生切口可利用一種或多種酶來催化。在一些實(shí)施方案中，使第二核酸鏈產(chǎn)生切口可在陽離子存在的情況下利用一種或多種酶來催化。在一些實(shí)施方案中，陽離子可包括鎂、錳或鈣。在一些實(shí)施方案中，第一切口的位置和第二切口的位置可位于雙鏈核酸上的相同或不同位置。
[0153]在一些實(shí)施方案中，移動(dòng)第一切口的位置可在多種核苷酸(標(biāo)記的和/或未標(biāo)記的)存在的情況下利用一種或多種酶來催化。例如，可將核苷酸連接至標(biāo)記例如熒光、發(fā)光或放射性部分。在一些實(shí)施方案中，移動(dòng)第二切口的位置可在多種核苷酸(標(biāo)記的和/或未標(biāo)記的)存在的情況下利用一種或多種酶來催化。在一些實(shí)施方案中，催化切口平移的酶包括偶聯(lián)5’ 一3’聚合/降解反應(yīng)的酶或偶聯(lián)5’ 一3’聚合/鏈置換反應(yīng)的酶。
[0154]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法還包括非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)(例如，加尾反應(yīng))。在一些實(shí)施方案中，非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)可在多種核苷酸(標(biāo)記的或未標(biāo)記的)存在的情況下由一種或多種酶來催化。在一些實(shí)施方案中，非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)可在一種或多種類型的核苷酸(例如，A、G、C、T、U或其類似物)存在的情況下由一種或多種酶來催化。
[0155]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法還可包括，將寡核苷酸接頭連接至片段的至少一個(gè)末端。例如，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括步驟:(a)通過下列來產(chǎn)生核酸片段群體:(i)在每一條鏈上使核酸產(chǎn)生切口至少一次和(ii)切口平移所述切口，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂以產(chǎn)生核酸片段群體；和(b)將群體中的每一個(gè)片段的至少一個(gè)末端連接至寡核苷酸接頭，從而產(chǎn)生核酸文庫。
[0156]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括:(a)提供具有第一和第二核酸鏈的雙鏈核酸；在適合于使第一核酸鏈產(chǎn)生切口，適合于使第二核酸鏈產(chǎn)生切口，適合于移動(dòng)第一切口的位置，適合于移動(dòng)第二切口的位置，適合于將接頭連接至核酸片段和/或適合于切口修復(fù)與連接位置相對(duì)的核酸鏈的條件下，(b)在第一位置使第一核酸鏈產(chǎn)生切口以產(chǎn)生第一切口，和在第二位置使第二核酸鏈產(chǎn)生切口以產(chǎn)生第二切口，其中第一和第二位置位于雙鏈核酸的不同位置上；(C)以彼此相向的方向移動(dòng)第一切口的位置和第二切口的位置，直至第一切口和第二切口的位置對(duì)齊， 以產(chǎn)生雙鏈缺口，從而片段化核酸；(d)將寡核苷酸接頭連接至片段化核酸；使接頭-核酸片段變性；和切口修復(fù)與連接位置相對(duì)的核酸鏈。
[0157]在一些實(shí)施方案中，可在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)(與或不與核酸結(jié)合蛋白結(jié)合)，例如切口產(chǎn)生反應(yīng)和切口平移反應(yīng)，或切口產(chǎn)生反應(yīng)和連接反應(yīng)，或切口產(chǎn)生反應(yīng)和連接反應(yīng)以及切口修復(fù)反應(yīng)，或例如切口產(chǎn)生反應(yīng)和切口平移反應(yīng)以及加尾反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，可在分開的反應(yīng)容器中進(jìn)行(結(jié)合核酸結(jié)合蛋白或不結(jié)合核酸結(jié)合蛋白)不同反應(yīng)(例如，切口產(chǎn)生反應(yīng)、切口平移反應(yīng)、連接反應(yīng)、切口修復(fù)反應(yīng)和/或加尾反應(yīng))，或這些不同的反應(yīng)可在相同的反應(yīng)容器中在不同的時(shí)間進(jìn)行。
[0158]其它步驟
[0159]在一些實(shí)施方案中，可在片段化反應(yīng)后進(jìn)行另外的核酸操作。在一些實(shí)施方案中，可以以任何順序進(jìn)行另外的反應(yīng)的任何組合，所述另外的反應(yīng)可包括:化學(xué)修飾、大小選擇、末端修復(fù)、加尾、接頭-連接、連接、切口修復(fù)、純化、切口平移、擴(kuò)增、表面連接和/或測序。在一些實(shí)施方案中，這些反應(yīng)的任何反應(yīng)可被省略或重復(fù)。
[0160]在一些實(shí)施方案中，可進(jìn)行核酸片段化反應(yīng)和另外的反應(yīng)以制備核酸片段，所述核酸片段用于插入載體，用作探針，用作雙鏈和單鏈片段的來源，用作擴(kuò)增模板，或用于制備核酸文庫。
[0161]在一些實(shí)施方案中，核酸片段群體可被修飾以連接至表面。例如，核酸片段群體可被氨基修飾以連接至表面(例如，顆?；蚱矫姹砻?。在一些實(shí)施方案中，可將氨基修飾的核酸片段連接至用羧酸涂覆的表面。在一些實(shí)施方案中，可將氨基修飾的核酸與EDC(或EDAC)反應(yīng)以連接羧酸涂覆的表面(具有或不具有NHS)。在一些實(shí)施方案中，可將核酸片段連接至顆粒例如1n Sphere?顆粒(Life Technologies)。
[0162]在一些實(shí)施方案中，表面可以是物體的外面或最上面的層或邊界。在一些實(shí)施方案中，表面可以是固體表面或半固體表面。在一些實(shí)施方案中，表面可以是有孔的或無孔的。在一些實(shí)施方案中，表面可以是平面表面以及凹表面、凸表面或其任意組合。在一些實(shí)施方案中，表面可以是珠粒、顆粒、球、濾器、流動(dòng)池(flowcell)或凝膠。在一些實(shí)施方案中，表面包括通道、孔、凹槽、通道、儲(chǔ)液池、毛細(xì)管的內(nèi)壁。在一些實(shí)施方案中，表面可包括紋理(例如，蝕刻的、空化的、孔、三維支架或隆起)。在一些實(shí)施方案中，表面可由材料例如玻璃、硼硅玻璃、硅石、石英、熔融石英、云母、聚丙烯酰胺、塑料聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯(PMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅、鍺、石墨、陶瓷、硅、半導(dǎo)體、高折光率電介質(zhì)、晶體、凝膠、聚合物或膜(例如，金、銀、鋁或金剛石的膜)制造。在一些實(shí)施方案中，核酸片段可以以隨機(jī)模式、有組織的模式、直線模式、六邊形模式或可尋址陣列模式排列在表面上。
[0163]在一些實(shí)施方案中，核酸片段群體可被修飾以連接至結(jié)合伴侶的一個(gè)成員(例如，生物素)。在一些實(shí)施方案中，可將生物素化的核酸片段連接至結(jié)合伴侶的另一個(gè)成員(例如，抗生物素蛋白樣，例如鏈霉抗生物素蛋白)，所述另一個(gè)成員連接至表面。
[0164]在一些實(shí)施方案中，用作結(jié)合伴侶`的分子包括:生物素(及其衍生物質(zhì))和其結(jié)合伴侶抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白(及其衍生物)；與鎳、鈷或銅結(jié)合的His-標(biāo)簽；結(jié)合N1-NTA的半胱氨酸、組氨酸或組氨酸區(qū)段；與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)結(jié)合的麥芽糖；凝集素-碳水化合物結(jié)合伴侶；鈣-鈣結(jié)合蛋白(CBP);乙酰膽堿和受體-乙酰膽堿；蛋白A和結(jié)合伴侶抗-FLAG抗體；GST和結(jié)合伴侶谷胱甘肽；尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和Ugi (尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制劑)蛋白；結(jié)合抗體或抗體片段的抗原或表位標(biāo)簽，特別地抗原例如地高辛、熒光素、二硝基苯酚或溴脫氧尿苷及其各自的抗體；小鼠免疫球蛋白和山羊抗-小鼠免疫球蛋白；結(jié)合蛋白A的IgG ;受體-受體激動(dòng)劑或受體拮抗劑；酶-酶輔因子；酶-酶抑制劑；以及，甲狀腺素-皮質(zhì)醇。生物素的另一個(gè)結(jié)合伴侶可以是來自雞的生物素結(jié)合蛋白(Hytonen 等人，BMC Structural Biology7:8)。
[0165]在一些實(shí)施方案中，核酸片段群體可用于產(chǎn)生DNA片段，所述DNA片段經(jīng)選擇具有任何期望的大小或大小范圍，包括例如，在長度上約100至約250bp，用于制備SOLiD?片段文庫；在長度上約100至約300bp，用于制備1n Torrent PGM?片段文庫；或在長度上約
0.8kb至約1.4kb,用于制備SOLiD?配對(duì)文庫；或在長度上約100至約60kb,用于任何類型的核酸文庫。還可產(chǎn)生具有適合用于RNA文庫(例如，mRNA文庫、RNA-Seq文庫、全轉(zhuǎn)錄組文庫、細(xì)胞特異性RNA文庫)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)文庫和甲基化DNA文庫的大小或大小范圍的DNA片段。
[0166]文庫制備方法
[0167]在一些實(shí)施方案中，按照本公開內(nèi)容產(chǎn)生的核酸片段群體可用于制備任何類型的核酸文庫，所述文庫與任何類型的測序平臺(tái)(包括化學(xué)降解測序、鏈終止測序、邊合成邊測序、焦磷酸測序、大規(guī)模平行測序、離子敏感型測序和單分子測序平臺(tái))相容。例如，測序平臺(tái)可包括任何類型的測序反應(yīng)，包括:Maxam Gilbert、Sanger、毛細(xì)管電泳(例如,AppliedBiosystems,目前Life Technologies的一部分)，或任何類型的新一代測序平臺(tái)，包括寡核苷酸探針連接測序(例如，SOLiD)、探針-錨定分子連接測序(例如，Complete Genomics或Polonator)、邊合成邊測序(例如，Illumina, Helicos)、焦磷酸測序(例如,454/Roche)和離子敏感型測序(例如，1n Personal Genome Machine?,由 1n Torrent Systems, Inc.(Life Technologies Corp 的子公司),Carlsbad, California 生產(chǎn))。
[0168]在一些實(shí)施方案中，可在片段化反應(yīng)之后進(jìn)行另外的核酸操作，包括，另外的反應(yīng)的任意組合。另外的反應(yīng)可以以任何順序進(jìn)行，并且可包括:化學(xué)修飾、大小選擇、末端修復(fù)、加尾、連接、切口修復(fù)、接頭連接、純化、切口平移、擴(kuò)增、表面連接和/或測序。在一些實(shí)施方案中，這些反應(yīng)的任何反應(yīng)可被省略或重復(fù)。
[0169]在一些實(shí)施方案中，核酸片段化反應(yīng)可包括:大小選擇、接頭連接和切口平移。在一些實(shí)施方案中，核酸片段化反應(yīng)可包括:大小選擇、接頭連接、切口平移和擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，核酸片段化反應(yīng)可包括:連接、切口修復(fù)反應(yīng)和大小選擇。在一些實(shí)施方案中，核酸片段化反應(yīng)可包括:連接、切口修復(fù)反應(yīng)、大小選擇和擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，核酸片段化反應(yīng)可包括:純化、連接、切口修復(fù)反應(yīng)、純化和大小選擇。在一些實(shí)施方案中，核酸片段化反應(yīng)可包括:大小選擇、連接、切口修復(fù)反應(yīng)、純化和大小選擇。
[0170]在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增可包括熱循環(huán)擴(kuò)增或等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，可利用熱穩(wěn)定的或不耐熱的聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，可如PCR反應(yīng)一樣進(jìn)行擴(kuò)增。
[0171]在一些實(shí)施方案中，按照本公開內(nèi)容產(chǎn)生的核酸片段可導(dǎo)致優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)的有利方面。例如，按照本公開內(nèi)容產(chǎn)生的核酸片段可具有增加的產(chǎn)率。在一些實(shí)施方案中，按照本公開內(nèi)容產(chǎn)生的核酸片段以更有效的方式產(chǎn)生，從而減少產(chǎn)生片段化核酸文庫所需的時(shí)間的量。在一些實(shí)施方案中，按照本公開內(nèi)容的教導(dǎo)產(chǎn)生的核酸片段在產(chǎn)率上足以用于下游應(yīng)用而無需擴(kuò)增步驟。例如，按照本公開內(nèi)容產(chǎn)生的核酸片段可直接整合至下游模板制備步驟，例如使用1n Torrent?PGM系統(tǒng)的1n Xpress? Template試劑盒(例如，PCR介導(dǎo)的核酸片段文庫至 1n Sphere? Particles 上的添加)(Life Technologies, PartN0.4467389)。例如,從核酸片段文庫制備模板文庫的說明書可見于1n Xpress Template試劑盒用戶指南(Life Technologies, Part N0.4465884)(其通過引用整體并入本文)。用于將模板文庫加載至1n Torrent?芯片上以進(jìn)行測序的說明書描述于1n Sequencing用戶指南(Part N0.4467391)(其通過引用整體并入本文)。
[0172]大小選擇:
[0173]在一些實(shí)施方案中，可將核酸片段群體經(jīng)歷任何大小選擇法以獲得任何期望的大小范圍。在一些實(shí)施方案中，不對(duì)核酸片段群體進(jìn)行大小選擇。在一些實(shí)施方案中，通過實(shí)踐本公開內(nèi)容產(chǎn)生的核酸片段可經(jīng)大小選擇來產(chǎn)生核酸片段群體。
[0174]在一些實(shí)施方案中，核酸大小選擇法包括但不限于:固相粘附或固定；電泳，例如凝膠電泳；和層析，例如HPLC和大小排阻層析。在一些實(shí)施方案中，固相粘附/固定法包括，涂覆有化學(xué)官能團(tuán)的順磁性珠粒，所述官能團(tuán)在聚乙二醇或聚亞烷基二醇(polyalkyleneglycol)存在或不存在的情況下在某些離子強(qiáng)度條件下與核酸相互作用。
[0175]因相粘附/固定法的實(shí)例包括但不限于:其為羧化物修飾的順磁性珠粒的來自Agencourt (參見 Hawkinsl995Nucleic Acids Research23:22)的 SPRI (固相可逆固定)珠粒；MAGNA PURE 磁性玻璃顆粒(Roche Diagnostics, Hoffmann-La Roche Ltd.);來自Promega的MAGNESIL磁性珠粒試劑盒；來自Bilatec AG的BILATEST磁性珠粒試劑盒；來自 Precision System Science, Inc.的 MAGTRATION 順磁性系統(tǒng)；來自 Omega Bio-Tek 的MAG BIND ;來自 Merck/Estapor 的 MAGPREP 硅石；來自 Bangs 的 SNARe DNA 純化系統(tǒng)；來自CHEMAGEN的CHEMAGEN M-PVA珠粒；和來自Aline Bioscience (DNA純化試劑盒)的磁性珠粒。
[0176]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)大小選擇的核酸片段可以為約50_250bp、或約250_500bp、或約 500-750bp、或約 750-1000bp、或約 l_5kb、或約 5_10kb、或約 10_25kb、或約 25_50kb、或約50-60kb或更長。
[0177]修復(fù)核酸片段:
[0178]在一些實(shí)施方案中，修復(fù)核酸片段群體可以是令人期望的。在一些實(shí)施方案中，來自群體的核酸片段具有第一末端，第二末端，或內(nèi)部部分，具有不期望的特征，例如切口，懸突末端，不存在磷酸化末端的末端，具有磷酸化末端的末端或具有無嘌呤或無嘧啶殘基的核酸片段。在一些實(shí)施方案中，可進(jìn)行酶促反應(yīng)以修復(fù)一個(gè)或多個(gè)末端或內(nèi)部部分。在一些實(shí)施方案中，可將核酸片段經(jīng)歷酶促反應(yīng)以將懸突末端轉(zhuǎn)化成平末端，或使鏈的5’末端磷酸化或去磷酸化，或封閉切口，修復(fù)氧化的嘌呤或嘧啶，修復(fù)脫氨基的胞嘧啶，或水解無嘌呤或無嘧啶殘基。在一些實(shí)施方案中，修復(fù)或末端修復(fù)核酸片段包括將核酸片段:與封閉雙鏈體DNA中的單鏈切口的酶(例如，T4DNA連接酶)接觸；與磷酸化雙鏈體DNA的至少一條鏈的5’末端的酶(例如，T4多核苷酸激酶)接觸；與除去5’或3’磷酸的酶(例如，任何磷酸酶，例如牛腸道堿性磷酸酶、細(xì)菌堿性磷酸酶、奸堿性磷酸酶、南極磷酸酶(Antarcticphosphatase)和胎盤堿 性磷酸酶)接觸；除去3’懸突末端的酶(例如，DNA聚合酶1、大(Klenow)片段、T4DNA聚合酶、綠豆核酸酶)接觸；與填充5’懸突末端的酶(例如，T4DNA聚合酶、Tfi DNA聚合酶、Tli DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、大(Klenow)片段、phi29DNA聚合酶、Mako DNA聚合酶(Enyzmatics, Beverly, MA)或任何熱穩(wěn)定或不耐熱的DNA聚合酶)接觸；與除去5’懸突末端的酶(例如，SI核酸酶)接觸；與除去5’或3’懸突末端的酶(例如，綠豆核酸酶)接觸；與水解單鏈DNA的酶(例如，核酸酶Pl)接觸；與除去雙鏈DNA的兩條鏈的酶(例如，核酸酶Bal-31)接觸；和/或與除去無嘌呤或無嘧啶殘基的酶(例如，內(nèi)切核酸酶IV)接觸。在一些實(shí)施方案中，聚合酶可具有外切核酸酶活性，或具有減小的外切核酸酶活性或無外切核酸酶活性。
[0179]在一些實(shí)施方案中，可以以任何組合和任何量用另外的修復(fù)酶補(bǔ)充修復(fù)或末端修復(fù)反應(yīng),所述另外的修復(fù)酶包括:內(nèi)切核酸酶iv(無嘌呤-無嘧啶去除)、Bst DNA聚合酶(5’ 一 3’外切核酸酶，用于切口平移)、甲酰氨基嘧啶DNA糖基化酶(FPG)(例如，用于氧化嘌呤的堿基切除修復(fù))、尿嘧啶DNA糖基化酶(尿嘧啶去除)、T4內(nèi)切核酸酶V (嘧啶去除)和/或內(nèi)切核酸酶VIII (除去氧化的嘧啶)。在一些實(shí)施方案中，可在適當(dāng)?shù)妮o因子包括dNTP、NAD、(NH4)2SO4, KCl和/或MgSO4存在的情況下進(jìn)行修復(fù)或末端修復(fù)反應(yīng)。
[0180]接頭連接
[0181]在一些實(shí)施方案中，可將核酸片段群體(例如，通過本文中公開的任何方法產(chǎn)生的)連接至至少一種類型的核酸接頭(例如，寡核苷酸接頭)。在一些實(shí)施方案中，可將通過公開的方法產(chǎn)生的群體中的核酸片段的至少一個(gè)末端連接至一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸接頭以產(chǎn)生核酸文庫。
[0182]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:將至少一個(gè)雙鏈斷裂引入樣品核酸，以產(chǎn)生至少一個(gè)核酸片段；和將至少一個(gè)核酸片段的至少一個(gè)末端連接至一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸接頭，從而產(chǎn)生片段-接頭構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，片段-接頭構(gòu)建體可以是核酸文庫的部分。
[0183]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:將樣品核酸經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件；將樣品核酸經(jīng)歷切口平移條件以產(chǎn)生核酸片段；和將核酸片段的至少一個(gè)末端連接至一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸接頭，從而產(chǎn)生片段-接頭構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，片段-接頭構(gòu)建體可以是核酸文庫的部分。
[0184]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:使核酸產(chǎn)生切口 ；切口平移所述切口以產(chǎn)生核酸片段；和將核酸片段的至少一個(gè)末端連接至一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸接頭，從而產(chǎn)生片段-接頭構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，片段-接頭構(gòu)建體可以是核酸文庫的部分。
[0185]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法包括:(a)通過下列來產(chǎn)生核酸片段群體:(i)在每一條鏈上使核酸產(chǎn)生切口至少一次和(ii)切口平移所述切口(從而產(chǎn)生雙鏈斷裂以產(chǎn)生核酸片段群體)；和(b)將群體中的每一個(gè)片段的至少一個(gè)末端連接至寡核苷酸接頭，從而產(chǎn)生核酸文庫。
[0186]在一些實(shí)施方案中，可將核酸片段在一個(gè)或兩個(gè)末端連接至至少一個(gè)核酸接頭。在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸文庫構(gòu)建體的方法包括步驟:(a)通過下列來切割核酸:(i)在每一條鏈上使核酸產(chǎn)生切口至少一次和(ii)切口平移所述切口從而產(chǎn)生雙鏈斷裂以產(chǎn)生至少一個(gè)核酸片段，其中切口產(chǎn)生和/或切口平移步驟包括核酸結(jié)合蛋白；和(b)將至少一個(gè)核酸片段的至少一個(gè)末端連接至寡核苷酸接頭，從而產(chǎn)生片段-接頭分子。
[0187]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸文庫構(gòu)建體的方法包括步驟:(a)在每一條鏈上使核酸產(chǎn)生切口至少一次；(b)切口平移所述切口，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂，以產(chǎn)生至少一個(gè)核酸片段；(C)將至少一個(gè)核酸片段的至少一個(gè)末端連接至寡核苷酸接頭，從而產(chǎn)生片段_接頭分子。
[0188]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸文庫構(gòu)建體的方法包括步驟:(a)提供具有第一和第二核酸鏈的雙鏈核酸；(b)使第一核酸鏈產(chǎn)生切口至少一次以產(chǎn)生第一切口和使第二核酸鏈產(chǎn)生切口至少一次以產(chǎn)生第二切口 ；(c)切口平移第一切口和第二切口，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂以產(chǎn)生至少一個(gè)核酸片段；和(d)將核酸片段的至少一個(gè)末端連接至寡核苷酸接頭，從而產(chǎn)生片段-接頭分子。在一些實(shí)施方案中，片段-接頭分子可被產(chǎn)生來用于制備核酸文庫構(gòu)建體。
[0189]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸文庫構(gòu)建體的方法的任何步驟可包括核酸結(jié)合蛋白或可以不存在核酸結(jié)合蛋白。
[0190]在一些實(shí)施方案中，群體中的核酸片段包含第一末端和第二末端。在一些實(shí)施方案中，可將核酸片段在其第一末端連接至第一寡核苷酸接頭。在一些實(shí)施方案中，可將核酸片段在其第二末端連接至第二寡核苷酸接頭。在一些實(shí)施方案中，在雙鏈核酸片段的至少一個(gè)末端上，可將核酸片段的一條鏈 連接至雙鏈寡核苷酸接頭的一條鏈以產(chǎn)生具有斷裂(例如，切口或缺口)的片段-接頭分子。在一些實(shí)施方案中，在雙鏈核酸片段的至少一個(gè)末端上，可將核酸片段的兩條鏈連接至雙鏈寡核苷酸接頭的兩條鏈以產(chǎn)生片段-接頭分子。在一些實(shí)施方案中，第一和第二寡核苷酸接頭可以是相同或不同的接頭。在一些實(shí)施方案中，可通過將一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸接頭連接至核酸片段的兩個(gè)末端來環(huán)化核酸片段。在一些實(shí)施方案中，可利用連接酶、PCR擴(kuò)增、核苷酸聚合或其任意組合將核酸片段連接至至少一個(gè)接頭。在一些實(shí)施方案中，可將核酸片段的一個(gè)或兩個(gè)末端連接至一個(gè)或多個(gè)接頭，可在溶液中進(jìn)行連接反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，可將核酸片段的一個(gè)或兩個(gè)末端連接至至少一個(gè)類型的寡核苷酸接頭。在一些實(shí)施方案中，可通過連接或退火連接核酸片段與接頭。
[0191]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可以是DNA、RNA或嵌合RNA/DNA分子。在一些實(shí)施方案中，接頭可包括一個(gè)或多個(gè)核糖核苷殘基。在一些實(shí)施方案中，接頭可以是單鏈或雙鏈核酸，或可包括單鏈或雙鏈部分。在一些實(shí)施方案中，接頭可具有任何結(jié)構(gòu)，包括線性、發(fā)夾、分叉或莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0192]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可以是包括具有懸突粘性部分的雙鏈寡核苷酸接頭(雙鏈體)的封閉寡核苷酸接頭，所述懸突粘性部分與封閉寡核苷酸(其為分開的單鏈寡核苷酸)退火(2011年9月29日提交的PCT/US2011/054053)。
[0193]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可具有任何長度，包括在長度上少于10個(gè)堿基，或在長度上為約10-20個(gè)堿基，或在長度上為約20-50個(gè)堿基，或在長度上為約50-100個(gè)堿基，或更長。
[0194]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可具有平末端和/或粘性末端的任意組合。在一些實(shí)施方案中，接頭的至少一個(gè)末端可與核酸片段的至少一個(gè)末端相容。在一些實(shí)施方案中，可將接頭的相容 性末端連接至核酸片段的相容性末端。在一些實(shí)施方案中，接頭可具有5’或3’懸突末端。
[0195]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可包括具有任何長度的單體序列(例如，AAA、TTTXCC或GGG)，或接頭可包括復(fù)雜序列(例如，非單體序列)，或可包括單體和復(fù)雜序列。
[0196]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可具有5’或3’尾。在一些實(shí)施方案中,尾在長度上可以是1、2、3或更多個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，接頭可具有包含A、T、C、G和/或U的尾。在一些實(shí)施方案中，接頭可擁有具有任意長度的單體尾序列。在一些實(shí)施方案中，接頭的至少一個(gè)末端可具有與核酸片段的一個(gè)末端上的尾相容的尾。
[0197]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可包含內(nèi)部切口。在一些實(shí)施方案中，接頭可具有至少一條缺乏5’末端磷酸殘基的鏈。在一些實(shí)施方案中,可將缺乏末端5’磷酸殘基或缺乏末端3’OH的接頭連接至核酸片段，以在接頭與核酸片段之間的連接處引入切口。在一些實(shí)施方案中，可將接頭連接至片段化核酸。在一些實(shí)施方案中，接頭至片段化核酸的連接導(dǎo)致在核酸鏈中形成與連接位點(diǎn)相對(duì)的切口。在一些實(shí)施方案中，與連接位點(diǎn)相對(duì)的切口可通過如下步驟來修復(fù):使接頭變性(從而釋放鄰近切口的接頭的核苷酸至接頭的末端)，使用切口修復(fù)酶將核酸鏈從切口位點(diǎn)延伸至接頭的末端。在一些實(shí)施方案中，用于修復(fù)核酸鏈的切口修復(fù)酶可以是Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Plat inum⑧Pfx DNA
聚合酶(Invitrogen)、Tfi Exo(-)DNA 聚合酶(Invitrogen)或Phusion? Hot StartHigh-Fidelity DNA 聚合酶(New England Biolabs)。[0198]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可包括與測序引物或擴(kuò)增引物互補(bǔ)的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，接頭可包括通用序列，該通用序列包含這樣的核苷酸序列，其為通用接頭、PI接頭、P2接頭、A(離子相容性接頭)、IA(內(nèi)部接頭)、條形碼序列、擴(kuò)增引物或測序引物的一部分，或與之互補(bǔ)。
[0199]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可包括簡并序列。在一些實(shí)施方案中，接頭可包括一個(gè)或多個(gè)肌苷殘基。
[0200]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可包括至少一個(gè)易切斷的連接。在一些實(shí)施方案中，易切斷的連接可對(duì)酶或化合物的切割或降解易感。在一些實(shí)施方案中，接頭可包括至少一個(gè)硫代磷酸酯(phosphorothiolate)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)和/或氨基磷酸酯連接。
[0201 ] 在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可包括標(biāo)識(shí)序列。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)識(shí)序列可用于分選或跟蹤。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)識(shí)序列可以是獨(dú)特序列(例如，條形碼序列)。在一些實(shí)施方案中，條形碼序列可允許在具有不同條形碼序列的不同接頭的混合物中鑒定特定接頭。例如，混合物可包含2、3、4、5、6、7-10、10-50、50-100、100-200、200-500、500-1000、或更多個(gè)不同的具有獨(dú)特條形碼序列的接頭。
[0202]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可包括任何類型的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，包括I型、II型、IIs型、IIB型、III型或IV型限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。
[0203]在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸接頭可包括細(xì)胞調(diào)控序列，包括啟動(dòng)子(誘導(dǎo)型或組成型)、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄或翻譯起始序列、轉(zhuǎn)錄或翻譯終止序列、分泌信號(hào)、Kozak序列、細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合序列等。
[0204]純化步驟
[0205]在一些實(shí)施方案中，可將核酸片段群體經(jīng)歷任何純化法以除去不期望的材料(緩沖劑、鹽、酶、引物二聚體或過量的接頭或引物)。在一些實(shí)施方案中，可在任意兩個(gè)步驟之間進(jìn)行純化法，以除去緩沖劑、鹽、酶、接頭、未反應(yīng)的核酸片段等。純化法包括但不限于:珠粒純化、柱純化、凝膠電泳、透析、醇沉淀和大小選擇性PEG沉淀。
[0206]核酸
[0207]在一些實(shí)施方案中，待片段化的適當(dāng)?shù)暮怂針悠房砂▎捂満碗p鏈核酸。在一些實(shí)施方案中，核酸可包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物的聚合物。在一些實(shí)施方案中，核酸可包括天然存在的和合成的形式。在一些實(shí)施方案中，核酸包括單鏈和雙鏈分子。在一些實(shí)施方案中，核酸可包括DNA、cDNA、RNA或嵌合RNA/DNA。
[0208]在一些實(shí)施方案中，待片段化的核酸樣品可包括單鏈或雙鏈DNA。在一些實(shí)施方案中，可以以任何形式分離待片段化的核酸，包括染色體、基因組、細(xì)胞器(例如，線粒體、葉綠體或核糖體)、重組分子、克隆的、擴(kuò)增的(例如，PCR擴(kuò)增的)、cDNA、RNA例如前體mRNA或mRNA、寡核苷酸，或任何類型的核酸文庫例如擴(kuò)增子文庫。在一些實(shí)施方案中，可從任何來源分離待片段化的核酸，所述來源包括生物體例如原核生物、真核生物(例如,人、植物和動(dòng)物)、真菌和病毒；細(xì)胞；組織；正常或患病細(xì)胞或組織或器官；體液，包括血液、尿、血清、淋巴、腫瘤、唾液、肛門和陰道分泌物、羊膜樣品、汗和精液；環(huán)境樣品；培養(yǎng)樣品；或使用重組分子生物學(xué)或化學(xué)合成法制備的合成的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，待片段化的核酸可經(jīng)化學(xué)合成來包括任何類型的核酸類似物。在一些實(shí)施方案中，可從福爾馬林固定的組織，或從石蠟包埋的組織，或從福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的組織分離待片段化的核酸。
[0209]在一些實(shí)施方案中，待片段化的核酸可為約100bp-1000bp，或約lkb_50kb，或約50kb-100kb 或更長。
[0210]在一些實(shí)施方案中，待片段化的核酸可包括約0-10%，或約10-25%，或約25_40%，或約40-55%，或約55-70%，或約70_85%，或約85-100%的GC%含量。
[0211]在一些實(shí)施方案中，核酸片段化反應(yīng)可利用約0.01-0.lng，或約0.l_lng，或約l-5ng,或約 5-10ng,或約 10_50ng,或約 50_100ng,或約 100_500ng,或約 500_1000ng,或約 l-2ug,或約 2-5ug,或約 5-10ug,或約 10_50ug,或約 50_100ug,或約 100_500ug,或約500-1000ug或更多來進(jìn)行。
[0212]聚合酶
[0213]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括一種或多種不同的聚合酶。在一些實(shí)施方案中，聚合酶包括可催化核苷酸和/或核苷酸類似物的聚合的任意酶或其片段或亞基。在一些實(shí)施方案中，聚合酶需要核酸引物的末端3’ OH來起始核苷酸聚合。在一些實(shí)施方案中，接頭核酸為聚合酶提供末端3’ OH以聚合核苷酸。
[0214]聚合酶包括可催化核苷酸(包括其類似物)聚合至核酸鏈中的任何酶。通常地但非必需地，此類核苷酸聚合可以以模板依賴性方式發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，聚合酶可以是高保真聚合酶。此類聚合酶可包括但不限于，天然存在的聚合酶及其任何亞基和截短形式、突變體聚合酶、變體聚合酶、重組聚合酶、融合聚合酶或另外地工程化的聚合酶、化學(xué)修飾的聚合酶、合成的分子或`裝配體，及保持催化此類聚合的能力的其任何類似物、衍生物或片段。任選地，聚合酶可以是包含一個(gè)或多個(gè)突變的突變體聚合酶，包括用其它氨基酸進(jìn)行的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、一個(gè)或多個(gè)氨基酸從聚合酶的插入或缺失、或兩個(gè)或更多個(gè)聚合酶的部分的連接。術(shù)語"聚合酶"及其變體，如本文中所用，還指包含彼此連接的至少兩個(gè)部分的融合蛋白，其中第一部分包含可催化核苷酸聚合至核酸鏈中的肽，并且連接至包含第二肽(例如報(bào)告酶或持續(xù)合成能力增強(qiáng)結(jié)構(gòu)域)的第二部分。通常地，聚合酶包含核苷酸結(jié)合和/或核苷酸聚合的催化可在其上發(fā)生的一個(gè)或多個(gè)活性部位。在一些實(shí)施方案中，聚合酶包括其它酶促活性例如3’至5’外切核酸酶活性或5’至3’外切核酸酶活性。在一些實(shí)施方案中，聚合酶可從細(xì)胞分離，或使用重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成法產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，可在原核生物、真核生物、病毒或噬菌體生物中表達(dá)聚合酶。在一些實(shí)施方案中，聚合酶可以是翻譯后修飾的蛋白或其片段。
[0215]在一些實(shí)施方案中，聚合酶可以是DNA聚合酶，包括但不限于細(xì)菌DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶、古細(xì)菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶和噬菌體DNA聚合酶。
[0216]在一些實(shí)施方案中，聚合酶可以是復(fù)制酶、依賴于DNA的聚合酶、引發(fā)酶、依賴于RNA的聚合酶(包括依賴于RNA的DNA聚合酶，例如逆轉(zhuǎn)錄酶)、鏈置換聚合酶、不耐熱的聚合酶或熱穩(wěn)定性聚合酶。在一些實(shí)施方案中，聚合酶可以是家族A或B的任何類型的聚合酶。許多類型的家族A (例如，大腸桿菌Pol I)、B(例如，大腸桿菌Pol II)、C(例如，大腸桿菌 Pol III)、D (例如,廣古菌門(Euryarchaeotic) Pol II)，X (例如，人 Pol β )和 Y (例如，大腸桿菌UmuC/DinB和真核生物RAD30/著色性干皮病(xeroderma pigmentosum)變體)聚合酶描述于 Rothwell 和 Watsman2005Advances in Protein Chemistry71:401-440中。在一些實(shí)施方案中，聚合酶可以是T3、T5、T7或SP6RNA聚合酶。
[0217]一些示例性聚合酶包括但不限于DNA聚合酶(例如Phi_29DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和大腸桿菌DNA聚合酶)和RNA聚合酶。[0218]在一些實(shí)施方案中，古細(xì)菌DNA聚合酶可以是但不限于，熱穩(wěn)定或嗜熱的DNA聚合酶，例如:水生棲熱菌(Thermus aquaticus) (Taq)DNA聚合酶；絲狀棲熱菌(Thermusfiliformis) (Tfi)DNA 聚合酶；速生熱球菌(Thermococcus zilligi) (Tzi)DNA 聚合酶;嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus) (Tth)DNA 聚合酶；黃棲熱菌(Thermus fIavus)(Tfl) DNA聚合酶；烏茲熾熱球菌(Pyrococcus woesei) (Pwo) DNA聚合酶；強(qiáng)烈熾熱球菌(Pyrococcus furiosus) (Pfu)DNA 聚合酶以及 Turbo Pfu DNA 聚合酶；Thermococcuslitoralis (Tli) DNA聚合酶或Vent DNA聚合酶；熾熱球菌屬的種(Pyrococcus sp.)的GB-D 聚合酶；〃Deep Vent〃DNA 聚合酶(New England Biolabs);海棲熱袍菌(Thermotogamaritima) (Tma)DNA 聚合酶；嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus) (Bst)DNA 聚合酶；Pyrococcus Kodakaraensis (KOD) DNA 聚合酶；Pfx DNA 聚合酶；熱球菌屬的種(Thermococcus sp.)的 JDF-3 (JDF-3) DNA 聚合酶；Thermococcus gorgonarius (Tgo)DNA 聚合酶；Thermococcus acidophilium DNA 聚合酶；酸熱硫化葉菌(Sulfolobusacidocaldarius)DNA 聚合酶；熱球菌屬的種(Thermococcus sp.)的 9° N-7DNA 聚合酶；熱球菌屬的種(Thermococcus sp.)NAl ;隱蔽熱網(wǎng)菌(Pyrodictium occultum)的 DNA 聚合酶；沃氏甲燒球菌(Methanococcus voltae)DNA聚合酶；熱自養(yǎng)甲燒球菌(Methanococcusthermoautotrophicum) DNA聚合酶；詹氏甲燒球菌DNA聚合酶；脫硫球菌屬TOK菌株的DNA聚合酶(D.Tok Pol) ；Pyrococcus abyssi DNA 聚合酶；Pyrococcus horikoshii DNA 聚合酶；Pyrococcus islandicum DNA 聚合酶；棲煙園熱球菌(Thermococcus fumicolans) DNA聚合酶；Aeropyrum pernix DNA聚合酶；或異二聚體DNA聚合酶DP1/DP2。在一些實(shí)施方案中，聚合酶可以是商購可得的聚合酶。例如AmpliTaq?或AmpliTaq Gold?(兩者都來自Applied Biosystems)。
[0219]這些和其它聚合酶由Rothwell 和 Watsman (2005Advances in ProteinChemistry71:401-440)進(jìn)行了描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，選擇哪一種聚合酶來進(jìn)行切割、切口平移和/或加尾反應(yīng)。
[0220]切口產(chǎn)生反應(yīng)
[0221]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括利用酶使核酸產(chǎn)生切口。在一些實(shí)施方案中，使核酸產(chǎn)生切口的酶包括具有內(nèi)切核酸酶活性，且具有或不具有外切核酸酶活性的任何酶。在一些實(shí)施方案中，使核酸產(chǎn)生切口的酶包括可催化雙鏈核酸的一條或兩條鏈產(chǎn)生切口的任何酶。在一些實(shí)施方案中，使核酸產(chǎn)生切口的酶包括可催化在雙鏈核酸的一條或兩條鏈的隨機(jī)位置引入切口的任何酶。在一些實(shí)施方案中，使核酸產(chǎn)生切口的酶包括可在雙鏈核酸的任一條鏈的隨機(jī)(或幾乎隨機(jī))位置上引入一個(gè)或多個(gè)切口的任何酶。在一些實(shí)施方案中，使核酸產(chǎn)生切口的酶包括可在雙鏈核酸的任一條鏈的任何位置上以非特異性序列方式引入一個(gè)或多個(gè)切口的任何酶。在一些實(shí)施方案中，使核酸產(chǎn)生切口的酶包括從任何生物或組織分離的，或作為重組酶分離的任何野生型或突變型脫氧核糖核酸酶I (DNA酶I)。在一些實(shí)施方案中，DNA酶I可從牛分離。在一些實(shí)施方案中，DNA酶I可從胰腺分離。[0222]在一些實(shí)施方案中，使核酸產(chǎn)生切口的酶可以是來自弧菌科(Virionaceae)例如弧菌屬(Vibrio)(其包括創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus))的DNA酶。在一些實(shí)施方案中，使核酸產(chǎn)生切口的酶可以是Vvn核酸酶。在一些實(shí)施方案中，使核酸產(chǎn)生切口的酶可以是來自霍亂弧菌(Vibrio cholera)的核酸酶(Focareta和Manningl987Gene53 (I): 31-400),或來自菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)的 NucM聚合酶(Moulardl993Mol.Microbiol.8) 4): 685-695),或來自大腸桿菌的 Endo I 核酸酶(Jekell995Genel54(I):55-59),或來自嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydwphila)的 Dns 或DnsH核酸酶(Changl992Genel22 (I): 175-180，Doddl999FEMS Microbiol.Lett.173:41-46，和Wang2007Nucleic Acids Research35:584-594)。在一些實(shí)施方案中，使核酸產(chǎn)生切口的酶可以是來自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)例如沙雷氏菌屬(Serratia)(其包括粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens))的 DNA 酶(Benzonase?,美國專利 N0.5，173，418)。
[0223]在一些實(shí)施方案中，使核酸產(chǎn)生切口的酶未顯示或幾乎未顯示對(duì)在具有較高或較低GC%含量的序列(包括具有約0-10%，或約10-25%，或約25-40%，或約40_55%，或約55-70%,或約70-85%，或約85-100%的GC%含量的核酸)上使核酸產(chǎn)生切口的偏愛性。
[0224]切口平移
[0225]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括切口平移反應(yīng)。切口平移可包括，籍以有效地將核酸鏈內(nèi)的切口位置移至核酸鏈中的新位置的任何過程或處理。切口平移通常包括一條新鏈的延伸(伴隨另一條新鏈的降解或侵蝕)。在一些實(shí)施方案中，切口平移包括核苷酸或核苷酸類似物至新的3’末端上的聚合，以及核苷酸從新的5’末端的降解或侵蝕。對(duì)于至新的3’末端上的每一次連續(xù)核苷酸聚合，切口的位置沿著帶切口的鏈有效地移動(dòng)一個(gè)核苷酸位置。切口平移可任選地持續(xù)進(jìn)行，直至切口被平移至帶切口的鏈的末端，或直至平移的切口與相反鏈中的另一個(gè)切口完全對(duì)齊或與其充分靠近，從而形成雙鏈斷裂，導(dǎo)致產(chǎn)生兩個(gè)來源于原始雙鏈核酸的核酸片段。雙鏈斷裂可在所得的核酸片段中產(chǎn)生兩個(gè)平末端或兩個(gè)新的“粘性”末端。
[0226]在一些實(shí)施方案中 ，切口平移可包括兩個(gè)或更多個(gè)酶促活性，所述酶促活性作用于雙鏈核酸以:(1)使雙鏈核酸產(chǎn)生切口和(2)平移切口。例如，切口產(chǎn)生酶可將切口引入至少一條核酸鏈，并且聚合酶可在切口上發(fā)揮作用，以以5’ 一3’方向除去核苷酸(外切核酸酶活性)，同時(shí)以5’ 一3’方向摻入核苷酸(聚合活性)?；蛘撸锌诋a(chǎn)生酶可將切口引入至少一條核酸鏈，并且聚合酶可以以5’ 一3’方向移動(dòng)以置換一條鏈(鏈置換活性)，同時(shí)以5’ 一 3’方向摻入核苷酸(聚合活性)。
[0227]在一些實(shí)施方案中，可通過使雙鏈核酸上的切口與聚合酶反應(yīng)來使切口位置移至新位置，所述聚合酶以5’ 一3’方向移動(dòng)以降解核苷酸或核苷(外切核酸酶活性)，同時(shí)以5’ 一3’方向?qū)⒑塑账峋酆现燎锌诘挠坞x3’末端上(聚合活性)。
[0228]在一些實(shí)施方案中，可將雙鏈核酸上的切口與聚合酶反應(yīng)，所述聚合酶以5’ 一 3’方向移動(dòng)以置換一條鏈(鏈置換活性)，同時(shí)以5’ 一3’方向?qū)⒑塑账峋酆现燎锌诘挠坞x3’末端(聚合活性)。
[0229]在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)可利用一種或多種酶來催化，所述酶偶聯(lián)5’ 一3’核酸聚合與降解反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)可利用具有5’ 一3’核苷酸聚合活性和5’ 一3’外切核酸酶活性的任何核酸聚合酶來催化。在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)可利用不存在3’ 一5’外切核酸酶活性的任何核酸聚合酶來催化。在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)可利用任何DNA聚合酶來催化。在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)可利用任何家族A DNA聚合酶(也稱為pol I家族)來催化。在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)可利用Klenow片段來催化。
[0230]在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)可利用大腸桿菌DNA Pol I來催化。在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)可利用一種或多種具有5’ 一3’核苷酸聚合活性和5’ 一3’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定酶來催化。在一些實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定的酶包括Taq聚合酶(來自水生棲熱菌)、Tfi聚合酶(來自絲狀棲熱菌)、Pfu聚合酶(來自強(qiáng)烈熾熱球菌)、Tth (來自嗜熱棲熱菌)、Pow聚合酶(來自烏茲熾熱球菌)、Tli聚合酶(來自Thermococcus litoralis)、Pol I 和 II 聚合酶(來自 Pyrococcus abyssi)和 Pab (來自 Pyrococcus abyssi)。
[0231]在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)可利用一種或多種偶聯(lián)5’至3’DNA聚合與鏈置換反應(yīng)的酶來催化。在一些實(shí)施方案中，鏈置換聚合酶包括Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Bst聚合酶(來自嗜熱脂肪芽孢桿菌)、Tli聚合酶、9° N聚合酶和phi29聚合酶。
[0232]在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)可通過解旋酶和DNA聚合酶的組合來催化。
[0233]在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)包括切口平移酶和至少一種類型的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，切口平移酶在切口位點(diǎn)催化一個(gè)或多個(gè)核苷酸至新的3’末端的聚合。在一些實(shí)施方案中，被聚合至新的3’末端上的核苷酸可以是未被標(biāo)記的或被可檢測部分標(biāo)記，或可以是未標(biāo)記的和標(biāo)記的核苷酸的組合。在一些實(shí)施方案中，切口平移反應(yīng)可產(chǎn)生未標(biāo)記的或標(biāo)記的末端。
[0234]加尾
[0235]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)(例如，加尾反應(yīng))。在一些實(shí)施方案中，非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)可利用Taq聚合酶、Tfi DNA聚合酶、3’外切核酸酶minus-大(Klenow)片段或3’外切核酸酶minus_T4聚合酶催化。
[0236]切口修復(fù)
[0237]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括切口修復(fù)酶(例如，切口修復(fù)或切口修復(fù)反應(yīng))。在一些實(shí)施方案中，切口修復(fù)反應(yīng)可利用切口修復(fù)聚合酶例如 Taq DNA 聚合酶、Bst DNA 聚合酶、Plat inum? Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen)、Tfi
Exo (-)DNA 聚合酶(Invitrogen)或PtlUSioil? Hot Start High-Fidelity DNA 聚合酶(New England Biolabs)來催化。在一些實(shí)施方案中，切口修復(fù)酶可用于將核酸鏈從切口位置延伸至接頭序列的原始末端。
[0238]核苷酸
[0239]在一些實(shí)施方案 中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可利用一個(gè)或多個(gè)類型的核苷酸來進(jìn)行。核苷酸包括可選擇性地結(jié)合聚合酶或可被聚合酶聚合的任意化合物。通常但非必需地，在核苷酸與聚合酶的選擇性結(jié)合后，聚合酶將核苷酸聚合至核酸鏈中；然而，偶然地核苷酸可從聚合酶解離而不被摻入核酸鏈(該事件在本文中稱為“非生產(chǎn)性”事件)。此類核苷酸不僅包括天然存在的核苷酸，而且還包括可選擇性地結(jié)合至聚合酶或可被聚合酶聚合的任何類似物，無論它們的結(jié)構(gòu)如何。雖然天然存在的核苷酸通常包含堿基、糖和磷酸部分，但本公開內(nèi)容的核苷酸可包括缺乏任一個(gè)、一些或全部此類部分的化合物。在一些實(shí)施方案中，核苷酸可任選地包括磷原子的鏈，其包含3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)磷原子。在一些實(shí)施方案中，可將磷鏈連接至糖環(huán)的任何碳例如5’碳?？赏ㄟ^間插O或S將磷鏈連接至糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，鏈中的一個(gè)或多個(gè)磷原子可以是具有P和O的磷酸基團(tuán)的部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可利用間插的0、NH、S、亞甲基、取代的亞甲基、亞乙基、取代的亞乙基、CNH2X(O) ,C(CH2) 'CH2CH2或C(0H)CH2R(其中R可以是4-吡啶或1-咪唑)將鏈中的磷原子連接在一起。在一個(gè)實(shí)施方案中，鏈中的磷原子可具有擁有O、BH3或S的側(cè)基。在磷原子鏈中，具有除O外的側(cè)基的磷原子可以是取代的磷酸基團(tuán)。在磷鏈中，具有除O外的間插原子的磷原子可以是取代的磷酸基團(tuán)。核苷酸類似物的一些實(shí)例描述于Xu，美國專利N0.7，405，281 中。
[0240]可用于公開的方法和組合物的核苷酸的一些實(shí)例包括但不限于，核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、修飾的核糖核苷酸、修飾的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸多磷酸、脫氧核糖核苷酸多磷酸、修飾的核糖核苷酸多磷酸、修飾的脫氧核糖核苷酸多磷酸、肽核苷酸、修飾的肽核苷酸、金屬核苷酸、核苷膦酸酯和修飾的磷酸-糖主鏈核苷酸、前述化合物的類似物、衍生物或變體等。在一些實(shí)施方案中，核苷酸可包含替代氧部分(其橋連核苷酸的α磷酸和糖、或核苷酸的α和β磷酸、或核苷酸的β和Y磷酸、或核苷酸的任何其它兩個(gè)磷酸之間、或其任意組合)的非氧部分例如硫代-或borano-部分。
[0241]在一些實(shí)施方案中，核苷酸包含標(biāo)記并且在本文中稱為〃標(biāo)記的核苷酸〃；標(biāo)記的核苷酸的標(biāo)記在本文中稱為“核苷酸標(biāo)記”。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記可以以連接至核苷酸的任何部分(包括堿基，糖，或任何間插磷酸基團(tuán)，或末端磷酸基團(tuán)，即離糖最遠(yuǎn)的磷酸基團(tuán))的熒光染料的形式存在。
[0242]標(biāo)記
[0243]在一些實(shí)施方 案中，可將核苷酸(或其類似物)連接至標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記包括可檢測部分。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記可產(chǎn)生或引起產(chǎn)生可檢測信號(hào)?？蓹z測信號(hào)可從化學(xué)或物理變化(例如，熱、光、電、pH、鹽濃度、酶促活性或接近事件)產(chǎn)生。例如，接近事件可包括彼此靠近、或彼此締合或彼此結(jié)合的兩個(gè)報(bào)告部分。可檢測部分可通過光學(xué)方法、電學(xué)方法、化學(xué)方法、酶促方法、熱學(xué)方法，或通過質(zhì)譜法或拉曼光譜法來檢測。標(biāo)記可包括發(fā)光的、光致發(fā)光的、電致發(fā)光的、生物發(fā)光的、化學(xué)發(fā)光的、熒光的、發(fā)磷光的或電化學(xué)的化合物。標(biāo)記可包括為熒光團(tuán)、生色團(tuán)、放射性同位素、半抗原、親和標(biāo)簽、原子或酶的化合物。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記包含通常不存在于天然存在的核苷酸中的部分。例如，標(biāo)記可包括熒光、發(fā)光或放射性部分。
[0244]核酸結(jié)合蛋白
[0245]在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法可包括，用結(jié)合核酸的蛋白質(zhì)(例如，核酸結(jié)合蛋白)結(jié)合核酸，或可缺少該步驟。在一些實(shí)施方案中，所述方法可包括在任何步驟用核酸結(jié)合蛋白結(jié)合核酸，這可進(jìn)行一次，或可重復(fù)進(jìn)行。
[0246]在一些實(shí)施方案中，所述方法可包括在切口產(chǎn)生反應(yīng)之前、期間和/或之后用核酸結(jié)合蛋白結(jié)合核酸。在一些實(shí)施方案中，所述方法可包括在切口平移反應(yīng)之前、期間和/或之后用核酸結(jié)合蛋白結(jié)合核酸。例如，可將核酸在核酸結(jié)合蛋白存在的情況下經(jīng)歷切口產(chǎn)生反應(yīng)和/或切口平移反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，可在進(jìn)行切口產(chǎn)生反應(yīng)和/或切口平移反應(yīng)之后添加核酸結(jié)合蛋白。
[0247]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以是蛋白質(zhì)或至少其部分。
[0248]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以是結(jié)合核酸的多聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物(例如，二聚體、三聚體、四聚體或更高級(jí)多聚體)。在一些實(shí)施方案中，多聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物可以是雜多聚體或同多聚體。在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可結(jié)合DNA、RNA或其任何類似物或衍生物。在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以以更高的親和力結(jié)合單鏈核酸(與結(jié)合雙鏈或三鏈核酸相比較)。在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以是單鏈核酸結(jié)合蛋白(Chase 和 Williamsl986Ann.Rev.Biochem.55:103-136)。在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可結(jié)合雙鏈或單鏈(例如，recA可結(jié)合3條核酸鏈)。在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可結(jié)合折疊的或非折疊的核酸。在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以不顯示或幾乎不顯示對(duì)于結(jié)合核酸的序列特異性。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核酸結(jié)合蛋白可結(jié)合核酸鏈。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)核酸結(jié)合蛋白可協(xié)同地結(jié)合核酸鏈(Lohman 和 Ferrari 1994Ann.Rev.Biochem.63:527-570)或可非協(xié)同地結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以是野生型、突變體或截短的。在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以是天然存在的或可以是使用重組DNA法制備的重組蛋白(Haseltine2002Mol.Microbiol.43:1505-1515)。
[0249]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以是嗜溫性或熱穩(wěn)定的蛋白。熱穩(wěn)定核酸結(jié)合蛋白可抵抗通過加熱(例如在約50-95°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行15秒至10分鐘或更長時(shí)間)進(jìn)行的滅活。例如，熱穩(wěn)定核酸結(jié)合蛋白可在約50-95°C的溫度范圍內(nèi)保持約50-95%的活性。
[0250]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可來自任何類型的生物，包括原核生物、真核生物、病毒或噬菌體。核 酸結(jié)合蛋白可源自任何類型的細(xì)胞、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物。來自真核生物的核酸結(jié)合蛋白可源自任何細(xì)胞器，包括細(xì)胞核、線粒體或葉綠體，或可源自細(xì)胞質(zhì)。來自真核生物的核酸結(jié)合蛋白可源自任何器官，包括胸腺。來自原核生物的核酸結(jié)合蛋白可以是附加體編碼的。
[0251]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可介導(dǎo)體內(nèi)和/或體外反應(yīng)，包括:DNA復(fù)制、修復(fù)和 / 或重組(Kowalczykowski 1994Microbiol Rev.58:401-465 ;Lohman 和Ferrari1994Ann.Rev.Biochem.63:527-570 ；Woldl997Annu.Rev.Biochem.66:61-92 ；Chedinl998Trends Biochem.Sc1.23:273-277 ；KelIy1998Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:14634-14639 ；Iftodyl999Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol34:141-180)；螺旋去穩(wěn)定化；DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的減少；互補(bǔ)序列的復(fù)性；核酸免受核酸酶降解的保護(hù)作用；和/或通過同源重組進(jìn)行的修復(fù)(例如，RecAj Zhumabayeval990Biotechniques27:834-845 ；LexAjRadmanj 1974〃Phenomenology of an inducible mutagenic DNA repair pathwayin Escherichia col1: SOS repair hypothesis〃in Sherman (ed)in:Molecular andEnvironmental Aspects of Mutagenesis, Springfield, ILj Charles C.Thomaspublisher, pp.128-142 ;和 Bridges2005, in:DNA Repair, (Amst) vol4 (6)，pp.725-739) 0
[0252]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可包括一個(gè)或多個(gè)具有終止于α螺旋的五鏈反向平行β桶的OB折疊或OB折疊樣結(jié)構(gòu)(寡核苷酸/寡糖結(jié)合折疊)(Μιιι^?ηΝθβΕΜΒΟJ.12:861-867 ；Philipoval996Genes Dev.10:2222-2233)0[0253]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以是噬菌體T4gp32蛋白(Williamsl981J.Biol.Chem.256:1754-1762 ；Topal 和 Sinhal983J.Biol.Chem.258:12274-12279 ；GenBank登錄號(hào)BAG54790 ;圖4)或T7gp2.5蛋白或phi29蛋白p5蛋白。
[0254]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可來自硫礦硫化葉菌(Sso SSB) (Haseltine和Kowalczykowski2002Mol.Microbiol.43:1505-1515 ;圖 5)。
[0255]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可來自大腸桿菌(Skyberg2006Infect.1mmun.74:6287-6292 ；Sigall972Proc.Natl.Acad.Sc1.USA69:3537-3541 ；Weinerl975J.Biol.Chem.250:1972-1980 ；GenBank 登錄號(hào) ABC42252 ;圖 6)。
[0256]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可來自詹氏甲烷球菌(Mja SSB)(Kellyl998PNAS95:14634-14639 ；GenBank 登錄號(hào) NP_248153 ;圖 7)。
[0257]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以是:噬菌體T7SSB ;T4基因44/62蛋白；大腸桿菌噬菌體N4SSB;腺病毒DNA結(jié)合蛋白(Ad DBP或Ad SSB);小牛胸腺解鏈蛋白(UPl);附加體編碼的 SSB(Kolodkinl983Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:4422-4426);線粒體(rim-1);酵母(例如，rpa-1、SSB 1、SSB II或SSB III) ；HeLa A1蛋白；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) SSB ;釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) RPA70 單鏈DNA-結(jié)合區(qū)域 I ;真核生物復(fù)制蛋白 A(RPA) (Smithl997J.Bacteriol.179:7135-7155 ；Woldl997Annu.Rev.Biochem.66:61-92);或來自智人(Homo sapiens)。
[0258]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可以是RecA或RecA樣蛋白，包括RecA (細(xì)菌)、Rad5I (真核生物)和 RadA(古細(xì)菌)(Kowalczykowski l"4Annu.Rev.Biochem.63:991-1043 ；Kuzminovl999Microbiol.Mol.Biol.Rev.63:751-813 ；Bianco2005in〃RecA pro`tein〃John Wiley and Sons, Ltd.Chichester, UK)。
[0259]在一些實(shí)施方案中，核酸結(jié)合蛋白可源自嗜溫性生物，包括甲烷球菌屬(Methanococcus)(例如，詹氏甲燒球菌)、甲燒桿菌屬(Methanobacterium)(例如，熱自養(yǎng)甲燒桿菌)、古球菌屬(Archaeoglobus)(例如，閃爍古球菌(Archaeoglobus fulgidus))、硫化葉菌屬(Sulfolobus)(例如,硫礦硫化葉菌(Sulfolobus sulfataricus))、氣熱菌屬(Aeropyrum)(例如，敏捷氣熱菌(Aeropyrum pernix))(參見例如，Chedin, 1998TrendsBiochem.Sc1.23:273-277 ；Haseltine2002Mol.Microbiol.43:1505-1515 ；Kellyl998Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:14634-14639 ；Klenkl997Nature390:364-370 ；Smithl997J.Bacterid.179:7135-55 ；ffadsworth 和 White2001Nucl.Acids Res.29:914-920)。
[0260]例如,熱穩(wěn)定核酸結(jié)合蛋白可以是:嗜熱棲熱菌SSB(例如，GenBank AJ564626)；水生棲熱菌SSB(例如，GenBank AF276705);熱自養(yǎng)甲烷球菌SSB ;詹氏甲烷球菌RPA蛋白；敏捷氣熱菌(ApeSSB);閃爍古球菌 SSB ;Pyrococcus abyssii SSB ;或 Pyrococcushorikoshii SSB0
[0261]在一些實(shí)施方案中，單鏈結(jié)合蛋白可以是公布的專利申請(qǐng)U.S.2007/0178491 (Park 和 Lee)的第 9-16 頁表 I 中公開的任何 SSB。
[0262]適當(dāng)?shù)臈l件
[0263]在一些實(shí)施方案中，可在這樣的條件下進(jìn)行用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法，所述條件適合于在雙鏈核酸的任一條鏈上引入一個(gè)或多個(gè)切口，和/或適合于沿著雙鏈核酸移動(dòng)切口位置至新位置，和/或適合于將核酸結(jié)合至一種或多種核酸結(jié)合蛋白，和/或適合于將核酸片段的末端連接至寡核苷酸接頭。
[0264]在一些實(shí)施方案中，可在這樣的條件下進(jìn)行用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法，所述條件適合于使第一核酸鏈產(chǎn)生切口，和/或適合于使第二核酸鏈產(chǎn)生切口，和/或適合于移動(dòng)第一切口的位置，和/或適合于移動(dòng)第二切口的位置，和/或適合于將核酸片段的至少一個(gè)末端連接至寡核苷酸接頭。
[0265]在一些實(shí)施方案中，適當(dāng)?shù)臈l件包括公知的參數(shù)，例如:時(shí)間、溫度、pH、緩沖劑、試劑、陽離子、鹽、輔因子、核苷酸、核酸和酶。在一些實(shí)施方案中，試劑或緩沖劑可包括離子的來源，例如KC1、醋酸鉀、醋酸銨、谷氨酸鉀、NH4Cl或硫酸銨。在一些實(shí)施方案中，試劑或緩沖劑可包括二價(jià)離子例如Mg2+或Mn2+的來源，MgCl2、MnCl2或醋酸鎂。在一些實(shí)施方案中，試劑或緩沖劑可包括鎂、錳和/或鈣。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑可包括Tris、Tricine,HEPES、MOPS、ACES、MES或無機(jī)緩沖劑例如基于磷酸鹽或醋酸鹽的緩沖劑，其可提供約4_12的pH范圍。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑可包括螯合劑例如EDTA或EGTA。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑可包括二硫蘇糖醇(DTT)、甘油、精脒和/或BSA(牛血清白蛋白)。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑可包括ATP。
[0266]在一些實(shí)施方案中，適當(dāng)?shù)臈l件包括，利用酶和一個(gè)或多個(gè)類型的核苷酸進(jìn)行切口平移反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，適當(dāng)?shù)臈l件包括利用酶和一個(gè)或多個(gè)類型的核苷酸進(jìn)行非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，適當(dāng)?shù)臈l件包括利用連接酶(例如，T4DNA連接酶、Taq DNA連接酶或其衍生物)將核酸片段的至少一個(gè)末端連接至寡核苷酸接頭。
[0267]在一些實(shí)施方案中，適當(dāng)?shù)臈l件包括循環(huán)溫度改變，或等溫的溫度條件或兩者的組合。在一些實(shí)施方案中，可在約0-10°C，或約10-20°c，或約20-30°C，或約30-40°C，或約40-500C，或約 50-60°C，或約 60-70°C，或約 70-80°C，或約 80-90°C，或約 90-100°C 的溫度下或更高的溫度下進(jìn)行反應(yīng)。
[0268]在一些實(shí)施方案中，適當(dāng)?shù)臈l件包括進(jìn)行反應(yīng)一段時(shí)間，例如約10-30秒、或約30-60秒、或約1-3分鐘、或約3-`5分鐘、或約5-6分鐘、或約6_7分鐘、或約7_8分鐘、或約8-9分鐘、或約9-10分鐘、或約10-11分鐘、或約11-12分鐘、或約12-13分鐘、或約13-14分鐘、或約14-15分鐘、或約15-20分鐘、或約20-30分鐘、或約30-45分鐘、或約45-60分鐘、或約1-3小時(shí)、或約3-6小時(shí)、或約6-10小時(shí)或更長時(shí)間。
[0269]在一些實(shí)施方案中，適當(dāng)?shù)臈l件包括在約Ι-lOuL，或約10_25uL，或約25_50uL，或約 50-75uL，或約 75-lOOuL，或約 100_125uL，或約 125_150uL，或約 150_200uL 或更大的體
積中進(jìn)行反應(yīng)。
[0270]在一些實(shí)施方案中，適當(dāng)?shù)臈l件包括在管或孔中進(jìn)行反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，孔可以是96孔板的部分。
[0271]在一些實(shí)施方案中，可通過改變?nèi)魏螀?shù)來調(diào)整在雙鏈核酸的任一條鏈上引入的切口的數(shù)目和/或切口平移反應(yīng)，包括改變:時(shí)間；溫度；pH ;模板的量；酶濃度；核苷酸濃度；鹽、陽離子和/或離子的類型；鹽、陽離子和/或離子的量；反應(yīng)體積；或其任何組合。
[0272]測序方法
[0273]在一些實(shí)施方案中，按照本公開內(nèi)容產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)核酸片段可使用檢測核苷酸摻入的一個(gè)或多個(gè)副產(chǎn)物的方法來進(jìn)行測序。通過檢測延伸反應(yīng)的物理化學(xué)副產(chǎn)物來檢測聚合酶延伸可包括焦磷酸、氫離子、電荷轉(zhuǎn)移、熱等，如例如Pourmand等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.，103:6466-6470(2006) ；Purushothaman 等人，IEEE ISCAS, IV-169-172 ；Rothberg 等人，美國專利公開案 2009/0026082 ；Anderson 等人，Sensors 和 Actuators BChem., 129:79-86 (2008) ;Sakata 等人,Angew.Chem.118:2283-2286 (2006) ；Esfandyapour等人，美國專利公開案 2008/01666727 ;和 Sakurai 等人，Anal.Chem.64:1996-1997(1992)中公開的。
[0274]廣泛地進(jìn)行涉及離子的產(chǎn)生和檢測的反應(yīng)。使用直接離子檢測法來監(jiān)測此類反應(yīng)的進(jìn)展可簡化許多現(xiàn)有的生物學(xué)測定。例如，利用聚合酶進(jìn)行的模板依賴性核酸合成可通過檢測氫離子(其作為聚合酶催化的核苷酸摻入的天然副產(chǎn)物而產(chǎn)生)來進(jìn)行監(jiān)測。離子敏感型測序(也稱為"基于PH的"或"基于離子的"核酸測序)利用作為核苷酸摻入的副產(chǎn)物產(chǎn)生的離子副產(chǎn)物例如氫離子的直接檢測。在用于基于離子的測序的一個(gè)示例性系統(tǒng)中，可將待測序的核酸捕獲在微孔中，并可在核苷酸摻入條件下，將核苷酸一次一種地流動(dòng)通過孔。聚合酶將適當(dāng)?shù)暮塑账釗饺胝谏L的鏈，釋放的氫離子可改變?nèi)芤旱膒H，這可由離子傳感器檢測到。該技術(shù)不需要標(biāo)記核苷酸或昂貴的光學(xué)組件，并且允許快得多地完成測序運(yùn)行。此類基于離子的核酸測序法和平臺(tái)的實(shí)例包括1n Torrent PGM?或Proton?測序儀(1n Torrent?Systems, Life Technologies Corporation)。
[0275]在一些實(shí)施方案中，使用本公開內(nèi)容的方法、系統(tǒng)和試劑盒產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)核酸片段可用作底物用于通過傳感器包括場效應(yīng)晶體管(FET)檢測和/或監(jiān)測的生物學(xué)或化學(xué)反應(yīng)。在不同的實(shí)施方案中，F(xiàn)ET是chemFET或ISFET?！╟hemFET〃或化學(xué)場效應(yīng)晶體管是一種用作化學(xué)傳感器的場效應(yīng)晶體管。其是MOSFET晶體管的結(jié)構(gòu)類似物，其中通過化學(xué)過程施加門電極上的電荷。"ISFET"或離子敏感型場效應(yīng)晶體管用于測量溶液的離子濃度；當(dāng)離子濃度(例如H+)改變時(shí)，通過晶體管的電流相應(yīng)地改變。ISFET的操作的詳細(xì)理論不于〃Thirty years of ISFET0L0GY:what happened in the past30years and what mayhappen in the next30years, "P.Bergveld, Sens.Actuators, 88(2003), pp.1-20 中。
[0276]在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ET可以是FET陣列。如本文中所用，“陣列”是元件例如傳感器或孔的平面排列。陣列可以是 一維或二維的。一維陣列可以是在第一維中具有一列(或行)元件并且在第二維中具有多列(行)的陣列。第一和第二維的列(或行)的數(shù)目可以相同或可以不同。FET或陣列可包括102、103、104、105、106、107或更多個(gè)FET。
[0277]在一些實(shí)施方案中，可在FET傳感器陣列上方制造一個(gè)或多個(gè)微流體結(jié)構(gòu)，以提供生物學(xué)或化學(xué)反應(yīng)的遏制和/或限制。例如，在一個(gè)儀器中，可將微流體結(jié)構(gòu)構(gòu)造為排列在陣列的一個(gè)或多個(gè)傳感器上方的一個(gè)或多個(gè)孔(或微孔，或反應(yīng)室，或反應(yīng)孔，所述術(shù)語在本文中可互換使用)，以便一個(gè)或多個(gè)上方放置有給定孔的傳感器檢測和測量分析在給定的孔中的存在、水平和/或濃度。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ET傳感器與反應(yīng)孔可存在1:1的對(duì)應(yīng)性。
[0278]微孔或反應(yīng)室通常是具有明確定義的形狀和體積的凹陷或孔，其可被制造成基底，并且可使用常規(guī)微制造技術(shù)例如下列參考資料中公開的技術(shù)來制造=Doering和Nishi, Editors, Handbook of Semiconductor Manufacturing Technology,第 2 版(CRCPress, 2007) ;Saliterman, Fundamentals of BioMEMS and Medical Microdevices(SPIEPublications, 2006) ;Elwenspoek等人，Silicon Micromachining (Cambridge UniversityPress, 2004)等等。微孔或反應(yīng)室的構(gòu)型(例如間距、形狀和體積)的實(shí)例公開于Rothberg等人，美國專利公開案2009/0127589 ;Rothberg等人，英國專利申請(qǐng)GB24611127中。
[0279]在一些實(shí)施方案中，可在溶液或反應(yīng)室(其與FET例如chemFET或ISFET接觸或通過電容耦合)中進(jìn)行生物學(xué)或化學(xué)反應(yīng)。FET(或chemFET或ISFET)和/或反應(yīng)室可以分別是FET或反應(yīng)室的陣列。
[0280]在一些實(shí)施方案中，可在反應(yīng)室的二維陣列中進(jìn)行生物學(xué)或化學(xué)反應(yīng)，其中可將每一個(gè)反應(yīng)室偶聯(lián)至FET，并且每一個(gè)反應(yīng)室在體積上不大于10 μ m3 (即IpL)。在一些實(shí)施方案中，每一個(gè)反應(yīng)室在體積上不大于0.34pL、0.096pL或甚至0.012pL。反應(yīng)室在頂部的橫切面積可任選地為22、32、42、52、62、72、82、92或102平方微米。優(yōu)選，陣列具有至少102、103、104、105、106、107、108、109或更多的反應(yīng)室。在一些實(shí)施方案中，可將反應(yīng)室通過電容耦合至FET。
[0281]如根據(jù)本公開內(nèi)容的不同實(shí)施方案中使用的，F(xiàn)ET陣列可按照常規(guī)CMOS制造技術(shù)，以及改進(jìn)的CMOS制造技術(shù)，以及在CMOS制造中常規(guī)使用的技術(shù)之外的其它半導(dǎo)體制造技術(shù)來進(jìn)行制造。此外，可將各種光刻技術(shù)用作陣列制造方法的一部分。
[0282]適用于公開的方法的示例性FET陣列以及微孔和伴隨的流控技術(shù)，和用于制造它們的方法公開于例如美國專利公開案20100301398 ;美國專利公開案20100300895 ;美國專利公開案20100300559 ;美國專利公開案20100197507，美國專利公開案20100137143 ;美國專利公開案20090127589和美國專利公開案20090026082 (所述美國專利公開案通過引用整體并入本文)中。
[0283]在一個(gè)方面，可將公開的方法、組合物、系統(tǒng)、裝置和試劑盒用于進(jìn)行無標(biāo)記核酸測序，特別地，基于離子的核酸測序。核苷酸摻入的無標(biāo)記檢測的概念已描述于文獻(xiàn)中，包括通過引用并入本文的下列參考資料=Rothberg等人，美國專利公開案2009/0026082 ；Anderson 等人，Sensors and Actuators B Chem.，129:79-86 (2008)；和 Pourmand 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.，103:6466-6470 (2006)。簡而言之，在核酸測序應(yīng)用中，核苷酸摻入通過測量聚合酶-催化的延伸反應(yīng)的天然副產(chǎn)物，包括氫離子、磷酸鹽、PPi和Pi (例如，在磷酸酶存在的情況下)來進(jìn)行測定。此類基于離子的核酸測序法和平臺(tái)的實(shí)例包括 1n Torrent PGM? 或 Proton? 測序儀(1n Torrent? Systems, Life TechnologiesCorporation)。
[0284]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容總地來說涉及，使用按照本文中提供的教導(dǎo)產(chǎn)生的核酸片段文庫對(duì)核酸進(jìn)行測序的方法。在一些實(shí)施方案中，核酸片段文庫可用于產(chǎn)生模板文庫，并且模板文庫可用于獲得序列信息。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容總地來說涉及，用于從核酸模板獲得序列信息的方法，包括:
[0285](a)將核酸分子片段化成兩個(gè)或更多個(gè)片段；
[0286](b)使用在步驟(a)中產(chǎn)生的至少一個(gè)片段作為模板進(jìn)行依賴于模板的核酸合成。
[0287]在一些實(shí)施方案中，片段化可包括:(a)在雙鏈核酸的任一條鏈上引入一個(gè)或多個(gè)切口 ；和(b)沿著雙鏈核酸移動(dòng)至少兩個(gè)切口的位置至對(duì)齊。切口的對(duì)齊可導(dǎo)致雙鏈斷裂或片段化位點(diǎn)。
[0288]在一些實(shí)施方案中，弓丨入可包括使用內(nèi)切核酸酶在雙鏈核酸的任一條鏈上引入切口。在一些實(shí)施方案中，移動(dòng)可包括使用一種或多種切口平移酶沿著雙鏈核酸移動(dòng)切口的位置至新的位置。在一些實(shí)施方案中，片段化還可包括在新的位置將3’尾酶促添加至切口。在一些實(shí)施方案中，片段化還可包括將寡核苷酸接頭連接至片段化的核酸，使接頭變性，和切口修復(fù)片段化的核酸鏈。
[0289]在一些實(shí)施方案中，模板依賴性合成包括以依賴于模板的方式將一個(gè)或多個(gè)核苷酸摻入新合成的核酸鏈。
[0290]任選地，所述方法還可包括產(chǎn)生此類核苷酸摻入的一種或多種離子型副產(chǎn)物。
[0291 ] 在一些實(shí)施方案中，所述方法還可包括檢測一個(gè)或多個(gè)核苷酸至測序引物中的摻入。任選地，檢測可包括檢測氫離子的釋放。
[0292]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容總地來說涉及，用于對(duì)核酸測序的方法，包括:(a)通過按照本文中公開的方法片段化核酸分子來產(chǎn)生多個(gè)核酸片段；(b)將多個(gè)核酸片段置于多個(gè)反應(yīng)室中，其中一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)室與場效應(yīng)晶體管(FET)接觸。任選地，所述方法還包括將置于一個(gè)反應(yīng)室中的至少一個(gè)核酸片段與聚合酶接觸，從而通過將一個(gè)或多個(gè)核苷酸連續(xù)摻入核酸分子來合成新的核酸鏈。任選地，所述方法還包括，產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)氫離子作為此類核苷酸摻入的副產(chǎn)物。任選地，所述方法還包括，通過使用FET檢測一個(gè)或多個(gè)氫離子的產(chǎn)生來檢測一個(gè)或多個(gè)核苷酸的摻入。
[0293]在一些實(shí)施方案中，檢測包括，檢測陣列內(nèi)至少一個(gè)FET上響應(yīng)一個(gè)或多個(gè)氫離子的產(chǎn)生而發(fā)生的電壓和/或電流的變化。
[0294]在一些實(shí)施方案 中，F(xiàn)ET可選自:離子敏感型FET(isFET)和化學(xué)敏感型FET(chemFET)。
[0295]通過檢測核苷酸摻入的離子型副產(chǎn)物來進(jìn)行測序的一個(gè)示例性系統(tǒng)是1nTorrent PGM?或Proton?測序儀(Life Technologies),其為通過檢測作為核苷酸摻入的副產(chǎn)物產(chǎn)生的氫離子來對(duì)核酸模板進(jìn)行測序的基于離子的測序系統(tǒng)。通常地，氫離子在依賴于模板的核酸合成過程中被聚合酶釋放為核苷酸摻入的副產(chǎn)物。1n Torrent PGM?或Proton?測序儀通過檢測核苷酸的摻入的氫離子副產(chǎn)物來檢測核苷酸摻入。1n TorrentPGM?或Proton?測序儀可包括多個(gè)待測序的核酸模板，每一個(gè)模板置于陣列中的各自的測序反應(yīng)孔中。陣列的孔可各自偶聯(lián)至至少一個(gè)離子傳感器，所述傳感器可檢測作為核苷酸摻入的副產(chǎn)物產(chǎn)生的H+離子的釋放或溶液pH的變化。離子傳感器包括偶聯(lián)至離子敏感型檢測層的場效應(yīng)晶體管(FET)，所述檢測層可感知H+離子的存在或溶液pH的變化。離子傳感器可提供指示核苷酸摻入的輸出信號(hào)，所述信號(hào)可表示為其強(qiáng)度與各自孔或反應(yīng)室中的H+離子濃度相關(guān)的電壓變化。不同的核苷酸類型可連續(xù)流入反應(yīng)室，并且可被聚合酶以由模板序列確定的順序摻入正在延伸的引物(或聚合位置)。每一個(gè)核苷酸摻入可伴隨H+離子在反應(yīng)孔中的釋放，以及局部pH的伴隨變化。H+離子的釋放可被傳感器的FET記錄，這產(chǎn)生表明核苷酸摻入的發(fā)生的信號(hào)。在特定核苷酸流動(dòng)過程中未被摻入的核苷酸可以不產(chǎn)生信號(hào)。來自FET的信號(hào)的強(qiáng)度還可與摻入正在延伸的核酸分子的特定類型的核苷酸的數(shù)目相關(guān)，從而允許同聚物區(qū)域被分辨出來。因此，在測序儀運(yùn)行期間，多種核苷酸至反應(yīng)室的流入以及大量孔或反應(yīng)室的摻入監(jiān)測可允許儀器同時(shí)分辨許多核酸模板的序列。關(guān)于1n Torrent PGM?或Proton?測序儀的組成、設(shè)計(jì)和操作的其它詳細(xì)內(nèi)容可見于例如美國專利申請(qǐng)系列N0.12/002781，現(xiàn)公布為美國專利公開案2009/0026082 ;美國專利申請(qǐng)系列N0.12/474897，現(xiàn)公布為美國專利公開案2010/0137143 ;和美國專利申請(qǐng)系列N0.12/492844，現(xiàn)公布為美國專利公開案2010/0282617(全部所述申請(qǐng)通過引用整體并入本文)。
[0296]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容總地來說涉及，將使用本公開內(nèi)容的任何方法、系統(tǒng)和試劑盒產(chǎn)生的核酸片段用于基于離子的測序方法中。此類核酸片段在基于離子的測序反應(yīng)中的使用可以是有利的，因?yàn)楸竟_內(nèi)容的片段化方法允許分離具有期望的大小的片段，所述大小可被選擇來匹配基于離子的測序系統(tǒng)的讀取長度能力。
[0297]在基于離子的核酸測序的典型實(shí)施方案中，核苷酸摻入可通過檢測由聚合酶催化的延伸反應(yīng)產(chǎn)生的氫離子的存在和/或濃度來檢測。在一個(gè)實(shí)施方案中，可將各自具有有效地結(jié)合的引物和聚合酶的模板加載至反應(yīng)室(例如本文中引用的Rothberg等人中公開的微孔)中，隨后可重復(fù)循環(huán)核苷酸的添加和洗滌的循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，可將此類模板作為克隆群體連接至固體支持物，例如顆粒、珠粒等，并且將所述克隆群體加載至反應(yīng)室中。如本文中所用，"有效地結(jié)合的"意指引物與模板退火以便引物的3’末端可被聚合酶延伸，以及聚合酶結(jié)合至此類引物-模板雙鏈體，或與其十分靠近，以便當(dāng)添加核苷酸時(shí)，發(fā)生結(jié)合和/或延伸。
[0298]在循環(huán)的每一個(gè)添加步驟中，僅當(dāng)模板中下一個(gè)堿基是添加的核苷酸的互補(bǔ)物時(shí)，聚合酶才可通過摻入添加的核苷酸來延伸引物。如果存在一個(gè)互補(bǔ)堿基，則存在一個(gè)摻入，如果存在兩個(gè)互補(bǔ)堿基，則存在兩個(gè)摻入，如果存在三個(gè)互補(bǔ)堿基，則存在三個(gè)摻入，依此類推。伴隨每一個(gè)此類摻入，氫離子被釋放，并且一群模板釋放的氫離子共同地改變反應(yīng)室的局部pH。氫離子的產(chǎn)生與模板中連續(xù)互補(bǔ)堿基的數(shù)目(以及參與延伸反應(yīng)的具有引物和聚合酶的模板分子的總數(shù))單調(diào)相關(guān)。因此，當(dāng)在模板中存在許多連續(xù)相同的互補(bǔ)堿基(即，同聚物區(qū)域)時(shí)，產(chǎn)生許多氫離子，從而局部pH變化的幅度可與連續(xù)相同的互補(bǔ)堿基的數(shù)目成正比。如果模板中的下一個(gè)堿基與添加的核苷酸不互補(bǔ)，則不發(fā)生摻入并且無氫離子釋放。在一些實(shí)施方案中，在每一個(gè)添加核苷酸的步驟后，可進(jìn)行另外的步驟，其中將預(yù)定PH的未緩沖的洗滌液用于除去先前步驟的核苷酸以防止在稍后循環(huán)中的錯(cuò)誤摻入。在一些實(shí)施方案中，在每一個(gè)添加核苷酸的步驟后，可進(jìn)行額外的步驟，其中用核苷酸破壞劑例如腺苷三磷酸雙磷酸酶處理反應(yīng)室，以消除留在反應(yīng)室中的任何殘留核苷酸，所述殘留核苷酸可在隨后循環(huán)中導(dǎo)致假的`延伸。
[0299]在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，將不同類型的核苷酸依次添加至反應(yīng)室，以便可將各個(gè)反應(yīng)一次一種地暴露于不同的核苷酸。例如，可以以下列順序添加核苷酸:dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dATP、dCTP、dGTP、dTTP等；并且每一次暴露后進(jìn)行洗滌步驟?？芍貜?fù)循環(huán)50次、100次、200次、300次、400次、500次、750次、或更多次，這取決于期望的序列信息的長度。
[0300]在一些實(shí)施方案中，可按照隨PGM?或Pr ο ton?測序儀提供的用戶方案進(jìn)行測序。實(shí)施例 3 提供了，使用 1n Torrent PGM? 測序儀(1n Torrent? Systems, LifeTechnologies, CA)進(jìn)行基于離子的測序的一個(gè)示例性方案。
[0301]系統(tǒng)
[0302]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了用于產(chǎn)生核酸片段群體的系統(tǒng)，其包含:核酸、一種或多種切口產(chǎn)生酶、一種或多種切口平移酶和核苷酸。在一些實(shí)施方案中，用于制備片段化核酸的系統(tǒng)還可包括至少一種核酸結(jié)合蛋白(例如，單鏈結(jié)合蛋白)。在一些實(shí)施方案中，用于制備片段化核酸的系統(tǒng)還包括一種或多種加尾酶。在一些實(shí)施方案中，用于制備片段化核酸的系統(tǒng)還可包括至少一種寡核苷酸接頭。在一些實(shí)施方案中，用于制備片段化核酸的系統(tǒng)還可包括如下試劑的任意組合:緩沖劑；陽離子；大小選擇試劑；一種或多種末端修復(fù)酶；一種或多種修復(fù)酶；一種或多種切口修復(fù)酶；一種或多種類型的接頭；一種或多種連接酶；用于核酸純化的試劑；用于核酸擴(kuò)增的試劑；內(nèi)切核酸酶；聚合酶；激酶；磷酸酶；和/或核酸酶。
[0303]試劑盒
[0304]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了用于產(chǎn)生核酸片段群體的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括可用于進(jìn)行核酸片段化法的任何試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括如下試劑的任意組合:緩沖劑；陽離子；一種或多種使核酸產(chǎn)生切口的酶；一種或多種切口平移酶；一種或多種核苷酸；一種或多種核酸加尾酶；大小選擇試劑；一種或多種末端修復(fù)酶；一種或多種修復(fù)酶；一種或多種切口修復(fù)酶；一種或多種類型的接頭；一種或多種連接酶；用于核酸純化的試劑和/或用于核酸擴(kuò)增的試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括如下試劑的任意組合:內(nèi)切核酸酶；聚合酶；連接酶；激酶；磷酸酶；和/或核酸酶。
實(shí)施例
[0305]還可根據(jù)下列實(shí)施例進(jìn)一步理解本公開內(nèi)容的實(shí)施方案，所述實(shí)施例不應(yīng)解釋為以任何方式限制本公開內(nèi)容的范圍。
[0306]實(shí)施例1:
[0307]A.酶促核酸片段化:
[0308]將來自DH10B、 Rhodo或Vibrio的基因組DNA (0.5ug)與5uL的IOX緩沖劑(具有dNTP)、10uL來自切口平移系統(tǒng)(Invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)18160-010)的酶混合物，40mUDNA酶I和水混合以產(chǎn)生50uL的總反應(yīng)體積。
[0309]將混合物在37°C溫育15分鐘，利用5uL終止緩沖劑(0.5M EDTA, pH8)終止反應(yīng)。使用SOLiD? Library Micro Column Purification試劑盒,利用B2-S緩沖劑，并且利用20uL的El緩沖劑進(jìn)行洗脫來純化片段化的DNA。
[0310]B.文庫制備:
[0311]將來自上文步驟(A)的片段化的DNA(20uL)連接至帶條形碼的接頭。將片段化的DNA與IOuL的5X反應(yīng)緩沖劑，帶條形碼的接頭Pl (50uM原液)、帶條形碼的接頭P2 (50uM原液)、5uL的5U/uL T4DNA連接酶和水混合以產(chǎn)生50uL的總反應(yīng)體積。
[0312]將混合物于室溫溫育30 分鐘。使用 SOLiD? Library Micro Column Purification試劑盒，利用B2-S緩沖劑并且利用20uL的El緩沖劑進(jìn)行洗脫來純化DNA。將DNA在切口平移反應(yīng)中反應(yīng)以除去連接的帶條形碼的接頭與DNA之間的切口。利用Platinum? PCR擴(kuò)增混合物在120uL的總體積中擴(kuò)增DNA，在熱循環(huán)儀中在72°C擴(kuò)增20分鐘，然后保持于4°C。使用 SOLiD? Library Micro Column Purif ication 試劑盒,利用 B2-S 緩沖劑并且利用20uL的El緩沖劑進(jìn)行洗脫來純化擴(kuò)增的DNA。
[0313]實(shí)施例2: [0314]A.酶促核酸片段化:[0315]可將DNA(IOng-1ug)在50uL的總體積中與IX iShear緩沖劑(具有dNTP)、IXiShear酶混合物混合。將混合物于37°C溫育15分鐘，然后反應(yīng)可利用5uL終止緩沖劑(0.5M EDTA, pH8)來終止。使用 AMPure XP 珠粒(1.8X) (Agencourt)純化片段化的 DNAjlJ用22uL的El緩沖劑回收片段化的DNA。
[0316]IOX iShear 緩沖劑可包含:500mM Tris-HCl (ρΗ7.5)，3mM dNTP 和 55mM MgCl2 (于水中)。
[0317]iShear 酶混合物可包含:50mM Tris-HCl (pH7.5)，DNA 聚合酶 I, DNA 酶I, MgCl2, 50% 甘油和 100ug/ml BSA。
[0318]B.文庫制備
[0319]可將來自上文步驟(A)的片段化DNA連接至接頭?？蓪⑵位疍NA于IX反應(yīng)緩沖劑中與接頭P1、接頭P2、25U T4DNA連接酶、25U Tfi (exo-)聚合酶、0.2mM dNTP混合于50uL的總體積中?？蓪⒒旌衔镌跓嵫h(huán)儀中于20°C溫育30分鐘，且在72°C溫育20分鐘。DNA可用AMPure XP珠粒(0.6X) (Agencourt)進(jìn)行純化，利用200uL的70%乙醇洗滌3次。之后的步驟是任選的?？捎肞latinum? PCR擴(kuò)增混合物，使用文庫PCR引物I和2于125uL的總體積中擴(kuò)增DNA，在熱循環(huán)儀中在下列條件下進(jìn)行擴(kuò)增:于95°C進(jìn)行5分鐘；(在95°C進(jìn)行15秒，在62°C進(jìn)行15秒，在70°C進(jìn)行I分鐘)X#個(gè)循環(huán)；在70°C進(jìn)行5分鐘來；在4°C保持?？墒褂肁MPure XP珠粒(1.5X) (Agencourt)純化擴(kuò)增的DNA。
[0320]實(shí)施例3
[0321]如下所述，片段化核酸分子，將其連接至接頭，隨后擴(kuò)增，并按照制造商提供的方案在 1n Torrent? PGM? 測`序儀(1n Torrent?Systems, Life Technologies)中進(jìn)行測序。
[0322]試劑
[0323]IOX 剪切緩沖劑:500mM Tris HCl, pH7.5 ；55mM MgCl2 ；3mM dNTP，于水中。
[0324]剪切酶:0.8個(gè)單位的大腸桿菌DNA聚合酶I ;0.0025個(gè)單位的DNA酶I，于貯存緩沖劑中。
[0325]終止緩沖劑:0.5M EDTA (pH8.0)。
[0326]5X 連接酶緩沖劑:250mM Tris-HCl, pH7.6 ;50mM MgCl2, 5mM ATP, 5mMDTT,25%PEG-8000o
[0327]El 緩沖劑:1OmM Tris-HCl, pH8.5。
[0328]接頭:1n Torrent Part No:602-1067_01,可作為1n片段文庫試劑盒的一部分獲得。
[0329]核酸分子的片段化:核酸片段的純化
[0330]將下列試劑于1.5ml LoBind 管中(Eppendorf#022431021)組合:
[0331]
【權(quán)利要求】
1.一種用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法，包括:通過將包含多個(gè)核酸的樣品經(jīng)歷切口產(chǎn)生條件來將一個(gè)或多個(gè)切口引入核酸；和在至少一個(gè)核酸中產(chǎn)生至少一個(gè)雙鏈斷裂。
2.一種用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法，包括:(a)將至少一個(gè)切口引入雙鏈核酸；和(b)通過平移至少一個(gè)切口在所述核酸中形成雙鏈斷裂。
3.一種用于產(chǎn)生核酸片段群體的方法，包括:(a)在每一條鏈上使核酸產(chǎn)生切口至少一次；和(b)切口平移所述切口，以產(chǎn)生雙鏈斷裂，從而產(chǎn)生核酸片段。
4.權(quán)利要求2的方法，其中切口產(chǎn)生包括酶促切口產(chǎn)生。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述切口平移包括5’至3’DNA聚合/降解反應(yīng)或5’至3’DNA聚合/鏈置換反應(yīng)。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述平移包括將一個(gè)或多個(gè)未標(biāo)記的核苷酸聚合至至少一個(gè)切口的3’末端上。
7.權(quán)利要求2的方法，其中至少一個(gè)核酸片段是未被標(biāo)記的。
8.權(quán)利要求2的方法，其中基本上全部核酸片段是未被標(biāo)記的。
9.權(quán)利要求2的方法，其還包括:將至少一個(gè)寡核苷酸接頭連接至核酸片段群體中的一個(gè)或多個(gè)核酸片段的至少一個(gè)末端。
10.權(quán)利要求2的方法，其中可將群體`中的片段的至少一個(gè)末端的一條鏈連接至雙鏈寡核苷酸接頭的一條鏈以產(chǎn)生具有斷裂的片段-接頭分子。
11.權(quán)利要求2的方法，其中可將群體中的片段的至少一個(gè)末端的兩條鏈連接至雙鏈寡核苷酸接頭的兩條鏈。
12.權(quán)利要求2的方法，其還包括，調(diào)整切口產(chǎn)生條件以調(diào)整核酸片段的平均大小。
13.通過權(quán)利要求2的方法產(chǎn)生的核酸片段群體。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103827318SQ201280037299
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月27日
【發(fā)明者】陳宙濤, X·段, K·樸 申請(qǐng)人:生命技術(shù)公司