中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法
【專利摘要】為了解決中國虎紋蛙實際保護工作中對外形酷似的中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的鑒定，本發(fā)明提供一種中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法。該鑒定方法以PCR技術為基礎，設計特異性引物進行擴增，從而達到對中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的快速鑒定，具體實現(xiàn)步驟為：1）提取樣本DNA；2）樣本DNA檢測；3）PCR擴增；分別采用四對特異性引物進行擴增；4）特異擴增產物鑒別。本發(fā)明設計的四對引物涉及不同基因位置，只需通過PCR擴增即可區(qū)分中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙，引物特異性強，瓊脂糖凝膠電泳特征譜帶穩(wěn)定性高，無區(qū)域性差異，在實際應用中能夠獲得可靠而有益的效果。
【專利說明】中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及蛙類的分子鑒定方法，具體涉及一種中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]虎紋蛙皮膚粗糙，頭部和身體兩側有深黑色的斑紋。背部具十幾行縱向排列的膚棱，膚棱之間散布著棕黑色小疣粒。腹面白色或灰色，也有不規(guī)則的斑紋，咽部和胸部具灰棕色斑，前后肢具橫斑。由于受到人為過度捕捉，虎紋蛙數(shù)量大量減少，被列為國家II級重點保護動物，也是蛙類中唯一的國家級保護動物。隨著泰國養(yǎng)殖場的泰國虎紋蛙的人工引進，國內各養(yǎng)殖場大量飼養(yǎng)泰國虎紋蛙。因泰國虎紋蛙和中國虎紋蛙是否屬于同一物種一直存在廣泛爭議，加之兩者形態(tài)特征幾乎一模一樣，無法從形態(tài)上有效進行鑒別，導致一些不法商人直接捕捉野外中國虎紋蛙冒充養(yǎng)殖場泰國虎紋蛙進行販賣。而林業(yè)執(zhí)法部門缺少相應儀器及技術無法有效對市場上銷售的虎紋蛙究竟是國家二級保護動物中國虎紋蛙還是允許銷售的泰國虎紋蛙進行鑒定，導致執(zhí)法難，近幾年野生中國虎紋蛙種群數(shù)量呈直線下降趨勢，迫切需要快速準確的鑒定方法協(xié)助執(zhí)法機構用于物種鑒定。

【發(fā)明內容】

[0003]針對中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙難以從形態(tài)特征進行鑒定的問題，本發(fā)明應用分子生物學技術解決中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定，提供一種以PCR技術為基礎，設計特異性引物進行擴增，從而實現(xiàn)快速鑒定中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的方法。
[0004]本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是:
[0005]一種中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法，其特征在于:該方法以PCR技術為基礎，設計特異性引物進行擴增，根據擴增產物電泳條帶的不同實現(xiàn)對中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的快速鑒定，包括如下步驟:
[0006]I)提取樣本DNA ；
[0007]2)樣本DNA檢測；
[0008]3) PCR擴增；分別采用以下四對特異性引物進行擴增，
[0009]HWW-HlJ/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；
[0010]HWW-H2J/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列；
[0011]HWW-H3J/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列；
[0012]HWW-H4J/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列；
[0013]4)特異擴增產物鑒別[0014]擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120V恒壓，核酸染色劑染色；在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察和分析，并記錄結果；當引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N、HWW-H4J/N分別擴增出1000bp、3000bp、3000bp、3500bp片段大小時，證明是中國虎紋蛙；當引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N不能擴增出片段而能HWW-H4J/N能擴增出3500bp片段大小時，證明為泰國虎紋蛙。
[0015]作為優(yōu)選，采用引物HWW-H1J/N時，PCR擴增反應總體積為50iU，其中包括以下組分:10 X PCR Buffer (Mg2+free)為 5 y I，dNTP Mixture (各 2.5mM)為 4 y I，MgCl2 為 4 y I，Primer (J)為 2 yl，Primer (N)為 2 yl，雙蒸水為 31.75 yl，樣本總 DNA 為 I yl，TaKaRaTaq 為 0.25 u I。
[0016]作為優(yōu)選，采用引物HWff-HlJ/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N時，PCR擴增反應總體積為 50ii 1，其中包括以下組分:10XLA PCR Buffer (Mg2+free)為 5 ii I，dNTP Mixture (各
2.5mM)為 IjMgCl2 為 4 y l，Primer(J)為 2 u l，Primer(N)為 2 u 1，雙蒸水為 27.75 U 1，樣本總 DNA 為 I ii 1，TaKaRa La Taq 為 0.25 ii I。
[0017]作為優(yōu)選，采用引物HWff-Hl J/N時，PCR擴增反應程序為，95 °C預變性4min，然后進入如下循環(huán):95°C變性40s、55°C退火40s、72°C延伸lmin，循環(huán)35次，循環(huán)結束后72°C再延伸 IOmin ；
[0018]采用引物HWW-H2J/N時，PCR擴增反應程序為，95°C預變性4min，然后進入如下循環(huán):95°C變性40s、55°C退火lmin、72°C延伸3min，循環(huán)35次，循環(huán)結束后72°C再延伸IOmin ；
[0019]采用引物HWW-H3J/N時，PCR擴增反應程序為，95°C預變性4min，然后進入如下循環(huán):95°C變性40s、59°C退火lmin、72°C延伸3min，循環(huán)35次，循環(huán)結束后72°C再延伸IOmin ；
[0020]采用引物HWW-H4J/N時，PCR擴增反應程序為，95°C預變性4min，然后進入如下循環(huán):95°C變性40s、56°C退火lmin、72°C延伸4min，循環(huán)35次，循環(huán)結束后72°C再延伸IOmin0
[0021]本發(fā)明該方法是一種以PCR技術為基礎，設計特異性引物進行擴增，根據擴增產物電泳條帶的不同實現(xiàn)對中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的快速鑒定，具體實現(xiàn)步驟為:
[0022]1)提取樣本DNA:
[0023]①剪取蛙樣本的腳趾3mm，用無菌水反復沖洗，置于滅菌的1.5ml離心管中充分剪碎；
[0024]②加入800 U I的DNA裂解緩沖液及7 ii L的蛋白酶K(20mg/ml)，在漩渦混合儀上混勻，金屬浴(560C 450rpm)消化5h，不時上下顛倒，直至溶液澄清透明，消化完全后冷卻至
室溫；
[0025]③于預冷至4°C的離心機中4°C 8000rpm離心5min,取750 ii I上清液，向上清液中加入等體積Tris飽和苯酹,金屬浴(4°C 300rpm)混勻15min,不時上下顛倒至水相成乳膠狀；
[0026]④4°C 8000rpm離心lOmin，取600iil上清液，向上清液中加入等體積溶劑，溶劑由苯酹:氯仿:異戍醇=25:24:1的體積比混合而成,金屬浴(4°C 400rpm)混勻15min ；
[0027]⑤4°C 8000rpm離心IOmin,取400 U I上清液，向上清液中加入2倍體積的預冷無水乙醇；
[0028]⑥將上述離心管放置于_20°C冰箱中沉淀DNA3h或以上；
[0029]⑦4°C 12000rpm離心15min，棄上清液，用400 iU的70%乙醇洗滌沉淀；
[0030]⑧4°C 12000rpm離心15min，棄上清液，室溫干燥DNA ；
[0031]⑨將上述提取的總DNA溶于200 U I無菌水中，標號后置于_20°C冰箱內保存。
[0032]2)樣本DNA檢測；
[0033]①配制1%瓊脂糖凝膠，取瓊脂糖0.4g、0.5 X TBE液40ml置于錐形瓶中，混勻后微波爐加熱至瓊脂糖完全溶解，室溫冷卻至50°C，加入2 Ul Gold View核酸染色劑，混勻后倒入制膠板中靜置20min ；
[0034]②分別吸取Marker和各樣本總DNA各4 y I于點樣孔內，凝膠板置于電泳槽中，由負極到正極方向120V電泳30min ；
[0035]③將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中進行檢測，觀察各泳道是否出現(xiàn)條帶，出現(xiàn)目的條帶則表明樣本總DNA提取成功。
[0036]3) PCR 擴增；
[0037]分別采用四對特異性引物于PCR儀中進行擴增，四對引物信息如表1所示。
[0038]表1PCR擴增引物
[0039]
【權利要求】
1.一種中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法，其特征在于:該方法以PCR技術為基礎，設計特異性引物進行擴增，根據擴增產物電泳條帶的不同實現(xiàn)對中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的快速鑒定，包括如下步驟: 1)提取樣本DNA; 2)樣本DNA檢測； 3)PCR擴增；分別采用以下四對特異性引物進行擴增， HWff-HlJ/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQID N0.2所示的核苷酸序列； HWW-H2J/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQID N0.4所示的核苷酸序列； HWW-H3J/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQID N0.6所示的核苷酸序列； HWW-H4J/N，其上游引物具有如SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQID N0.8所示的核苷酸序列； 4)特異擴增產物鑒別 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120V恒壓，核酸染色劑染色；在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察和分析，并記錄結果；當引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N、HWW-H4J/N分別擴增出1000 bp,3000 bp,3000 bp,3500 bp片段大小時，證明是中國虎紋蛙；當引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N不能擴增出片段而能HWW-H4J/N能擴增出3500 bp片段大小時，證明為泰國虎紋蛙。
2.根據權利要求1所述的中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法，其特征在于:采用引物HWW-HlJ/N時，PCR擴增反應總體積為50 U 1，其中包括以下組分=IOXPCRBuffer (Mg2+ free)為 5 u I, dNTP Mixture (各 2.5mM)為 4 u I, MgCl2 為 4 u I, Primer(J)為 2 u l,Primer (N)為 2 yl，雙蒸水為 31.75 yl，樣本總 DNA 為 I iil，TaKaRa/^為 0.25 u 10
3.根據權利要求1所述的中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法，其特征在于:采用引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N時，PCR擴增反應總體積為50 U 1，其中包括以下組分:10XLA PCR Buffer (Mg2+ free)為 5 y I, dNTP Mixture (各 2.5mM)為 8 y I,MgCl2為 4 u I, Primer (J)為 2 u I, Primer (N)為 2 u I,雙蒸水為 27.75 Ul,樣本總 DNA 為I U I, TaKaRa LaTaq 為 0.25 U I。
4.根據權利要求1或2或3所述的中國虎紋蛙及泰國虎紋蛙的分子鑒定方法，其特征在于: 采用引物HWW-H1J/N時，PCR擴增反應程序為，95 °C預變性4 min，然后進入如下循環(huán):.95 °C變性40 s、55 °C退火40 s、72°C延伸I min，循環(huán)35次，循環(huán)結束后72 °C再延伸10min ； 采用引物HWW-H2J/N時，PCR擴增反應程序為，95 °C預變性4 min，然后進入如下循環(huán):.95 °C變性40 s、55 °C退火I min、72°C延伸3 min，循環(huán)35次，循環(huán)結束后72 °C再延伸10min ； 采用引物HWW-H3J/N時，PCR擴增反應程序為，95 °C預變性4 min，然后進入如下循環(huán):.95 °C變性40 s、59 °C退火I min、72 °C延伸3 min，循環(huán)35次，循環(huán)結束后72 °C再延伸10 min ； 采用引 物HWW-H4J/N時，PCR擴增反應程序為，95 °C預變性4 min，然后進入如下循環(huán):95 °C變性40 s、56 °C退火I min、72°C延伸4 min，循環(huán)35次，循環(huán)結束后72 °C再延伸10min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667482SQ201310656633
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權日:2013年11月12日
【發(fā)明者】張加勇, 俞丹娜, 葉麗婷, 朱成成, 於倍菲, 王超峰, 邵晨, 鄭榮泉 申請人:浙江師范大學