具有快速加工性能的經(jīng)過修飾的酸性α葡糖苷酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種修飾的人酸性α-葡糖苷酶多肽，其在N端70kDa加工位點處或其附近具有增加的疏水性，以及制造和使用該修飾的人酸性α-葡糖苷酶治療糖原貯積癥(glycogen?storage?disorder)的方法。
【專利說明】具有快速加工性能的經(jīng)過修飾的酸性Cl葡糖苷酶
[0001]本申請要求獲得于2011年4月22日提交的美國臨時專利申請N0.61/478，336的優(yōu)先權(quán)，本文通過引用并入其全部內(nèi)容。
[0002]本公開一般地涉及經(jīng)過修飾的人酸性α葡糖苷酶及其在治療糖原貯積病中的使用。
[0003]蓬佩病，也稱作2型糖原貯積病(GSD)和酸性麥芽糖酶缺陷，是一種由于一種溶酶體酶——酸性α葡糖苷酶(GAA)缺陷導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳代謝性肌病。GAA是一種1，4和1，6-α -外切葡糖苷酶，在溶酶體中將糖原水解為葡萄糖。GAA缺陷導(dǎo)致糖原在溶酶體中積累，造成呼吸肌、心肌和骨骼肌進行性損傷。病情的范圍從急進性嬰兒期病程，其通常導(dǎo)致1-2歲前死亡，到進行更緩慢的、更不均一的病程，其在孩童和成年中造成顯著的發(fā)病和早夭。Hirschhorn RR, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,3:3389-3420(2001, McGraw-Hill);Van der Ploeg and Reuser, Lancet372:1342-1351 (2008)。
[0004]GAA的生物合成、靶定和溶酶體加工中涉及的步驟是復(fù)雜的。人GAA的初級翻譯產(chǎn)物是一種952個氨基酸的多肽，含有7個共有的N-糖基化位點。Moreland et al., J.Biol.Chem.280:6780-6791(2005)。GAA上的N-聚糖(N-glycan)包括復(fù)雜的和高甘露糖型聚糖，其中一些被甘露糖-6-磷酸修飾。GAA通過不依賴陽離子的甘露糖-6-磷酸受體被靶定到溶酶體。在溶酶體中，該酶被蛋白酶和糖苷酶進一步加工，產(chǎn)生具有提高的糖原清除能力的成熟肽。
[0005]圖1顯示了 GAA加工 通路的示意圖。Moreland et al.，2005。典型地，GAA在加工期間經(jīng)歷最多4個剪切事件。首先，初級GAA翻譯產(chǎn)物在57位氨基酸左右被剪切，形成一個表觀分子量為100-110-kDa的前體。接著，100-110-kDa的前體在113和122位氨基酸周圍被剪切，形成一個 3.9-kDa (aa78-113)和一個 95_kDa (aal22_952)部分。然后，該 95_kDa多肽在781和792位氨基酸左右被剪切，產(chǎn)生76-kDa(aal22-781)和19.4-kDa (aa792-952)的片段。該76-kDa種類仍然與19.4-和3.9-kDa多肽保持關(guān)聯(lián)。進一步的一個蛋白水解切割將76-kDa種類變成70-kDa (aa204-781)種類，其仍然與19.4_，10.4_，和3.9-kDa多肽保持關(guān)聯(lián)。
[0006]當(dāng)前用于治療蓬佩病的人用療法涉及施用重組人GAA(例如ΜΥ0ΖΥΜΕ?)。盡管重組人GAA可有效減少患者體內(nèi)糖原的積累，但是其在施用時不會被完全加工成70-kDa形式。因為GAA對糖原的親和力可能會由于蛋白酶的加工而顯著提高(Moreland etal.，2005; Wisselaar et al.，J.Biol.Chem.268:2223-2231 (1993))，所以提高重組人 GAA的加工速度可能為增加GAA的治療效力，包括降低GAA療法的劑量和/或減少施用頻率，提供條件。
[0007]因此，我們在這里描述修飾的GAA多肽，其與未修飾的人GAA相比可以被更加快速地加工。
[0008]某些實施方案包含在N-端70-kDa加工位點或N-端70_kDa加工位點附近具有修飾的人酸性α葡糖苷酶或其催化活性片段。在一些實施方案中，提供這樣的多肽，其包含在N-端70-kDa加工位點或N-端70-kDa加工位點附近具有修飾的人酸性α葡糖苷酶(GAA)或其催化活性片段。所述催化活性片段可選自70-kDa，76-kDa，82-kDa，95-kDa或任何其它催化活性片段。在某些實施方案中，多肽還包含受體靶定序列。在一些實施方案中，受體靶定序列是IGF2序列。
[0009]在某些情況下，修飾導(dǎo)致N-端70-kDa加工位點或其附近的疏水性增加。在一些情況下，多肽在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的195-209位的一個或多個氨基酸處被修飾。在進一步的實施方案中，修飾位于對應(yīng)于SEQ ID NO:1的200-204位的一個或多個氨基酸。在某些實施方案中，修飾位于相當(dāng)于SEQ IDN0:1的201位的氨基酸。在進一步的實施方案中，修飾是用更疏水的氨基酸替代一個或多個氨基酸。在其它實施方案中，修飾是插入一個或多個更疏水的氨基酸。在更進一步的實施方案中，疏水氨基酸選自亮氨酸和酪氨酸。
[0010]在某些實施方案中，多肽與SEQ ID NO:1的至少500個氨基酸有至少80%同一性。在一些情況下，多肽與SEQ ID NO:1的至少500個氨基酸有至少90%同一性。在其它情況下，多肽與SEQ ID NO:1的至少500個氨基酸有至少95%同一性。
[0011]在某些實施方案中，多肽與未修飾的人酸性α葡糖苷酶相比顯示更迅速的溶酶體蛋白酶加工。在一些實施方案中，多肽在施用20個小時后有至少50%被蛋白水解加工成70-kDa形式。在其它實施方案中，多肽在被施用55個小時之內(nèi)基本上全部被蛋白水解加工成70-kDa形式。
[0012]一些實施方案包括與包含至少一個甘露糖-6-磷酸的寡糖綴合的多肽。
[0013]在某些實施方案中，提供了一種編碼修飾的GAA多肽的核酸。在進一步的實施方案中，提供了一種被該核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細胞。在進一步的實施方案中，該宿主細胞能夠分泌修飾的GAA。
[0014]在某些實施方案中·，提供了一種減少或防止糖原在組織中積累的方法，包括向有此需要的患者施用有效量的如本文中描述的多肽。在進一步的實施方案中，患者患有糖原貯積病。在更進一步的實施方案中，糖原貯積病是蓬佩病。
[0015]在其它實施方案中，提供了一種治療糖原貯積病的方法，包括向有此需要的患者施用治療有效量的修飾GAA。在進一步的實施方案中，糖原貯積病是蓬佩病。在其它實施方案中，提供了一種適用于治療糖原貯積病的藥物組合物，其包括如本文中描述的修飾GAA。在一些實施方案中，該多肽是凍干的。
[0016]附圖簡要說明
[0017]圖1的圖示顯示了天然人GAA的成熟的模型。
[0018]圖2顯示了重組GAA(泳道I)、人胎盤GAA(泳道2)和牛睪丸GAA(泳道3)的SDS-PAGE。
[0019]圖3A顯示了人GAA氨基酸197-206與來自小鼠、倉鼠、牛和鵪鶉GAA的比對結(jié)果。圖3B顯示了不同的經(jīng)加工的GAA的Western印跡的比較結(jié)果。泳道I顯示了從胎盤純化的人GAA。泳道2和3是從用野生型人GAA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的293T細胞中純化的對照GAA。泳道4-7是從用人GAA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的293T細胞中純化的修飾GAA，該GAA構(gòu)建體中的第201位氨基酸組氨酸被改變成精氨酸(泳道4)、亮氨酸(泳道5)、酪氨酸(泳道6)和賴氨酸(泳道7)。
[0020]圖4顯示了 rhGAA(H201L)和rhGAA(WT)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細胞中的生物合成。[0021]圖5顯示了蓬佩病成纖維細胞(Pompe fibroblast)攝取和加工rhGAA(WT)和rhGAA(H201L)。
[0022]圖6顯示了用抗GAA183-200(圖6A)抗體和單克隆抗體GAAl (圖6B)檢測的Western印跡結(jié)果。
[0023]圖7是rhGAA (H201L)加工模型的示意圖。
[0024]實施方案詳細i兌明
[0025]為了幫助理解本公開，首先對一些術(shù)語進行定義。其他定義在專利申請中各處提供。
[0026]如這里所使用的，術(shù)語“N-端70-kDa加工位點”是指在對應(yīng)于SEQ ID NO:1 (天然人GAA)的200-204位氨基酸的位置處切割GAA的蛋白水解酶的識別位點。
[0027]如這里所使用的，術(shù)語“修飾(的)GAA”是指在N-端70_kDa加工位點或其附近具有至少一個與天然人GAA中發(fā)現(xiàn)的氨基酸不同的氨基酸的人GAA和GAA變體。修飾的GAA在本說明書中還被稱作“修飾 的人GAA”。術(shù)語“修飾的GAA”包括含有信號序列的全長GAA多肽，以及從細胞分泌的、被部分加工的GAA多肽。
[0028]如這里所使用的，除非在上下文中明確指明，否則單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”包括復(fù)數(shù)指代。因此，例如，當(dāng)稱一種方法涉及“一種化合物”時，包括兩種或多種化合物的混合物。除非在上下文中明確指明，否則術(shù)語“或者”一般地采用其包含“和/或”的意義。
[0029]在整個說明書中，蛋白和多肽的大小以“kDa”單位提供。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會意識到，這些尺寸是基于多肽在電泳測定如SDS-PAGE中的表觀分子量(見例如Moreland etal.，2005)。確切的分子量將取決于糖基化狀態(tài)和其它的參數(shù)，例如與其它多肽的締合，并且能夠通過各種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法加以確定。
[0030]本文通過提述并入在本文中引用的全部參考文獻的全部內(nèi)容。當(dāng)通過提述引入的出版物和專利或?qū)＠暾埖膬?nèi)容與說明書中包含的本發(fā)明相矛盾時，本說明書優(yōu)先于任何矛盾的材料。
[0031]1.酸性α葡糖苷酶(GAA)
[0032]如上所述，GAA是一種參與糖原清除的溶酶體酶。術(shù)語GAA即包括全長、野生型的蛋白，也包括其它催化活性變體。催化活性GAA和GAA變體至少保持針對糖原的催化活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知有多種天然人GAA的變體，包括已被截短、融合或綴合于其它多肽，改變其氨基酸序列，或通過重組或化學(xué)方法改變的變體。例如，已知有至少77個N-端氨基酸可以從天然人GAA(SEQ ID NO:1)中除去而不會喪失活性。Moreland et al.，2005。此外，偶聯(lián)和融合蛋白也已有人描述。在一些實施方案中，GAA或GAA的催化活性片段可以和受體靶定序列綴合或融合。在一些情況下，受體靶定序列可以被細胞受體識別。例如，截短的GAA可以和IGF2結(jié)構(gòu)域融合，如美國專利7，785，856所述，本文通過提述并入其全部內(nèi)容。還已有人改變GAA來添加合成部分、碳水化合物部分和/或提高甘露糖-6-磷酸的水平。例如，美國專利 7, 001, 994; 7, 723，296; 7, 786，277;美國專利公開 2010/0173385;和 PCT 公開2010/075010描述了具有經(jīng)過修飾的碳水化合物基團、含有更高水平甘露糖-6-磷酸的溶酶體酶，本文通過提述并入這些文獻的全部內(nèi)容。
[0033]在某些實施方案中，本文中描述的GAA與人GAA或GAA變體具有至少80%, 90%, 95%,或99%同一性。在一些情況下，GAA與SEQ ID N0:1的至少500，550，600，650，700，750，800，850，或 900 個氨基酸具有至少 80%, 90%, 95%,或 99% 同一性。
[0034]在本部分中描述的任何催化活性人GAA均可用作本文中描述的修飾的GAA的基礎(chǔ)序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會知道哪種GAA變體適合于用于在本發(fā)明中。當(dāng)基礎(chǔ)GAA序列的長度或糖基化模式與天然人GAA不同時，被加工多肽的大小也將相應(yīng)變化。
[0035]I1.修飾的 GAA
[0036]在多種實施方案中，提供了包含修飾的人GAA的多肽，所述修飾的人GAA在N-端70-kDa加工位點或其附近被修飾。N-端70-kDa加工位點“附近”的區(qū)域包括N-端70-kDa加工位點上下游最多5個氨基酸。在某些實施方案中，N-端70-kDa加工位點或其附近的區(qū)域包含相應(yīng)于SEQ ID NO:1位置195-209的氨基酸。
[0037]本文中描述的修飾的GAA比未修飾的GAA的加工更加快速。在某些實施方案中，修飾的GAA在N-端70-kDa加工位點或其附近具有更高的疏水性。在一些實施方案中，修飾的GAA被蛋白水解加工成70-kDa成熟形式的速度更快。在一些實施方案中，并且取決于開始序列，修飾的GAA被加工成70-kDa成熟形式的變體。修飾的GAA可以被如此加工，以致成熟的多肽仍保持與額外的多肽片段相締合。在某些實施方案中，修飾的GAA的加工所經(jīng)由的通路與未修飾的GAA相同。在其它實施方案中，修飾的GAA的加工所經(jīng)由的中間體與未修飾的GAA不同。例如，修飾的全長GAA可以經(jīng)由76-kDa和/或82_kDa中間體進行加工。修飾的GAA可以被與未修飾的GAA相同的蛋白酶所識別，并且以相同或不同的順序被加工。
[0038]在某些實施方案中，GAA修飾是通過將至少一個氨基酸用更疏水的氨基酸代替，從而其N-端70-kDa加工位點或其附近的疏水性增加。在一些實施方案中，替換可以發(fā)生在N-端70-kDa加工位點上游或下游5個氨基酸內(nèi)。在某些實例中，氨基酸替換可以發(fā)生在對應(yīng)于SEQ ID NO:1第195-209位的氨基酸。在其它情況下，氨基酸替換可以發(fā)生在對應(yīng)于SEQ ID NO:1第100-204位的氨基酸。在進一步的實施方案中，修飾的人GAA在對應(yīng)于SEQ ID NO:1第201位氨基酸處含有疏水氨基酸。在一些實施方案中，GAA的修飾是通過在N-端70-kDa加工位點或其附近插入一個或多個疏水氨基酸。其他修飾包括在N-端70-kDa加工位點或其附近刪除一個或多個氨基酸。
[0039]在某些實施方案中，提供了一種修飾的人GAA，其在N-端70_kDa加工位點或其附近的超過I個位置處或在N-端70-kDa加工位點的5個氨基酸內(nèi)含有一個疏水氨基酸(天然的或合成的)。在一個實施方案中，其中一個經(jīng)過修飾的氨基酸位于對應(yīng)于SEQ ID NO:1第201位的氨基酸。
[0040]在各種實施方案中，疏水氨基酸從下組中選出:纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸或丙氨酸。在進一步的實施方案中，疏水氨基酸是亮氨酸或酪氨酸。在一些實施方案中，修飾的人GAA含有顯示疏水性質(zhì)的合成或非天然氨基酸。一般地，被替換的氨基酸比野生型氨基酸更加疏水，因此增加N-端70-kDa加工位點或其附近的疏水性。
[0041]在一個示例實施方案中，修飾的GAA在對應(yīng)于SEQ ID NO:1第201位氨基酸的位置處具有一個亮氨酸。在另一個實施方案中，修飾的GAA在對應(yīng)于SEQ ID N0:1第201位氨基酸的位置處具有一個酪氨酸。[0042]在某些實施方案中，提供了修飾的GAA，其與SEQ ID NO:1的至少500，550，600，650，700，750，800，850 或 900 個氨基酸具有至少 80%, 90%, 95% 或 99% 同源性，
并且其中修飾的人GAA在N-端70-kDa加工位點處的至少一個氨基酸被一個更加疏水的氨
基酸替換。
[0043]在一些實施方案中，有至少50%的修飾的人GAA在溶酶體中在20、30或40小時之內(nèi)被加工成70-kDa形式。在更進一步的實施方案中，基本上全部的修飾的人GAA在溶酶體中44、65或75小時之內(nèi)被加工成70-kDa形式。
[0044]在某些實施方案中，本發(fā)明的修飾的人GAA可以通過其更快速地被蛋白水解加工成成熟70-kDa形式或其相應(yīng)的變體來加以鑒別。在其它實施方案中，本文中描述的修飾的人GAA可以通過在天然人GAA的蛋白水解加工中不會產(chǎn)生的82-kDa中間體多肽的產(chǎn)生來加以鑒別。在進一步的實施方案中，修飾的人GAA可以通過在未修飾的人GAA的蛋白水解加工中產(chǎn)生的76-kDa中間多肽的缺失來加以鑒別。
[0045]II1.修飾的GAA的產(chǎn)生
[0046]在各種實施方案中，修飾的GAA多肽可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法加以產(chǎn)生。例如，修飾的GAA多肽可以由被編碼修飾的GAA的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系表達并分泌。合適的細胞系包括成纖維細胞、中華倉鼠卵巢(CHO)細胞、293T細胞或植物細胞，以及本領(lǐng)域的技術(shù)人員可認識到的其他細胞。美國專利Nos.7，351，410和7，138，262和美國專利公開N0.2010/0196345描述了細胞系和生產(chǎn)方法實例，本文通過提述引入其全部內(nèi)容。在某些實施方案中，編碼修飾的GAA的核酸被插入到含有用于在細胞系中表達的合適啟動子和調(diào)節(jié)序列的質(zhì)?；蜉d體中。可用于在哺乳動物細胞系中產(chǎn)生修飾的GAA的啟動子包括rpS21和β -肌動蛋白啟動子(見例如美國專利N0.7，423，135)，以及本領(lǐng)域的技術(shù)人員所認可的許多其它的啟動子。在 某些實施方案中，修飾的GAA被進一步改變以增加或降低糖基化或甘露糖-6-磷酸的水平，借此提高分泌和/或溶酶體靶定。
[0047]IV.藥物組合物
[0048]在某些實施方案中，修飾的GAA存在于藥物組合物中，其包括至少一種添加物如填充劑(filler)、膨脹劑、崩解劑、緩沖劑、穩(wěn)定化劑或賦形劑。標準的藥物制劑技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(見例如 2005Physicians’Desk Reference? , Thomson Healthcare:Montvale, NJ, 2004;Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 20版，Gennado等編著.Lippincott Wi 11 iams&ffi lkins !Philadelphia, PA, 2000)。合適的藥物添加劑包括，例如，甘露醇、淀粉、葡萄糖、乳糖、鹿糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯(propylene)、乙二醇(glycol)、水、乙醇等。在某些實施方案中，藥物組合物還可以包含PH緩沖劑和潤濕劑或乳化劑。在進一步的實施方案中，組合物可以含有防腐劑或穩(wěn)定劑。
[0049]在一些實施方案中，包含修飾的人GAA的藥物組合物可以進一步包括如下的一種或多種:甘露醇、聚山梨酯(polysorbate)80、七水合磷酸氫二鈉，和一水合磷酸二氫鈉。在另一個實施方案中，藥物組合物可以含有IOmM組氨酸pH6.5及最多2%甘氨酸、最多2%甘露醇、和最多0.01%聚山梨酯80。更多示例藥物組合物可以參閱PCT公布文本N0.2010/075010。
[0050]藥物組合物的配制可以根據(jù)預(yù)期的給藥途徑和其它參數(shù)而變化(見例如Rowe等，Handbook of Pharmaceutical Excipients,第 4 版，APhA Publications, 2003.)在一些實施方案中，修飾的GAA組合物可以是凍干的餅或粉末。凍干的組合物可以重建用于靜脈注射給藥，例如使用注射用無菌水USP重建。在其它實施方案中，組合物可以是無菌的非熱原性溶液。
[0051]本文中描述的藥物組合物可以包含修飾的GAA作為唯一的活性化合物，或者可以和另一種化合物、組分或生物材料組合遞送。例如，藥物組合物還可以包括一種或多種用于治療蓬佩病和/或與蓬佩病或其治療相關(guān)的副作用的小分子。在一些實施方案中，組合物可以包含美格魯特(miglustat)和/或一種或多種在例如美國專利申請公開Nos.2003/0050299, 2003/0153768; 2005/0222244;或 2005/0267094 中描述的化合物。在一些實施方案中，藥物組合物還可以包含一種或多種免疫抑制劑、mTOR抑制劑或自噬抑制劑。免疫抑制劑的實例包括雷帕霉素和萬珂(velcade)。雷帕霉素還是一種mTOR抑制劑。
[0052]V.治療方法
[0053]在一些實施方案中，修飾的GAA用于減少或防止糖原在患者組織中的積累。在其它實施方案中，修飾的GAA用于治療糖原貯積病。在進一步的實施方案中，糖原貯積癥是蓬佩病。在示例實施方案中，修飾的GAA在施用給患者之后在溶酶體中被加工成為成熟的GAA。
[0054]本文中描述的修飾的GAA可以通過任何合適的遞送系統(tǒng)施用，并可以包括，沒有限制，胃腸外(包括皮下、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、髓腔內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)注射)、經(jīng)皮或經(jīng)口(例如膠囊、懸液或藥片)。在一個實施方案中，修飾的GAA通過靜脈內(nèi)給藥遞送。
[0055]在其他的實施方案中，可以遞送編碼修飾的GAA的核酸給患者。該核酸可以用適用于基因治療的載體加以遞送?；蛑委煼椒ǖ膶嵗诶缑绹鴮＠?，952，516; 6，066，626; 6，071，890;和 6，287，857 中有描述。
·[0056]施用給患者可以以單一劑量或以重復(fù)施用的形式發(fā)生，可以施用多種生理可接受的鹽形式的任何一種，和/或與可接受的藥物載體和/或添加劑一起作為藥物組合物的一部分。
[0057]本文中描述的修飾的GAA組合物以治療有效量施用。一般地，治療有效量可以隨著受試者的年齡、一般狀況、和性別，以及受試者病癥的嚴重程度而變化。劑量可以由醫(yī)生確定，并根據(jù)需要調(diào)節(jié)以適合觀察到的治療效果。
[0058]本文中描述的修飾的GAA可以在門診環(huán)境下通過靜脈內(nèi)輸注施用，例如每1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10或更多天施用一次，或例如每周、每兩周、每月、每兩個月施用一次?；衔锏暮线m治療有效劑量由處置醫(yī)師選擇，范圍可以是大約1μ g/kg-大約500mg/kg，大約 10mg/kg-大約 100mg/kg,大約 20mg/kg-大約 100mg/kg,和大約 20mg/kg-大約 50mg/kg。在一些實施方案中，合適的劑量從下選出:例如0.1,0.25，0.5,0.75，1,5, 10，15，20，30,40,50, 60, 70,和 100mg/kg。此外，具體劑量的實例可以在 Physicians’Desk Reference?中找到。
[0059]在一些實施方案中，該方法包括施用修飾的人GAA，借此將受試者體內(nèi)的糖原清除相對于內(nèi)源活性增加例如至少 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,或100%ο在一些實施方案中，該方法包括施用修飾的人GAA，借此將受試者體內(nèi)的糖原清除相對于內(nèi)源活性增加例如至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，100，或1000倍。增加的糖原清除可以通過例如臨床癥狀的減少加以確定，或通過合適的臨床測定或生物測定，如溶酶體糖原貯積測定來加以確定。
[0060]在某些實施方案中，用包含修飾的人GAA的藥物組合物治療受試者之后增加的糖原清除可以通過生物化學(xué)觀察(見例如Zhu et al.，J.Biol.Chem.279:50336-50341 (2004))或組織學(xué)觀察到溶酶體糖原的積累減少，例如在心肌細胞、骨骼肌細胞或皮膚成纖維細胞中的積累減少加以確定。還可以測定例如肌肉活組織檢查樣品中，培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞中，淋巴細胞中，和干燥的血斑中的GAA活性。干燥血斑測定在例如 Umpathysivam et al.，Clin.Chem.47:1378-1383 (2001)和 Li et al., Clin.Chem.50:1785-1796(2004)中有描述。蓬佩病的治療也可以例如通過如下的方法進行評估:肌酐激酶的血清水平、 運動功能的增加(gains in motor function)(例如通過阿爾伯塔嬰兒運動量表(Alberta Infant Motor Scale)進行評估)，通過超聲心動圖測量的左心室質(zhì)量指數(shù)變化，和通過超聲心動圖衡量的心電活動。施用包含修飾的人GAA的藥物組合物還可導(dǎo)致蓬佩病的一種或多種癥狀減輕，所述癥狀例如心臟肥大、心肌病、白天嗜睡(daytimesomnolescence)、勞累性呼吸困難、發(fā)育停滯、喂養(yǎng)困難、“懶散(floppiness) ”、步態(tài)異常(gait abnormalities)、頭痛、肌肉張力低下、器官巨大癥(例如心臟、舌頭、肝臟肥大)、脊柱前彎癥、平衡喪失、下背部疼痛、晨起頭痛、肌肉無力、呼吸功能不全、翼狀肩胛、脊柱側(cè)凸、深腱反射減低、睡眠呼吸暫停、呼吸道感染的易感性、和嘔吐。
[0061]在某些實施方案中，該方法包括在一種或多種其他治療中施用包含修飾的人GAA的藥物組合物。該一種或多種其他治療可以在修飾的人GAA的施用同時(包括作為組合制劑同時施用)、之前或之后施用。在一些情況下，其他治療可以在修飾的GAA兩次給藥之間施用。例如，小分子治療可以用于減慢糖原的再積累，從而為減少修飾的GAA的給藥頻率提供條件。
[0062]在一些實施方案中，該方法包括用解熱藥、抗組胺劑、和/或免疫抑制劑治療受試者(在如前文所述的用修飾的人GAA治療之前、之后或期間)。在某些實施方案中，可以在用修飾的人GAA治療之前,用解熱藥、抗組胺劑、和/或免疫抑制劑治療受試者，以減少或防止輸注相關(guān)反應(yīng)。例如，受試者可以用如下的一種或多種藥物進行預(yù)先治療:對乙酰氨基酚、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢菌素A、苯海拉明、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、口服類固醇、或雷帕霉素。
[0063]在一些實施方案中，該方法包括(在用修飾的人GAA治療之前、之后或期間)用小分子療法和/或基因療法治療受試者，小分子療法和/或基因療法包括旨在治療糖原忙積癥的小分子療法和基因療法。小分子療法可以包括施用美格魯特和/或一種或多種在例如美國專利申請公開 2003/0050299，2003/0153768; 2005/0222244;和 2005/0267094 中描述的化合物?；虔煼梢匀缋缑绹鴮＠鸑os.5，952，516; 6，066，626; 6，071，890;和6，287,857;和美國專利申請公開N0.2003/0087868中所述地進行。
[0064]V1.實施例
[0065]下面的實施例用于例證本公開，并沒有任何限制意義。
[0066]實施例1:材料和方法
[0067]A.測定試劑和材料
[0068]伴刀豆球蛋白A、DEAE-Sepharose FF 和制備級 Superdex200 從 AmershamPharmacia Biotech (Piscataway, NJ)獲得。α -甲基葡糖苷、苯甲脈、和4_甲基傘形酮a-D-葡糖苷從Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO)獲得。其它化學(xué)品為試劑級或更好的級別，從常規(guī)供應(yīng)商獲得。SDS-PAGE凝膠從Invitrogen(San Diego, CA)獲得。滾瓶從Corning (Corning, NY)獲得。Dulbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(FBS)從 JRH Biosciences (Lenexa, KS)獲得。蓬佩病成纖維細胞(GM00248)從 Coriell CellRepositories (Camden, NJ)獲得。
[0069]B.酸性α-葡糖苷酶活性和蛋白測定
[0070]酸性α -葡糖苷酶在酶標板中使用4-甲基傘形酮α -D-葡糖苷通過熒光定量進行測定，如先前所述。Oude Elferink et al.，Eur.J.Biochem.139:489-495 (1984)。通過280nm吸光度評估蛋白濃度，其中假定Ew=IO,或使用牛血清白蛋白標準化的微量BCA(Micro-BCA)測定進行評估。Smith et al.，Anal.Biochem.150:76-85 (1985)。
[0071 ] C.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0072]將還原和非還原的樣品和分子量標記(Amersham Pharmacia Biotech)施用到4-20%或10%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠。電泳在150伏進行1.5小時，蛋白用考馬斯藍或銀染可視化。Blum et al.，Electrophoresis93_99 (1987)。
[0073]D.重組和胎盤GAA的單離
[0074]重組和人胎盤GAA的產(chǎn)生和純化如前所述。Martiniuk et al., Archives ofBiochem.and Biophys.231:454-460(1984);Mutsaers et al., Biochimica et BiophysicaActa911:244-251(1987);Moreland et al., (2005)。
[0075]E.抗體和Western印跡分析
[0076]如前所述(Moreland et al.，2005)，用與KLH偶聯(lián)的合成肽免疫家兔。每條肽的序列如下:抗-GAA57-74(QQGASRPGPRDAQAHPGR(SEQ ID NO:2)),抗-GAA78-94(VPTQCDVPPNSRFDCA`(SEQ ID NO:3)),和抗-GAA183-200(IKDPANRRYEVPLETPRV(SEQ ID N0:4))。產(chǎn)生了針對純化人胎盤GAA的山羊多克隆抗體。單克隆抗體GAAl如前所述。Moreland et al., 2005。Western 印跡的實施如前所述。Moreland et al., 2005。
[0077]F.成纖維細胞的rhGAA攝取
[0078]對于每個時間點，將大約5x10s個蓬佩病成纖維細胞置于含10%FBS的DMEM中，用250nM rhGAA (WT)或rhGAA (H201L)溫育。在第16小時，清洗細胞并添加不含GAA的新鮮培養(yǎng)基。在指定的時間點，除去細胞并用磷酸鹽緩沖鹽水清洗5次，并保存在-80°C。在最后一個時間點之后，將所有細胞離心沉淀解凍并同時用0.25%Triton裂解。離心沉降細胞碎片，并用抗GAA抗體對每個時間點的上清進行Western印跡分析。
[0079]G.制備表達載體和瞬時轉(zhuǎn)染
[0080]用標準程序在pcDNA6 (Invitrogen)中制備用于具有和沒有氨基酸取代或缺失的重組GAA的表達質(zhì)粒。將人腎293T細胞在補充有10%FBS的DMEM中，5%C02，37°C培養(yǎng)。將6微克的每種質(zhì)粒與Fugene6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)混合,并添加到置于IOcm培養(yǎng)盤的2.5xl06個細胞中。72小時后，用PBS清洗附著的細胞兩次，并用含有0.25%Triton的PBS裂解。通過離心沉淀細胞碎片，將上清保存在_20°C。
[0081]H.代謝標記和免疫沉淀
[0082]穩(wěn)定表達rhGAA(WT)或rhGAA(H201L)的CHO細胞系通過先前所述的方法產(chǎn)生。Qiuet al.，J.Biol.Chem.278:32744-32752(2003)。在 IOcm培養(yǎng)盤中，將大約 5xl06個細胞在缺少甲硫氨酸和半胱氨酸的DMEM中溫育30min。在缺少甲硫氨酸和半胱氨酸的DMEM中將細胞用150μ Ci/ml(1175Ci/mmol Tran35S標記物)沖激標記2h。將細胞在DMEM中清洗兩次并取Oh時間點后，將細胞在37°C用沒有標記物的DMEM溫育。在每個時間點，將細胞用PBS清洗兩次。將培養(yǎng)盤保存在_20°C。在最后時間點之后，將細胞用含有0.25%Triton的PBS (PBST)裂解。通過離心除去細胞碎片，并向上清添加60 μ 150%的伴刀豆蛋白A Sepharose衆(zhòng)液。溫育2h后，用PBST清洗珠子3次。用含有0.5Mα -甲基葡糖苷的PBS洗脫被標記的GAA。隨后用偶聯(lián)有親和純化的山羊抗-GAA的NHS-Sepharose對洗脫液中存在的GAA進行免疫沉淀。免疫沉淀物用PBST清洗3次，并向珠子添加40 μ I含有β -巰基乙醇的2x SDS樣品緩沖液。將樣品煮沸后進行Western印跡分析。
[0083]1.縮寫
[0084]如這里所使用的，“rhGAA”是指重組人酸性α-葡糖苷酶?！癈H0”是指中華倉鼠卵巢?！癕SX”是指甲硫氨酸亞砜酰亞胺(methionine sulfoximine)?！癊RT”是指酶替代療法。
[0085]如這里所使用的，“GAA(H201R) ”是指在201位具有組氨酸變?yōu)榫彼岬陌被崽鎿Q的修飾的GAA?！癎AA(H201L) ”是指在201位具有組氨酸變?yōu)榱涟彼岬陌被崽鎿Q的修飾的GAA?！癎AA(H201Y) ”是指在201位具有組氨酸變?yōu)槔野彼岬陌被崽鎿Q的修飾的GAA?！癎AA(H201K) ”是指在201位具有組氨酸變?yōu)橘嚢彼岬陌被崽鎿Q的修飾的GAA。
[0086]實施例2:人、牛和倉鼠GAA的比較
[0087]當(dāng)通過SDS-PAGE檢查從胎盤純化的GAA時，兩條對應(yīng)于76-和70_kDa多肽的條帶具有大約相等的豐度(圖2)。類似地，在中華倉鼠卵巢(CHO)細胞中過表達并從細胞裂解物純化的rhGAA在先前已經(jīng)證明具有76-和70-kDa條帶。Moreland et al., 2005。相比之下，從CHO細胞純化的倉鼠GAA只作為70-kDa多肽存在。為了確定70-kDa形式的主導(dǎo)地位是否是倉鼠獨有的性質(zhì)，`對牛睪丸GAA進行純化，并通過還原性銀染SDS-PAGE(4-20%丙烯酰胺)進行表征，也顯示僅含有70-kDa多肽(圖2)。
[0088]實施例3 =GAA第201位氨基酸影響從76-到70_kDa形式轉(zhuǎn)變的效率并決定蛋白水解切割的順序
[0089]哺乳動物GAA序列在氨基酸197-206之間的蛋白水解位點的比對結(jié)果(圖3A)證明，被保留的序列高度保守，而被切除的序列顯示一些差異。人GAA在201位含有一個組氨酸，而倉鼠和牛GAA則分別具有疏水性殘基亮氨酸和酪氨酸。為了確定這些氨基酸替換是否導(dǎo)致加工中的種屬特異性差異，構(gòu)建了 GAA表達質(zhì)粒，其中變化氨基酸201。組氨酸被替換為亮氨酸(H201L)、酪氨酸(H201Y)、精氨酸(H201R)或賴氨酸(H201K)。用每種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染人胚胎腎細胞293T，隨后用針對GAA的單克隆抗體進行Western印跡分析。細胞裂解物的Western印跡分析表明，當(dāng)GAA的201位氨基酸被亮氨酸或酪氨酸替換后，從76-kDa向70-kDa形式的轉(zhuǎn)變效率極其顯著地高于野生型(圖3B，泳道2_7)。疏水氨基酸替換似乎導(dǎo)致形成一個新的~82-kDa中間產(chǎn)物，如星號所示(圖3B)。在僅有載體的對照中(圖3，泳道8)，與來自被瞬時轉(zhuǎn)染的293T細胞的裂解物相比，細胞裂解物上樣量需要超過9倍才能顯示內(nèi)源GAA。
[0090]為了表征野生型GAA相對于GAA(H201L)的加工速度，進行了脈沖追蹤實驗(pulsechase experiment)。將穩(wěn)定表達每種GAA的CHO細胞用Tran35S放射性標記2小時,用不含有標記物的培養(yǎng)基追蹤指定的時間(圖4)。用Con A從細胞裂解物純化rhGAA后進行免疫沉淀，如實施例1所述。時間Oh在2h脈沖之后。在55小時時間點，GAA(H201L)被完全加工成70-kDa形式，而野生型GAA在120小時后僅有非常少地被加工成70-kDa形式。在表達野生型GAA的細胞中觀察到了一個95-kDa種類，但在H201L中沒有。該95_kDa中間產(chǎn)物的身份在先前已經(jīng)有人表征(Moreland et al.，2005)，并且顯示在圖1中。
[0091]為了確定rhGAA(H201L)是否在攝取研究中經(jīng)歷更快的加工，從穩(wěn)定的重組CHO細胞系純化了分泌形式的rhGAA(H201L)和rhGAA(WT)。攝取研究在蓬佩病成纖維細胞上實施，因為它們?nèi)鄙貵AA(圖5)。如實施例1所述，將GAA缺陷的蓬佩病成纖維細胞(GM00248)與250nM rhGAA (WT)和rhGAA (H201L)溫育。在指定的時間點收集成纖維細胞并冷凍在_80°C。用針對人GAA的單克隆抗體(其未知的表位位于204-782位氨基酸之內(nèi))探查細胞裂解物的還原SDS-PAGE(7.5%丙烯酰胺)Western印跡。攝取GAA之后，95-kDa和76-kDa形式是rhGAA(WT)的主導(dǎo)形式，而在rhGAA(H201L)中則沒有觀察到(圖5，泳道5_13)。這種加工上的差異再次伴隨著在GAA(H201L)中~82-kDa的中間產(chǎn)物的出現(xiàn)。
[0092]為了表征該~82-kDa中間產(chǎn)物，用識別氨基酸183-200 (因此可結(jié)合從完全加工的GAA釋放的10.4-kDa片段)的抗-GAA抗體探查含有純化rhGAA、胎盤GAA和rhGAA (H201L)的Western印跡(圖6A)。rhGAA、胎盤GAA和成熟rhGAA (H2OIL)的純化如實施例1所述?？贵w結(jié)合表明，來自胎盤的76-kDa種類仍然含有氨基酸183-200。與之對照的是，82-kDa中間產(chǎn)物不含有這些氨基酸，表現(xiàn)在沒有抗體結(jié)合。這是因為已經(jīng)發(fā)生了抗體識別位點的切割，如泳道3中~?Ο-kDa條帶所證明的。另一種針對GAA的單克隆抗體證明了在rhGAA(H201L)樣品中82-kDa中間產(chǎn)物的存在(圖6B)。
[0093]可以得出結(jié)論，82-kDa中間產(chǎn)物來自于氨基酸200-204之間的切割位點處的加速的蛋白水解。該切割發(fā)生在氨基酸782-792之間的切割之前。如圖6A所示，該82-kDa多肽不含有來自氨基酸122-200的~?Ο-kDa片段。這些結(jié)果提示rhGAA (H201L)有另一種加工途徑，如圖7所示。野生型與GAA(H201L)的加工在95-kDa中間產(chǎn)物之后發(fā)生分歧。野生型GAA在羧基端附近(氨基 酸781-792之間)被切割而產(chǎn)生76-kDa中間產(chǎn)物，而GAA (H201L)在氨基酸200-204之間被切割而產(chǎn)生82-kDa中間產(chǎn)物。兩條通路最終均產(chǎn)生成熟的70-kDaGAA0
[0094]本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過考慮這里公開的專利說明書和實施方案的實踐容易想到本公開其它的實施方案。專利說明書和實施例的目的僅是例示說明。
【權(quán)利要求】
1.一種多肽，由在N-端70-kDa加工位點處或其附近具有修飾的人酸性α -葡糖苷酶或其催化活性片段組成。
2.一種多肽，其包含在N-端70-kDa加工位點處或其附近具有修飾的人酸性α -葡糖苷酶或其催化活性片段。
3.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述修飾是N-端70-kDa加工位點處或其附近的疏水性增加。
4.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述修飾位于對應(yīng)于SEQID NO:1的195-209位的一個或多個氨基酸。
5.權(quán)利要求4的多肽，其中所述修飾位于對應(yīng)于SEQID NO:1的200-204位的一個或多個氨基酸。
6.權(quán)利要求5的多肽，其中所述修飾位于對應(yīng)于SEQID NO:1的201位的氨基酸。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的多肽,其中該修飾包括: a)用更疏水的氨基酸取代一個或多個氨基酸，或者 b)插入一個或多個疏水性氨基酸。
8.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述片段選自人酸性α-葡糖苷酶的70-kDa、76_kDa、82-kDa、95-kDa、或任何其它催化活性片段。
9.權(quán)利要求8的多肽，其中所述多肽還包含受體靶定序列。
10.權(quán)利要求9的多肽，其中所述受體靶定序列是IGF2。`
11.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述多肽與SEQID NO:1的至少500個氨基酸具有至少80%同一性。
12.權(quán)利要求11的多肽，其中所述多肽與SEQID NO:1的至少500個氨基酸具有至少90%同一性。
13.權(quán)利要求11的多肽，其中所述多肽與SEQID NO:1的至少500個氨基酸具有至少95%同一性。
14.權(quán)利要求1或2的多肽，其中該修飾的多肽與未修飾的人酸性α-葡糖苷酶相比，顯示更迅速的溶酶體蛋白酶加工。
15.權(quán)利要求14的多肽，其中該多肽在施用20個小時內(nèi)有至少50%被蛋白水解加工成70-kDa 形式。
16.權(quán)利要求15的多肽，其中該多肽在施用55個小時內(nèi)基本上全部被蛋白水解加工成70-kDa 形式。
17.權(quán)利要求1或2的多肽，其中該多肽與包含至少一個甘露糖-6-磷酸的寡糖綴合。
18.—種核酸,其編碼選自權(quán)利要求1-17中任一項的多肽。
19.經(jīng)過權(quán)利要求18的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
20.權(quán)利要求19的宿主細胞，其中該宿主細胞能夠分泌由權(quán)利要求18的核酸編碼的多肽。
21.一種減少或防止糖原在組織中積累的方法，包括向有此需要的患者施用有效量的權(quán)利要求1或2的多肽。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述患者患有糖原貯積病。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述糖原貯積病是蓬佩病。
24.一種治療糖原貯積病的方法，包括向有此需要的患者施用治療有效量的權(quán)利要求1或2的多肽。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述糖原貯積病是蓬佩病。
26.一種適用于治療糖原貯積病的藥物組合物，包含權(quán)利要求1-17中任一項的多肽。
27.權(quán)利要求26的藥物組合物，其中所述多肽是凍干的。
28.權(quán)利要求1-17中任一項的多肽在制造用于減少或防止組織中的糖原積累的藥物中的用途。
29.權(quán)利要求28的用途，其中所述糖原積累是由于糖原貯積病所致。
30.權(quán)利要求29的用途，`其中所述糖原貯積病是蓬佩病。
【文檔編號】C12N9/24GK103797115SQ201280030662
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月22日
【發(fā)明者】W.M.坎菲爾德, R.J.莫雷蘭, 工藤麻里子 申請人:建新公司